Імуномодуляторні ефекти пептидоглікану Staphylococcus aureus Wood 46 при пухлинному рості

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Імуномодуляторні ефекти пептидоглікану Staphylococcus aureus Wood 46 при пухлинному рості

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Досягнення фактичної межі ефективності засобів хіміо- і променевої терапії в наш час і, відповідно, певне розчарування в їх можливостях сприяють постійному пошуку альтернативних і доповнюючих підходів до терапії онкологічних захворювань. Одним з таких напрямів є біотерапія [Новиков, 2002; Obrador-Hevia, 2009; Recchia, 2009]. Біотерапія в онкології спрямована на досягнення протипухлинного ефекту препаратами біогенного походження (цитокіни, моноклональні антитіла) та/або ресурсами організму, посиленими за допомогою біопрепаратів (ЛАК-клітини), модифікованими пухлинними клітинами (вакцини на основі модифікованих клітин пухлини). Останній вид біотерапії передбачає введення аутологічних або алогенних пухлинних клітин, або їх окремих компонентів, в організм разом з ад'ювантом. Традиційними ад'ювантами, що добре зарекомендували себе, є живі атенуйовані мікобактерії Кальметта-Жерена (вакцина БЦЖ) [Chang, 2000; Hoag, 2009], а також C. parvum, ліпополісахарид грамнегативних бактерій, повний ад'ювант Фрейнда та інші.

Однією з вагомих складових всіх мікробних клітин є основний компонент клітинної стінки бактерій - пептидоглікан (ПГ) [Boneca, 2005]. ПГ різних бактерій мають відмінні структурні особливості, однак, всі вони відсутні на поверхні еукаріотичних клітин і тому є адекватною мішенню для імунної системи [Takada, 2002; Girardin, 2004; Fournier, 2005]. ПГ різних видів бактерій неоднакові за амінокислотним складом міжпептидних містків і за антигенним профілем. Дослідження хімічної структури ПГ показали, що існує близько 100 його структурних типів. ПГ та їх похідним - мурамілпептидам притаманні ад'ювантні властивості як у гуморальній, так і клітинній відповідях, як до розчинних, так і до нерозчинних корпускулярних антигенів, котрі забезпечують посилення реакцій протиінфекційного, а також протипухлинного імунітету [Machenzie, 2001; Lin, 2001; Dziarski, 2003]. Дані літератури [Nitta, 2000; Позур, 2002; Kato, 2007] свідчать, що ПГ та їхні синтетичні аналоги з імуномодуляторними властивостями можуть мати важливе прикладне значення як неспецифічні імуностимулятори, а також використовуватись в якості ад'ювантних компонентів для імунотерапії захворювань людини і тварин, пов'язаних з функціональними розладами імунної системи. Здатність ПГ ініціювати прозапальну імунну відповідь дозволила розглядати їх як потенційні терапевтичні агенти в лікувані онкологічних захворювань, перебіг яких, як відомо, супроводжується порушенням низки показників в системі імунітету [Traub, 2006]. Пошук ефективних ад'ювантів з мінімальною побічною дією поки що триває.

Розвиток інфекції в онкологічних хворих залишається важливою проблемою, яка стоїть на шляху до ефективного лікування пацієнтів [Scheinpflug, 2008; Moyes, 2009]. Грампозитивні патогени, такі як Staphylococcus аureus, коагулазо-негативні стафілококи, деякі стрептококи, на даний момент домінують серед збудників інфекційних ускладнень у онкологічних пацієнтів, вони є часто резистентними до більшості антибіотиків, що ускладнює їх лікування [Scheinpflug, 2008].

Інформація стосовно дослідження впливу ПГ Staphylococcus aureus Wood 46 (золотавого стафілококу) на пухлинний ріст в літературі практично відсутня. З огляду на те, що на сьогодні залишається актуальним пошук нових протипухлинних препаратів на основі компонентів бактеріальних клітин та з'ясування їх імуномодуляторної дії, ПГ Staphylococcus aureus Wood 46 може розглядатися як перспективний агент для використання в ад'ювантній терапії.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана на кафедрі мікробіології та загальної імунології Київського національного університету імені Тараса Шевченка за темою: «Визначення біохімічних, генетичних, імунологічних та цитологічних маркерів розвитку патологічних станів організму з метою розробки засобів направленої корекції» (2006-2010 рр., державний реєстраційний номер 0106 U005750).

Мета та завдання дослідження. Визначити імуномодуляторні та протипухлинні властивості пептидоглікану Staphylococcus aureus Wood 46 при його самостійному застосуванні та в якості компонента протипухлинної вакцини.

Для досягнення мети були поставленні наступні завдання:

1. Визначити вплив пептидоглікану Staphylococcus aureus Wood 46 на функціональну активність ефекторів природного імунітету в умовах in vitro.

2. Встановити зміни життєздатності пухлинних клітин різного гістогенезу in vitro під впливом пептидоглікану Staphylococcus aureus Wood 46.

