Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ ІНСТИТУТ БІОЛОГІЇ КЛІТИНИ

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

03.00.07 - мікробіологія

ПУРПУРОВІ СІРКОБАКТЕРІЇ ВОДОЙМ ЯВОРІВСЬКОГО СІРКОВОГО РОДОВИЩА: МОРФОФІЗІОЛОГІЧНА ХАРАКТЕРИСТИКА І РОЛЬ У ДЕТОКСИКАЦІЇ СІРКОВОДНЮ

КІТ ЛЮБОВ ЯРОСЛАВІВНА

Львів - 2009

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

екологічний мікробіологічний моніторинг водойма

Актуальність теми. За об'ємом розвіданих запасів самородної сірки Україна посідає одне з перших місць у світі. Основна сировинна база сірчаної промисловості України зосереджена переважно у Львівській області на Роздільському, Подорожненському, Яворівському та Немирівському родовищах. З них найбільшим було Яворівське родовище сірки, багаторічна промислова розробка якого призвела до виникнення низки негативних екологічних наслідків, з яких найбільш суттєвим є порушення природних процесів перетворення сірки, що підтримували рівновагу її сполук у цьому районі і, як наслідок, забруднення гідросфери і атмосфери токсичними сполуками цього елементу (Гайдин, 2001).

Відкритий спосіб видобутку сірки зробив її доступною для впливу атмосферного кисню, створив оптимальні умови для діяльності аеробних сіркоокиснювальних бактерій. Продукти їх життєдіяльності - сульфати - активізували розвиток та зростання активності сульфатвідновлювальних бактерій. Як наслідок, у навколишньому середовищі почав нагромаджуватись сірководень і виникла загроза для існування багатьох живих організмів не лише у даному районі, а й на прилеглих до нього територіях.

Окиснення сполук сірки залежно від умов може відбуватись як винятково хімічно, так і за участю різних мікроорганізмів, зокрема прокаріотів. Зв'язати сірководень, що виділяється із анаеробних ділянок водойм, і знешкодити його у значній мірі можуть не лише аеробні хемолітотрофні (тіонові) бактерії, а й фотосинтезувальні сіркобактерії (Грабович, 1999; Kelly et al., 1997). Наявність їх у водоймах може бути важливим індикатором екологічного стану гідросистеми.

Подібна екологічна проблема, зумовлена тривалою розробкою сірковидобувального кар'єру, виникла свого часу у Польщі (кар'єр Махув). Розв'язати її вдалось шляхом складних конструктивних геологічних перебудов: виположуванням берегів майбутнього озера та їх облицювання залізобетонними плитами, створенням на дні глиняного екрану товщиною 25-ти м, який запобігає притоку в озеро сірководневих вод. Вартість проекту склала 200 млн. доларів США (Гайдин, 2001). Однак, ця робота не була пов'язана з такою величезною площею, як територія Яворівського сіркового родовища.

Яворівський сірковий кар'єр невпинно наповнюється підземними водами та водами з навколишніх річок і водосховищ. На його території планують створити величезну природну рекреаційну зону. На сьогоднішній день не має жодних даних стосовно складу мікрофлори та ролі окремих груп сіркометаболізуючих бактерій у процесах становлення біоценозів на території колишніх розроблювальних покладів сірки. У зв'язку з цим виникла гостра необхідність вивчення можливості відновлення рівноваги сполук сірки даного регіону природнім шляхом, а саме оцінки потенційної можливості біологічного окиснення сірководню фотосинтезувальними сіркобактеріями.

Дослідження пурпурових сіркобактерій має вагоме теоретичне значення, оскільки відомості про метаболізм цієї групи мікроорганізмів та вплив різноманітних факторів на їх здатність до окиснення сполук сірки та фотосинтезу з'ясовано у небагатьох видів. Пізнання закономірностей функціонування мікробних ценозів, які беруть участь у процесах перетворення сполук сірки, дозволить у майбутньому керувати цими процесами у штучних і природних системах.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана у рамках наукових досліджень, які проводились на кафедрі мікробіології Львівського національного університету імені Івана Франка за темою Б2-02 “Сіркометаболізуючі бактерії водойм Яворівського сіркового родовища. Особливості метаболізму в умовах антропогенного впливу” (№ держреєстрації 0102U001146).

