Мікрофлора систем гідробіологічного очищення морських вод

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ БІОЛОГІЇ ПІВДЕННИХ МОРІВ

ім. О. О. КОВАЛЕВСЬКОГО

МІкрофлора систем гІдробІологІчного очищення морських вод

03.00.17 - гідробіологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

ДОРОШЕНКО Юлія Валеріївна

УДК 579.8:628.35(262.5)

Севастополь - 2009

Дисертація є рукописом

Робота виконана в Інституті біології південних морів ім. О. О. Ковалевського

Національної академії наук України, м. Севастополь

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор

Миронов Олег Глібович,

Інститут біології південних морів

ім. О. О. Ковалевського НАН України,

завідувач відділу

морської санітарної гідробіології

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук,

старший науковий співробітник

Рябушко Віталій Іванович,

Інститут біології південних морів

ім. О. О. Ковалевського НАН України,

завідувач відділу

морської фармакології та біотестування

кандидат біологічних наук,

старший науковий співробітник

Ковальова Наталія Володимирівна,

Одеський національний університет

ім. І. І. Мечникова МОН України,

провідний науковий співробітник Регіонального

міжвідомчого центру інтегрального

моніторингу й екологічних досліджень

Захист відбудеться « 21 » жовтня 2009 р. о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради

Д 50.214.01 Інституту біології південних морів ім. О. О. Ковалевського НАН України за адресою: 99011, м. Севастополь, пр. Нахімова, 2

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту біології південних морів

ім. О. О. Ковалевського НАН України за адресою: 99011, м. Севастополь, пр. Нахімова, 2

Автореферат розісланий « 10 » вересня 2009 р.

Вчений секретар

спеціалізованої ради Д 50.214.01

доктор біологічних наук, професор А.В. Гаєвська

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. В самоочищенні морського середовища від забруднення й формуванні якості природних вод беруть участь всі групи гідробіонтів. Однак в умовах постійного забруднення природні процеси самоочищення не справляються з потоками забруднюючих речовин, що призводить до деградації морських угруповань. Одним із шляхів подолання проблеми є стимуляція самоочищуючої здатності морського середовища (Миронов и др., 2003; Александров, 2008) за допомогою спеціальних технічних конструкцій - систем гідробіологічного очищення, розроблених у відділі морської санітарної гідробіології ІнБПМ НАНУ та опробованних у різних акваторіях Чорного моря (Миронов, 2006).

Першою ланкою систем гідробіологічного очищення є активні обростувачі і фільтратори - молюски, зокрема, мідії та мітілястери (Миронов и др., 1995, Миронов, 2006, Соловьева, 2008), які, фільтруючи великі об'єми води в процесі своєї життєдіяльності й зв'язуючи у фекаліях і псевдофекаліях усі забруднювачі водної товщі, сприяють загальному оздоровленню акваторії. Активно розселяючись на поверхні основних носіїв (колекторів), ця група обростувачів створює додаткові площі для заселення й інших морських організмів, в першу чергу мікроорганізмів перифітону, які є другою ланкою гідробіологічної системи й обумовлюють, у підсумку, інтенсивність і потужність сформованого біофільтра, трансформуючого й утилізуючого забруднення. Таким чином, вивчення складу та функцій мікроорганізмів перифітону є складовою частиною загальної проблеми самоочищення морського середовища і є необхідністю, як для оцінки „коефіцієнта корисної дії” існуючих технічних конструкції (систем гідробіологічного очищення), так й для їх можливого удосконалення.

Дослідження мікробіальної ланки проводили в акваторії Севастополя (Чорне море). Як приклади різних конструкцій систем гідробіологічного очищення були обрані системи, розташовані в Нафтогавані Севастопольської бухти.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана в межах фундаментальних досліджень ІнБПМ НАН України за держбюджетними темами Національної академії наук України «Вивчення біогеохімічних закономірностей формування потоків радіоактивних, мінеральних, органічних речовин природного і техногенного походження й обумовленого ними екологічного ризику для популяцій критичних видів у Чорному морі» (№ держ. реєстрації 0103U001050, 2003 - 2007 рр.); «Вивчення закономірностей формування ценозу обростання пілотної установки системи гідробіологічного очищення морської води і його вплив на екологічні умови в районі розташування» (№ держ. реєстрації 0107U005583, 2005 - 2009 рр.). У перерахованих темах дисертантка брала участь під час навчання в аспірантурі як виконавець.

Мета та завдання дослідження. Мета роботи полягала у визначенні динаміки чисельності, біохімічних особливостей і складу мікрофлори, що бере участь у трансформації нафтових вуглеводнів та інших органічних речовин у системах гідробіологічного очищення.

Для реалізації зазначеної мети були поставлені наступні завдання:

· вивчити динаміку чисельності бактерій перифітону систем гідробіологічного очищення морської води;

· виділити чисті культури бактерій і визначити їхню родову належність;

· виявити в мікробному угрупованні систем гідробіологічного очищення дріжджі;

· виділити чисті культури дріжджів і визначити їхню видову належність;

· вивчити ріст бактерій і дріжджів перифітону на різних джерелах вуглецю;

· зробити порівняльну оцінку перетворення нафтових вуглеводнів та інших органічних речовин бактеріями й дріжджами.

Об'єкт дослідження - мікроорганізми перифітону (обростання).

Предмет дослідження - чисельність, біохімічні особливості й склад мікроорганізмів перифітону (обростання).

Методи дослідження: комплексні методи гідробіології і морської мікробіології (для виділення з перифітону і морської води гетеротрофних бактерій і морських дріжджів), загальної мікробіології (для оцінки морфологічних, культуральних і фізіолого-біохімічних особливостей отриманих штамів бактерій і дріжджів та їхньої ідентифікації, для зберігання культур морських бактерій і дріжджів на поживних середовищах), математичної статистики (для аналізу й оцінки вірогідності отриманих даних).