3. Дослідити вплив різних доз пептидоглікану Staphylococcus aureus Wood 46 за різних способів його введення на пухлинний ріст та показники імунологічної реактивності мишей з експериментальними пухлинами різного гістогенезу.

4. Провести порівняльну оцінку імунологічних і протипухлинних ефектів, викликаних протипухлинною вакциною, виготовленою із застосуванням пептидоглікану Staphylococcus aureus Wood 46, на різних експериментальних моделях пухлинного росту.

Об'єкт дослідження: пептидоглікан Staphylococcus aureus Wood 46.

Предмет дослідження: імуномодуляторні та протипухлинні ефекти пептидоглікану Staphylococcus aureus Wood 46.

Методи дослідження: імунологічні - визначення маси і клітинності лімфоїдних органів, оцінка інфільтрації пухлини мононуклеарними лейкоцитами, визначення кисне-залежного метаболізму фагоцитів різних популяцій, визначення цитотоксичної активності природних кілерних клітин, імуноферментний аналіз; методи експериментальної онкології - перещеплення експериментальних пухлин, оцінка показників пухлинного росту: середня тривалість життя тварин, індекс модуляції середньої тривалості життя, розміри первинної пухлини, які оцінювали за середнім її об'ємом; оцінка життєздатності пухлинних клітин; методи статистичної обробки результатів.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше досліджені особливості впливу пептидоглікану Staphylococcus aureus Wood 46 на функціональну активність ефекторів природного імунітету - моноцитів, макрофагів, нейтрофілів; цитотоксичну активність природних кілерних клітин (по відношенню до різних клітин-мішеней); життєздатність пухлинних клітин різного гістогенезу в умовах in vitro. Виявлені його імуномодуляторні, протипухлинні та антиметастатичні властивості.

Вперше в експериментальних дослідженнях in vivo доведена ефективність застосування пептидоглікану Staphylococcus aureus Wood 46 в якості самостійного протипухлинного засобу.

Сконструйовано протипухлинну вакцину з використанням пухлинних клітин, оброблених пептидогліканом Staphylococcus aureus Wood 46. Проведена порівняльна оцінка імуномодуляторних і протипухлинних ефектів, викликаних як пептидогліканом Staphylococcus aureus Wood 46, так і протипухлинною вакциною, виготовленою з використанням пухлинних клітин і пептидоглікану, на різних експериментальних моделях пухлинного росту.

Практичне значення отриманих результатів. Отримано експериментальне обгрунтування доцільності застосування пептидоглікану Staphylococcus aureus Wood 46 як самостійного протипухлинного препарату, так і у складі протипухлинної вакцини, що аргументує їх подальше доклінічне дослідження з метою практичного застосування при лікуванні пацієнтів з онкологічними захворюваннями. Дані щодо динаміки змін в імунній системі тварин з пухлинним процесом, які відбуваються під впливом вакцинації, можуть бути використанні при розробці схем імунотерапії і її моніторингу при клінічному застосуванні вакцин.

Особистий внесок здобувача. У співробітництві з науковим керівником д.м.н. Г.П. Потебнею розроблено концепцію дисертаційної роботи. Здобувачем особисто була сформульована мета роботи, поставлені основні завдання і підібрані методи дослідження, які необхідні для виконання поставлених задач. Автором зібрана і проаналізована сучасна наукова література за темою дисертації. Всі експериментальні дослідження були проведені самостійно. Зроблено аналіз отриманих даних. Особисто сформульовано основні наукові положення та висновки дисертації. Підготовку публікацій за отриманими результатами та представлення результатів на наукових конференціях здійснено за участю наукового керівника д.м.н. Г.П. Потебні та наукового консультанта к.б.н., доцента Л.М. Сківки.

Апробація результатів дисертації. Результати дисертаційної роботи були представленні на: 5-му з'їзді Європейської імунологічної спілки (Прага, Чехія, 2006), VIІ Всеукраїнській конференції студентів та аспірантів «Дослідження молодих вчених на Україні» (Київ, Україна, 2007); V Міжнародній науково-практичній конференції «Становление современной науки - 2007» (Дніпропетровськ, Україна, 2007); IV Міжнародній науковій конференції «Молодь та поступ біології» (Львів, Україна, 2008); VI Міжнародній науково-практичній конференції студентів, аспірантів та молодих вчених «Шевченківська весна» (Київ, Україна, 2008); ІХ Міжнародній конференції молодих онкологів «Сучасні проблеми експериментальної та клінічної онкології» (Київ, Україна, 2008).

За матеріалами дисертації на конкурсній основі призначено академічну стипендію Кабінету Міністрів України у 2008 році (Наказ №594-34 від 10.10.2008 р.)

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 13 наукових праць, в тому числі 6 статей у провідних фахових виданнях, рекомендованих ВАК України, і 6 тез, отримано 1 патент України на корисну модель.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається із вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів дослідженнь, 6 розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення результатів дослідження, висновків і списку використаних літературних джерел, який включає 230 найменувань, з них 60 вітчизняних та 170 іншомовних. Основний зміст дисертації викладений на 134 сторінках машинописного тексту, містить 24 рисунки та 8 таблиць.

