Гетерогенність за факторами патогенності та антибіотикочутливістю мікроорганізмів роду Enterococcus, вилучених з різних екотопів
Видова ідентифікація мікроорганізмів роду Enterococcus, вилучених із різних екотопів. Рівень активності факторів патогенності у мікроорганізмів роду Enterococcus. Фенотипові і генетичні властивості мікроорганізмів. Вивчення патогенного потенціалу.
| Рубрика | Биология и естествознание |
| Вид | автореферат |
| Язык | украинский |
| Дата добавления | 26.08.2015 |
| Размер файла | 3,9 M |
Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже
Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.
Размещено на http://www.allbest.ru/
ДЕРЖАВНА УСТАНОВА
«ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ ТА ІМУНОЛОГІЇ ІМ. І. І. МЕЧНИКОВА
АКАДЕМІЇ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ»
ГЕТЕРОГЕННІСТЬ за факторами патогенності ТА АНТИБІОТИКОЧУТЛИВІСТЮ МІКРООРГАНІЗМІВ РОДУ ENTEROCOCCUS, ВИЛУЧЕНИХ З РІЗНИХ ЕКОТОПІВ
03.00.07 - мікробіологія
АВТОРЕФЕРАТ
дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук
ПЕРЕТЯТКО ОЛЕНА ГЕОРГІЇВНА
УДК 579.862:575.174.015.3:579.61:616-078(043.3)
Харків - 2009
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана в ДУ «Інститут мікробіології та імунології ім. І. І.Мечникова АМН України»
Науковий керівник: кандидат медичних наук, старший науковий співробітник Мироненко Людмила Григорівна, ДУ «Інститут мікробіології та імунології ім. І. І. Мечникова АМН України», завідувач філії музею мікроорганізмів
Офіційні опоненти: доктор медичних наук, професор
Бірюкова Світлана Василівна, Харківська медична академія післядипломної освіти МОЗ України, професор кафедри клінічної імунології та мікробіології
доктор медичних наук, професор Кременчуцький Геннадій Миколайович, Дніпропетровська державна медична академія МОЗ України, завідувач кафедри мікробіології, вірусології та імунології
Захист дисертації відбудеться « 24 » грудня 2009 р. о 11.00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.618.01 ДУ «Інститут мікробіології та імунології ім. І. І. Мечникова АМН України» (61057, м. Харків, вул. Пушкінська, 14-16).
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці ДУ «Інститут мікробіології та імунології ім. І. І. Мечникова АМН України» (61057, м. Харків, вул. Пушкінська, 14-16).
Автореферат розісланий « 20 » листопада 2009 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради Д 64.618.01
к.мед.н., с.н.с. С. В. Бруснік
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. В останні роки науковцями багатьох країн світу відмічено зростання ролі грампозитивної умовно патогенної мікрофлори, зокрема ентерококів, у виникненні нозокоміальних та гнійно-септичних інфекцій (Wisplinghoff H. et al., 2004; A. Garg et al., 2007; Козлов Р. С. и др., 2007). Пріоритетними дослідженнями доведено етіологічну роль у патології людини не тільки E. faecalis і E. faecium, але й інших видів, а саме: E. avium, E. casseliflavus, E. durans, E. gallinarum та ін. (Treitman N. et al., 2005; Stepanovic S. et al., 2004; Mohanty S. et al., 2006). На противагу даним зарубіжних дослідників, нами не знайдено повідомлень вітчизняних вчених про клінічну значущість ентерококів різних видів, за винятком E. faecalis і E. faecium, що пов'язано з недосконалістю існуючих методів їх виділення та ідентифікації. Вищезазначене свідчить про необхідність розширення вимог до проведення лабораторної діагностики мікроорганізмів роду Enterococcus та доцільність розробки нових методичних рекомендацій щодо їх виділення та ідентифікації.
Популяційний рівень ентерококів у товстому кишечнику людини як представників факультативної нормофлори, як правило, складає 106-108 життєздатних клітин на один грам фекалій, тому обґрунтування їх етіологічної ролі при патологічних станах шлунково-кишкового тракту, у тому числі й при гострих кишкових інфекціях (ГКІ), навіть при виділенні цих мікроорганізмів у високій концентрації, є складним завданням. Крім цього, дані про етіопатогенетичну значущість ентерококів у патології людини вкрай обмежені та іноді суперечні, як у цілому при гнійно-септичних інфекціях, так і при раневих інфекціях шкіри та м'яких тканин (пролежні та діабетичні виразки) зокрема. Важливим напрямком досліджень у цій сфері є вивчення факторів патогенності (ФП) у ентерококів та оцінка впливу ФП на розвиток патологічного процесу. Незважаючи на досить чисельну кількість публікацій щодо етіологічної ролі ентерококів, патогенний потенціал цих мікроорганізмів вивчено недостатньо. Існує думка, що наявність у ентерококів комплексу факторів патогенності забезпечує можливість їх транслокації з місць природного перебування в інші органи і тканини, з подальшою ініціацією запального процесу і підтриманням його протягом тривалого часу (Бухарин О. В. и др., 2002; Янковский Д. С. и др., 2005). Відомо, що біологічна різноманітність є однією з фундаментальних характеристик популяцій умовно патогенних мікроорганізмів, життєвий цикл яких пов'язаний з міграційними процесами і періодичною зміною екологічних ніш (Бухарин О. В. и др., 1997). Однак залишається не з'ясованим питання, чи супроводжується освоювання ентерококами колонізуємого екотопу модифікацією комплексу фенотипових характеристик і яким чином впливають на їх формування специфічні умови еконіш.
Значущість мікроорганізмів роду Enterococcus як етіопатогенів визначається також їх природною резистентністю до багатьох антибактеріальних препаратів та набутою до препаратів, які найбільш часто призначаються в клініці (Сидоренко С. В., 2004). Виявлені дані про резистентність ентерококів до антибіотиків в Україні є неповними, обмежені за кількістю та не містять наукових узагальнень для практичного застосування. Однією з основних проблем світової медицини лікування нозокоміальних інфекцій є розповсюдження ванкоміцинрезистентних ентерококів (Murray B. E., 2000; Deshpande L. M., 2007). У літературі знайдено лише поодинокі повідомлення, які свідчать про появу їх в Україні. Тому вивчення внутрішньовидової та внутрішньоштамової гетерогенності за ознакою резистентності до ванкоміцину, проведене на фенотиповому і генетичному рівні, буде мати не тільки теоретичне, а й практичне значення. Дані стосовно внутрішньоштамової гетерогенності за ознакою резистентності до ванкоміцину в ентерококів у науковій літературі відсутні.
Усе вищезазначене свідчить про актуальність досліджень, спрямованих на вивчення комплексу біологічних властивостей мікроорганізмів роду Enterococcus, їх патогенного потенціалу та чутливості до антибіотиків.
Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Роботу виконано в рамках планових НДР філії музею мікроорганізмів ДУ “Інститут мікробіології та імунології ім. І. І. Мечникова АМН України” за темами: НН/3 - 2007; НН/1 - 2008; НН/1 - 2009: “Підтримка та розвиток Музею-Депозитарію патогенних для людини мікроорганізмів”. У рамках вказаних наукових робіт здобувач провів мікробіологічні дослідження клінічного матеріалу, вивчив біологічні властивості ізолятів, визначив перспективність досліджень вилучених штамів та створив колекцію мікроорганізмів роду Enterococcus.
Тему дисертаційної роботи затверджено на засіданні вченої ради Інституту мікробіології та імунології ім. І. І. Мечникова АМН України (протокол № 3 від 17 березня 2006 року).
Мета й завдання дослідження. Мета роботи - комплексна оцінка рівня фенотипового поліморфізму за антибіотикочутливістю і факторами патогенності, з встановленням спрямованості адаптаційних зсувів у мікроорганізмів роду Enterococcus, вилучених із різних екотопів, та удосконалення мікробіологічної діагностики ентерококових інфекцій.
Для досягнення поставленої мети сформульовано такі завдання:
1. Провести видову ідентифікацію мікроорганізмів роду Enterococcus, вилучених із різних екотопів, та розробити додаткові критерії щодо її удосконалення.
2. Охарактеризувати за чутливістю до антимікробних препаратів представників роду Enterococcus та встановити розповсюдженість полірезистентних штамів.
