Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ БІОРЕСУРСІВ І ПРИРОДОКОРИСТУВАННЯ УКРАЇНИ

03.00.04 - біохімія

УДК 577.112:577.122:579.222:576.32

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук

МОЛЕКУЛЯРНІ АСПЕКТИ ЕКЗОГЕННОЇ РЕГУЛЯЦІЇ МЕТАБОЛІЗМУ У КЛІТИНАХ МІКРООРГАНІЗМІВ-СИМБІОНТІВ ТА ТВАРИНИ-ГОСПОДАРЯ

КАЛАЧНЮК ЛІЛІЯ

ГРИГОРІВНА

Київ - 2009

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Науково-дослідному інституті біотехнологічних основ підвищення продуктивності тварин Львівського національного університету ветеринарної медицини та біотехнологій імені С.З. Ґжицького Міністерства аграрної політики України

Науковий консультант

доктор біологічних наук, професор, академік НАН України і УААН Мельничук Дмитро Олексійович, Національний університет біоресурсів і природокористування України, ректор, професор кафедри біохімії тварин, якості і безпеки сільськогосподарської продукції імені академіка М.Ф.Гулого

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, професор, членкор УААН Захаренко Микола Олександрович, Національний університет біоресурсів і природокористування України, директор Науково-дослідного інституту технологій та якості продукції тваринництва і рибництва

доктор біологічних наук, професор, членкор НАН України Костерін Сергій Олексійович, Інститут біохімії імені О.В. Палладіна НАН України, завідувач відділу біохімії м'язів, заступник директора з наукової роботи

доктор біологічних наук, професор Войціцький Володимир Михайлович, Київський національний університет імені Тараса Шевченка, професор кафедри біохімії

Захист відбудеться «03» квітня 2009 р. о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.004.08 у Національному університеті біоресурсів і природокористування України за адресою: 03041 м. Київ-41, вул. Героїв Оборони, 15, навчальний корпус № 3, ауд. № 65

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного університету біоресурсів і природокористування України за адресою: 03041 м. Київ-41, вул. Героїв Оборони, 13, навчальний корпус № 4, кімн. № 28

Автореферат розісланий «27» лютого 2009 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради Є.А. Деркач

1. ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Процеси екзогенної регуляції метаболізму в клітинах мікроорганізмів-симбіонтів, які заселяють травний канал, та в соматичних клітинах макроорганізму тварини-господаря, що надає відповідне місце й створює сприятливі умови для існування мікробів, здійснюються за участю складного ланцюга біохімічних перетворень на рівні функціонування субклітинних структур і біополімерів (Ґжицький С.З., 1962, 1976; Курилов Н.В., Кроткова А.П., 1971; Гулий М.Ф., Мельничук Д.О., 1978; Kmet' V., Baran M., Kalachnyuk G., 1990; Marounek M., Kalachnyuk G.I., 1995; Калачнюк Г.И., 2000; Кравців Р.Й. та ін. 2000; Янович В.Г., Сологуб Л.І., 2000; Rychlik J.L., Russel.J.B., 2000, 2002; Мельничук Д.О. та ін., 2006, 2007; Мельничук С.Д., Мельничук Д.О., 2006). Науково-теоретичні основи досліджень з цієї проблеми на клітинному рівні були закладені в роботах багатьох вітчизняних вчених (Мацука Г.Х., 2000; Комісаренко С.В., 2000; Костерін С.О., 2000; Єльська Г.В., 2002; Великий М.М., 2002; Стойка Р.С., 2002, 2006; Цудзевич Б.О., 2002; Захаренко М.О., 2004; Федоренко В.О., 2004; Кононський О.І., 2006; Тукало.М.А., 2006; Малюта С.С., 2007; Войціцький В.М., 2008; та ін.).

У загальному обсязі молекулярних механізмів екзогенної регуляції метаболічних процесів на клітинному рівні в організмі тварин передусім особливу роль відіграють природа й фізико-хімічні властивості біосубстратів, які надходять у травний канал і засвоюються клітинами багатьох видів корисних симбіотичних прокаріотів, що згодом стають цінною поживою для життєдіяльності еукаріотичних клітин організму тварини та впливають на її здоров'я, ріст, розвиток, показники продуктивності. Вивченню наведеного важливого регуляторного аспекту присвячено велику кількість наукових досліджень. Серед них порівняно мало експериментальних робіт було спрямовано на з'ясування ролі еукаріотичних клітин організму тварини-господаря у механізмах підтримання вищевказаних симбіотичних взаємовідносин і зовсім відсутні наукові пошуки у згаданому напрямі на молекулярному рівні, без яких неможливо вирішити основні завдання галузі тваринництва за сучасних умов. Тому, враховуючи вищенаведене й поставлені перед наукою загальнобіологічні завдання щодо необхідності з'ясування основних закономірностей становлення й розвитку симбіотичних взаємозв'язків клітин організму тварини-господаря з клітинами популяції мікроорганізмів його травного каналу, з метою стимуляції антитоксичних коригуючих та анаболічних процесів, а також прискорення темпів збільшення виробництва високоякісних продуктів тваринництва, обрана тема дисертаційної роботи є актуальною i перспективною.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота була складовою частиною комплексних досліджень НДІ біотехнологічних основ підвищення продуктивності тварин Львівського національного університету ветеринарної медицини та біотехнологій імені С.З..Ґжицького, які виконувалися на замовлення Департаменту кадрової політики, аграрної освіти та науки МАП України з тем 9/1 і 9/9 (№.Держреєстрації 0198U008022) «Розробити нові, комплексні біотехнологічні способи підвищення вмісту рістстимулюючих речовин у природних кормових засобах» та № 1/19 - «Внутрішньоклітинний метаболізм мікробних популяцій травного тракту тварин за дії екзогенних факторів, токсичних речовин і природних сорбентів» (№ Держреєстрації 0108U001919); фрагментом науково-дослідних робіт, проведених разом з Національним аграрним університетом України Кабінету Міністрів України з тем № 1/51-пр - «Вплив фосфоліпідів молока на відновлення обміну речовин у печінці за розвитку ентеропатології у новонароджених телят» (№ Держреєстрації 0101U001695) і № 21/178-пр/13 - «Вивчити молекулярно-біологічні механізми регуляції метаболічних процесів у печінці лікарськими препаратами на основі фосфоліпідів молока» (№.Держреєстрації 0106U003305), з Інститутом фізіології і генетики тварин Чеської Академії наук з тем: «Біохімічні механізми регуляції мікробних перетворень у травному тракті тварин», «Біотехнологічні аспекти регуляції процесів травлення у тварин», «Вивчення метаболічних процесів у організмі тварин» і «Розробка фізіолого-біохімічних та біотехнологічних основ підвищення продуктивності тварин», а також з Хіросакським університетом за програмою Міжнародного фонду Матсумае (Японія) з теми «Вивчення молекулярних механізмів трансляційних переключень на рибосомах клітин», у яких автором вивчалися молекулярні аспекти екзогенної регуляції метаболізму в клітинах мікроорганізмів-симбіонтів та тварини-господаря.