Основний зміст роботи

пептидоглікан імунітет вакцина пухлинний

У огляді літератури представленні новітні дані про структурний компонент клітинної стінки бактерій - пептидоглікан, будову бактеріальних пептидогліканів, механізм розпізнавання пептидоглікану клітинами імунної системи, а, також, імуномодуляторні та ад'ювантні властивості пептидогліканів. Проаналізовано дані щодо сучасної біотерапії злоякісних пухлин, її нові напрями та принципи створення, види протипухлинних вакцин.

Матеріали і методи досліджень. Експериментальні дослідження проведено на мишах ліній: С₅₇В1/₆, Balb/c, нелінійних мишах розведення віварію біологічного факультету КНУ імені Тараса Шевченка, самцях та самицях віком 2-3 місяці, вагою 20-24 г. В кожній групі було по 7 тварин. Тварини утримувались в стандартних умовах віварію. Усі дослідження на тваринах здійснювали згідно із нормами, встановленими законом України №3447-ІV «Про захист тварин від жорстокого поводження» і норм, прийнятих в Європейській конвенції із захисту хребетних тварин, яких використовують для експериментальних і наукових цілей від 20.09.1985 [Резников, 2001]. В роботі використовували кров здорових донорів, чоловіків віком 25-35 р.

Для створення експериментальних модельних систем злоякісного росту були використані штами пухлин з Банку клітинних ліній та перещеплюваних пухлин ІЕПОР ім. Р.Є. Кавецького НАН України, зокрема саркома 37, саркома 180, карцинома легені Льюїс та меланома В-16. Перещеплення здійснювали підшкірно в область крижового відділу по 0.2 мл суспензії пухлинної тканини в концентрації клітин 400 тис./мл. Культивування клітинних ліній LLC, LLC-R/9, LSK, L929, МТ4, Raji проводили за стандартною методикою [Фрешни, 1989]. Перебіг пухлинного процесу характеризували за стандартними показниками: середня тривалість життя тварин (СТЖ), індекс модуляції середньої тривалості життя (ІМ СТЖ), розміри первинної пухлини на момент проведення досліджень (у мм³), середня кількість метастазів [Куцэнок, 2004].

В дослідах використовували ліофілізований пептидоглікан Staphylococcus aureus Wood 46, люб'язно наданий професором Позуром В.К. ПГ отримувався за методами описаними раніше [Вершигора, 1981]. Вибір в якості об'єкта досліджень Staphylococcus aureus Wood 46 мотивований тим, що клітини цього штаму не містять білка А, який застосовується в терапії онкологічних захворювань. Фізико-хімічний та хроматографічний аналізи показали наявність в його складі таких амінокислот та аміноцукру: аланіну, глютамінової кислоти, гліцину, лізину і глюкозаміну [Позур, 2002]. За даними електрофорезу оброблений ультразвуком ПГ містить три фракції з молекулярними масами 100, 92 і 84 кДа [Михальский, 1995]. ПГ погано розчинний у водних розчинах. В зв'язку з цим, для введення експериментальним тваринам використовували гомогенну суспензію ПГ, створену шляхом ультразвукової обробки 1- 5 хв при 25 кГц.

Для оцінки впливу пептидоглікану Staphylococcus aureus Wood 46 на метаболічну активність клітин імунної системи використовували НСТ-тест. [Muller, 1989]. Макрофаги виділяли з перитонеальної порожнини мишей. Моноцити виділяли за методом [Gill, 1977], нейтрофіли - за методом [Prema Madyasta, 1982] з периферичної крові здорових донорів. Цитотоксичну активність мононуклеарних лейкоцитів селезінки по відношенню до пухлинних клітин оцінювали методом проточної цитометрії. Коефіцієнт лізису клітин-мішеней (ЛКМ) розраховували за формулою ЛКМ=Д-К, де Д -%лізису КМ в пробах з ефекторами, К -% спонтанного лізису КМ.

Для оцінки впливу пептидоглікану на життєздатність пухлинних клітин різного генезу використовували стандартні методики [Mosman, 1983]. Визначали оптичну густину вітального барвника на мікроплейтфотометрі типу «Reader» (МП «Лаботек», Латвія) при довжині хвилі 540 нм та паралельно підраховували кількість живих та мертвих клітин в камері Горяєва з трипановим синім, через 4, 24, 48, 72 год культивування.