3. Визначити штамову та внутрішньоштамову гетерогенність мікроорганізмів роду Enterococcus за чутливістю до ванкоміцину на фенотиповому та генетичному рівні.
4. Вивчити наявність і рівень активності факторів патогенності у мікроорганізмів роду Enterococcus.
5. Провести порівняльний аналіз біопрофілей мікроорганізмів роду Enterococcus у залежності від екотопу.
6. Створити авторську колекцію культур ентерококів.
Об'єкт дослідження: штами ентерококів, вилучені з різних екотопів: з товстого кишечника здорових дітей; з товстого кишечника дітей, хворих на ГКІ; з виділень трофічних виразок і кишечника хворих на цукровий діабет з синдромом “діабетична стопа”; з об'єктів оточуючого середовища стаціонарного відділення “Центру діабетичної стопи”.
Предмет дослідження: біологічні властивості мікроорганізмів роду Enterococcus: морфологічні, тинкторіальні, культуральні характеристики, біохімічна активність, чутливість до антимікробних препаратів, продукція ферментів.
Методи дослідження: мікробіологічні, біохімічні, молекулярно-генетичні, математико-статистичні.
Наукова новизна одержаних результатів. На підставі комплексного дослідження факторів патогенності уперше проаналізовано рівень фенотипового поліморфізму мікроорганізмів роду Enterococcus, вилучених з різних екотопів. Встановлено закономірності адаптаційних зсувів у напрямку посилення патогенного потенціалу ентерококів, вилучених з “маргінальних” еконіш, що характеризуються наявністю гнійно-запального процесу.
Уперше доведено наявність у мікроорганізмів роду Enterococcus таких факторів патогенності, як казеїназна, фосфатазна, РНК-азна активності та відсутність здатності в ентерококів продукувати еластазу, лецитиназу, плазмокоагулазу.
Уперше визначено внутрішньоштамову гетерогенність ентерококів за ознакою ванкоміцинрезистентності на фенотиповому і генетичному рівні. Доведено наявність неекспресуючого гену ванкоміцинрезистентності (VanА) у помірно чутливих і чутливих штамів ентерококів. Підтверджено наявність на території України ванкоміцинрезистентних штамів ентерококів.
Уперше на території України визначено протиентерококову активність антибактеріальних препаратів “Тейкопланін” і “Лінезолід”.
Розширено знання про фенотипові і генетичні властивості мікроорганізмів роду Enterococcus.
Практичне значення одержаних результатів. Удосконалено методи виділення та схеми ідентифікації клінічно значущих видів мікроорганізмів роду Enterococcus. Розроблено методичні рекомендації: Методи виділення та ідентифікації ентерококів. - 2009. Видано інформаційний лист про нововведення в системі охорони здоров'я: Стандартизація приготування мікробних суспензій. - 2006. Методичні рекомендації та інформаційний лист впроваджено в практику роботи бактеріологічних лабораторій санітарно-епідеміологічних станцій та бактеріологічних відділів клініко-діагностичних лабораторій лікувально-профілактичних закладів.
Встановлено високу чутливість клінічних штамів ентерококів до тейкопланіну і лінезоліду, що обґрунтовує їх важливе практичне значення як препаратів резерву для лікування ентерококових інфекцій, обумовлених полірезистентними штамами. Обґрунтовано доцільність періодичного мікробіологічного моніторингу в лікувальних закладах для своєчасного усвідомлення зміни антибіотикочутливості ентерококів і внесення коректив в етіотропну терапію захворювань, спричинених ними.
Створено авторську колекцію, яка налічує 29 штамів мікроорганізмів роду Enterococcus, і поповнено ними фонди філії музею мікроорганізмів ДУ “Інститут мікробіології та імунології ім. І. І. Мечникова АМН України”.
Особистий внесок здобувача. Особисто здобувачем проведено виділення, ідентифікація, вивчення патогенного потенціалу (адгезивна, казеїназна, желатиназна, еластазна, фібринолітична, плазмокоагулазна, лецитиназна, гіалуронідазна, фосфатазна, ліпазна, РНК-азна, антилізоцимна, антикомплементарна, гемолітична активності) та визначення чутливості до антибіотиків представників роду Enterococcus, вилучених із різних екотопів. Автор визначив оптимальне середовище для культивування ентерококів. Приймав участь у розробці шкали відповідності показників мутності мікробних суспензій в одиницях за шкалою McFarland до концентрації мікробних клітин. Особисто визначив кількісний вміст ентерококів у різних за оптичною щільністю суспензіях, що увійшло до інформаційного листа: Стандартизація приготування мікробних суспензій. - 2006. Здобувач приймав участь у розробці скороченої схеми ідентифікації клінічно значущих ентерококів, яка увійшла до методичних рекомендацій: Методи виділення та ідентифікації ентерококів. - 2009. Особисто проведено статистичну обробку отриманих у ході досліджень результатів.
Автор висловлює щиру подяку лікарям “Центру діабетичної стопи” міської клінічної лікарні № 2 м. Харкова за надання клінічного матеріалу для досліджень; співробітникам кафедри дитячих інфекцій Одеського державного медичного університету за допомогу в проведенні молекулярно-генетичних досліджень ванкоміцинрезистентності ентерококів.
Апробація результатів дисертації. Основні наукові положення дисертації доповідались та обговорювались на Міжнародній науково-практичній конференції “Пошук та розробка нових протимікробних засобів, антисептиків, дезінфектантів та пробіотиків” (Харків, 20 - 21 листопада 2006 р.); Всеукраїнській науково-практичній конференції “Вклад молодих вчених в розвиток медичної науки і практики” (Харків, 12 квітня 2006 р.); Міжнародній міждисциплінарній науково-практичній конференції “Сучасні проблеми науки та освіти” (Сімеїз, 25 червня - 2 липня 2006 р.); Науково-практичній конференції молодих вчених “Медична наука: сучасні досягнення та інновації” (Харків, 22 листопада 2007 р.); Міжнародній науково-практичній конференції “Актуальні питання стратегії, тактики застосування та дослідження антибіотиків, антисептиків, дезінфектантів” (Вінниця, 9 - 10 жовтня 2008 р.); Науково-практичній конференції “Шпитальні інфекції: сучасний стан проблеми” (Харків, 11 - 12 грудня 2008 р.); Конгресі “Поєднані інфекційні та паразитарні хвороби” (Тернопіль, 8 - 9 жовтня 2009 р.).
Публікації. За темою дисертації опубліковано 16 наукових праць (4-одноосібно), у тому числі 6 статей у фахових виданнях, рекомендованих ВАК України, 1 методичні рекомендації, 1 інформаційний лист про нововведення в системі охорони здоров'я та 7 тез у матеріалах наукових конференцій.
Структура та обсяг дисертації. Робота викладена на 205 сторінках комп'ютерного тексту, містить вступ, огляд літератури, розділ матеріалів і методів досліджень, 4 розділи власних досліджень, аналіз та узагальнення одержаних результатів, висновки, 2 додатки (9 с.) та список використаних джерел (32 с.), який містить 257 посилань (114 українською та російською мовами, 143 - іноземною). Роботу ілюстровано 23 таблицями (7 с.) та 16 рисунками.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ ДИСЕРТАЦІЇ
мікроорганізм екотоп патогенний enterococcus
Огляд літератури містить 3 підрозділи, у яких розглянуто роль ентерококів у виникненні внутрішньолікарняних та гнійно-септичних захворювань, охарактеризовано відомі у цих мікроорганізмів фактори патогенності та чутливість до антибактеріальних препаратів.
Матеріали і методи досліджень. Обстежено 47 дітей, із них 21 здорових і 26 хворих на ГКІ; 82 хворих з діагнозом цукровий діабет, синдром “діабетична стопа” та 318 об'єктів оточуючого середовища стаціонарного відділення “Центру діабетичної стопи” міської лікарні № 2 м. Харкова. Як матеріал для дослідження використовували випорожнення, вміст трофічних виразок вищезазначених пацієнтів та змиви з об'єктів оточуючого середовища стаціонару.