Наукова новизна одержаних результатів. Отримано систематичні дані про розподіл гетеротрофних мікроорганізмів перифітону систем гідробіологічного очищення, розташованих в акваторії Севастопольської бухти (Нафтогавань). Уточнено сучасний родовий склад бактерій перифітону. Встановлено, що переважною формою є грамнегативні, неспороносні, рухливі палички, що відносяться до роду Vibrio. Отримано нові дані про видовий склад морських дріжджів перифітону. Автором виділено 67 штамів, віднесених до 10 видів. Вперше для мікроорганізмів перифітону виявлені деякі біохімічні особливості бактерій і дріжджів. Бактерії більш активно росли на флотському мазуті й дизельному паливі, а дріжджі - на сирій нафті і фенолі. Дріжджі, на відміну від бактерій, краще росли на крохмалі і жирі. Істотних розходжень між бактеріями і дріжджами у використанні білка як єдиного джерела вуглецю й енергії не виявлено. Автором установлено, що деякі види дріжджів перифітону здатні зберігати не тільки життєздатність, а й активність навіть при високих концентраціях нафтопродуктів.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані кількісні дані про різні групи гетеротрофних мікроорганізмів, використовувані як біоіндикаційні показники, можуть бути застосовані для оцінки рівня забруднення морської акваторії. Виявлені фізіолого-біохімічні особливості бактерій і дріжджів є новими даними, які необхідно використовувати для більш повної характеристики систем гідробіологічного очищення і розробки рекомендацій щодо посилення їхньої самоочищуючої здатності в хронічно забруднених акваторіях подібного типу. Отримані результати дають підставу рекомендувати під час екологічного моніторингу забруднення морського середовища нафтовими вуглеводнями й іншими органічними речовинами вести облік в угрупованні мікроорганізмів не тільки бактерій, а й морських дріжджів.

Особистий внесок здобувача. Дисертація є самостійним науковим дослідженням виконаним в період навчання в аспірантурі. Авторка брала безпосередню участь у зборі, обробці й аналізі матеріалів. Постановка наукових завдань, методичні розробки, проведення лабораторних експериментів були виконані дисертанткою, що підтверджується самостійністю публікації основних матеріалів роботи.

Апробація результатів дисертації. Матеріали роботи доповідалися й обговорювалися на VI Всеукраїнській науково-практичній конференції молодих учених з проблем Чорного й Азовського морів “Понт Евксинський” (Севастополь, 2005), Третій міжнародній науково-практичній конференції “Проблеми природокористування, сталого розвитку і техногенної безпеки регіонів” (Дніпропетровськ, 2005), Міжнародній конференції “Фундаментальні дослідження найважливіших проблем природничих наук на основі інтеграційних процесів в освіті та науці” (Севастополь, 2006), IIІ Міжнародній конференції молодих учених, присвяченій 100-річчю з дня народження видатного українського ліхенолога М. Ф. Макаревич “Розмаїття живого. Екологія. Адаптація. Еволюція.” (Одеса, 2007), IIІ міжнародній конференції “Молодь і поступ біології” (Львів, 2007), Міжнародній конференції молодих учених “Сучасні проблеми раціонального природокористування в прибережних морських акваторіях України” (м. Севастополь - с. Кацивелі, 2007), Міжнародній науково-практичній конференції «Перифітон і обростання: теорія і практика» (м. Санкт-Петербург, РФ), на семінарах відділу морської санітарної гідробіології ІнБПМ НАН України.

Публікації. За темою дисертації опубліковано 11 наукових праць (з них 10 без співавторів): 4 статті опубліковано у провідних наукових виданнях, які рекомендовані ВАК України, і 7 праць - у тезах матеріалів вітчизняних і міжнародних наукових конференцій та з'їздів. У праці, опублікованій у співавторстві, внесок здобувача полягає в проведенні лабораторного опрацювання проб і статистичної обробки отриманих даних, розробки мети дослідження й обговоренні отриманих результатів (разом з керівником), написанні тексту статті. Зі статті, опублікованої в співавторстві, в дисертації використані дані, отримані особисто дисертанткою. Права співавтора публікації не порушено.

Структура й обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, шести розділів, висновків, списку використаних джерел, що включає 175 найменувань, з яких 74 - іноземні. Загальний обсяг рукопису 123 сторінки. Робота містить 45 рисунків і 20 таблиць.

Подяки. Здобувач висловлює глибоку подяку науковому керівникові, доктору біологічних наук, професору О. Г. Миронову, колективу відділу морської санітарної гідробіології ІнБПМ НАН України за всебічну допомогу при виконанні роботи та критичні зауваження; доктору біологічних наук, професору А. В. Гаєвській за цінні поради та рекомендації. Особливу вдячність автор висловлює доктору біологічних наук, професору С. С. Нагорній, кандидату біологічних наук Т. В. Бабіч (Інститут мікробіології та вірусології ім. Д. К. Заболотного НАН України, м. Київ) за допомогу в ідентифікації дріжджів.

бактерія перифітон гідробіологічний мікрофлора

зміст роботи

Огляд літератури

В цьому розділі охарактеризовані морські мікроорганізми (бактерії й дріжджі). Розглянуто ареали їхнього поширення і дана характеристика їхньої ролі в трансформації речовин та енергії. Окремо розглянуті мікроорганізми перифітону. Описано етапи формування мікрообростання. Обґрунтовано необхідність виконання досліджень за темою дисертаційної роботи.

Матеріал І методи досліджень

Проби обростань (друзи мідій) відбиралися щомісяця від січня 2005 по лютий 2006 рр. з капронових носіїв (СГО-1) і з металевих елементів (СГО-2) (рис. 1).

Для цього використовували скребок, на ручці якого закріплювали поліетиленові пакети. Пробу (обростання й вода) після підняття на борт мотобота переносили в стерильні п'ятилітрові пластмасові відра із припасованими кришками. Водночас щомісяця відбирали проби морської води в центрі акваторії Нафтогавані батометром. Під час відбору проб вимірювали температуру води.

В лабораторії вся наступна обробка проб виконувалася в стерильних умовах. З поверхні черепашки мідій зіскоблювали в чашки Петрі проби перифітону масою 2 г. Під час транспортування проб відбувалось часткове змивання мікроорганізмів з обростань. Щоб простежити, яка кількість бактерій потрапляє у воду при гідродинамічному впливі, із відер з обростаннями відбирали проби води об'ємом 20 мл. Зазначеної вище кількості матеріалу було достатньо для проведення мікробіологічних досліджень (Нетрусов, 2005, Родина, 1965, Егоров, 1976).