Мета і завдання дослідження. Метою роботи було проведення еколого-мікробіологічного моніторингу водойм Яворівського сіркового родовища, виділення та ідентифікація чистих культур фотосинтезувальних пурпурових сіркобактерій, вивчення їх ролі у процесах очистки води від сірководню.

Для досягнення зазначеної мети були поставлені наступні завдання:

провести аналіз мікрофлори природних водойм на території Яворівського сіркового родовища та проаналізувати зміни, що у них відбуваються під впливом господарської діяльності людини;

дослідити динаміку чисельності бактерій циклу сірки у процесі затоплення сірковидобувального кар'єру;

виділити та ідентифікувати культури аноксигенних фотосинтезувальних пурпурових сіркобактерій;

дослідити пігментний склад виділених культур пурпурових сіркобактерій та особливості їх фізіології;

дослідити оптимальні умови утилізації сірководню пурпуровими сіркобактеріями.

Об'єкт дослідження: процес окиснення сірководню аноксигенними фотосинтезувальними пурпуровими сіркобактеріями.

Предмет дослідження: пурпурові сіркобактерії, виділені з водойм Яворівського сіркового родовища.

Методи дослідження: мікробіологічні, цитологічні, біохімічні, фізико-хімічні, хімічні, статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів.

Проведено екологічний моніторинг водойм Яворівського сіркового родовища. Отримано дані щодо складу їх мікрофлори та екології пурпурових сіркобактерій. Це дає змогу прогнозувати використання водойм у зоні видобутку сірки у майбутньому.

Вперше з водойм Яворівського сіркового родовища отримано нагромаджувальні та чисті культури пурпурових сіркобактерій, ідентифіковані як Thiocapsa sp., Lamprocystis sp. і Chromatium sp. Проаналізовано якісний і кількісний склад фотосинтезувальних пігментів виділених культур, вивчено особливості їх фізіології, отримано дані про інтенсивність окиснення ними сірководню. Виявлено, що за кількісного домінування пурпурові сіркобактерії можуть відігравати важливу роль в очистці водойм від цієї токсичної сполуки.

Практичне значення одержаних результатів. У результаті проведених досліджень удосконалено методи одержання нагромаджувальних та чистих культур фотосинтезувальних пурпурових сіркобактерій та їх культивування.

Запропоновано спосіб визначення інтенсивності окиснення сірководню пурпуровими сіркобактеріями із застосуванням спектрофотометрії, який може бути використаний для аналогічних досліджень інших бактерій циклу сірки.

Результати роботи використані у навчальному процесі на кафедрі мікробіології Львівського національного університету імені Івана Франка, зокрема, при викладанні загального курсу „Мікробіологія” та спецкурсів „Екологія мікроорганізмів” і „Біогеохімічна діяльність мікроорганізмів”.

Особистий внесок здобувача. Пошук та аналіз наукової літератури з обраної проблеми, експериментальні дослідження, результати яких викладені у дисертації, проведені автором особисто. Спектральний аналіз виконаний у співпраці з к.б.н., с.н.с. А.М. Федоровичем; електронно-мікроскопічні дослідження виконані з к.б.н., с.н.с. О.Р. Кулачковським; хімічний аналіз води виконаний у співпраці з к.х.н., с.н.с. Г.В. Грищук (Львівський національний університет імені Івана франка).

Планування основних напрямків досліджень, аналіз та обговорення одержаних результатів проведено спільно з науковим керівником. Підготовку публікацій за матеріалами дисертації до друку проведено за участю співавторів.