Мікробіологічні дослідження проводили згідно з Наказом № 535 від 22.04.1985 “Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений”, “Методическими рекомендациями по выделению и идентификации энтерококков” (Іваново, 1982), “Визначником бактерій Берджі” (1997). Кількість бактерій визначали шляхом підрахунку колонієутворюючих одиниць в 1 г матеріалу (lg КУО/г). Біохімічну ідентифікацію 119 культур ентерококів проводили за допомогою тест-системи EN-COCCUStest (Pliva-Lachema Diagnostika, Чехія).
Приготування мікробних суспензій із визначеною концентрацією мікробних клітин проводили за шкалою McFarland з використанням приладу Densi-La-Meter (PLIVA-Lachema Diagnostika, Чехія). Синхронізацію культур проводили одноразовою дією низької температури (Баснакьян І. А., 1992).
Чутливість 106 штамів ентерококів до антибактеріальних препаратів (пеніциліну, ампіциліну, амоксициліну, еритроміцину, кларитроміцину, азитроміцину, норфлоксацину, пефлоксацину, офлоксацину, ципрофлокса-цину, левофлоксацину, ломефлоксацину, тетрацикліну, доксицикліну, хлорамфеніколу, лінезоліду, тейкопланіну) визначали диско-дифузійним методом Keurby-Bayer. Чутливість ентерококів до ванкоміцину та високих доз аміноглікозидів - методом розведень в серцево-мозковому агарі. Дослідження проводили згідно з наказом № 167 МОЗ України від 05.04.2007 “Визначення чутливості мікроорганізмів до антибактеріальних препаратів”.
Визначення гену ванкоміцинрезистентності (VanA) 94 субклонів 12 штамів ентерококів проводили методом полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) на ампліфікаторі “Терцік” (“ДНК-технологія”, Росія) з використанням праймерів: прямий праймер - 5-AATGТGCGAAAAACCTTGT-3; зворотний праймер - 5-AACAACTAACGCGGGCACT-3.
Ферментативну активність 106 штамів ентерококів визначали за їх здатністю продукувати казеїназу, желатиназу, еластазу, фібринолізин, плазмокоагулазу, лецитиназу, фосфатазу, ліпазу, РНК-азу, гемолізини, за стандартними методиками (Герхардт Ф., 1984; Никитин В. М., 1986). Гіалуронідазну активність визначали за схемою McClean у модифікації Миронової Т. К. (1978).
Адгезивні властивості 106 штамів ентерококів визначали розгорнутим методом (Бриліс В. І. та ін., 1986). Антикомплементарну активність (АКА) визначали фотометричним методом (Брудастов Ю. А., 1992; Лабінська А. С., 2004). Антилізоцимну активність (АЛА) визначали прискореним методом (Соколов В. Ю., 1991).
Досліди проводили в трьох - чотирьох повторюваннях. Результати аналізували статистично (Ашмарин И. П., Воробьев А. А., 1962; Гельман В. Я., 2002; Лапач С. Н. та ін., 2000) за допомогою комп'ютерних програм Microsoft Excel.
Результати досліджень та їх аналіз. Результати власних досліджень викладено в третьому - шостому розділах.
У третьому розділі подано результати досліджень з виділення та ідентифікації мікроорганізмів роду Enterococcus, вилучених із різних екотопів. Для спрощення та уніфікації визначення видової належності клінічно значущих ентерококів нами запропонована укорочена схема (табл. 1).
Схема складається з мінімального набору тестів для ідентифікації, є зручною у використанні, надійною, ефективною, доступною за ціною. Неодноразові дослідження показали стовідсоткову відтворюваність тестів запропонованої нами схеми.
Під час проведення досліджень вилучено 119 штамів мікроорганізмів роду Enterococcus, з яких 25 - з товстого кишечника здорових дітей, 30 - з товстого кишечника дітей, хворих на гострі кишкові інфекції (ГКІ), 28 - із трофічних виразок хворих на цукровий діабет з синдромом “діабетична стопа”, 23 - з товстого кишечника цих же хворих, 13 - з об'єктів оточуючого середовища стаціонарного відділення “Центру діабетичної стопи”.
Встановлено відмінності за видовим складом мікробних популяцій ентерококів у залежності від екотопу (рис. 1).
З кишечника здорових дітей, при домінуванні видів E. faecalis - 10 (40,0±9,8) % і E. faecium - 8 (32,0±9,3) %, виділено інші види, а саме: E. avium - 1 (4,0±3,9) %, E. solitarius - 1 (4,0±3,9) %, E. mundtii - 1 (4,0±3,9) %, E. cecorum - 1 (4,0±3,9) %, E. spp. - 3 (12,0±6,5) % (рис. 1а).
Таблиця 1
Укорочена схема ідентифікації клінічно значущих ентерококів
|
ВИД |
РУХ |
ПГ |
АРГ |
АРА |
КСИ |
TEЛ |
ГEM |
|
|
E. faecalis |
- |
- |
+ |
- |
- |
+ |
+(в) |
|
|
E. faecium |
- |
- |
+ |
+ |
- |
- |
+(б) |
|
|
E. casseliflavus |
+ |
+ |
d |
+ |
+ |
+ |
+ |
|
|
E. mundtii |
- |
+ |
+ |
+ |
+ |
- |
- |
|
|
Е. raffinosus |
- |
- |
- |
+ |
- |
- |
- |
|
|
E. gallinarum |
+ |
- |
+ |
+ |
+ |
+ |
+(б,в) |
|
|
E. durans |
- |
- |
+ |
- |
- |
- |
+(б,в) |
Примітки: РУХ - рухливість; ПГ - пігмент; АРГ- аргінін; АРА - арабіноза; КСИ - ксилоза, TEЛ - телурит калію; ГEM - гемоліз; “+” - >90 % позитивних результатів на першу добу; “-” - <10 % негативних результатів на першу добу; “d” - ознака варіабельна - позитивний результат у 26-74 % штамів.
З кишечника дітей, хворих на ГКІ, при домінуванні видів E. faecalis - 1 (43,3±9,0) % і E. faecium - 10 (33,4±8,6) %, вилучено E. mundtii - 2 (6,7±4,5) %, E. cecorum - 1 (3,3±3,2) %, E. raffinosus - 1 (3,3±3,2) %, E. columbae - 1 (3,3±3,2) %, E. spp. - 2 (6,7±4,5) % (рис. 1б).
Видовий склад ентерококів, вилучених у хворих на цукровий діабет, відрізнявся від попередньо названих екотопів ще більшим представництвом E. faecalis. Так, з кишечника хворих на цукровий діабет вилучено E. faecalis - 16 (69,6±9,6) %, E. faecium - 4 (17,5±7,9) %, E. mundtii - 1 (4,3±4,2) %, E. durans - 1 (4,3±4,2) %, E. raffinosus - 1 (4,3±4,2) % (рис. 1в).
З виділень трофічних виразок хворих на цукровий діабет вилучено E. faecalis - 25 (89,3±5,8) %, E. faecium - 2 (7,1±4,8) %, E. mundtii - 1 (3,6±3,5) % (рис. 1г).
Вилучені з об'єктів оточуючого середовища стаціонару ізоляти ентерококів віднесено виключно до виду E. raffinosus.
У четвертому - п'ятому розділах подано результати вивчення чутливості ентерококів до антимікробних препаратів (табл. 2). Встановлено розбіжності в антибіотикочутливості штамів, вилучених із різних екотопів.
Частота розповсюдження ентерококів з високим рівнем резистентності до аміноглікозидів (HLAR) - гентаміцину і стрептоміцину - була вищою в 1,2 рази у штамів, вилучених від хворих на цукровий діабет, і складала (72,0±6,3) % (p<0,05). Також відмінністю цієї групи ентерококів є більш високий відсоток стійких до стрептоміцину, ніж до гентаміцину.
Аналіз результатів вивчення чутливості ентерококів щодо в-лактамів показав високу активність амоксициліну в усіх проаналізованих групах, кількість нечутливих штамів не перевищувала (5,7±2,2) %. Питома вага штамів, стійких до пеніциліну, в 1,9 рази була вищою серед ентерококів, вилучених від хворих на цукровий діабет (p<0,05). За частотою розповсюдження ампіцилінстійких ентерококів між групами, які аналізували, не було достовірних відмінностей (p>0,05).
На підставі комплексної оцінки чутливості до аміноглікозидів та бета-лактамів можна зробити висновок, що лікування за стандартною схемою: ампіцилін + гентаміцин, ампіцилін + стрептоміцин в (56,2±12,4) % та в (68,7±11,6) % випадків відповідно буде неефективним.