Мета і завдання дослідження. Метою дисертацiйної роботи було вивчення молекулярно-біологічних аспектів регуляції метаболізму в клітинах мікроорганізмів-симбіонтів та тварини-господаря з урахуванням сучасного стану розвитку галузі тваринництва та багатьох чинників складного механізму послідовних біохімічних перетворень на різних рівнях функціонування окремих клітинних асоціацій, субцелюлярних структур, біополімерів та їх комплексів.

Для досягнення мети було поставлено такі основні завдання:

- на моделі функціонування рибосомального апарату клітини Escherichia coli з'ясувати роль його окремих учасників, в тому числі й RsgA-білка, у процесах трансляції і транс-трансляції;

- дослідити роль зовнішньоклітинного редокс-потенціалу (Eh) у метаболізмі популяцій мікроорганізмів-симбіонтів та їх окремих видів для можливого використання в регуляції рівня засвоєння поживних речовин;

- виявити існування додаткових ензимних реакцій на шляхах засвоєння вуглецю й амонійного азоту мікроорганізмами рубця та можливості їх корекції екзогенними чинниками;

- вивчити інгібувальну дію пентахлорфенолу на біохімічні процеси в клітинах мікроорганізмів-симбіонтів травного каналу тварин на тлі впливу різноманітних за природою чинників та можливості ефективного використання існуючих внутрішньоклітинних метаболічних шляхів й способів зниження токсичності біоцидів в організмі;

- з'ясувати особливості просторової структури і взаємодії тирозинової тРНК з гомологічною аміноацил-тРНК-синтетазою та процесів якісного контролю в клітинах еукаріотів і прокаріотів при виникненні помилок на рівні реакцій аміноацилювання транспортних рибонуклеїнових кислот;

- встановити походження та роль межувальної глутаматдегідрогенази слизової оболонки рубця в метаболізмі мікроорганізмів-симбіонтів і макроорганізму жуйної тварини та її плода;

- вивчити зміни у структурно-функціональному стані клітин печінки телят при диспепсії та здійснити пошук ефективних способів їх корекції.

Об'єкт дослідження: метаболічні процеси на різних рівнях структурної організації й функціонування клітин еукаріотів і прокаріотів, які тісно пов'язані з системою травлення, входять до складу популяцій мікроорганізмів-симбіонтів, окремих штамів, ізольованих із травного каналу тварин.

Предмет дослідження: зміни в метаболічних процесах на різних рівнях структурної організації та функціонування клітин еукаріотів і прокаріотів за впливу різноманітних факторів.

Методи дослідження: біохімічні (виділення, очищення, кількісний та якісний аналіз ізоакцепторних тирозинових тРНК, РНК, тмРНК, ДНК, аміноацил-тРНК-синтетаз, RsgA); хроматографічні; спектрофотометричні (визначення концентрації метаболітів й активності ензимів); центрифугування, ультрацентрифугування; електрофоретичні (для аналізу ДНК, РНК, білків), мікробіологічні (одержання зразків мікробних популяцій, їх культивування), молекулярно-біологічні (гель-електрофорез тРНК, тмРНК, секвенування тРНКТир1 і 2, експресія та очищення білків, вивчення зміни рухливості РНК-білкових комплексів), Вестерн-блот аналіз білків, імунобіологічні, потенціометричні, фармакологічні (встановлення ступеня токсичності різних доз біоциду) й статистична обробка результатів.

Наукова новизна одержаних результатів. У дисертації викладено результати вивчення закономірностей інтра- й екзоцелюлярного метаболізму, а також особливостей екзогенного впливу на молекулярно-біохімічні механізми перетворення у клітинах мікроорганізмів-симбіонтів і тканин травної системи тварини-господаря.

Вперше наведено дані про особливості контактування нововідкритої ГТФ-ази (RsgA) з малою субодиницею рибосоми в клітинах E. coli. Показано, що RsgA, який на початкових стадіях очистки фракціонується в комплексі з іншими тмРНК-зв'язувальними білками: VacB, SAF, S1, PrsA, SmpB й аланіл-тРНК-синтетазою, з високим ступенем афінності може зв'язуватися з транспортно-матрицевою РНК (котра співседементується із 70S рибосомою), не впливаючи на швидкість її аміноацилювання аланін-тРНКсинтетазою, і здатний приймати участь у трансляційних і/або транс-трансляційних процесах. Інгібування активації RsgA аміноглікозидними антибіотиками, які зв'язуються з 30S рибосомальною субодиницею в зоні аміноацилюючого сайту, відкривають нові деталі функціонування рибосоми та можливі механізми регуляції трансляційних процесів.

Показано, що в підтриманні стабільного стану функціонування травної системи важливу роль відіграє зовнішньоклітинний редокс-потенціал і екзогенні фактори щодо мікробної клітини, які здатні його змінити. Швидкість зниження концентрації аміаку в рубці відбувається не тільки шляхом утворення глутамату та глутаміну, але і за допомогою синтезу піроглутамату (піролідонкарбонової кислоти). Корекцію цих процесів можна здійснювати аліментарними чинниками. Встановлено відсутність фосфокетолази (ключового ензиму пентозофосфатного циклу) в клітині пектинолітичної бактерії Butyrivibrio fibrisolvens 787 навіть за умов повної утилізації пектину, ксилози та інших субстратів. Виявлення в цій же клітині високої активності 2-кето-3-дезокси-6-фосфоглюконатальдолази та фруктозодифосфатальдолази свідчить про перетворення згаданих сполук шляхами Ентнера-Дудорова й Ембдена-Мейєргофа-Парнаса, ключовими ензимами яких вони є. Зміну швидкості їх та стехіометрію утворених метаболітів можна регулювати багатьма факторами живлення. При надходженні в шлунково-кишковий канал біоцидів токсичність їх вірогідно знижується за наявності в середовищі природних сорбентів, йонофору й легкодоступних джерел енергії. З'ясовано молекулярні механізми взаємодії окремих макромолекул у клітинах, властивості глутаматдегідрогенази слизової оболонки рубця еукаріотичного й прокаріотичного походження, зміни рівнів азотфіксуючих і дегідрогеназних реакцій в тканинах слизової оболонки рубця та печінки за умов довготривалої дії йонофору, вплив надлишків аміаку на метаболічні процеси в організмі жуйної тварини й її плода та інше. За умов виникнення аліментарної диспепсії в телят знижується майже на 30 % загальний вміст ліпідів й їх компонентів і в 4 рази концентрація ароВ 100 у гепатоцитах, що вказує на різкі зміни синтезу й секреції останнього та на ко- і посттранскрипційні механізми регуляції його продукції. Згадані й інші порушення обміну речовин можна коригувати за допомогою використання традиційної схеми лікування в поєднанні з застосуванням комплексних фосфоліпідвмісних біологічно активних добавок молочного походження, при цьому активність ключових ензимів циклів трикарбонових кислот і сечовиноутворення відновлюється на 80-90 %.