Апробація результатів дисертації. Матеріали результатів дисертаційної роботи були представлені на Міжнародній науковій конференції “Екологія і біогеохімічна діяльність мікроорганізмів” (Одеса, 2001); на Міжнародній науково-практичній школі для молодих вчених і спеціалістів “Природні екосистеми Карпат в умовах посиленого антропогенного впливу” (Ужгород, 2001); на Міжнародній науковій конференції студентів та молодих вчених “Політ-2002” (Київ, 2002); на 6-й і 7-й Пущинській школі-конференції молодих вчених “Биология - наука ХХI века” (Пущино, Росія, 2002); на ІІІ-му з'їзді Українського біофізичного товариства (Львів, 2002); на науковій конференції студентів, аспірантів і молодих вчених, присвяченій 180-річчю від дня народження Л.С. Ценковського “Біорізноманіття, екологія, еволюція, адаптація” (Одеса, 2003); на Міжнародній науковій конференції молодих вчених “Екологічні проблеми міст і промислових зон: шляхи їх вирішення” (Львів, 2003); на Міжнародній науково-практичній конференції “Водні ресурси на рубежі XXІ століття” (Київ, 2003); на Міжнародній конференції “Мікроорганізми у патогенезі та їхня стійкість до лікарських препаратів” (Львів, 2003); на X-му з'їзді Товариства мікробіологів України (Одеса, 2004); на Другій міжнародній науковій конференції студентів і аспірантів “Молодь та поступ біології” (Львів, 2006); на ІІ-й міжнародній конференції молодих учених “Біологія: від молекули до біосфери” (Харків, 2007).

Публікації. Результати дисертаційної роботи викладені у 20 наукових працях, із них - 7 статей у фахових виданнях та 13 тез доповідей на з'їздах і конференціях.

Структура і обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 140 сторінках машинописного тексту і складається з розділів: “Вступ”, “Огляд літератури”, “Методи і матеріали”, “Результати досліджень та їх обговорення”, “Висновки”, “Список використаних джерел” (231 найменування) та 1 додатка. Робота містить 13 таблиць та 25 рисунків.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

В огляді літератури відображено сучасні дані щодо екології, морфології, цитології і фізіології пурпурових сіркобактерій. На основі аналізу літератури обґрунтовано вибір теми дисертаційної роботи та методів виконання запланованих науково-дослідних робіт.

Матеріали і методи досліджень. Проби води та мулу для мікробіологічних і хімічних досліджень відбирали у зоні Яворівського сіркового родовища: із річок - Гноєнець, Терешка, Шкло, водосховищ - Гноєнець, Руське, центрального зумфу сіркового кар'єру.

Відбір проб води та мулу здійснювали з різних глибин водної товщі (5-15 м) залежно від глибини водойми батометром Родінової. Транспортування і зберігання відібраних зразків здійснювали за загальноприйнятою методикою (Антипчук, 1971; Родина, 1965).

Склад мікрофлори досліджуваних водойм визначали за результатами аналізів мікроорганізмів різних фізіологічних груп. Для виділення представників різних фізіологічних груп мікроорганізмів використовували такі середовища: сусло-агар (для мікроскопічних грибів); м'ясо-пептонний агар (для сапрофітних бактерій); середовище Ешбі (для олігонітрофілів); середовище Виноградського (для нітрифікаторів); середовище Гетченсона (для аеробних целюлозорозкладаючих бактерій); середовище Кравцова-Сорокіна (для сульфатвідновлювальних бактерій); середовища Бейеринка, Сільвермана і Люндгрена (для сіркоокиснювальних бактерій), середовища Ван Ніля і Пфенніга (для аноксигенних фотосинтезувальних сіркобактерій). Мікроскопічні гриби культивували за температури 21-25 ⁰С, а бактерії - 28-30 ⁰С протягом 5-14 діб (Кузнецов и др., 1959; Родина, 1965).

Кількісний підрахунок мікроорганізмів у воді та мулі проводили методом серійних розведень (Кузнецов и др., 1959).