Встановлено невисокий рівень активності антибіотиків фторхінолонового ряду щодо ентерококів усіх проаналізованих груп. Найбільшу активність серед фторхінолонів проявляв пефлоксацин, питома вага нечутливих штамів складала (55,6±4,8) %, більшість з яких вилучено у хворих на цукровий діабет. Усі штами ентерококів, які вилучено у хворих на цукровий діабет, були нечутливими до ципрофлоксацину. У дітей, хворих на ГКІ, відсоток чутливих до цього антибіотику штамів складав (33,3±8,6) %, у здорових дітей - (46,7±7,2) %. До норфлоксацину питома вага чутливих штамів була вищою в 1,4 рази серед ентерококів, вилучених від хворих на цукровий діабет (p<0,05). Достовірної різниці в чутливості до офлоксацину, левофлоксацину та ломефлоксацину між штамами проаналізованих груп не виявлено (p>0,05).
Встановлено низьку протиентерококову активність тетрациклінів. Кількість штамів, нечутливих до тетрацикліну і доксицикліну, була вищою в 1,6 та 1,8 рази відповідно серед ентерококів, вилучених від хворих на цукровий діабет (p<0,05).
Виявлено помірну активність хлорамфеніколу, питома вага нечутливих культур складала (49,0±4,8) %. Кількість штамів стійких до цього антибіотику була вищою в 1,4 рази серед ентерококів, вилучених від хворих на цукровий діабет (p<0,05).
Усі взяті для досліду штами ентерококів були чутливими до лінезоліду.
А б
В г
д
Рис. 1. Розподіл за видовою належністю ентерококів, вилучених з кишечника здорових дітей (а); з кишечника дітей, хворих на ГКІ (б); з кишечника хворих на цукровий діабет (в); із виділень трофічних виразок хворих на цукровий діабет (г).
Встановлено високу протиентерококову активність глікопептидних антибіотиків (тейкопланін, ванкоміцин). Виявлено (8,5±2,7) % помірно стійких до ванкоміцину та (1,0±0,9) % стійких до тейкопланіну серед штамів, ізольованих від хворих на цукровий діабет.
Встановлено високу розповсюдженість поліантибіотикорезистентних штамів, від (48,0±9,9) % - серед вилучених з кишечника здорових дітей до (85,7±6,6) % - серед вилучених із виділень трофічних виразок при цукровому діабеті.
Дослідження з вивчення внутрішньоштамової гетерогенності за ознакою ванкоміцинрезистентності ентерококів на фенотиповому і генетичному рівні показали, що за типом експресії резистентності до ванкоміцину штами Enterococcus можуть бути гомо- або гетерогенними. Так, з двох ванкоміцинрезистентних E. faecium, які отримано з музею патогенних для людини мікроорганізмів ДУ “ІЕІХ ім. Л. В. Громашевського АМН України”, штам E. faecium 167 виявився гетерогенним за вивченою ознакою, штам E. faecium 113 - гомогенним (рис. 2).
Таблиця 2
Антибіотикорезистентність мікроорганізмів роду Enterococcus
(n=106)
|
Антибіотик |
Розподіл штамів за чутливістю |
||||||
|
Стійкі |
Помірно стійкі |
Чутливі |
|||||
|
абс. |
(M±m), % |
абс. |
(M±m), % |
абс. |
(M±m), % |
||
|
в-лактами |
|||||||
|
Пеніцилін |
69 |
65,1±4,7 |
0 |
0 |
37 |
34,9±4,7 |
|
|
Ампіцилін |
33 |
31,1±4,4 |
0 |
0 |
73 |
68,9±4,4 |
|
|
Амоксицилін |
4 |
3,8±1,8 |
2 |
1,9±1,3 |
100 |
94,3±2,2 |
|
|
Аміноглікозиди |
|||||||
|
Гентаміцин |
7 |
6,6±2,4 |
0 |
0 |
99 |
93,4±2,4 |
|
|
Стрептоміцин |
10 |
9,4±2,3 |
0 |
0 |
96 |
90,6±2,3 |
|
|
Амікацин |
103 |
97,1±1,6 |
0 |
0 |
3 |
2,9±1,6 |
|
|
Сизоміцин |
98 |
92,4±2,6 |
0 |
0 |
8 |
7,6±2,6 |
|
|
Неоміцин |
106 |
100,0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
|
|
Нетилміцин |
60 |
56,6±4,8 |
10 |
9,4±2,8 |
36 |
34,0±4,6 |
|
|
Макроліди |
|||||||
|
Еритроміцин |
58 |
54,7±4,8 |
37 |
34,9±4,6 |
11 |
10,4±2,9 |
|
|
Кларитроміцин |
38 |
35,8±4,6 |
38 |
35,8±4,6 |
30 |
28,4±4,4 |
|
|
Азитроміцин |
87 |
82,0±3,7 |
10 |
9,4±2,8 |
9 |
8,6±2,7 |
|
|
Тетрацикліни |
|||||||
|
Тетрациклін |
65 |
61,3±4,7 |
4 |
3,8±1,8 |
37 |
34,9±4,6 |
|
|
Доксициклін |
81 |
76,4±4,1 |
0 |
0 |
25 |
23,6±4,1 |
|
|
Нітробензоли |
|||||||
|
Хлорамфенікол |
38 |
35,8±4,6 |
14 |
13,2±3,3 |
54 |
51,0±4,8 |
|
|
Глікопептиди |
|||||||
|
Ванкоміцин |
0 |
0 |
9 |
8,5±2,7 |
97 |
91,5±2,7 |
|
|
Тейкопланін |
1 |
1,0±0,9 |
0 |
0 |
105 |
99,0±0,9 |
|
|
Фторхінолони |
|||||||
|
Ципрофлоксацин |
70 |
66,0±4,6 |
18 |
17,0±3,6 |
18 |
17,0±3,6 |
|
|
Норфлоксацин |
77 |
72,6±4,3 |
18 |
17,0±3,6 |
11 |
10,4±2,9 |
|
|
Офлоксацин |
70 |
66,0±4,6 |
19 |
17,9±3,7 |
17 |
16,1±3,6 |
|
|
Левофлоксацин |
60 |
56,6±4,8 |
17 |
16,0±3,5 |
29 |
27,4±4,3 |
|
|
Пефлоксацин |
52 |
49,0±4,8 |
7 |
6,6±2,4 |
47 |
44,4±4,8 |
|
|
Ломефлоксацин |
78 |
73,5±4,3 |
17 |
16,0±3,5 |
11 |
10,5±2,9 |
|
|
Оксазолідини |
|||||||
|
Лінезолід |
0 |
0 |
0 |
0 |
106 |
100,0 |
Привертають увагу дані, які отримано при вивчені штамів, чутливих до ванкоміцину. З восьми штамів шість були гомогенними за даним фенотипом, а у двох інших виявлено субклони з геном VanA. Враховуючи можливість мікроорганізмів роду Enterococcus до горизонтального переносу генів штами з неекспресуючим геном ванкоміцинрезистентності (в нашому дослідженні ген VanA) представляють потенційну загрозу для розповсюдження в популяції ентерококів резистентності до ванкоміцину.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
|
300пн 500пн 1000пн |
Рис. 2. Електрофореграма результатів ПЛР - детекції гену VanA у штамів ентерококів: 1 і 18 - маркер молекулярної маси ДНК; 2 - штам E. faecalis ATCC 29212; 3 - штам E. faecium 113; 4 - 17 - субклони штаму E. faecium 167.
У шостому розділі подано результати вивчення факторів патогенності ентерококів.
Як показали наші дослідження адгезивної активності ентерококів, штами, які вилучено з кишечника здорових дітей, характеризувались середньою (16,0±7,3) % та високою (84,0±7,3) % адгезивністю. Усі штами, ізольовані з кишечника хворих на ГКІ, були високоадгезивні. Показники індексу адгезивності мікроорганізмів (ІАМ) у цих штамів перевищували в 1,3 рази аналогічні показники штамів, вилучених від здорових дітей (p<0,001).
Встановлено, що всі штами, які вилучено з трофічних виразок, і більшість штамів (91,6±5,8) % з кишечника хворих на цукровий діабет характеризувались високою адгезивністю.