Виготовлення протипухлинної вакцини проводили згідно стандартної методики (Опис до патенту України №57869, МПК⁸ A61K 35/12, 2003). Для приготування 1 мл вакцини на основі лектину до 1х10⁷ пухлинних клітин додавали лектин в концентрації 0,06-0,5 мг/мл, інкубували в термостаті при 37⁰С протягом 2-х год, готову вакцину зберігали при -18-20єС. Для приготування 1 мл вакцини на основі ПГ до 1х10⁷ пухлинних клітин додавали гомогенізовану суспензію ПГ в концентрації 500 мкг/мл, інкубували в термостаті при 37⁰С протягом 2-х годин, готову вакцину зберігали при -18-20єС. Для мишей з меланомою В-16 до складу вакцини додавали ПГ у концентрації 250 мкг/мл.

Реакцію лімфоїдних органів: регіонарних (по відношенню до місця трансплантації пухлинних клітин і введення ПГ) пахових лімфовузлів, селезінок та тимусів оцінювали за ваговими індексами, які розраховували за формулою: вага органу / загальна вага тварини, а також за відносним вмістом лімфоїдних клітин, який визначали за формулою: абсолютна клітинність/вага органу [Kozlowska, 1997]. Лімфоїдні клітини, що інфільтрують пухлину, виділяли за методикою, що описана раніше [Skivka, 2004]. Мононуклеарні лейкоцити виділяли з пухлинної тканини, нашаровували на градієнт фікол-верографін (с=1,077), центрифугували 40 хв при 1500 об/хв. Виділяли кільце мононуклеарних лейкоцитів, підраховували кількість клітин в камері Горяєва.

Рівень антитіл у сироватці крові визначали методом імуноферментного аналізу згідно методики [Christensson, 1984].

Статистичну обробку отриманих результатів проводили загальноприйнятими методами варіаційної статистики з розрахунком середнього значення (М), середнього квадратичного відхилення (у) та середньої квадратичної похибки (m). Для визначення вірогідності відмінності показників між дослідом та контролем використовували t-критерій Стьюдента.

Результати досліджень, аналіз та узагальнення отриманих даних. На першому етапі досліджень вивчали вплив пептидоглікану S. aureus Wood 46 на функціональну активність клітин імунної системи в умовах in vitro. Додавання ПГ в концентрації 250 мкг/мл підвищувало цитотоксичну активність перитонеальних макрофагів втричі порівняно з нестимульованим контролем (рис. 1). ПГ в концентрації 100 і 250 мкг/мл посилював стимуляторну дію форболмеристатацетату (ФМА) на 35% в порівнянні з контрольними показниками ФМА.

Функціональна активність моноцитів досліджувалась на трьох фракціях клітин: фракція І, фракція ІІ і сумарна фракція мононуклеарів (рис. 2). Найвищу спонтанну метаболічну активність демонстрували моноцити у складі фракції мононуклеарів. Додавання ПГ незалежно від концентрації як самостійно, так і з ФМА, помірно посилювало метаболічну активність мононуклеарів.

Додавання ПГ в концентрації 10 мкг/мл підвищувало спонтанну метаболічну активність нейтрофілів на 10% (рис. 3). ПГ у цій же концентрації посилював стимуляторну дію ФМА на 9%. Порівняно зі спонтанним контролем, рівень метаболічної активності в цих пробах був вищим на 16%.

Пептидоглікан практично у всіх застосованих концентраціях помірно посилював спонтанний лізис клітин LLC (рис. 4). Найефективнішою виявилась концентрація ПГ 100 мкг\мл. Додавання високої концентрації бактеріального глікопептиду (500 мкг/мл) призводило до посилення лізису клітин-мішеней на 48%.

Таким чином, пептидоглікан S. аureus здатний чинити вплив in vitro на клітини імунної системи, що задіяні у розвитку протипухлинного імунітету, спричиняючи їх прозапальну активацію. Різні клітини для досягнення максимального стимуляторного ефекту потребували різної концентрації ПГ, що, ймовірно, обумовлено їх структурно-функціональними особливостями.

Наступним етапом роботи було дослідження впливу пептидоглікану на ріст експериментальних пухлин, а також оцінка показників імунологічної реактивності у тварин з пухлинами. В задачі цього етапу входило. По-перше, з'ясувати, яким чином гальмівний ефект ПГ на пухлинний ріст залежить від його дози і способу введення (системно - внутрішньочеревно чи локально - підшкірно). І, по-друге, яким чином ПГ впливає на ріст експериментальних пухлин різного походження. Імунізація пептидогліканом як підшкірно, так і внутрішньочеревно в дозі 8 мг/г гальмувала ріст первинної пухлини у мишей з карциномою легені Льюїс, в середньому, на 25% (рис. 5).

Слід, однак, відзначити, що розміри пухлин у дослідних тварин характеризувались значною індивідуальною варіабельністю.

Підшкірне введення ПГ спричиняло інгібування процесу метастазування експериментальної пухлини на 74%, внутрішньочеревне - на 54% (рис. 6).

Більш стабільний гальмувальний ефект спостерігався при підшкірному введенні ПГ, тому надалі використовували цей спосіб введення.

Результати досліджень свідчать про те, що введення пептидоглікану в зону трансплантації клітин експериментальних пухлин більш виразно гальмує ріст злоякісних новоутворень (рис. 7).