Пріоритетність отриманих результатів дисертації досліджень підтверджено деклараційними патентами України на корисну модель № 19957 і № 26782.

Практичне значення одержаних результатів. Результати можуть бути використані передусім в якості необхідного біохімічного підґрунтя для створення науково-дослідної програми молекулярно-біологічних досліджень закономірностей взаємовідносин між клітинами мікроорганізмів-симбіонтів і тварини-господаря за різних умов існування з метою розробки ефективних заходів зміцнення здоров'я тварин, збільшення виробництва високоякісної екологічно чистої продукції тваринництва. Одержані результати є цінними для розробки нових і вдосконалення існуючих способів використання корисної популяції мікроорганізмів-симбіонтів, окремих їх видів і штамів з метою зниження токсичної дії біоцидів.

За умов комплексного використання соєвих і ріпакових високопротеїнових кормових добавок та карбаміду з метою ефективного засвоєння азотовмісних речовин клітинами макроорганізму тварини-господаря в склад раціонів доцільно додатково вводити природний сорбент (кліноптилоліт) і йонофор (монензин). Рівень анаболічних процесів у клітинах мікроорганізмів-симбіонтів травного каналу тварин можна підвищити також корекцією раціону за допомогою додавання відповідних джерел енергії (цукру, крохмалю, пектину тощо).

При виникненні диспепсії аліментарного походження в новонароджених телят підтверджена доцільність застосування комбінованої терапії, яка разом із традиційним лікуванням включає застосування комплексної фосфоліпідвмісної біологічно активної добавки FLP-MD.

Результати досліджень використовуються в навчальній роботі Львівського національного університету ветеринарної медицини та біотехнологій імені С.З. Ґжицького й інших науково-навчальних закладах України.

Матеріали дисертаційної роботи використані при написанні «Малої енциклопедії ветеринарної медицини» (Львів, 2008), рекомендацій з науково-практичним обґрунтуванням: «Біотехнологічні основи використання модифікованих ріпакових кормових добавок у тваринництві» (Київ: МАП України, 2000) і «Відновлення внутрішньоклітинного метаболізму в печінці телят при ентеропатології» (Київ: МАП України, 2006), а також - у селянському виробничому кооперативі «Відродження» Радивилівського району Рівненської області, що підтверджено відповідними документами.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота виконана автором відповідно до програми експериментальних досліджень, спланованих, проведених й узагальнених упродовж докторантури за участі наукового консультанта, академіка НАНУ і УААН Д.О. Мельничука. Особисто дисертантом проведено вивчення наукової літератури за темою дисертації й виконано весь обсяг експериментальних досліджень, їх аналіз й узагальнення одержаних результатів. Дослідження процесів функціонування рибосомального апарату проведено за участю професорів Хіросакського університету А. Муто та Х. Хімено, а особливостей метаболізму мікроорганізмів-симбіонтів за участю професора Інституту фізіології і генетики тварин Чеської Академії наук М. Мароунека й інших співробітників, що висвітлено у спільних наукових працях.

Автор висловлює щиру подяку за наукову та методичну допомогу при виконанні дисертаційної роботи науковому консультанту, співробітникам і керівництву Львівського національного університету ветеринарної медицини та біотехнологій імені С.З. Ґжицького, Національного університету біоресурсів і природокористування України, Інституту молекулярної біології і генетики НАНУ, Хіросакського університету, Інституту фізіології і генетики тварин Чеської Академії наук.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації були представлені на наукових форумах: The Fifth International Symposium on Nucleic Acids Chemistry (Japan, Tokyo, 2007); The 15-th International tRNA Workshop (Cap d'Agde, France, 1993), The 46th Annual Meeting of the European Association for Animal Production (Prague, Czech Republic, 1995); VIII і ІХ Українські біохімічні з'їзди (Чернівці, 2002; Харків, 2006); The First (Inaugural) Ukrainian Congress for Cell Biology (Lviv, 2004); The 1st Polish-Ukrainian Scientific Conference «Anim. Sci. in the XXI century» (Krakow, 2001); XIX Dni Ћivoиiљnej fyziolуgie (Slovensko, Koљice, 2001); Jubilejnich XX. DNЩ Ћivoиiљnй fyziolуgie (Иeskб Republika, Tшeљt, 2002); Третій Західноукраїнський симпозіум з адсорбції та хроматографії (Львів, 2003); Науково-практична конференція «Актуальні проблеми токсикології, гігієни та аналітичної хімії пестицидів і агрохімікатів» (Київ, 2003), Науково-практична конференція «Ветеринарні та зоотехнічні проблеми у придніпровському регіоні» (Дніпропетровськ, 1996); III Международная конференция «Актуальные проблемы биологии в животноводстве» (Россия, Боровск, 2000); Конференція молодих вчених і спеціалістів «Досягнення і перспективи розвитку агробіотехнології в Україні» (Київ, 2002); Міжнародні науково-практичні конференції «Сучасність і майбутнє аграрної науки та виробництва» (Львів, 2005, 2006); Міжнародні науково-практичні конференції «Інноваційність розвитку сучасного аграрного виробництва» (Львів, 2007, 2008); Міжнародні науково-практичні конференції молодих вчених та спеціалістів «Молоді вчені у вирішенні проблем аграрної науки і практики» (Львів, 2003, 2004, 2008); Всеукраїнська наукова конференція «Фундаментальні та прикладні аспекти гастроентерології» (Київ, 2008); щорічні звітні наукові конференції Львівського національного університету ветеринарної медицини та біотехнологій імені С. З. Ґжицького (2001-2008).