Для вивчення динаміки формування обростань у лютому 2005 р. в акваторії Нафтогавані на глибину близько 2,5 м у районі СГО-2 були занурені виготовлені із цементу 12 кубиків із гранню 4Ч4 см і 12 уламків каменів з мармуроподібного вапняку. Камені підбирали таким чином, щоб площа їхньої поверхні приблизно відповідала такий у бетонних кубиків, тобто 0,0096 м2 (Соловьёва, 2008). Використані матеріали для експериментальних зразків використовуються при будівництві гідротехнічних споруджень у прибережній зоні Севастополя. Зазначена кількість зразків дозволила відбирати їх для аналізу щомісяця протягом року (з березня 2005 по лютий 2006 рр.) по 1 екз. Змиви з поверхні бетонного кубика і каменя робили відразу після підняття зразків на борт мотобота.

Всього опрацьовано 27 проб обростань, 27 змивів з обростань, 14 проб води, а також по 12 змивів із цементних кубиків і каменів. Таким чином, дослідженнями були охоплені перифітон з СГО, змиви з перифітону, перифітон, що формується з експериментальних зразків, і морська вода.

У період 2006 - 2007 рр. проводили лабораторні дослідження фізіолого-біохімічних властивостей мікроорганізмів, а також їхню ідентифікацію.

У зіскобах перифітону, змивах з обростань і в пробах води із Нафтогавані визначали загальну чисельність гетеротрофних, нафтоокислюючих, ліполітичних, амілолітичних і фенолокислюючих бактерій. Таким чином, були охоплені всі основні групи бактерій, що трансформують органічні речовини. У змивах з кубиків і каменів визначали тільки загальну кількість гетеротрофів і нафтоокислюючих бактерій, оскільки нас, насамперед, цікавила динаміка чисельності бактерій у процесі формування обростання.

Паралельно з кількісним обліком мікроорганізмів були виділені культури бактерій і дріжджів. Накопичувальну культуру бактерій одержували на пептонній воді (Родина, 1965), накопичувальну культуру дріжджів - на солодово-дріжджевом бульйоні (Квасников, Щелокова, 1991).

Визначення бактерій до роду проводили по Берджи (1997). Морфологічні, культуральні та фізіолого-біохімічні властивості бактерій вивчали по посібниках М. С. Єгорова (1976), О. І. Нетрусова (2005) і В. В. Лисак (2005). Ідентифікацію дріжджів до виду проводили по (Kurtzman, 1998).

Здатність й інтенсивність росту дріжджових і бактеріальних культур на нафті й нафтопродуктах визначали культивуванням виділених організмів на середовищі Діанової-Ворошилової з наступним доданням джерел вуглецю (Миронов и др., 1995). Як джерело нафтових вуглеводнів використовували дизельне паливо, флотський мазут і сиру нафту. Крім того, як єдине джерело вуглецю й енергії використовували також білок, крохмаль, жир, фенол. Ріст на мінеральному середовищі з нафтопродуктами оцінювався візуально за характерними показниками росту мікроорганізмів.

ЧИСЕЛЬНІСТЬ БАКТЕРІЙ ПЕРИФіТОНу

За досліджуваний період загальна чисельність гетеротрофних бактерій у перифітоні СГО-1 (капроновий колектор) коливалося від 150 тис. до 45 млн. кл./г. Чисельність гетеротрофних мікроорганізмів у перифітоні СГО-2 (металевий колектор) за період дослідження коливалася від 25 тис. до 25 млн. кл./г. Виявити залежність між чисельністю гетеротрофних бактерій перифітону і температурою морської води нам не вдалося. Очевидно, температура не є основним чинником росту гетеротрофних бактерій, і їхня чисельність більшою мірою залежить від інших факторів, наприклад, від наявності у воді органічних речовин.

У динаміці чисельності ліполітичних бактерій на обох системах виявлено максимум у серпні 2005 р., при цьому чисельність ліполітичних бактерій на СГО-2 в 5,5 разів перевищувала таку на СГО-1. Для СГО-2 максимальне значення становило 2,5*106 кл./г, а для СГО-1 - 4,5*105 кл./г. Мінімальні значення чисельності ліполітичної групи бактерій у перифітоні СГО-2 і СГО-1 склали відповідно 95 кл./г і 45 кл./г.

При дослідженні амілолітичної групи бактерій у перифітоні систем гідробіологічного очищення вдалося виявити максимуми чисельності, приурочені до теплих місяців, коли температура води досягала 23 - 25 С, як і для ліполітичних бактерій. Максимальна чисельність цієї групи в перифітоні СГО-1 становила 4,5*105 кл./г, а СГО-2 - 9,5*105 кл./г, що в 2 рази перевищує максимум для СГО-1, мінімальні показники в перифітоні СГО-1 і СГО-2 склали відповідно 95 кл./г і 2500 кл./г.

Про наявність зв'язку між температурою морської води й чисельністю ліполітичних і амілолітичних груп мікроорганізмів у перифітоні систем гідробіологічного очищення свідчать також отримані позитивні значимі коефіцієнти кореляції. Значення коефіцієнтів дорівнювали 0,63 для ліполітичних і 0,61 для амілолітичних бактерій на СГО-1 і відповідно 0,59 і 0,58 на СГО-2. Таким чином, для зазначених груп бактерій температура морської води може бути основним обмежуючим чинником росту.

Чисельність нафтоокислюючих бактерій у перифітоні СГО-1 знаходилась в межах 950 - 45 тис. кл./г, що на 3 - 4 порядки нижче загальної чисельності гетеротрофних мікроорганізмів. У перифітоні СГО-2 чисельність нафтоокислюючих бактерій варіювала від 450 до 95 тис. кл./г, що на 2 - 3 порядки менше загальної чисельності гетеротрофів.

Чисельність мікроорганізмів фенолокислюючої групи варіювала від 150 кл./г до 45 тис. кл./г для СГО-1 і від 250 кл./г до 25 тис. кл./г - для СГО-2.