У штамів, вилучених з трофічних виразок, показники адгезії були достовірно вищими. Так, середнє значення ІАМ у штамів з трофічних виразок перевищувало аналогічний показник штамів, вилучених з кишечника, в 1,5 рази (p<0,001). При попарному порівнянні адгезивних властивостей штамів, вилучених у одного і того ж хворого, встановлено, що в 15 (62,5±9,8) % випадках ІАМ штамів, ізольованих з виразок, перевищував цей показник у штамів, вилучених з кишечника, у 1,5 рази, а в 3 (12,5±6,7) % випадках - більш ніж у 3,5 рази (p<0,01). Показники ІАМ достовірно не змінились у 6 (21,0±8,8) % випадках (p>0,05).
Аналіз результатів вивчення протеолітичної активності ентерококів показав, що желатиназу продукували (36,6±8,8) % штамів, вилучених з кишечника хворих на ГКІ. Частота виявлення даного ферменту у штамів, ізольованих від здорових дітей, була достовірно нижчою і дорівнювала (16,0±7,3) % (p<0,05). Казеїназна активність серед штамів, вилучених від хворих на ГКІ, зустрічалась в 2,2 рази частіше, ніж у групі здорового контингенту і складала відповідно (53,3±9,1) % і (24,0±8,5) % (p<0,05). Встановлено, що експресивність казеїназної активності була вищою у штамів, вилучених від хворих на ГКІ. Так, середній розмір зони казеїнолізу цих штамів в 1,2 рази перевищував розмір зони казеїнолізу штамів групи порівняння (p<0,05). Аналіз ступеня вираженості казеїнолізу в залежності від виду виявив його перевагу у E. faecalis в обох проаналізованих групах. Так, розмір зони казеїнолізу у штамів виду E. faecalis, вилучених від хворих на ГКІ, складав (16,6±0,9) мм, виду E. faecium - (13,4±1,1) мм (p<0,05).
Виявлено суттєві відмінності протеолітичної активності ентерококів, вилучених від хворих на цукровий діабет, у залежності від екотопу. У штамів, ізольованих із трофічних виразок, пенентрантність желатиназної активності була вищою у 2,2 рази і казеїназної - в 1,1 рази, ніж у кишкових штамів (р<0,001). Серед ентерококів, вилучених із трофічних виразок, (39,3±6,2) % штамів володіли як желатиназною, так і казеїнолітичною активністю. При попарному порівнянні протеолітичної активності ентерококів, які вилучено від одного і того ж хворого з трофічної виразки та кишечника, встановлено, що у (21,0±9,3) % випадків желатиназу і у (47,4±11,4) % випадків казеїназу продукували обидва штами. Проте у (26,3±10,1) % випадків наявність желатинази і у (21,0±9,3) % - казеїнази спостерігалась тільки у штамів, вилучених із трофічної виразки, що підтверджує думку деяких вчених про набуття мікроорганізмами факторів патогенності в процесі транслокації в інший біотоп. Рівень активності казеїнолізису у штамів, вилучених із трофічних виразок, був достовірно вищим, ніж у кишкових штамів (p<0,05).
Аналіз фібринолітичної активності показав наявність її у (43,3±9,0) % штамів ентерококів, вилучених від хворих на ГКІ, що в 1,8 рази перевищувало аналогічний показник штамів, ізольованих з кишечника здорових дітей (р<0,05). Серед штамів з фібринолітичним фенотипом E. faecalis зустрічались достовірно частіше в обох проаналізованих групах, ніж інші види ентерококів (p<0,05). Встановлено, що рівень фібринолітичної активності був вищим в 1,3 рази у штамів, вилучених від хворих на ГКІ, ніж у ентерококів групи порівняння (p<0,05). Так, середній розмір зони фібринолізу складав (14,5±0,7) мм і (10,7±0,5) мм відповідно. Виявлена залежність ступеня вираженості фібринолізу від видової приналежності досліджених штамів. Так, середній рівень зони фібринолізу у E. faecalis, вилучених від хворих на ГКІ, складав (15,5±0,9) мм, тоді як у E. faecium - (12,3±0,5) мм (p<0,05).
Встановлено, що у хворих на цукровий діабет частота виявлення фібринолітичноактивних штамів залежала від екотопу і була вищою в 2,5 рази серед ентерококів, вилучених з трофічних виразок, ніж з кишечника (p<0,05). Так, фібринолітичноактивними було (64,3±11,3) % штамів з трофічних виразок і (26,0±9,1) % - з кишечника хворих на цукровий діабет. Розмір зони фібринолізу у штамів, ізольованих із трофічних виразок, також був достовірно вищим і складав (15,9±0,7) мм проти (12,0±1,0) мм у кишкових штамів (р<0,05). При порівнянні фібринолітичної активності штамів, вилучених від одного і того ж хворого з трофічної виразки та кишечника, встановлено, що в (31,6±10,6) % випадків фібринолітичноактивними були обидва штами, а в (36,8±11,0) % випадків дана ознака виявлялась лише у штамів, вилучених з трофічної виразки.
При вивченні гіалуронідазної активності встановлено наявність її у (73,3±8,1) % штамів, вилучених з кишечника хворих на ГКІ, що в 1,8 рази перевищувало кількість гіалуронідазоактивних штамів у групі порівняння (р<0,05). Пенентрантність гіалуронідазної активності ентерококів була достовірно вищою у E. faecalis, ніж у представників інших видів ентерококів в обох проаналізованих групах (р<0,05).
Доведено, що у хворих на цукровий діабет пенентрантність гіалуронідазоактивних штамів ентерококів залежала від екотопу і була вищою в 1,6 рази серед штамів, вилучених із трофічних виразок у порівнянні зі штамами, ізольованими з кишечника (р<0,05). Ентерококи, вилучені з трофічних виразок, продукували гіалуронідазу в (68,0±8,8) % випадків, кишкові штами - у (43,5±10,3) %. Порівняльний аналіз штамів, які вилучено в одного і того ж хворого на цукровий діабет, показав, що гіалуронідазну активність визначено у (52,6±11,4) % випадків в обох штамів. Проте в (15,8±8,3) % випадків гіалуронідазу виявлено тільки у штамів, які вилучено з трофічної виразки.
Аналіз результатів досліджень фосфатазної та ліпазної активностей ентерококів, вилучених від хворих на ГКІ і від здорових, не виявив достовірної різниці між кількістю штамів, що продукують ці ферменти. Питома вага штамів, які продукували фосфатазу, серед ентерококів, вилучених від хворих на ГКІ, становила (36,7±8,8) % і (36,0±9,6) % серед штамів від здорових. Бактеріальні ліпази продукували (23,3±7,7) % штамів від хворих на ГКІ і (20,0±8,0) % - від здорових дітей.
Встановлено, що (53,6±9,4) % штамів із трофічних виразок і (56,2±10,3) % штамів з кишечника хворих на цукровий діабет були здатними продукувати фосфатазу. Попарне порівняння штамів від одного хворого з трофічної виразки та кишечника показало, що в (42,2±11,3) % випадків фосфатазу мали обидва штами, у (10,5±7,0) % - штами, вилучені з трофічної виразки, а в (21,0±9,3) % - кишкові штами. Ліпазна активність спостерігалась у (17,8±3,7) % штамів, вилучених із трофічних виразок, і (17,4±7,9) % - з кишечника хворих на цукровий діабет. При попарному порівнянні штамів з трофічної виразки і кишечника від одного і того ж хворого виявлено, що в (15,8±8,4) % випадків ліпазну активність мали обидва штами, у (15,8±8,4) % - штами, вилучені з трофічної виразки, і в (5,3±5,1) % - кишкові штами.
Аналіз пенентрантності РНК-азної активності показав, що серед штамів, вилучених з кишечника хворих на ГКІ, РНК-азоактивних було в 1,9 рази більше (р<0,05), ніж серед штамів, отриманих від здорових дітей, та їх кількість складала (23,3±7,7) % і (12,0±6,5) % відповідно. Рівень РНК-азної активності був вищим в 1,3 рази у штамів, вилучених із кишечника хворих на ГКІ (р<0,05).