Гальмування пухлинного росту як у відношенні карциноми легені Льюїс, так і у випадку з саркоми S180, спостерігалося лише при введенні максимальної дози пептидоглікану (8 мкг/г), натомість, введення пептидоглікану у дозах 4 мкг/г та 2 мкг/г, призводило до стимулювання росту пухлин обох типів. Більш чутливою на введення ПГ виявилась карцинома легені Льюїс (гальмування росту експериментальної пухлини склало 25%).

Пригнічувальний вплив ПГ на ріст експериментальних пухлин може реалізовуватись двома шляхами: безпосереднім впливом на життєздатність пухлинних клітин і модуляцією функцій імунної системи. Для з'ясування внеску цих механізмів в отриманий ефект ми вивчали вплив ПГ на ріст пухлинних клітин in vitro, а також оцінювали показники імунітету дослідних тварин.

На даному етапі досліджень ми вивчали реакцію лімфоїдних органів у мишей з карциномою легені Л'юїс при введенні різних доз пептидоглікану.

Паралельно з тваринами з пухлиною імунізацію ПГ проводили і у тварин без пухлини. Більш виразна позитивна реакція з боку лімфоїдних органів на введення ПГ спостерігалась у мишей з карциномою легені Льюїс, яким вводили ПГ в дозі 8 мкг\г. Це дозволяє зробити припущення, що реакція імунної системи є частиною механізму протипухлинної дії ПГ. Зважаючи на те, що в групах мишей з пухлинами, які отримали ПГ у дозах 4 та 2 мкг/г спостерігалась також позитивна реакція органів імунної системи у відсутності гальмування пухлинного росту, можна припустити, що існують й інші складові механізму протипухлинного ефекту ПГ наприклад, безпосередня його дія на пухлинні клітини.

За результатами досліджень бактеріальний глікопептид здатний посилювати загибель злоякісно-трансформованих клітин при сумісному їх культивуванні in vitro. Більш істотний цитотоксичний вплив ПГ спостерігався по відношенню до пухлинних клітин сполучнотканинного походження (LSK, L-929). Найвища чутливість фібробластів до бактеріального глікопептиду у всіх застосованих концентраціях спостерігалась після 48-годинної інкубації.

Максимальний відсоток загиблих клітин LSK спостерігався після 24 год інкубації в пробах, оброблених ПГ в концентрації 100 мкг/мл і був удвічі більшим порівняно з контролем. ПГ у решті застосованих концентрацій також чинив негативну дію на пухлинні клітини: відносний вміст мертвих клітин у цих пробах був в середньому на 60% вищим в порівнянні з контролем. Подовження терміну інкубації до 48 год призводило в цілому до зниження негативної дії ПГ, за винятком проб, оброблених ПГ в концентрації 250 мкг\мл.

Одним з аспектів використання бактеріальних клітин, субклітинних компонентів та біополімерів в онкології є введення їх до складу протипухлинних вакцин в якості ад'ювантів. На наступному етапі досліджень ми оцінювали вплив протипухлинних вакцин з введеним до їх складу ПГ S. aureus Wood 46 на ріст і метастазування експериментальних пухлин різного гістогенезу.

Використання ПГ у біотерапії експериментальних пухлин як самостійно, так і у складі протипухлинної вакцини, по різному позначалося на тривалості життя дослідних тварин.

У мишей з карциномою легені Льюїс найбільш позитивно на тривалості життя позначилось використання вакцини з ПГ (+7,4,) та лектином (+6,9). При цьому введення ПГ самостійно призводило до зниження ІМ СТЖ (-23,0).

У мишей з саркомою 37 найвиразніший позитивний ефект щодо тривалості життя справляла вакцина з лектином (+98,0). Порівняний результат спостерігався при введенні ПГ самостійно (+74,3), вакцина з ПГ виявилась менш ефективною (+47,0).

ПГ Staphylococcus aureus застосований як самостійно, так і у складі протипухлинної вакцини, здатний чинити супресивний вплив на ріст експериментальних пухлин у мишей (рис. 8).

Слід зазначити, що ПГ у складі вакцини ефективніше гальмує пухлинний ріст ніж самостійно. З трьох типів експериментальних пухлин найбільш результативним виявилось введення вакцини з ПГ тваринам з карциномою легені Льюїс та меланомою В-16. Розміри пухлин були меншими на 46% та 53% відповідно. До найбільш суттєвого пригнічення росту саркоми-37 призводило використання вакцини з лектином. Препарати ПГ по відношенню до цієї пухлини виявились менш ефективними.

Методи введення протипухлинних препаратів, в тому числі, і протипухлинних вакцин, ще недостатньо відпрацьовані. Одним з перспективних підходів до імунізації є інтраназальний метод введення, що характеризується рядом переваг. Він індукує розвиток як місцевої, так і системної В-та Т-клітинної імунної відповіді, а також супроводжується дисемінацією імунної відповіді на всі слизові. Цей спосіб вже успішно використовується в клініці при лікуванні меланоми.