Публікації. Основні матеріали дисертаційної роботи висвітлені у 72 друкованих наукових працях, з яких у посібнику - 1, у журналах та збірниках наукових праць - 52, патентах - 2, рекомендаціях - 2, тезах міжнародних і всеукраїнських наукових форумів - 15.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду наукової літератури, матеріалів і методів досліджень, результатів експериментальних досліджень, аналізу та узагальнення результатів досліджень, висновків, додатків та списку використаних джерел, що включає 771 найменування, з яких 605 латиницею. Робота викладена на 513 сторінках комп'ютерного тексту, містить 85 рисунків і 65 таблиць.

2. ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи досліджень. Експериментальні дослідження були проведені впродовж 1992-2008 рр. на базі НДІ біотехнологічних основ підвищення продуктивності тварин ЛНУВМтаБТ імені С.З..Ґжицького, Національного університету біоресурсів і природокористування України, Інституту фізіології і генетики тварин Чеської АН, Хіросакського університету, Інституті біології тварин УААН, Інституту молекулярної біології і генетики НАНУ, Закарпатського інституту агропромислового виробництва УААН, господарств Західного регіону України та ін. Виходячи з основних завдань було проведено 26 серій експериментів (рис. 1).

Матеріалом для досліджень слугували тканини: слизової оболонки рубця, сітки, книжки, сичуга, сліпої й прямої кишки та печінки тільних корів й їх плодів, вмістиме рубця, адгеровані мікроорганізми на його слизовій оболонці й кров; бактерії: E. coli W3110, W3110ДssrA, які були люб'язно надані професорами А. Муто і Х. Хімено (Хіросакський університет, Японія); чисті бактеріальні культури (Butyrivibrio fibrisolvens 787, Megasphaera elsdenii LC1, LC8; Selenomonas ruminantium Z108, Bacteroides amylophilus WP91, Bacteroides succinogenes BP2, Streptococcus bovis АО 24/85, Streptococcus bovis ESI та ін.) із колекцій Інституту фізіології i генетики тварин ЧАН (Чехія), Інституту фізіології тварин САН (Словаччина) й Роветського науково-дослідного інституту (Шотландія) та зразки змішаної популяції мікроорганізмів-симбіонтів рубця й інших відділів травного каналу різних видів тварин з урахуванням віку, статі й умов живлення. Досліди проводили в умовах in vivo та in vitro. Для відновлення структурно-функціонального стану клітин печінки телят використовували комплексний фосфоліпідвмісний препарат FLP-MD, розроблений вченими Національного університету біоресурсів і природокористування України (Мельничук Д., Грищенко В., 2005).

З'ясовуючи роль окремих учасників рибосомального апарату клітини E. coli, згідно описаних методик у вказаних роботах культивували бактеріальні штами (Muto A. et al., 1996), виділяли рибосоми, тмРНК, аланіл-тРНК-синтетазу (відповідно: Ushida C. et al., 1994 і Blaha G. et al., 2000; Komine Y. et al., 1994, 1996; Himeno H., 1997) і виявляли утворені комплекси білків з тмРНК (Ushida C. et al., 1994). З метою вивчення контактування RsgA (РНК-зв'язувального білка з ГТФ-азною функцією) з рибосомою в трансляційних процесах виділяли його в препаративних й аналітичних кількостях, визначали ГТФ-азну активність у присутності 30S рибосомальних субодиниць та її інгібування антибіотиками, виявляли його комплекси з рибосомальними субодиницями у присутності нуклеозидтрифосфатів у фракціях елюатів після центрифугування в сахарозному градієнті щільності за допомогою Вестерн-блот аналізу (Himeno H. et al., 2004, 2007; Калачнюк.Л.Г., 2005-2007).

Зміни рівнів рН і зовнішньоклітинного редокс-потенціалу визначали в інкубаційному середовищі та вмісті рубця жуйної тварини, сліпої кишки свині й кроля за допомогою платинових електродів по Жакобу (1970), а прирости мікробної й білкової біомаси - спектрофотометрично (А600 і А280, відповідно), традиційні біохімічні показники - за методами, описаними Калачнюк Г.І., Мароунек М., Калачнюк Л.Г., Савка О.Г. (1994), концентрацію амоніаку й білка - згідно опису в роботах Калачнюк Г.И. (1981) й Lowry О.Н. et al. (1951), загальну кількість низькомолекулярних карбонових кислот - шляхом парової дистиляції в апараті Маркгама із наступним титруванням (Fridemann Т.E., Brook T., 1938), індивідуальних летких жирних кислот (ацетат, пропіонат, бутират й інші) - на газових хроматографах («Chrom-4», mod. Laboratory Instruments, Prague. Чеська Республіка; та «Fractovap». mod. GV, Carlo Erba, Divisione apparecchi scientificі, Italia); лактат - ензиматично за методикою M. Hohornst (Калачнюк Г.И. и др., 1991); піруват - високоефективною рідинною хроматографією (Duљkova D., Marounek M., 2001); форміат - колориметрично, ксилозу - за допомогою орцинового реагенту (Kova L. et al., 1996) і глюкозу - за глюкозооксидазо-перокисдазним методом з використанням комерційного Bio-La-Test “Oxochrom Glucose” (Lachema, Brno, Czech Republic); активність ензимів: L-аспартат: 2-оксоглутарат-амінотрансферази (КФ 2.6.1.1) i L-аланін: 2-оксоглутаратамінотрансферази (КФ 2.6.1.2) - згідно пропису (Прохорова М.И., 1982), глутамінсинтетази (КФ 6.3.1.2) і б-кетоглутаратдегідрогенази (КФ 1.2.4.2) за методами відповідно Elliot W.H. (1955) і Sanadi D.R. (1963), лактатдегідрогенази (КФ 1.1.1.27) - за протоколом комерційного набору Lachema (Brno, Czech Republic), малатдегідрогенази (КФ 1.1.1.37), ізоцитратдегідрогенази (КФ 1.1.1.42), малікензиму (малатдегідрогенази [декарбоксилюючої оксалоацетат] (NADP+); КФ 1.1.1.40), форміатдегідрогенази (КФ 1.2.1.2), фумарази (КФ 4.2.1.2) і аконітази (КФ 4.2.1.3) - спектрофотометричними методами (Калачнюк Г.І., Войтюк О.А., Савка О.Г., 1994; Калачнюк Г.И., Мароунек М., Войтюк А.А. и др., 1997), целюлази (КФ 3.2.1.4) й амілази (КФ 3.2.1.1) - згідно опису Kmet' V., Baran M., Kalachnyuk G.I. (1990), фруктозодифосфатальдолази (КФ 4.1.2.13) - за прописом методу № 752 тесту-комплекту Sigma, 2-кето-3-дезокси-6-фосфоглюконатальдолази (КФ 4.1.2.14) - за описом Мароунека М. і Душкової Д. (1999), фосфокетолази (КФ 4.1.2.9) - за методом Маті (Kova L. et al., 1996), глутаматдегідрогенази, яка працює, як з NAD+, так і з NADР+, тобто є неспецифічною до кофактора (КФ 1.4.1.2) у напрямку відновного амінування - за швидкістю окислення коензимів NADPH і NADH (Fisher H.F., 1985) і в напрямку окисного дезамінування - за швидкістю відновлення коензимів NADP+ і NAD+ при А340нм (Holovska K. et al., 1979; Fisher H.F. 1985; Lenartova V., Holovska K., Javorski P. et al., 1987), орнітинтранскарбомоілази (КФ 2.1.3.3) і цитозольної аргінази (КФ 3.5.3.1) - за методами, описаними в роботі (Калачнюк Л. та ін., 2004), цитратсинтази (КФ 4.1.3.7) і цитохром-с-оксидази (КФ 1.9.3.1) згідно методики (Smith L., 1956; Shepherd D., Garland P.B., 1969). Мітохондріальну і цитозольно-мікросомальну субклітинні фракції тканини одержували на холоді з використанням диференційного центрифугування (Прохорова М.И., 1982).