Виявити залежність між температурою морської води й чисельністю нафтоокислюючих і фенолокислюючих бактерій перифітону не вдалося. Очевидно, температура не є основним чинником росту цих груп мікроорганізмів, і їхня чисельність більшою мірою залежить, наприклад, від наявності в акваторії відповідних забруднюючих речовин, тобто нафтопродуктів і фенолу.

Відзначено, що чисельність гетеротрофних бактерій і її динаміка на обох системах носять подібний характер (рис. 2).

У цілому, на досліджуваних станціях установлені значні коливання чисельності мікроорганізмів на обох системах. Зокрема, чисельність гетеротрофних бактерій коливалася в межах 104 - 107 кл./г, ліполітичних - 10 - 106 кл./г, амілолітичних - 10 - 105 кл./г, нафтоокислюючих і фенолокислюючих бактерій - 102 - 104 кл./г.

Під час відбору проб обростань на системах ми звернули увагу на те, що сформоване угруповання обростань покрито значним шаром завислої речовини (замулення). При спробі зняти частину обростання воно утворює «хмару». Подібні процеси можуть відбуватися в природі при надмірному нагромадженні детриту в перифітоні, а також при хвильовому впливі, при цьому частки завислої речовини, що потрапили у воду, поступово осідають на дно. У зв'язку із цим ми спробували визначити чисельність мікроорганізмів у воді, у якій транспортувалися проби обростання, щоб у цьому випадку до деякої міри змоделювати зазначені вище процеси.

У воді, у якій доставлялись обростання з обох систем всі досліджувані групи мікроорганізмів були виявлені в 100 % проб. Виключенням була група ліполітичних бактерій у змиві з перифітону СГО-1, яку не вдалося виявити у квітні. Чисельність гетеротрофних бактерій на 2-3 порядки нижча, ніж у зіскобах, і становила 103 - 104 кл./мл, чисельність нафтоокислюючих і фенолокислюючих мікроорганізмів склала 10 - 103 кл./мл. Виявлене значне коливання чисельності ліполітичних й амілолітичних бактерій 10 - 104 кл./мл.

Одночасно з мікробіологічним аналізом перифітону і змивів з нього, ми проводили мікробіологічний аналіз морської води із Нафтогавані.

Слід зазначити, що чисельність бактерій у морській воді між системами, у порівнянні з перифітоном і навіть змивами з обростань, по всіх групах мікроорганізмів нижча на кілька порядків, і не перевищує 103 кл./мл для гетеротрофів.

Таким чином, під час гідродинамічних впливів відбувається змив частини бактерій перифітону, і їхня концентрація у воді біля систем гідробіологічного очищення підвищується в кілька разів, досягаючи іноді значень перифітону. Отже, біля систем створюється особлива зона, де чисельність бактерій вище середніх значень для морської води, а трансформація забруднюючих речовин відбувається більш активно, ніж у відкритих ділянках бухти.

Аналогічні процеси характерні для прибережних наносів, де в умовах активного гідродинамічного режиму, спостерігається помітне збільшення чисельності мікроорганізмів (майже в 100 разів) (Рубцова, 2003).

Біота штучних гідротехнічних споруджень, які можна розглядати як один із прикладів гідробіологічних систем, суттєво впливає на загальну продуктивність водойми й формування якості води в конкретному регіоні (Миронов и др., 2003). Результати натурного експерименту з бетонними кубиками й уламками мармуроподібного вапняку наведені нижче (рис. 3-4). Чисельність гетеротрофів на бетоні перевищувала таку на камені майже в 20 разів. Кількісні значення нафтоокислюючих бактерій на бетоні були вищі в 3,5 р.

Бетонні кубики, використовувані в експерименті, відрізняються від уламків каменів більш пористою структурою. Завдяки цьому на них відбувалося більш активне осідання бактерій, що підтверджують отримані результати.

ЯКІСНА ХАРАКТЕРИСТИКА МОРСЬКИХ БАКТЕРІЙ, ВИДІЛЕНИХ З ПЕРИФІТОНУ ТА МОРСЬКОЇ ВОДИ

Усього за час дослідження з перифітону систем гідробіологічного очищення, розташованих в акваторії Нафтогавані виділено 164 культури бактерій. Виділені мікроорганізми віднесені до 6 родів.

У цілому, за весь період досліджень із урахуванням змивів з обростань на обох системах переважали бактерії роду Vibrio - 36 %, 22 % виділених з перифітону культур віднесені до роду Marinococcus, а 19 % - до роду Pseudomonas, 16 % - Microbacterium, 5 % - Micrococcus і лише 2 % - Bacillus.

Визначено родову приналежність бактерій, виділених із води в центрі акваторії Нафтогавані. З води було виділено 9 культур гетеротрофних бактерій, які представлені тільки 4 родами. Переважали мікроорганізми роду Vibrio - 34 %, а інші бактерії віднесені до родів Microbacterium, Pseudomonas, Micrococcus, які представлені однаковими частками - 22 %.

Найбільша різноманітність родів відзначена в перифітоні систем гідробіологічного очищення. Такий же таксономічний склад спостерігали у змивах із СГО. Тут відбувався змив бактерій при транспортуванні. Проби води не відрізняються значною різноманітністю бактерій, що свідчить про те, що бактерії, в основному, концентруються на твердих субстратах і завислій речовині.

У лабораторному експерименті ми досліджували біохімічну активність всіх виділених бактеріальних культур (164 штамів) відносно таких забруднюючих речовин: сирої нафти, дизельного палива, флотського мазуту, а також фенолу - побічного продукту розпаду нафтопродуктів (рис. 5).

Найактивніший ріст бактерій спостерігали на мінеральному середовищі (С) із флотським мазутом - 99 % виділених культур. З дизельним паливом та сирою нафтою бактерії росли практично однаково. Рясний ріст відзначено в 35 і 37 % культур бактерій відповідно на сирій нафті та дизельному паливі, причому ріст бактеріальних культур з нафтою взагалі був відсутній в 7 % випадків, а з дизельним паливом - в 4 %. Результати нашого експерименту показали, що на мінеральному середовищі в присутності фенолу змогли жити й розвиватися тільки 58 % виділених бактерій.