Підшкірне введення вакцини з ПГ тваринам з карциномою легені Льюїс спричиняло зменшення відносної ваги тимусу при одночасному зменшені в ньому мононуклеарних лейкоцитів, що може бути свідченням активації Т-клітинного імунітету (табл. 1).

Комбіноване введення вакцини істотно позначилось на вазі селезінки, що вказує на залучення цього органу в розвиток імунних реакцій, ініційованих вакцинацією. Хоча одночасно спостерігалась також зміна в дослідних показниках тимусу.

На відміну від LLC (див. табл. 1), меланома викликала зниження ваги селезінок і вмісту в них мононуклеарних лейкоцитів (табл. 2). Вага і клітинність тимусів також істотно знижувалась. Застосування протипухлинної вакцини сприяло відновленню пригічених функцій лімфоїдних органів. Можливо, саме цим пояснюється більш виразний протипухлинний ефект вакцинації у мишей з меланомою В-16, порівняно з LLC.

Відносна вага лімфатичних вузлів у дослідних тварин була меншою на 50%, а клітинність вдвічі більшою в порівнянні з контрольними тваринами-пухлиноносіями. Відносна вага та клітинність селезінки в дослідній групі тварин була на 20% та 22% (відповідно) більшою в порівнянні з контрольними тваринами-пухлиноносіями. Імунізація тварин-пухлиноносіїв протипухлинною вакциною з ПГ призводила до збільшення маси та клітинності тимуса на 20% та 10% відповідно в порівнянні з контролем.

Мононуклеарні фагоцити є дієвими ефекторами протипухлинного імунітету. Дослідження кисне-залежного метаболізму цих клітин при застосуванні протипухлинної вакцини з пептидогліканом показало наступне. У контрольних пухлиноносіїв були достовірно знижені спонтанна метаболічна активність і стимульована, що свідчить про втрату фагоцитами функціонального резерву (рис. 9.).

Дослідження як спонтанного, так і стимульованого кисне-залежного метаболізму перитонеальних макрофагів у тварин з карциномою легені Льюїс не показало достовірних відмінностей цих показників між контролем пухлини і дослідними групами. Показники кисне-залежного метаболізму перитонеальних макрофагів у мишей з меланомою В-16 були іншими. У контрольних тварин з пухлиною спостерігалось пригнічення спонтанного кисне-залежного метаболізму перитонеальних макрофагів (рис. 10.) в порівнянні з інтактними тваринами на 26%. Одночасно мало місце збільшення функціонального резерву клітин, що свідчить про активне залучення фагоцитів у тривалу протипухлинну імунну відповідь.

Імунізація тварин підшкірно спричиняла достовірне посилення спонтанної метаболічної активності перитонеальних макрофагів у тварин з меланомою В-16 (до рівня інтактних тварин). Комбінована імунізація протипухлинною вакциною приводила до ще більш істотної стимуляції як спонтанного, так і стимульованого кисне-залежного метаболізму перитонеальних макрофагів в середньому на 20% в порівнянні з інтактним контролем. Порівняно з контрольними пухлиноносіями у тварин, вакцинованих комбіновано, спонтанна функціональна активність макрофагів була вищою на 62%, стимульована - на 19%.

Зважаючи на те, що ад'ювантні компоненти більшості протипухлинних аутовакцин обмежуються неспецифічною активацією імунних реакцій і не несуть корисної інформації для адаптивного імунітету лише перевантажуючи імунну систему антитілами зайвої специфічності, утворення антитіл до компонента клітинної стінки золотавого стафілокока може сприяти формуванню антистафілококового імунітету і профілактиці тяжких інфекційних ускладнень стафілококової етіології.

Як показали результати досліджень, введення тваринам з експерименталь-ними пухлинами вакцини з ПГ, спричиняло утворення специфічних антитіл до ПГ (рис. 11.). Слід також зазначити, що у випадку карциноми легені Льюїс ефективнішим виявилось комбіноване введення вакцини, тоді як у мишей з меланомою В-16 - підшкірне.

Різний ступінь гальмівного ефекту препаратів ПГ при різних типах пухлин, ймовірно, може бути наслідком особливостей формування протипухлинного імунітету на пухлини різного походження, а також результатом різної реакції самих пухлинних клітин на ПГ. Причиною різної реакції на ПГ також можуть бути генетично-детерміновані відмінності імунологічної реактивності у тварин різних ліній, оскільки карцинома і меланома перещеплюється мишам лінії С₅₇В1/₆, а саркома-180 і -37 - Balb/c.

Відомо, що S. aureus є одним з основних етіологічних факторів інфекційних ускладнень в онкології. Зважаючи на це, видоспецифічний ПГ може розглядатись як перспективний ад'ювант у складі протипухлинних вакцин, котрий, паралельно з активацією протипухлинного імунітету, забезпечує формування імунітету проти золотавого стафілокока.