Встановлено, що у хворих на цукровий діабет кількість РНК-азоактивних штамів була вищою в 1,8 рази серед ентерококів, вилучених із трофічних виразок порівняно з кишковими штамами (р<0,05), і складала (39,3±9,2) % і (21,7±8,6) % відповідно. Аналогічні закономірності встановлено при визначенні експресії РНК-азної активності. Так, розмір зони просвітлення середовища у штамів, вилучених із трофічних виразок, був достовірно вищим, ніж аналогічний показник у кишкових штамів, і складав (11,4±0,5) мм та (8,6±0,9) мм відповідно (р<0,05). При порівнянні РНК-азної активності штамів, вилучених від одного і того ж хворого з трофічної виразки та кишечника, встановлено, що у (26,3±10,1) % випадків РНК-азоактивними були обидва штами, а в (5,3±5,1) % випадків дана ознака виявлялась лише у штамів, ізольованих із трофічної виразки.
Під час досліджень було встановлено, що жоден із досліджених нами штамів ентерококів не продукував еластазу, лецитиназу, плазмокоагулазу.
Серед ФП, які обумовлюють здатність мікроорганізму протистояти захисним факторам організму хазяїна, нами вивчена антилізоцимна (АЛА) і антикомплементарна (АКА) активності ентерококів.
Згідно з нашими дослідженнями, АЛА у 2,6 рази частіше зустрічалась у ентерококів, вилучених від хворих на ГКІ, ніж від здорових дітей (p<0,05). Середнє значення АЛА штамів, вилучених із товстого кишечника хворих на ГКІ, дорівнювало (1,4±0,1) мкг/мл, що в 1,4 рази перевищувало аналогічний показник у штамів, ізольованих від здорових дітей (p<0,05). Питома вага штамів з низькою АЛА (менш ніж 2 мкг/мл) серед ентерококів, вилучених від хворих на ГКІ, складала (80,0±7,3) %, з середньою (2-3) мкг/мл - (20,0±7,3) %. Штамів з високою АЛА (більш ніж 4 мкг/мл) серед ентерококів, вилучених від хворих на ГКІ дітей, не виявлено. На відміну від попередніх, усі штами, які вилучено від здорових дітей, мали низьку АЛА. Можливо, що низький рівень інактивації лізоциму у представників нормофлори є достатнім для захисту від бактерицидної дії факторів природної резистентності, що забезпечує стабільність мікробіоценозів.
Встановлено, що у хворих на цукровий діабет АЛА була характерною для (86,9±7,0) % кишкових штамів і (92,8±4,9) % штамів, вилучених із трофічних виразок. Серед ентерококів, вилучених з кишечника і трофічних виразок, питома вага штамів з низькою АЛА складала (41,3±10,2) % і (32,2±8,8) %, середньою - (41,3±10,2) % і (50,0±8,3) %, високою - (17,4±7,9) % і (17,8±7,2) % відповідно. При попарному порівнянні АЛА ентерококів, вилучених у одного і того ж хворого із трофічної виразки і кишечника, встановлено, що у (89,5±7,0) % випадків інактивувати лізоцим були здатні обидва штами. Однак у (10,5±7,0) % випадків наявність вивченої ознаки виявлено тільки в ентерококів, які вилучено із трофічної виразки. Рівень АЛА в (52,6±11,4) % випадків співпадав у штамів, вилучених із трофічної виразки і кишечника, до того ж у (30,0±14,5) % парних штамів були високі значення АЛА, у (50,0±15,8) % - середні і у (20,0±12,6) % - низькі. Серед парних штамів з неоднаковим рівнем АЛА показники були вищими в ентерококів, ізольованих із трофічних виразок.
Аналіз результатів АКА показав наявність її у всіх узятих для досліду ентерококів. Діапазон експресії АКА штамів, вилучених з кишечника хворих на ГКІ, складав від 18,0 до 33,0 анти-С'Н50 одиниць, у штамів, вилучених від здорових, - від 15,0 до 38,6 анти-С'Н50 одиниць. Середній рівень АКА штамів, вилучених від хворих на ГКІ, дорівнював (26,4±0,8) анти-С'Н50 одиниць, що достовірно не відрізнялось від середнього рівня АКА штамів контрольної групи, який складав (26,3±2,2) анти-С'Н50 одиниць (p>0,05).
При оцінці експресивності АКА ентерококів, вилучених із трофічних виразок і кишечника хворих на цукровий діабет, виявлено деякі відмінності у штамів аналізуємих груп. Так, середній рівень АКА в ентерококів, вилучених із трофічних виразок, складав (31,7±1,2) анти-С'Н50 одиниць, що в 1,1 рази перебільшувало аналогічний показник штамів, вилучених з кишечника хворих на цукровий діабет, який складав (27,8±1,0) анти-С'Н50 одиниць (p<0,05). Діапазон експресії АКА коливався від 18,5 до 51,3 анти-С'Н50 одиниць у штамів із трофічних виразок і від 18,0 до 35,7 анти-С'Н50 одиниць у штамів, вилучених з кишечника хворих на цукровий діабет.
Серед факторів патогенності мікроорганізмів роду Enterococcus, які спричиняють розвиток патологічних процесів в органах і тканинах, нами було вивчено їх гемолітичну активність. Суттєвих відмінностей у частоті виявлення штамів з гемолітичними властивостями серед ентерококів, вилучених від хворих на ГКІ і здорових дітей, не виявлено (р>0,05). До гемолізу були здатні (13,3±6,2) % штамів, вилучених від хворих на ГКІ, та (12,0±6,5) % - від здорових дітей.
Встановлено, що у хворих на цукровий діабет пенентрантність гемолітичноактивних штамів залежала від екотопу і була вищою в 2,5 рази серед ентерококів, вилучених із трофічної виразки (р<0,05). Так, здатними до гемолізу були (32,1±8,8) % штамів із трофічних виразок і (13,0±7,0) % - з кишечника. При порівнянні гемолітичної активності штамів, ізольованих від одного і того ж хворого з трофічної виразки та кишечника, встановлено, що в (15,8±8,4) % випадків гемолітичноактивними були обидва штами, а в (21,0±9,3) % випадків дана ознака виявлялась лише у штамів, вилучених із трофічної виразки.
Нами проведено порівняльний аналіз фенотипової структури популяцій ентерококів різних груп спостереження, представлено узагальнені результати досліджень пенентрантності та рівня активності факторів патогенності (рис. 3, рис. 4).
Слід відзначити, що серед ентерококів, вилучених з оптимальної екологічної ніші (кишечник здорових дітей), не реєстрували мікроорганізми з повним комплексом факторів патогенності (ФП), і на долю штамів з максимальною кількістю ФП (для даної групи - вісім) у структурі проаналізованої вибірки припадало всього (4,0±3,9) %. Разом з цим питома вага штамів, які мали мінімальний набір, тобто два ФП, складала (12,0±6,5) %. Більшість штамів характеризувались набором з трьох - п'яти ФП, на долю яких припадало по (20,0±8,0) % від вибірки.
Рис. 3. Пенентрантність факторів патогенності ентерококів: група 1 - штами, вилучені з кишечника здорових дітей; група 2 - штами, вилучені з кишечника дітей, хворих на ГКІ; група 3 - штами, вилучені з кишечника хворих на цукровий діабет; група 4 - штами, вилучені з виділень трофічних виразок хворих на цукровий діабет.
Рис. 4. Експресивність факторів патогенності ентерококів: група 1 - штами, вилучені з кишечника здорових дітей; група 2 - штами, вилучені з кишечника дітей, хворих на ГКІ; група 3 - штами, вилучені з кишечника хворих на цукровий діабет; група 4 - штами, вилучені з виділень трофічних виразок хворих на цукровий діабет.