Такі розходження активності бактерій з різними нафтопродуктами, імовірно, пов'язані з їхнім різним рівнем токсичності, який визначається кількісними розходженнями хімічного складу, зокрема вмістом летких ароматичних вуглеводнів та нафталінів (Hadson, 1977).

Крім нафтопродуктів, як єдине джерело вуглецю й енергії ми використали білок (пептон), жир і крохмаль - органічні речовини, часто присутні в морських акваторіях. Здатність мікроорганізмів рости на цих джерелах вуглецю демонструє табл. 1.

Таблиця 1

Ріст бактерій з різними джерелами вуглецю

	Рясний, %	Помірний, %	Слабкий, %	Немає росту, %
Жир	42	31	21	6
Крохмаль	29	36	24	11
Білок (пептон)	96	2	2	0

Результати вивчення фізіолого-біохімічних властивостей мікроорганізмів, виділених з перифітону систем гідробіологічного очищення та води в районі їхнього розміщення, свідчать про їх різнобічну біохімічну активність. Отримані результати дозволяють судити про те, що мікроорганізми перифітону здатні використовувати як єдине джерело вуглецю й енергії різні органічні речовини, у тому числі нафту та нафтопродукти. Крім того, відомо, що глибока деградація вуглеводнів відбувається лише в присутності достатньої кількості кисню. При його зниженій концентрації (нижче 1 мг/л) процес сповільнюється. Отже, саме в перифітоні, де вистачає кисню й відзначена яскраво виражена біохімічна активність бактерій, процеси деградації забруднюючих речовин повинні протікати найбільше активно.

МОРСЬКІ ДРІЖДЖІ, ВИДІЛЕНІ З ПЕРИФІТОНУ ТА МОРСЬКОЇ ВОДИ

Усього за період досліджень із перифітону систем гідробіологічного очищення, змивів із перифітону, морської води й дослідних зразків (бетон і мармуроподібний вапняк) удалося виділити 67 культур дріжджів. Майже половина культур була виділена в червні - вересні - 32 (48 %), коли температура води становила 20 - 25 С. Навіть без урахування змивів із перифітону більше половини культур дріжджів (37) виділено на системах гідробіологічного очищення; далі - на бетонних кубиках і каменях - 11 і 12 культур відповідно. Таким чином, близько 90 % всіх культур отримано на твердих субстратах.

За весь період досліджень на обох системах з урахуванням змивів із обростань домінував рід Candida - 81 %, 14 % виділених культур віднесені до роду Rhodotorula і тільки 5 % - Pichia.

У первинних обростаннях виділено 11 культур на бетонних кубиках і 12 культур на каменях, які віднесені до двох родів (Candida та Rhodotorula) і шести видів. На каменях переважним видом був Rhodotorula mucilaginosa - 67 % від числа виділених культур, а на бетоні домінував вид Candida krusei - 64 %.

Із води в грудні 2005 р. виділено лише 1 культуру дріжджів, яку віднесли до виду Pichia anomala.

Об'єднавши дані про видову приналежність дріжджів у всіх пробах, ми виявили, що найбільша зустрічальність відзначена у Candida lambica - 26 %. Далі йдуть Candida krusei - 24 % й Rhodotorula mucilaginosa - 22 %. На частку дріжджів, віднесених до Candida tropicalis припадає 9 %, C. intermedia - 7 %. Рідше зустрічалися Pichia anomala - 4 %, Candida boidinii - 3 %. Інші види - Candida parapsilosis, C. famata, C. guilliermondii var. membranaefaciens виявлялися в одиничних випадках, на частку кожного з них доводиться тільки по 1 %.

Представники роду Candida - C. krusei, C. tropicalis, C. lambica, C. parapsilosis, C. guilliermondii - зустрічаються в прісній і морській воді різних типів (Hagler, 1986). Їхня наявність указує на надходження у воду господарсько-побутових стоків. З виділених нами культур дріжджів раніше відмічені для Чорного моря тільки два види: Rhodotorula mucilaginosa й Candida famata, причому перший вид виділяли з морської води із глибини до 300 м, а другий - до 1500 м (Новожилова, 1979). Інші види відзначені для Чорного моря вперше.

Відомо, що дріжджі беруть активну участь у перетворенні органічних речовин у водоймах, використовуючи не тільки прості вуглеводи, а й більш складні органічні речовини. Ураховуючи специфіку досліджуваної акваторії, ми вивчили здатність дріжджів, всіх 67 виділених культур, використовувати нафтопродукти як єдине джерело вуглецю й енергії (рис. 6).

Як видно із представлених на рис. 6 даних, найбільш активний ріст спостерігався в 46 % культур дріжджів на фенолі, 36 % на флотському мазуті й сирій нафті і тільки 26 % на дизельному паливі. Однак, слід зазначити, що 5 % культур дріжджів не змогли розвиватися при наявності фенолу.

Порівнюючи наведені дані, можна відзначити, що дріжджі, виділені з перифітону систем гідробіологічного очищення, як і бактерії з того ж джерела, здатні використовувати нафту й нафтопродукти як єдине джерело вуглецю й енергії. Однак, якщо бактерії давали рясний ріст на флотському мазуті й дизельному паливі, то дріжджі більш активно росли на сирій нафті та фенолі.

Здатність дріжджів, так само як і бактерій, до росту на нафтопродуктах указує на можливість розщеплення останніх у природних умовах у водоймі. Отже, при оцінці очищення води від нафтових забруднень у складі мікробоценозів морських водойм необхідно враховувати й дріжджі.

У своїх експериментах, крім нафтопродуктів, як єдине джерело вуглецю й енергії ми використовували також білок (пептон), жир і крохмаль - органічні речовини, які часто присутні в морській воді (табл. 2).