Виділення ДНК із печінки здійснювали згідно методу Мармура в модифікації Ванюшина і Сулімової (1970) та методичних підходів, описаних в роботах (Калачнюк Л., 2004; Мельничук Д.О. та ін., 2006), сумарну тРНК - за методом Брунгабер (Brungraber E.A., 1962), суміші аміноацил-тРНК-синтетаз для визначення акцепторної активності тРНК (Berg B.H., 1975) - за описом (Keller E., 1956). Препарати індивідуальних ізоакцепторних тирозинових тРНК із печінки жуйної тварини (бички) зі сформованим типом рубцевого травлення виділяли комбінацією двох хроматографій на колонках з БД-целюлозою й подальшою очисткою за допомогою електрофорезу в ПААГ (7 %) у 7 М сечовині (Калачнюк Л.Г. 1994). Визначення просторової структури тРНКТир печінки бика в розчині здійснювали за допомогою комплексу методичних підходів, описаних у роботах (Donis-Keller H., 1977; Vlassov V.V., Giege R., Ebel J.P., 1980; Калачнюк Л.Г., 1994). Ділянки взаємодії тирозинової тРНКQ*A із клітин печінки бика з гомологічною аміноацил-тРНК-синтетазою виявляли за допомогою методу хімічної модифікації: алкілування міченої тРНК (1 мкМ) у присутності ферменту або альбуміну сироватки крові бика (по 4 мкМ) згідно опису (Калачнюк Л.Г., 1992, 1995).

Відновлення структурно-функціонального стану клітин печінки телят при диспепсії визначали за результатами аналізу спектрів молекулярних компонентів загальних ліпідів, фосфоліпідів, жирних кислот та кількісних обсягів РНК, загального білка, альбуміну, ароВ згідно описаних методів (Folch J., 1957; Новицкая Г.В., 1972; Vaskovsky V.E. et al., 1975; Љarљunova.M., Schwarz V., Michalec И., 1977; Christlie W.W., 1979; Крепс С.И., 1981; Прохорова М.И., 1982; Калачнюк Л. та ін., 2005).

Експерименти проводили у відповідності до конвенції Ради Європи щодо захисту тварин, які використовуються в наукових дослідженнях.

Статистичну обробку отриманих цифрових даних в усіх проведених дослідженнях здійснювали за допомогою програми Microcal Origin
(Version: 5,0) з використанням t-критерію Стюдента (Кучеренко М.Є., Бабенюк.Ю.Д., Войціцький В.М., 2001).

3. РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Нові механізми регуляції метаболізму в клітині. Біосинтез білка, зокрема трансляція, відбувається за рахунок складної й водночас скоординованої роботи субодиниць рибосоми (Ramakrishnan V., 2002), безпомилкове функціонування яких залежить поряд з іншими відомими чинниками й від ГТФ-аз. Активація цих гідролаз відбувається на 50S субодиниці та спричиняє зміни у структурній конформації рибосоми або ж її великої субодиниці (Rodnina M.V. et al., 2000).

Внаслідок секвенування геному еубактеріальних клітин було виявлено кілька ГТФ-аз з невідомими функціями (Caldon C.E. et al., 2001), одна з яких - RsgA-білок (за синтез якого відповідає ген yjeQ). RsgA за нашими даними вважається дуже цінним і важливим для E. coli. Він має слабкуГТФ-азну активність, яка значно посилюється малою субодиницею рибосоми.

Нижченаведені результати досліджень свідчать, що присутність RsgA значно впливає на ріст клітин та об'єднання субодиниць рибосом. Цей протеїн можна класифікувати як новий тип ГТФ-ази, бо відкриває нові деталі функціонування рибосоми під час канонічної трансляції та транс-трансляції.

Трансляційні переключення на рибосомах. У системі якісного контролю біосинтезу білка мікроорганізмів (зокрема E. coli) важливим є процес транс-трансляції, в якому провідну роль виконує транспортно-матрицева РНК (тмРНК; 10Sa RNA або SsrA RNA) і тмРНК-зв'язувальні білки високомолекулярного комплексу, особливо RsgA, VacB, SAF, S1, PrsA і SmpB, які при хроматографії пост-рибосомального супернатанту клітинного екстракту E. coli W3110 ДssrA (S100) фракціонуються разом з аланіл-тРНК-синтетазою (рис. 2). Характерною ознакою цих білків є зв'язування з тмРНК. Утворення комплексу RsgA з тмРНК виявляли за допомогою використання електрофоретичного прийому детекції зсуву рухливості електрофоретичних смуг у ПААГ (рис. 3). Встановлено, що при збільшенні його концентрацій зростає комплексоутворення RsgA·тмРНК (рис. 3, А). З метою визначення ступеня афінності та специфічності даного білка до нуклеїнової кислоти, з якою він зв'язується, була проведена серія експериментів, у яких до проб із досліджуваним білком та [32Р]-тмРНК додавались “холодні“ тмРНК із E. coli W3110 і дріжджова тРНК різного спектру концентрацій. Рівні конкуренції для транспортної й транспортно-матрицевої РНК з міченою тмРНК при зв'язуванні з RsgA є однаковими тільки за умови вищої в 400-крат концентрації тРНК за тмРНК (рис. 3, Б). Все це вказує на високу ступінь афінності й специфічність тмРНК-зв'язувального білка до тмРНК.

В умовах in vitro тмРНК може аміноацилюватись аланіл-тРНК-синтетазою. Результати щодо аміноацилювання тмРНК аланіл-тРНК-синтетазою в присутності й відсутності RsgA (рис. 3, В) демонструють, що наявність RsgA в реакційній суміші не впливає на швидкість даної реакції.