Серед ентерококів, вилучених з кишечника хворих на ГКІ, штамів з повним комплексом ФП теж не було виявлено, але на відміну від контрольної групи, визначено штами з комплексом з десяти (3,3±3,2) % і дев'яти (13,3±6,2) % ФП. Кількість штамів з активністю двох ФП достовірно не відрізнялась від попередньої групи (p>0,05). Основна доля штамів характеризувалась сполученням шести (16,7±6,8) %, семи (20,0±7,3) % і восьми (16,7±6,8) % ФП. Кількість штамів з комплексом шести і восьми ФП в 2,1 і 4,2 рази відповідно перевищувала аналогічні показники контрольної групи (p<0,05). Узагальнення отриманих даних дозволяє припустити, що для кожної екологічної ніші (у даному випадку - кишечник здорових дітей, кишечник дітей, хворих на ГКІ) характерний набір бактеріальних фенотипів ентерококів з домінуванням певних біопрофілей вивчених мікроорганізмів. При цьому, структура домінуючих біопрофілей ентерококів, вилучених з кишечника дітей, хворих на ГКІ, відрізнялась більш вираженою агресивністю біопрофілей, для яких було характерне широке представництво вивчених факторів патогенності. На наш погляд, останнє може свідчити про значення вивчених фенотипових ознак бактерій та їх комбінацій у розвитку патологічних процесів при гострих кишкових інфекціях та вказує на етіопатогенетичну роль деяких ентерококів у формуванні даної патології.
Аналіз фенотипової структури ентерококів, вилучених від хворих на цукровий діабет, показав, що серед ентерококів, ізольованих з кишечника, не було мікроорганізмів з повним комплексом вивчених характеристик, і на долю штамів з максимальною кількістю ФП (для даної групи - десять) у структурі проаналізованої вибірки припадало всього (4,4±4,2) %. Характерною особливістю цієї групи була відсутність штамів з мінімальним набором ФП. Основна доля штамів характеризувалась сполученням п'яти (17,4±7,9) %, шести (21,7±8,6) % і дев'яти (17,4±7,9) % ФП.
Доведено, що фенотипова структура ентерококів, вилучених із трофічних виразок, відрізнялась від групи порівняння. Максимальний набір ФП складався з одинадцяти активних характеристик і був визначений у (7,1±4,8) % штамів. Як і в попередній групі, у проаналізованій не реєстрували фенотипи з мінімальним набором ФП (1 - 3). Кількість штамів з активністю чотирьох ФП достовірно не відрізнялась від групи порівняння і складала (14,3±6,6) %. Основна доля штамів характеризувалась сполученням семи (14,3±6,6) %, дев'яти (35,8±9,0) % і десяти (10,7±5,8) % ФП. Кількість штамів з активністю дев'яти ФП у 2 рази перевищувала аналогічний показник штамів, вилучених з кишечника (p<0,05), хоча домінуючим у цих штамів був той же біопрофіль, що і в попередній групі. Разом з цим, питома вага штамів з активністю десяти ФП збільшилась у 2,4 рази (p<0,05).
Таким чином, результати порівняльного аналізу структури фенотипових варіантів у вивчених мікроорганізмів роду Enterococcus, вилучених з кишечника і трофічних виразок хворих на цукровий діабет, свідчать про вплив специфічних умов екологічної ніші на формування біопрофілей колонізуючих її бактеріальних ізолятів. Відмінності бактеріальних біопрофілей можуть розглядатися як результат їх екологічної детермінації. Високий ступінь фенотипової гетерогенності ентерококів в “оптимальній” еконіші деякою мірою забезпечує транслокацію їх в інші екологічні ніші, де під дією селекціонуючих факторів мікробні популяції модифікують фенотипову структуру відповідно до умов середовища. У нехарактерній для ентерококів еконіші (у даному випадку - трофічні виразки) відбувається переважне накопичення штамів з вираженим агресивним потенціалом.
У залежності від кількості ФП нами було поділено штами на непатогенні (1 - 3 ФП), малопатогенні (4 - 6 ФП), середньопатогенні (7 - 9 ФП) та високопатогенні (10 - 12 ФП).
Встановлено, що серед ентерококів, вилучених від здорових дітей, до групи непатогенних відносилось (32,0±9,3) %, малопатогенних - (48,0±9,9) %, середньопатогенних - (20,0±8,0) % штамів. Високопатогенних серед штамів контрольної групи не виявлено.
У групі хворих на ГКІ в 1,7 рази, у порівнянні з контрольною групою, зменшилась загальна кількість непатогенних і малопатогенних штамів, у 2,5 рази збільшилась кількість середньопатогенних штамів і з'явились високопатогенні (p<0,05). Встановлено, що за видовим складом середньопатогенні штами, вилучені від хворих на ГКІ, розподілились таким чином: E. faecalis - (71,4±12,0) %, E. faecium - (28,6±12,0) %. Високопатогений штам належав до виду E. faecalis.
При аналізі комплексу факторів патогенності ентерококів, вилучених з кишечника хворих на цукровий діабет, слід зазначити, що основна частина проаналізованої вибірки була представлена непатогенними і малопатогенними штамами, (60,8±10,1) % і (13,0±7,0) % відповідно. На долю середньопатогенних штамів припадало (34,8±9,9) %, високопатогенних - (4,4±4,2) %, серед яких питома вага E. faecalis складала (75,4±15,3) %, E. faecium - (25,0±15,3) %.
На відміну від групи порівняння, серед штамів, вилучених із трофічних виразок хворих на цукровий діабет, не виявлено непатогенних штамів, а малопатогенних було менше в 1,7 рази і дорівнювало (28,5±8,5) % (p<0,05). На долю середньопатогенних ентерококів припадало (53,7±9,4) % штамів, серед яких питома вага E. faecalis складала (93,7±6,0) %, E. faecium - (6,3±6,0) %. Кількість високопатогенних штамів дорівнювала (17,8±7,2) %, що в 4 рази перевищувало аналогічний показник групи порівняння (p<0,001). Усі вони належали до виду E. faecalis.
На наш погляд, наявність у штамів певного набору ФП може свідчити про етіопатогенетичну роль їх у виникненні трофічної виразки хворих на цукровий діабет із синдромом “діабетична стопа”. Хоча відомо, що при цукровому діабеті з інфікованими формами синдрому діабетичної стопи, в умовах зниження захисних властивостей шкіри навкруги некротизованих м'яких тканин в інфекційному процесі можуть відігравати роль і мікроорганізми з низькою вірулентністю.
ВИСНОВКИ
Комплексна оцінка вивчення факторів патогенності та антибіотикочутливості мікроорганізмів роду Enterococcus дозволила встановити рівень фенотипового і генетичного поліморфізму ентерококів, вилучених із різних екотопів, визначити спрямованість адаптаційних зсувів у популяціях цих мікроорганізмів.
1. Встановлено відмінності за видовим складом мікробної популяції ентерококів у залежності від еконіші їх вегетування. У кишечнику здорових дітей домінуючими видами є E.faecalis - (40,0±9,8) % і E.faecium - (32,0±9,3) %, із суттєво меншою частотою (28±4,3) % виявляються види E.avium, E.solitarius, E.mundtїi, E.cecorum та інші неідентифіковані види цих мікроорганізмів. У кишечнику дітей, хворих на ГКІ, при домінуванні видів E.faecalis (43,3±9,0) %, E.faecium (33,4±8,6) % значно рідше виділяються (23,3±3,9) % - E.mundtii, E.cecorum, E.raffinosus, E.columbae та інші неідентифіковані види цих мікроорганізмів.
2. У кишечнику хворих на цукровий діабет домінуючим є вид E.faecalis (69,6±9,6) %, інші види ентерококів вилучаються з меншою частотою: E.faecium (17,5±7,9) %, E.mundtїi, E.durans, E.raffinosus (13,9±5,6) %. У виділеннях трофічних виразок - E.faecalis (89,3±5,8) %, E.faecium (7,1±4,8) %, E.mundtii (3,6±3,5) %. Вилучені з об'єктів оточуючого середовища стаціонару “Центру діабетичної стопи” ізоляти ентерококів віднесено виключно до виду E.raffinosus.
3. Встановлено значні розбіжності в антибіотикочутливості штамів, вилучених із різних екотопів. Визначено, що від (60,0±12,6) % до (72,0±6,3) % штамів характеризуються високим рівнем резистентності до аміноглікозидів (HLAR). Рівень розповсюдженості штамів з (HLAR) вище серед вилучених від хворих на цукровий діабет. Встановлено високу протиентерококову активність амоксициліну, питома частка нечутливих штамів становила (5,7±2,2) %, і низьку - інших бета-лактамів (пеніциліну, ампіциліну) - (65,1±4,7) % і (31,1±4,4) % відповідно. Виявлено високий відсоток штамів E.faecalis, резистентних до ампіциліну та пеніциліну (25,0±5,2 % і 68,6±5,6 % відповідно).