Таблиця 2

Ріст дріжджів з різними джерелами вуглецю

	Рясний, %	Помірний, %	Слабкий, %	Немає росту, %
Жир	54	30	13	3
Крохмаль	31	61	5	3
Білок (пептон)	75	22	3	0

Всі виділені культури мікроорганізмів активно росли на білку (пептоні), хоча у дріжджів спостерігали активний ріст тільки в 75 % випадків, а у бактерій, як було показано раніше - в 96 %. Розглядаючи біохімічну активність мікроорганізмів відносно жиру й крохмалю, слід зазначити, що дріжджі, на відміну від бактерій, у ряді випадків краще росли на цих джерелах вуглецю.

Отже, дріжджі, маючи високу біохімічну активність, беруть участь у трансформації забруднюючих речовин у системах гідробіологічного очищення.

РОСТОВІ ХАРАКТЕРИСТИКИ ДЕЯКИХ КУЛЬТУР МІКРООРГАНІЗМІВ (БАКТЕРІЇ, ДРІЖДЖІ)

Перевага в угрупованні мікроорганізмів різних систематичних груп деякою мірою залежить від швидкості їхнього росту (Одум, 1986).

Для дослідження процесу росту бактерій і дріжджів перифітону нами був використаний автоматичний аналізатор «Біоскрин-С» з програмою BIORTN. Він дозволяє більш детально вивчати особливості фізіології мікроорганізмів, зокрема, характер росту культур певних груп мікроорганізмів.

Для кожної культури визначали:

1. Відносну максимальну щільність (біомасу) культури (Вмах. від., %)

2. Відносний приріст (ДВмах. від, %)

3. Середню швидкість приросту (Vср = ДВмах. від /Дt)

Був досліджений ріст виділених бактеріальних і дріжджових культур на пептоні й СДБ, селективному середовищі для дріжджів, причому культури бактерій росли тільки на пептоні, а дріжджі як на пептоні, так і на СДБ. Експеримент тривав 75 годин.

В експерименті брали участь 4 культури, дві бактеріальні й дві дріжджові:

№ 101 (Vibrio) зі змивів з обростань СГО-2;

№ 104 (Vibrio) з того ж джерела, що й № 101;

№ 1 (Candida) з обростань СГО-2;

№ 5 (Candida) з того ж джерела, що й № 1;

Для експерименту нами обрані культури з бактерій - Vibrio, а із дріжджів - Candida, які виявилися представниками домінуючих родів у мікроперифітоні систем гідробіологічного очищення.

Результати представлені на рис. 7. Вони показали, що інтенсивність росту дріжджів на СДБ була в 2 - 3 рази вища, ніж на пептоні. Відносний приріст біомаси, як бактерій, так і дріжджів на пептоні незначно відрізнявся, а приріст біомаси дріжджових культур на СДБ був вищим на 20 %.

Таким чином, результати дослідження показали, що дріжджі в декілька разів активніше ростуть на спеціальному середовищі (СДБ), при цьому немає суттєвих розходжень між ростом бактерій і дріжджів, коли ці мікроорганізми ростуть на пептонной воді.

Отримані результати співпадають з даними, наведеними в літературі. Додання до поживного середовища речовин, що містять комплекс вітамінів, амінокислот або цукрів, як у нашому випадку, приводить до помітного стимулювання росту дріжджів.

З метою оцінити стійкість дріжджів у перифітоному угрупованні в умовах аварійних розливів нафтопродуктів деякі культури дріжджів, виділені з різних субстратів, перевірялися на можливість їхнього росту в присутності високих концентрацій дизельного палива. Для цього були використані культури родів Candida й Rhodotorula.

Експериментальні дані показали, що нафтопродукти (дизельне паливо) у високих концентраціях на дріжджі роду Rhodotorula діють як пригнічуючий фактор. Однак деякі представники роду Candida можуть жити та розвиватися в присутності нафтопродуктів.

ВИСНОВКИ

1. Уперше отримані систематичні дані про чисельність, особливості розподілу, таксономічний склад та біохімічні особливості мікроорганізмів перифітону на різних варіантах систем гідробіологічного очищення морської води й оздоровлення прибережних акваторій.

2. Загальна кількість гетеротрофних бактерій у перифітоні коливалась від 104 до 107 кл./г. Чисельність ліполітичних - 10 - 106 кл./г, амілолітичних - 10 - 105 кл./г і фенолокислюючих бактерій -102 - 104 кл./г.

3. Близькі значення чисельності спостерігали у морській воді, у якій доставлялися проби обростань: загальна кількість гетеротрофів 103-106 кл./мл, чисельність ліполітичних, амілолітичних бактерій становила 10-105 кл./мл, а нафтоокислюючих і фенолокислюючих бактерій коливалася від 10 до 104 кл./мл, що пояснюється змивом з перифітону. Подібні явища можуть відбуватися у морі при гідродинамічному впливі.

4. Чисельність гетеротрофних бактерій в акваторії, де розміщалися гідробіологічні системи, нижча ніж у перифітоні на 4 - 5 порядків, що відображає закономірності поширення бактерій у морі.

5. Чисельність гетеротрофів у змивах із бетонних кубиків варіювала від 102 до 106 кл./мл, а в змивах з мармуроподібного вапняку - від 103 до 104 кл./мл. Відзначено, що на пористому субстраті (бетон), загальна чисельність гетеротрофів вища у 20 разів, ніж на гладкому субстраті (камінь).

6. Із перифітону та змивів із перифітону виділено 155 культур бактерій. Переважали бактерії роду Vibrio - 36 %, 22 % культур віднесені до роду Marinococcus, а 19 % - до роду Pseudomonas, 16 % - Microbacterium, 5 % - Micrococcus і тільки 2 % - Bacillus. Із морської води виділено 9 культур бактерій, які представлені тільки 4 родами. Переважали мікроорганізми роду Vibrio - 34 %, а інші бактерії віднесені до родів Microbacterium, Pseudomonas, Micrococcus, які представлені в рівних частках - 22 %. Це свідчить про подібність родової структури бактерій у морській акваторії та перифітоні.

7. Виділені культури бактерій були здатні використовувати вуглеводні нафти, а також білки, жири й вуглеводи як єдине джерело вуглецю та енергії. На сирій нафті росло 93 % штамів, на дизельному паливі - 96 %, на флотському мазуті - 99 %, на фенолі - 58 %. Всі виділені культури бактерій могли використовувати білок, жир - 94 % штамів, крохмаль - 89 %.