Загалом, наведені дані свідчать про те, що у випадку виникнення помилок у процесі синтезу білка відбуваються трансляційні переключення на рибосомах, зокрема, вступає в дію система якісного контролю (транс-трансляції). Діючими складовими частинами цієї системи є тмРНК і комплекс тмРНК-зв'язувальних білків, серед яких особливу увагу привертає RsgA. Даному протеїну властива висока ступінь афінності при зв'язуванні з транспортно-матрицевою РНК, і водночас він не впливає на швидкість аміноацилювання тмРНК аланіл-тРНК-синтетазою.

тмРНК-зв'язувальний білок і його роль у трансляції. Поряд з характеристиками RsgA, що розглядалися вище, особливо вагомими для глибшого розуміння трансляційних і транс-трансляційних процесів вважаються дослідження його взаємодії з тмРНК за різних умов.

За допомогою електрофоретичного прийому виявлення зсуву рухливості електрофоретичних смуг РНК-білкових комплексів у ПААГ було встановлено, що RsgA може зв'язуватися: 1) з 30S субодиницею та слабо - з 70S рибосомою, 2) з тмРНК у відсутності й присутності Mg2+ з вищим ступенем комплексоутворення при 20 мМ Мg2+ (не виключається можливість утворення вказаних комплексів за концентрації Мg2+ більше за 20 мМ, оскільки в даній серії експериментів не досліджувалося утворення тмРНК·RsgA за вищих концентрацій іонів магнію) і 3) з рибонуклеїновими кислотами, зокрема з тмРНК, упродовж тривалого часу (30 хв інкубації при 37 і 20 єС).

Враховуючи результати, які підтверджують взаємодію великого білкового комплексу (в складі якого є й RsgA) з тРНКАла, 5S рРНК, тмРНК, а RsgA - з 5S, 16S рРНК та його невзаємодію з 23S рРНК разом з іншими даними, можна припускати, що цей білок має олігонуклеотид-зв'язувальну ділянку. Відносно висока потреба в кількості іонів металу для комплексоутворення може наводити на думку про обов'язкову присутність металозв'язувальної ділянки в структурі RsgA. Поряд з цими ділянками в RsgA існує, можливо, й інша, відповідальна за забезпечення енергетикою процесу приєднання субодиниць, оскільки зв'язування з нуклеїновими кислотами й іонами металу переважно супроводжуються відповідними енергетичними витратами.

Для визначення ролі RsgA використовували клітини E. coli W3110, yjeQ-дефектного та yjeQ-“відновленого“ (за допомогою введення плазміди із геном для синтезу RsgA) штамів. За умов проведення інкубації культур клітин різних штамів час подвоєння клітин виявився в 2,34-крат довшим у тих, в яких був відсутній RsgA, ніж у штаму W3110. Введення плазміди із геном для синтезу RsgA в генетичний матеріал клітин yjeQ_дефектного штаму майже повністю повертає цей показник до значення для штаму W3110.

Порівняльний аналіз одержаних спектрів рибосом, виділених із клітин yjeQ-дефектного і W3110 штамів, які були отримані в результаті центрифугування в сахарозному градієнті щільності, показав, що більшість 70S рибосом із таких дефектних клітин є дисоційованими на субодиниці (рис. 4. криві 1 і 2). Введення гену yjeQ в дефектні клітини за допомогою плазміди відновлює нормальний спектр рибосом (рис. 4, крива 3). Подібні спектри спостерігали тоді, коли клітини вирощували при 30 і 42° С. Все це вказує, що дефіцит RsgA знижує рівень трансляції, призводячи до фенотипу повільного росту клітини.

Експериментальні дані щодо дії RsgA на комплекс рибосомальних субодиниць (рис. 4) є підтвердженням його своєрідної ролі в процесі трансляції, а виявлення домінуючої дисоціації рибосом через втрату цього протеїну слугує доказом того, що він приймає участь не тільки в трансляційному процесі окремої специфічної мРНК.

Привертає увагу те, що RsgA вступає у взаємодію з 30S рибосомальною субодиницею, 16S і 5S рРНК. Він приєднується до дисоційованої малої рибосомальної субодиниці, стимулюючи її об'єднання з великою. Тому, враховуючи вищевказане та здатність RsgA взаємодіяти з 70S рибосомою й не зв'язуватися з 23S рРНК, цей білок можна розглядати одним із чинників успішної ініціації трансляції та можливо й транс-трансляції.

Вищенаведені результати наших досліджень, а також дані літератури дають підстави припускати, що великий протеїновий комплекс («білки S-100»), який зв'язується з тмРНК, приймає участь як у канонічній трансляції, так і в транс-трансляції, а RsgA (один із протеїнів цього комплексу) є своєрідним фактором ініціації трансляції й транс-трансляції. Він у своїй структурі, очевидно, має ділянки, які відповідають за зв'язування РНК й іонів металу та за забезпечення енергією процесу приєднання субодиниць рибосоми.

Особливості контактування RsgA, як нової ГТФ-ази, з малою субодиницею рибосоми. Оскільки, як вказувалося вище, RsgA має слабку ГТФ-азну активність, яка значно посилюється малою рибосомальною субодиницею, то вивчення зростання його активності за різних умов, особливо в присутності антибіотиків, що мають вплив на певні рибосомальні компартменти, може вказувати на особливості його взаємодії з рибосомою. Звідси виявлене нами (рис. 5) зниження ГТФ-азної активності цього білка, виділеного за умов різних концентрацій магнію ацетату (6 і 1 мМ) із 30S-фракції yjeQ-дефектних клітин, у яких повністю дисоційовані на субодиниці 70S рибосоми, порівняно з таким же показником у клітинах дикого штаму (рис. 5, Б, А; криві 1, 2) та різниця між величинами активності залежно від концентрації іонів магнію при виділенні білка (вища ГТФ-азна активність для RsgA, одержаному за умов 1 мМ (СН3СОО)2Mg, ніж при 6 мМ (СН3СОО)2Mg; рис. 5 А, Б, криві 2, 1) вказують на те, що певна популяція малих субодиниць, яка не приймає участі в утворенні 70S рибосом, не здатна підвищувати ГТФ-азну активність RsgA навіть у клітинах дикого штаму, тоді як порушення yjeQ достовірно збільшує розмір такої популяції. Таке явище спостерігається, мабуть, через те, що ця популяція має ще недозрілі форми малих субодиниць. У той же час дві 30S-фракції, які були виділені із 70S рибосом клітин дикого та yjeQ-дефектного штамів, стимулюють зростання ГТФ-азної активності RsgA (рис. 5, А, Б; крива 3).