4. Підтверджено високу протиентерококову активність лінезоліду та глікопептидних антибіотиків (тейкопланін, ванкоміцин). Виявлено (8,5±2,7) % штамів, помірно стійких до ванкоміцину та (1,0±0,9) % стійких до тейкопланіну, серед ізольованих від хворих на цукровий діабет. Встановлено високу розповсюдженість поліантибіотикорезистентних штамів ентерококів, від (48,0±9,9) % серед виділених з кишечника здорових дітей до (85,7±6,6) % - з трофічних виразок при цукровому діабеті.
5. Доведено на фенотиповому і генетичному рівні, що за типом експресії гену резистентності до ванкоміцину (VanA) штами Enterococcus можуть бути гомо- або гетеротипні. У деяких штамів, які фенотипово чутливі або помірно чутливі визначено неекспресуючий ген VanA.
6. Визначено, що пенентрантність та ступінь вираженості желатиназної, казеїназної, фібринолітичної, гіалуронідазної, РНК-азної та антилізоцимної активностей у штамів ентерококів корелює з наявністю гнійно-запального процесу в екотопі їх вегетування. Усі штами ентерококів володіють адгезивністю середнього та високого рівня, але ентерококи, які вилучено при патологічних станах, характеризуються вірогідно більш високими показниками адгезії. Показники пенентрантності та експресивності факторів патогенності штамів, ізольованих із виділень трофічних виразок хворих на цукровий діабет перевищували в 1,1 - 3,5 рази аналогічні показники групи порівняння.
7. Встановлено, що ентерококи, вилучені із різних еконіш, гетерогенні за факторами патогенності. Зміна умов існування ентерококів у природній еконіші та транслокація їх у “маргінальну” еконішу веде до зсуву патогенного потенціалу в напрямку його посилення шляхом зростання адгезивної, казеїназної, желатиназної, фібринолітичної, гіалуронідазної, РНК-азної та антилізоцимної активностей.
...Подобные документы
Основні концепції виду в бактеріології. Особливості визначення систематичного положення мікроорганізмів. Значення морфологічних властивостей в сучасній систематиці мікроорганізмів. Механізм ідентифікації мікроорганізмів на основі морфологічних ознак.
курсовая работа [5,8 M], добавлен 30.01.2016Особливості визначення систематичного положення мікроорганізмів. Виявлення взаємозв'язку між морфологічними властивостями та ідентифікацією сапрофітних мікроорганізмів. Дослідження кількісних та якісних закономірностей формування мікрофлори повітря.
курсовая работа [3,7 M], добавлен 26.01.2016Особливості та основні способи іммобілізації. Характеристика носіїв іммобілізованих ферментів та клітин мікроорганізмів, сфери їх застосування. Принципи роботи ферментних і клітинних біосенсорів, їх використання для визначення концентрації різних сполук.
реферат [398,4 K], добавлен 02.10.2013Біотехнологія мікроорганізмів та їх різноманітний світ. Створення мікроорганізмів-продуцентів та отримання генетичних рекомбінантів. Застосування рекомбінантних ДНК для переносу природних генів. Виробництво харчових білків, амінокислот та вітамінів.
реферат [21,8 K], добавлен 16.01.2013Фундаментальні принципи, методи, перспективи розвитку і застосування нанотехнологій з використанням мікроорганізмів та продуктів їх життєдіяльності. Виробництво наноматеріалів за допомогою мікроорганізмів, використання їх специфічних властивостей.
курсовая работа [1,2 M], добавлен 21.01.2016Дослідження штамів мікроорганізмів. Використання мутантів мікроорганізмів. Промисловий синтез амінокислот. Мікробіологічний синтез глутамінової кислоти, лізину, метіоніну, треонина, ізолейцину та триптофану. Ход реакцій і блокуванням етапів синтезу.
реферат [34,9 K], добавлен 25.08.2010Характеристика фізіологічних груп мікроорганізмів людини, їх морфологічні ознаки, вплив на організм. Розробка профілактичних заходів. Мікрофлора у лікуванні та захисті людського організмі. Шляхи проникнення мікроорганізмів у тканини і порожнини тіла.
курсовая работа [563,2 K], добавлен 06.08.2013Характеристика ґрунту як середовища проживання мікроорганізмів. Дослідження методів визначення складу мікроорганізмів. Аналіз їх ролі у формуванні ґрунтів та їх родючості. Біологічний кругообіг в ґрунті. Механізм дії мінеральних добрив на мікрофлору.
реферат [96,7 K], добавлен 18.12.2014Характеристика генетичного апарату бактерій. Особливості їх генів та генетичної карти. Фенотипова і генотипова мінливість прокаріот. ДНК бактерій. Генетичні рекомбінації у бактерій: трансформація, кон’югація, трансдукція. Регуляція генної активності.
курсовая работа [44,8 K], добавлен 21.09.2010Основна характеристика літотрофів - мікроорганізмів, що використовують неорганічні речовини у якості відновлюючих агентів для біосинтезу. Енергетичний метаболізм бактерій. Класифікація літотрофних бактерій. Роль літотрофних мікроорганізмів у природі.
реферат [34,8 K], добавлен 10.04.2011Ідентифікація лимонної кислоти в якості продукту метаболізму цвільових грибів. Реалізація синтезу лимонної кислоти у мікроорганізмів. Варіанти синтезу в виробництві кислоти (незмінний, незмінний із доливами, метод плівок). Характеристика умов ферментації.
контрольная работа [23,3 K], добавлен 12.03.2016Характеристика родини Складноцвітні (Asteraceae). Екологічні особливості. Відмітні ознаки видів роду Matricari. Генетичні типи Ромашки аптечної, екологія і ареал розповсюдження. Ідентифікація різних генетичних типів для отримання високоякісної сировини.
реферат [4,3 M], добавлен 10.03.2009Взаємодія барвників із структурами бактеріальної клітини. Ріст і розмноження бактерій. Культивування вірусів в організмі тварин. Фізичні методи дезінфекції. Гетерогенність популяцій мікроорганізмів. Бактеріостатичний, бактерицидний ефект дії антибіотиків.
контрольная работа [60,4 K], добавлен 24.02.2012Розташування грибів роду та ознаки, покладені в основу систематики. Морфологічні особливості вегетативних та репродуктивних стадій. Біологічні особливості основних видів роду. Джерела інфекції та шляхи їх розповсюдження. Механізми мінливості патогенів.
курсовая работа [1,4 M], добавлен 16.03.2014Морфологічні ознаки бактерій, пліснявих грибів і дріжджів. Мікробіологія найважливіших харчових продуктів. Фізіологічна роль складових частин їжі. Основи раціонального харчування. Складання меню добового раціону харчування для різних груп населення.
курс лекций [40,7 K], добавлен 21.11.2008Чинники довкілля, що впливають на мікроорганізми. Вплив гідростатичного тиску. Характеристика та головні властивості психрофілів. Фактори, що обумовлюють низьку максимальну температуру росту. Використання психрофільних мікроорганізмів в промисловості.
реферат [231,7 K], добавлен 24.05.2010Вивчення середовища для виробництва білкових концентратів із водоростей, бактерій, рослин, дріжджів та грибів. Огляд ферментаторів для стерильного культивування мікроорганізмів. Аналіз флотації, сепарування, випарювання й сушіння для одержання протеїнів.
дипломная работа [126,7 K], добавлен 07.05.2011Історія вивчення гіпертермофільних мікроорганізмів, їх систематичне положення, середовища існування (наземні і морські біотопи). Морфологічні, фізіологічні і культуральні особливості архей; механізми їх термофілії. Практичне використання в біотехнології.
дипломная работа [1,8 M], добавлен 17.09.2010Основні джерела антропогенного забруднення довкілля. Вплив важких металів на фізіолого-біохімічні процеси рослин, зміни в них за впливу полютантів. Структура та властивості, функції глутатіон-залежних ферментів в насінні представників роду Acer L.
дипломная работа [950,6 K], добавлен 11.03.2015Історія вивчення ґрунтових олігохет. Фізико-географічні особливості Малого Полісся. Екологія люмбріцід роду Apporectoidea, їх поширення в Малом Поліссі. Дослідження фауни, екології, хорології ґрунтових олігохет у природних біоценозах Малого Полісся.
дипломная работа [1,6 M], добавлен 12.09.2012