8. Уперше виділені дріжджі (66 культур) із перифітону систем гідробіологічного очищення, які віднесені до 3 родів і 10 видів. Найбільшу зустрічальність відзначено у представників видів Candida lambica (Pichia fermentans) - 26 %, Candida krusei (Issatchenkia orientalis) - 24 % й Rhodotorula mucilaginosa - 22 %, 9 % віднесені до Candida tropicalis, 7 % - Candida intermedia, по 3 % припадає на види Candida boidinii й Pichia anomala, по 2 % - Candida famata (Debaryomyces hansenii), Candida parapsilosis й Candida guilliermondii var. membranaefaciens.

9. Експериментально показано, що нафтопродукти (дизельне паливо) у високих концентраціях на дріжджі роду Rhodotorula діють як пригнічуючий фактор, однак представники роду Candida можуть жити та розвиватися у присутності нафтопродуктів.

10. Виділені культури дріжджів, маючи високу біохімічну активність, активно росли на пептоні - 100 %, використовували крохмаль і жир - 97 %. Більшість дріжджових культур могли використовувати нафту або нафтопродукти як єдине джерело вуглецю й енергії. Істотний ріст спостерігався у 99 % культур дріжджів на сирій нафті та флотському мазуті, 97 % на дизельному паливі й 95 % на фенолі.

11. Отримані дані про біохімічні особливості дріжджів свідчать про участь цієї групи мікроорганізмів у процесах самоочищення морського середовища. Це дає підставу рекомендувати під час екологічного моніторингу вести облік в угрупованні мікроорганізмів не тільки бактерій, а й морських дріжджів.

СПИСОК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Дорошенко Ю. В. Изучение микрофлоры в системах гидробиологической очистки / Ю. В. Дорошенко // «Pontus Euxinus-2005»: IV всеукр. науч.-практ. конф., 24 - 27 мая 2005 г.: тезисы докл. - Севастополь, 2005. - С. 48-49.

2. Дорошенко Ю. В. Системы гидробиологической очистки как способ повышения качества природных вод / Ю. В. Дорошенко // Проблемы природопользования, устойчивого развития и техногенной безопасности регионов: III междунар. науч.-практ. конф., 3 - 8 октября 2005 г.: тезисы докл. - Днепропетровск, 2005. - Т. 2. - С. 141-142.

3. Дорошенко Ю. В. Микрофлора нефтегавани Севастопольской бухты (Черное море) / Ю. В. Дорошенко // Морск. экол. журн. - 2005. - Отд. Вып. №1. - С. 33-37.

4. Дорошенко Ю. В. Морские дрожжи как компонент систем гидробиологической очистки морской среды / Ю. В. Дорошенко // Фундаментальные исследования важнейших проблем естественных наук на основе интеграционных процессов в образовании и науке: междунар. науч. конф.: тезисы докл. - Севастополь, 2006. - С. 125-126.

5. Дорошенко Ю. В. Морські дріжджі Нафтогавані Севастопольської бухти (Чорне море) / Ю. В. Дорошенко // Молодь та поступ біології: III між нар. наук. конф. студентів та аспірантів: збірник тез. - Львів, 2007. - С. 345-346.

6. Миронов О. Г. Нефтеокисляющие дрожжи перифитона систем гидробиологической очистки морских вод / О. Г. Миронов, Ю. В. Дорошенко // Морск. экол. журн. - 2007. - Т. 6, № 2.- С. 58-62. (Вклад автора - проведение исследований, обработка проб и анализ результатов, совместное написание текста статьи).

7. Дорошенко Ю. В. Микрофлора акватории в районе размещения систем гидробиологической очистки морских вод / Ю. В. Дорошенко // Экология моря. - 2007. - Вып. 73. - С. 36-43.

8. Дорошенко Ю. В. Микроорганизмы перифитона и их роль в улучшении качества морских вод / Ю. В. Дорошенко // Современные проблемы рационального природопользования в прибрежных морских акваториях Украины: междунар. конф. молодых ученых, 12 - 14 июня 2007 г.: тезисы докл. - Севастополь - Кацивели: НПЦ «ЭКОСИ-Гидрофизика», 2007. - С. 96-97.

9. Doroshenko J. Number and biochemical peculiarities of bacteria of periphyton and marine water in Oil Harbour (Sevastopol Bay) / J. Doroshenko // “Biodiversity. Ecology. Adaptation. Evolution.”: III International Young Scientists: мaterials of сonference. - Odesa, 2007. - Р. 243-244.

10. Дорошенко Ю. В. Исследование ростовых характеристик бактериальных и дрожжевых культур перифитона систем гидробиологической очистки морских вод / Ю. В. Дорошенко // Экология моря, 2008. - Вып. 76. - С. 49-53.

11. Дорошенко Ю. В. Гетеротрофные микроорганизмы перифитона и их роль в преобразовании загрязняющих веществ / Ю. В. Дорошенко // Перифитон и обрастание: теория и практика: междунар. науч.-практ. конф., 22 - 25 октября, 2008 г.: тезисы докл. - СПб, 2008. - С. 234-235.

АННОТАЦИЯ

Дорошенко Ю.В. - Микрофлора систем гидробиологической очистки морских вод. - Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.17 - гидробиология. - Институт биологии южных морей НАН Украины, Севастополь, 2009.

Исследованы микроорганизмы (бактерии, дрожжи) перифитона систем гидробиологической очистки морских вод, расположенных в Нефтегавани Севастопольской бухты (Чёрное море).

Установлено, что общее количество гетеротрофных бактерий в перифитоне колебалось от 104 до 107 кл./г. Численность липолитических - 10 - 106 кл./г, амилолитических - 10 - 105 кл./г и фенолокисляющих бактерий -102 - 104 кл./г. Численность гетеротрофных бактерий в акватории, где размещались гидробиологические системы ниже, чем в перифитоне на 4-5 порядков, что отражает закономерности распространения бактерий в море.