Висновки

У результаті виконаної роботи досліджені і визначені імуномодуляторні і протипухлинні властивості пептидоглікану Staphylococcus aureus Wood 46, доведено перспективність його використання у протипухлинній терапії як самостійно, так і у складі протипухлинної вакцини.

1. Експериментально доведена ефективність пептидоглікану Staphylococcus aureus Wood 46 в якості протипухлинного агенту. Імуномодуляторні ефекти пептидоглікану Staphylococcus aureus Wood 46 при пухлинному рості залежать від дози та способу його введення.

2. Пептидоглікан Staphylococcus aureus Wood 46 здійснює стимуляторний вплив як на спонтанний, так і на стимульований кисне-залежний метаболізм фагоцитів різних популяцій, а також на цитотоксичну активність природних кілерних клітин in vitro.

3. Бактеріальний глікопептид здатний спричиняти загибель пухлинних клітин при сумісному їх культивуванні in vitro. Максимальний відсоток загиблих клітин L-929 спостерігається при їх обробці ПГ у концентраціях 100 і 250 мкг/мл, і перевищує показники спонтанної загибелі в 5,4 і 6,2 рази відповідно. Відносний відсоток мертвих клітин LSK, оброблених пептидогліканом у концентрації 250 мкг/мл, був в 2,5 рази більшим за контрольні проби. Т- і В-клітинні лімфобласти людини виявились практично не чутливими до дії пептидоглікану Staphylococcus aureus Wood 46.

4. Одноразове введення пептидоглікану Staphylococcus aureus Wood 46 в зону трансплантації клітин експериментальних пухлин в дозі 8 мкг/г гальмувало ріст карциноми легені Льюїс на 25% і помірно інгібувало ріст саркоми S180 на ранніх етапах після перещеплення.

5. Імунізація пептидогліканом Staphylococcus aureus Wood 46 як підшкірно, так і внутрішньочеревно в дозі 8 мкг/г призводила до гальмування росту первинної пухлини у мишей з карциномою легені Льюїс, в середньому, на 25%; метастатичного ураження - на 64%.

6. Вакцина з пептидогліканом Staphylococcus aureus Wood 46 ефективніше гальмує пухлинний ріст, ніж сам пептидоглікан. З трьох типів експериментальних пухлин більш результативним виявилось введення вакцини з пептидогліканом тваринам з карциномою легені Льюїс та меланомою В-16, що сприяло зменшенню розмірів первинної пухлини на 46% та 53% відповідно.

7. Реакція органів імунної системи на введення вакцини з пептидогліканом Staphylococcus aureus Wood 46 у тварин з різними моделями пухлинного росту відрізняється: у тварин з карциномою легені Льюїс спостерігалось збільшення вагових індексів і клітинності тимусів, що вказує на більш виразну активацію клітинного імунітету. У мишей з меланомою В-16 відмічено достовірне підвищення значень показників ваги і клітинності як для тимусу, так і для селезінки, що свідчить про активацію як клітинних, так і гуморальних імунних реакцій.

8. Імунізація протипухлинною вакциною з пептидогліканом сприяє відновленню кисне-залежного метаболізму перитонеальних макрофагів до рівня інтактних тварин у мишей з меланомою В-16 і не впливає достовірно на метаболізм фагоцитів у мишей з карциномою легені Льюїс.

9. Використання протипухлинної вакцини з пептидогліканом супроводжується появою в сироватці крові антитіл проти пептидоглікану, що свідчить про формування гуморального імунітету проти стафілококової інфекції паралельно з активацією протипухлинних імунних реакцій.

Список опублікованих праць за темою дисертації

1. Вплив стафілококового пептидоглікану на ріст і метастазування карциноми легені Льюїс у мишей / Л.М. Сківка, В.В. Позур, Т.М. Фурзікова [та ін.] // Доповіді Національної академії наук України - 2006. - №5. - С. 155-157. (Дисертантом особисто проведено імунізацію тварин стафілококовим пептидогліканом, дослідження впливу пептидоглікану на ріст і метастазування експериментальної пухлини, здійснено аналіз і статистичну обробку результатів дослідження, роботу до друку підготовлено колективно).

2. Позур В.В. Пептидоглікан Staphylococcus aureus та його імунобіологічні властивості / В.В. Позур, Л.М Сківка, Г.П. Потебня // Біополімери і клітина - 2008. - №1. - том 24. - С. 3-14. (Дисертантом особисто підібрано і проаналізовано наукову літературу стосовно імунобіологічних властивостей пептидогліканів та перспективи їх застосування в якості ад'ювантів в імунотерапії злоякісних новоутворень, підготовлено роботу до друку).

3. Позур В.В. Вплив протипухлинної вакцини на основі пептидоглікану Staphylococcus aureus Wood 46 на ріст меланоми В-16 / В.В. Позур, Л.М Сківка, Г.П. Потебня // Імунологія та алергологія - 2008. - №3. - С. 8-10. (Дисертантом особисто проведено планування схеми експерименту, виготовлення протипухлинної вакцини з пептидогліканом, імунізацію тварин вакциною, дослідження її впливу на ріст меланоми В-16 у мишей, здійснено аналіз і статистичну обробку результатів дослідження, підготовлено роботу до друку).