Наведені на рис. 5 дані свідчать, що мала субодиниця рибосоми здатна вірогідно збільшувати ГТФ-азну активність RsgA. Вивчення впливу специфічних до різних структурних частин рибосоми антибіотиків на активність цього білка є важливим для розуміння її функціонування (рис. 5, В). Як виявилось, на активність RsgA вірогідно впливають аміноглікозидні антибіотики і, зокрема, такі, як неоміцин, паромоміцин, канаміцин та гентаміцин, які є специфічними до 44-го геліксу 16S рРНК малої субодиниці в області А-сайту. Вони індукують помилки трансляції. Додавання 5-500 мкМ цих антибіотиків призводить до 50 % зниження рівня ГТФ-азної активності RsgA. Інгібування її спостерігається також при додаванні вищої концентрації (5 мМ) стрептоміцину або тетрацикліну, які також зв'язуються біля А-сайту рибосоми. Це є підтвердженням того, що RsgA знаходиться в тісному контакті з А-сайтом рибосоми. З іншого боку, ні канаміцин (специфічний до Р-сайту рибосоми антибіотик), ні хлорамфенікол (який зв'язується із пептидил-трансферазним центром великої субодиниці), ні спектиноміцин (що зв'язується з 34-м геліксом 16S рибосомальної РНК, розташованим у ділянці так званої “голови” малої рибосомальної субодиниці), не проявляють впливу на активність RsgA - рибосомально-залежної ГТФ-ази.

Звідси випливає, що інгібування активації RsgA (як ГТФ-ази) аміноглікозидними антибіотиками, які зв'язуються з 30S рибосомальною субодиницею в зоні аміноацилюючого сайту, відкриває нові деталі функціонування рибосоми, а широка його специфічність у зв'язуванні РНК дає підстави вважати, що він дійсно є залученим не тільки у трансляцію окремої специфічної мРНК

Для визначення зв'язування RsgA з рибосомою in vitro було проведено фракціонування суміші його з рибосомами за допомогою центрифугування в сахарозному градієнті щільності та виявлено утворення комплексу за допомогою імуноблотінгу. За відсутності гуанінового нуклеотиду він майже не осаджується або тільки дуже мала його кількість осідає разом із 70S рибосомою чи їх субодиницями. Аналогічне явище спостерігали також й у випадку присутності ГТФ і ГДФ (рис. 6 а, б). Співвідношення рівнів 70S-, 50S- і 30S-фракцій було незмінним, незважаючи на присутність чи відсутність ГТФ і ГДФ. Але у присутності ГДФНФ, аналогу ГТФ, який не піддається гідролізу (рис. 6 в), цей РНК-зв'язувальний білок переважно осаджувався із малою субодиницею рибосоми. Крім того, майже всі рибосоми дисоціюються на субодиниці в присутності ГДФНФ. Аміноглікозидні антибіотики (наприклад, неоміцин) специфічно зв'язуються з нуклеотидами A1492 і A1493 в зоні акцепторного сайту рибосоми E. coli. За додавання 500 мкМ неоміцину (що є достатнім для інгібування зростання ГТФ-азної активності РНК-зв'язувального білка, яка індукується малою субодиницею рибосоми) до реакційної суміші в присутності ГДФНФ, не спостерігається ні дисоціації субодиниць, ні зв'язування RsgA з 30S субодиницею (рис. 6 г). Це вказує на те, що аміноглікозиди швидше інгібують стадію зв'язування ГТФ-форми даного білка з рибосомою, ніж активацію його ГТФ-азної функції після асоціації з рибосомою або дисоціацію його ГДФ-форми від рибосоми.

Отже, RsgA, який був виділений нами із мікробної клітини травного каналу, E. coli, приймає своєрідну участь у швидкоплинних процесах дисоціації субодиниць шляхом зв'язування його ГТФ-форми з 30S субодиницею (яке потребує енергетичного потенціалу, вивільненого внаслідок гідролізу ГТФ за дії цього ж білка) та їх асоціації після від'єднання його ГДФ-форми від малої субодиниці рибосоми.

Молекулярні аспекти екзогенної регуляції метаболізму в клітинах мікроорганізмів-симбіонтів. Роль редокс-потенціалу в метаболізмі мікроорганізмів-симбіонтів. Встановлено, що життєдіяльність різних мікроорганізмів-симбіонтів травного каналу підтримується багатьма факторами, в тому числі і відповідною величиною зовнішньоклітинного редокс-потенціалу. Рівень його в шлунково-кишковому тракті коливається в досить широких межах (від -300 до +200 мВ і ширше). Eh у тих відділах, де відбуваються інтенсивні мікробні ферментативні процеси, є вірогідно зсунутим у зону менших від'ємних величин, ніж у сичузі та дванадцятипалій кишці. Анаеробне і відновлювальне середовище рубця створює вузький діапазон від'ємних значень Eh: переважно від -130 до -200 мВ. Зміни його величин і рН мають лінійну залежність. За умов in vivo та in vitro при посиленому рості клітин змішаної популяції мікроорганізмів-симбіонтів, бактеріальної фракції та чистих штамів зрушення значень Eh у бік менших від'ємних величин (-200 мВ і нижче) супроводжується збільшенням продукції ЛЖК та інших низькомолекулярних сполук.

Eh вмісту рубця відхиляється в зону ще менших від'ємних величин при додаванні Na2S, NaOH, цистеїну і NaHSO4, а вищих додатних значень він набуває при додаванні пікрату, натрію нітриту, соляної кислоти, сірчанокислої міді, газоподібного кисню і, особливо, солей важких металів (срібла та ртуті), внаслідок чого блокується рубцевий метаболізм.

Кожен із мікробів має свої чітко виражені особливості. Наприклад, у процесі росту лактатпродукуючого факультативно-анаеробного штаму Streptococcus bovis AO 24/85 посилюється утворення лактату, ЛЖК, СН2О2 і NH3 на тлі вірогідного зниження рН. Це супроводжується відхиленням Eh у сторону менших від'ємних величин. У зоні ще менших від'ємних величин Eh функціонує лактатутилізуюча грам-позитивна бактерія Megasphera elsdenii. За умов зміщення Eh у бік більших додатних величин гальмується питома швидкість росту багатьох бактерій (Selemonas ruminantium, Bacteriodes amylophilus, Bacteriodes succinogenes та ін.). Змінюючи Eh у бік від'ємних чи додатних величин, можна суттєво регулювати інтенсивність і спрямованість метаболізму мікроорганізмів у травному каналі та адекватно впливати на асиміляційні процеси у клітинах макроорганізму тварини-господаря.