Из перифитона и смывов с перифитона выделено 155 культур бактерий. Преобладали бактерии рода Vibrio - 36 %, 22 % культур отнесены к роду Marinococcus, а 19 % - к роду Pseudomonas, 16 % - Microbacterium. Исследована биохимическая активность всех выделенных бактериальных культур по отношению к следующим загрязняющим веществам: сырой нефти, дизельному топливу, флотскому мазуту, а также фенолу. Наиболее активный рост бактерий наблюдали на минеральной среде (Д-В) с флотским мазутом - 99 % выделенных культур. С дизельным топливом и сырой нефтью бактерии росли практически одинаково. Обильный рост отмечен у 35 и 37 % культур бактерий соответственно на сырой нефти и дизельном топливе, причём рост бактериальных культур с нефтью вообще отсутствовал в 7 % случаев, а с дизельным топливом - в 4 %. Результаты нашего эксперимента показали, что на минеральной среде в присутствии фенола смогли жить и развиваться только 58 % выделенных бактерий.

Впервые выделены дрожжи (66 культур) из перифитона систем гидробиологической очистки, которые отнесены к 3 родам и 10 видам. Наибольшая встречаемость отмечена у представителей видов Candida lambica - 26 %, Candida krusei - 24 % и Rhodotorula mucilaginosa - 22 %. Дрожжи, выделенные из перифитона систем гидробиологической очистки, как и бактерии из того же источника, способны использовать нефть и нефтепродукты в качестве единственного источника углерода и энергии. Однако, если бактерии давали обильный рост на флотском мазуте и дизельном топливе, то дрожжи более активно росли на сырой нефти и феноле. Способность дрожжей, равно как и бактерий, к росту на нефтепродуктах указывает на возможность расщепления последних в природных условиях в водоёме. Следовательно, при оценке очистки воды от нефтяных загрязнений в составе микробоценозов морских водоёмов необходимо учитывать и дрожжи.

Экспериментально показано, что нефтепродукты (дизельное топливо) в высоких концентрациях на дрожжи рода Rhodotorula действует как ингибирующий фактор, однако представители рода Candida могут жить и развиваться в присутствии нефтепродуктов.

Ключевые слова: бактерии, дрожжи, перифитон, системы гидробиологической очистки, Чёрное море.

АНОТАЦІЯ

Дорошенко Ю.В. - Мікрофлора систем гідробіологічного очищення морських вод. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.17 - гідробіологія. - Інститут біології південних морів НАН України, Севастополь, 2009.

Досліджені мікроорганізми (бактерії, дріжджі) перифітону систем гідробіологічного очищення морських вод, розташованих у Нафтогавані Севастопольської бухти (Чорне море).

Встановлено, що загальна кількість гетеротрофних бактерій у перифітоні коливалася від 104 до 107 кл./г. Чисельність ліполітичних бактерій - 10 - 106 кл./г, амілолітичних - 10 - 105 кл./г і фенолокислюючих - 102 - 104 кл./г. Чисельність гетеротрофних бактерій в акваторії, де розміщалися гідробіологічні системи, нижча ніж у перифітоні на 4-5 порядків, що відображає закономірності поширення бактерій у морі.

Із перифітону та змивів із перифітону виділено 155 культур бактерій. Переважали бактерії роду Vibrio - 36 %, 22 % культур віднесені до роду Marinococcus, а 19 % - до роду Pseudomonas, 16 % - Microbacterium.

Уперше виділені дріжджі (66 культур) із перифітону систем гідробіологічного очищення, які віднесені до 3 родів і 10 видів. Найбільшу зустрічальність відзначено у представників видів Candida lambica - 26 %, Candida krusei - 24 % і Rhodotorula mucilaginosa - 22 %.

Досліджена біохімічна активність всіх виділених бактеріальних та дріжджівих культур відносно таких забруднюючих речовин: сирої нафти, дизельного палива, флотського мазуту, а також фенолу. Порівнюючи отримані дані, можна відзначити, що дріжджі, виділені з перифітону систем гідробіологічного очищення, як і бактерії з того ж джерела, здатні використовувати нафту й нафтопродукти як єдине джерело вуглецю й енергії. Однак, якщо бактерії давали рясний ріст на флотському мазуті й дизельному паливі, то дріжджі більш активно росли на сирій нафті та фенолі.

Експериментально показано, що нафтопродукти (дизельне паливо) у високих концентраціях на дріжджі роду Rhodotorula діють як інгібуючий фактор, однак представники роду Candida можуть жити й розвиватися в присутності нафтопродуктів.

Ключові слова: бактерії, дріжджі, перифітон, системи гідробіологічного очищення, Чорне море.

SUMMARY

Doroshenko J. V. Microflora of the systems of the hydrobiological cleaning of marine waters. - Manuscript.

Thesis for scientific degree of candidate of biological sciences by specialty 03.00.17 - hydrobiology. - Institute of Biology of the Southern Seas, National Academy of Sciences of Ukraine, Sevastopol, 2009.

The role and functions of periphyton microorganisms of technical construction - hydrobiological system for cleaning of polluted waters placed in Oil Harbour (Sevastopol Bay, Black sea) are studied.

It's shown that total quantity of heterotrophic bacteria in periphyton changes from 104 to 107 cell/g. The quantity of other groups varies from 10 to 106 cell/g. The quantity of heterotrophic bacteria in area of hydrobiological system placing is decreased by 4 - 5 orders as compared with periphyton`s quantity. This fact has reflected the law of bacteria expansion in sea water.

From peryfiton 155 cultures of bacteria are selected. From those cultures prevailed the bacteria Vibrio - 36 %, 22 % cultures Marinococcus, and 19 % - Pseudomonas, 16 % - Microbacterium.

Yeasts (66 cultures) from the periphyton systems of the hydrobiological cleaning are first selected. The dominant representatives species composition were determined according to modern nomenclature: Candida lambica - 26 %, Candida krusei - 24 % and Rhodotorula mucilaginosa - 22%.

The sea yeasts ability to grow on media with high concentrations of the diesel fuel was evaluated.

Keywords: periphyton, bacteria, yeasts, the systems of hydrobiological cleaning, Black sea.

Размещено на Allbest.ru

...