Хімічний аналіз води проводили: атомно-адсорбційним (Mnзаг, Znзаг, Cuзаг, Cdзаг), спектрофотометричним (F^-) і фотометричним (Feзаг, NO3^-, SO4^2-, HCO3^-) методами (Лурье, 1984), а також полум'яно-емісійною спектрофотометрією (K⁺ і Na⁺) і титруванням (Ca²⁺ та Mg²⁺, Cl^-, H2S) (Марченко, 1971). Визначення загальної твердості води проводили трилонометричним методом (Кульский и др., 1980). Концентрацію іонів водню у пробі визначали за допомогою pH-метра МТ-58.

Для одержання нагромаджувальних культур пурпурових сіркобактерій використовували метод Виноградського, змінивши у ньому густину вихідного інокуляту (води або мулу) і поживне середовище, у яке додатково вводили хлорид заліза (III) (100 мкг/л), при співвідношенні компонентів 1: 3. Культури освітлювали за допомогою ламп розжарювання через інтерференційний світлофільтр, який пропускає світло з довжиною хвиль понад 800 нм.

Для одержання чистих культур пурпурових сіркобактерій невелику кількість суспензії їх клітин висівали “виснажуючим штрихом” на поверхню агаризованого середовища Ван Ніля в чашках Петрі. Після цього чашки поміщали в анаеростат (Jar 7,0 L, France із генераторами GEN box anaer., France) за температури 23-30 ⁰С. Чистоту культур перевіряли мікроскопуванням та посівом на м'ясо-пептонні середовища (МПА і МПБ), сусло і середовище для сульфатвідновлювальних бактерій (Кузнецов и др., 1959).

Ідентифікацію виділених культур пурпурових сіркобактерій проводили за цитоморфологічними, культуральними і фізіологічними ознаками, користуючись визначником бактерій Берджі (Хоулт и др., 1997). Фарбували бактерії згідно стандартних методик (Сергійчук, 2001).

Електронно-мікроскопічні дослідження проводили за Рейнольдсом (Reynolds, 1963).

Бактерії вирощували на рідкому або агаризованому мінеральному середовищі Ван Ніля в анаеробних умовах за температури 23 ⁰С і постійного освітлення через червоний світлофільтр упродовж 16 діб. Для дослідження використання пурпуровими сіркобактеріями сполук сірки як донорів електронів у середовище вносили розчини сульфіду натрію (0,1 %), тіосульфату натрію (0,3 %), сульфату амонію (0,2 %) та елементну сірку (0,5 %). Для дослідження резистентності бактерій до сірководню у середовище вносили стерильний розчин сульфіду натрію до концентрації від 0,03 до 0,70 %. Для вивчення здатності сіркобактерій засвоювати органічні сполуки до середовища як джерело вуглецю вносили одну із сполук: глюкозу, рамнозу, галактозу, мальтозу, інозит та натрієві солі органічних кислот - винної, ацетату, цитрату, оксалату, малату, сукцинату і неодимпропіонат концентрацією 0,2 % (Кондратьева, 1972; Overmann et al., 1992). Культури бактерій засівали “газоном” на поверхні агаризованого середовища у кількості 0,005-0,007 опт. од. /см². Пізніше клітини двічі відмивали від середовища ізотонічним розчином NaCl і визначали абсолютно суху масу клітин (Егоров, 1983).

Визначення якісного та кількісного складу фотосинтезувальних пігментів бактерій проводили після хроматографічного розділення екстракту пігментів та спектрального аналізу отриманих елюатів (Подопригора та ін., 1996; Britton, 1985; Frigard, 1996). Концентрацію та вміст головних пігментів сіркобактерій розраховували на 1 г сухої маси клітин (Мусієнко та ін., 2001). Спектри поглинання інтактних клітин бактерій, екстрагованих та хроматографічно очищених пігментів записували на реєструючому двопроменевому спектрофотометрі “Specord M-40”.

Визначення активності ферментів здійснювали у безклітинних екстрактах. Тричі відмиті клітини руйнували ультразвуком на ультразвуковому дезінтеграторі УЗДН-2Т частотою 22 кГц протягом 3 хв. Інтактні клітини та їх уламки осаджували центрифугуванням при 15 тис. об/хв протягом 45 хв. (Кулакова и др., 1981). Супернатант використовували як безклітинний екстракт. Діаліз білкових екстрактів проводили як описано B.B. Buchnan (Buchnan et al., 1965).