4. Позур В.В. Вплив пептидоглікану Staphylococcus aureus Wood 46 на кисне-залежний метаболізм макрофагів і нейтрофілів / В.В. Позур, Л.М Сківка, Г.П. Потебня // Доповіді Національної академії наук України - 2008. - №3. - С. 156-158. (Дисертантом особисто проведено планування схеми експерименту, дослідження впливу пептидоглікану на кисне-залежний метаболізм макрофагів і нейтрофілів в НСТ-тесті, здійснено аналіз і статистичну обробку результатів дослідження, роботу до друку підготовлено колективно).

5. Позур В.В. Вплив аутовакцини на основі пептидоглікану Staphylococcus aureus Wood 46 на динаміку росту експериментальних пухлин у мишей / В.В. Позур, Л.М Сківка, Г.П. Потебня // Доповіді Національної академії наук України - 2008. - №12. - С. 145-149. (Дисертантом особисто проведено планування схеми експерименту, виготовлення протипухлинної вакцини з пептидогліканом, імунізацію тварин вакциною, дослідження її впливу на ріст експериментальних пухлин різного гістогенезу у мишей, здійснено аналіз і статистичну обробку результатів дослідження, підготовлено роботу до друку).

6. Позур В.В. Реакція лімфоїдних органів мишей на пептидоглікан Staphylococcus aureus Wood 46 в нормі і при пухлинному рості / В.В. Позур, Л.М Сківка, Г.П. Потебня // Мікробіологія і біотехнологія - 2008. - №3. - С. 69-74. (Дисертантом особисто проведено планування схеми експерименту, імунізацію тварин пептидогліканом, визначення маси та клітинності лімфоїдних органів, аналіз і статистичну обробку результатів дослідження, роботу до друку підготовлено колективно).

7. Патент на корисну модель А61К35/12, №31924. Україна. «Спосіб отримання протипухлинної аутовакцини» / Сківка ЛМ, Позур ВВ, Потебня ГП, Черемшенко НЛ, Позур ВК (Україна); №2007 14465; Заявл. 21.12.2007; Опубл. 25.04.2008: Бюл. №8. (Дисертантом особисто проведено виготовлення протипухлинної вакцини з пептидогліканом, аналіз і статистичну обробку результатів дослідження, матеріал до патентування підготовлено колективно).

8. Skivka L. The effect of peptidoglycan from Staphylococcus aureus on cytotoxic activity of murine mononuclear splenocytes / L Skivka, A Fedorchuk, O Pyaskovskaya, N Khranovska, V Pozur // 5^th meeting of the European mucosal immunology group (Prague, Czech republic) 5-7 october 2006. - Cz., 2006. - Р. 63.

9. Позур В.В. Вплив стафілококового пептидоглікану на метаболічну активність фагоцитів різних популяцій / В.В. Позур, Л.М. Сківка, Г.П. Потебня // VI Всеукраїнська конференція студентів та аспірантів «Дослідження молодих вчених на Україні» 20-21 вересня 2007 р. - К., 2007. - С. 42-43.

10. Позур В.В., Порівняльна характеристика впливу різних доз пептидоглікану S. aureus на ріст експериментальних пухлин у мишей / В.В. Позур, М.П. Рудик, Л.М. Сківка, В.К. Позур // V міжнародна науково-практична конференція «Становление современной науки - 2007» 1-15 жовтня 2007 р. - Д., 2007. - С. 42-44.

11. Позур В.В., Л.М. Сківка, Г.П. Потебня Динаміка росту експериментальних пухлин у мишей під впливом аутовакцини з пептидогліканом / В.В. Позур, Л.М. Сківка, Г.П. Потебня // IV Міжнародна наукова конференція «Молодь та поступ біології» 7-10 квітня 2008 р. - Л., 2008. - С. 332.

12. Позур В.В. Порівняльна характеристика різних способів введення протипухлинної аутовакцини на основі пептидоглікану Staphylococcus aureus Wood 46 у мишей з меланомою В-16 / В.В. Позур, Л.М. Сківка, Г.П. Потебня // VI Міжнародна науково-практична конференція студентів, аспірантів та молодих вчених «Шевченківська весна» 20-23 березня 2008 р. - К., 2008. - С. 87-88.

13. Позур В.В. Вплив пептидоглікану Staphylococcus aureus Wood 46 та протипухлинної аутовакцини виготовленої на його основі на динаміку росту карциноми легені Льюїс у мишей / В.В. Позур, Л.М. Сківка, Г.П. Потебня // ІХ Міжнародна конференція молодих онкологів «Сучасні проблеми експериментальної та клінічної онкології» 23-24 квітня 2008 р. - К., 2008.-С. 89.

Размещено на Allbest.ru