Регуляція аміакоутворення в рубці шляхом змін реакцій синтезу й розпаду глутаміну. Показано, що в процесах амонієгенезу клітини змішаної популяції мікроорганізмів-симбіонтів у рубці здатні перетворювати глутамін не тільки через реакцію утворення глутамату, але й шляхом синтезу піроглутамату (піролідонкарбонової кислоти) і такий механізм дозволяє мікробній екосистемі значно знижувати швидкість утворення NH3 на тлі паралельного збільшення продукції джерел вуглецю та енергії.

Вірогідного зниження процесів утворення NH3 із глутаміну, глутамату і піроглутамату можна досягти шляхом екзогенного використання йонофорного антибіотика монензину, який суттєво зменшує активність глутамінсинтетази, -кетоглутаратдегідрогенази, глутамінциклотрансферази у клітинах грам-позитивних бактерій при активації амінотрансфераз, зростанні рН культурального середовища та відхиленні Eh у бік більших значень його від'ємної шкали.

Субстратно-ерготропна дія на метаболізм мікроорганізмів у травному каналі. Зміни метаболічних процесів у рубці за впливу аліментарних чинників. З'ясовано, що високу метаболізуючу здатність змішаної популяції мікроорганізмів-симбіонтів у рубці, адаптаційні процеси в клітинах тварини-господаря та ефективне функціонування рубцево-печінкового циклу у відгодівельних бичків можна забезпечувати за допомогою збалансованого раціону за азотом ріпакових і соєвих шротів (1:1), карбаміду та іншими поживними речовинами. Це дозволяє одержувати середньодобові прирости тварин вище 1 кг.

Надмірний процес утворення амоніаку в середовищі рубця знижується на 15-30 % (Р < 0,05) за допомогою внесення в раціон борошна кліноптилоліту. Застосування його в поєднанні з монензином вірогідно збільшує позитивний ефект засвоєння небілкового азоту за рахунок селективноого пригнічення росту й розвитку окремих видів мікроорганізмів, інгібування активності уреази й дезамінази та посилення проникності клітинних стінок і мембран. При цьому стимулюється пропіоновокислий тип ферментації, який забезпечує енергією реакції біосинтезу. Утворений пропіонат потрібний для підтримання реакцій глюконеогенезу, біосинтезу амінокислот та білка в печінці.

Метаболізм у сліпій кишці за екзогенної дії. Виявлено, що у кролів, які ростуть, метаболізм мікроорганізмів у сліпій кишці формується з віком і відрізняється від такого в рубці жуйних тварин підвищеною продукцією ацетату (близько 80 моль% у складі суми летких жирних кислот) та низьким рівнем пропіонату (< 5 моль%). Дія екзогенних аліментарних чинників тут є також значною, але кінцевий метаболічний і продуктивний ефект визначається складом раціону й іншим місцем знаходження мікробної популяції в травному каналі, що спонукає кролів до явища копрофагії для повнішого використання поживних речовин, синтезованих клітинами мікроорганізмів-симбіонтів. Тому основні показники цекально-інтермедіарного метаболізму та продуктивності в молодняка кролів є майже рівнозначними при заміні в раціоні 50 % соєвого шроту ріпаковим. За умов додавання 1,5 % карбаміду до комбікорму, що містив соєвий (5 %) і ріпаковий (5 %) шроти, виявлено підвищення рівнів NH3, суми ЛЖК і рН в цекальній екосистемі мікроорганізмів та сечовини, аміаку, активності аспартат- і аланінамінотрансфераз (при зменшенні вмісту глюкози й активності лактатдегідрогенази) в плазмі крові на тлі зниження на 17,3 % приростів живої маси молодняку кролів й збільшення на 19 днів терміну вирощування. Негативні зрушення в показниках окремих ланок цекально-інтермедіарного метаболізму та продуктивності кролів вірогідно змінюються в позитивну сторону за умов додавання до комбікорму 3 % порошку кліноптилоліту. Суттєве наближення їх до рівнів контрольних тварин досягається додатковим згодовуванням монензину, який селективно пригнічує життєдіяльність грам-позитивних бактерій, процеси утворення аміаку та посилює трансмембранний рух поживних речовин у клітинах.

Підвищення інтенсивності анаболічних процесів у клітинах популяції мікроорганізмів травного каналу й органів тварини-господаря забезпечується також і корекцією раціону за допомогою зміни рівнів споживання клітковини, пектину, крохмалю й інших джерел азоту, вуглецю, енергії та біологічно активних речовин. Вищий анаболічний та продуктивний ефект від застосування природних сорбентів і йонофору одержується на тлі використання легкоперетравних вуглеводів (цукру, крохмалю, пектину).

Біохімічні реакції у клітинах популяцій мікроорганізмів за дії токсикантів і протекторів. Метаболізм популяцій мікроорганізмів-симбіонтів, сформованих на різних за перетравністю біосубстратах, та вплив пентахлорфенолу й кліноптилоліту. Показано особливості інгібувальної дії біоциду пентахлорфенолу (ПХФ), різні дози якого по-різному гальмують внутрішньоклітинний метаболізм змішаних популяцій мікроорганізмів, сформованих на різних за поживною доступністю біосубстратах. Низькі дози біоциду (10-40 мкМ) знижують на 80-90 % активність екосистеми мікроорганізмів-симбіонтів, сформованої на менш перетравних джерелах поживних речовин. Середні (100-150 мкМ) та високі (300 мкМ) дози - зовсім нейтралізують життєдіяльність клітин. На популяції мікроорганізмів, які сформовані на легкоперетравних субстратах, наведені низькі дози токсиканту інгібують метаболізм на 5-15 %, середні - на 40-50 % і тільки високі зупиняють його цілком.

За умов впливу низьких доз пентохлорфенолу (до 40 мкМ) природні сорбенти вірогідно знижують токсичну дію біоциду, але їхній позитивний ефект підвищується в 2 рази тоді, коли змішані популяції мікроорганізмів-симбіонтів рубця або окремі бактеріальні компоненти формуються на легкоперетравних біосубстратах. При цьому активність багатьох інтрацелюлярних ензимів бактерій відновлюється на 19-47 %.

Від складу та природи біосубстратів, які надходять із тонкого кишечника в сліпу кишку кролів і свиней залежить інтенсивність мікробної ферментації. У культурах з легкоперетравними джерелами поживних речовин (глюкоза, РНК, муцин тощо) токсична дія ПХФ знижується (Р < 0,01), а також порівняно швидше (Р < 0,05) реалізується протекторна здатність кліноптилоліту.