Концентрацію білка визначали за методом Лоурі (Lowry et al., 1951).

Активність б-кетоглутаратдегідрогенази (КФ 1.2.4.2) визначали спектрофотометрично за швидкістю відновлення нікотинамідаденіндинуклеотиду при 340 нм (Kaufman et al., 1953). Активність ізоцитратліази (КФ 4.1.3.1.) визначали спектрофотометрично за швидкістю утворення фенілгідразону гліоксилату при 324 нм (Reeves et al., 1997). Активність НАД- і НАДФ-залежних ізоцитратдегідрогеназ (КФ 1.1.1.41 і КФ 1.1.1.42) у карбоксилюючій реакції визначали за швидкістю окиснення нікотинамідних коферментів (НАДН⁺ і НАД(Ф)Н⁺) при довжині хвилі 340 нм (Kanao et al., 2002) Активність АТФ-залежної цитратліази (КФ 4.1.3.8) визначали модифікованим гідроксаматним методом (Kanao et al., 2001; Takeda et al., 1969). Активність б-кетоглутаратсинтази визначали як описано B.B. Buchnan (Buchnan et al., 1965). Концентрацію б-кетоглутарату визначали ензиматично, перетворенням його в глутаматдегідрогеназній реакції в глутамат (Прохорова, 1982). Активність каталази визначали за кількістю розкладеного пероксиду водню за одиницю часу (Luck, 1963). Активність супероксиддисмутази визначали за методом, описаним у роботі (Костюк та ін., 1990). Питому активність ферментів виражали у мкмоль субстрату, перетвореного за одну хвилину на один міліграм білка (мкмоль · хв^-1 · мг^-1 білка, або в Од · мг^-1 білка).

Інтенсивність окиснення сірководню інтактними клітинами пурпурових сіркобактерій визначали за швидкістю зменшення концентрації сірководню у водному середовищі з часом. Культури бактерій для цього вирощували у рідкому середовищі Ван Ніля протягом 10 діб за температури 10±3 і 22±1 ⁰C і цілодобового освітлення. Концентрацію сірководню у середовищі визначали йодометричним (Кульский, 1980) і спектрофотометричним (Cline, 1969) методами.

Статистичну обробку експериментальних даних проводили за (Деркач, 1977). Побудову графіків здійснювали за допомогою програмного пакета для персональних комп'ютерів Microsoft Excel.

Результати досліджень та їх обговорення

Екологічний моніторинг водойм Яворівського сіркового родовища: мікробіологічний та хімічний аспекти. Результати хімічного аналізу води досліджуваних водойм, проведеного протягом 2001-2003 років, показали, що з часу затоплення сірковидобувального кар'єру (жовтень, 2001) у зоні недіючого сіркового родовища відбулось покращення якості води у найбільшому водосховищі Гноєнець та кар'єрі. Підтвердженням цього є зниження концентрації сірководню у воді та зменшення показника її твердості. Однак, порівняння результатів хімічного аналізу цих водойм із результатами аналізу природної водойми (озера на території природного заповідника “Розточчя”) показало, що вода водосховища Гноєнець і, особливо, кар'єру за своїми властивостями суттєво відрізняється від природних водойм. Це виявляється у підвищеній мінералізації води кар'єру та прилеглих до нього водойм, зумовленій високим вмістом гідрокарбонат- (280,6-305,0 мг/л) і сульфат- (784,0-1700,0 мг/л) іонів. Крім цього, вода із кар'єру містить підвищену концентрацію Ca²⁺ та Mg²⁺, сумарна кількість мг-еквівалентів яких обумовлює високу загальну твердість води (30,9 мг-екв/л). Значення цього показника у воді кар'єру у 3-5 разів вище, ніж в інших водоймах родовища та природній водоймі. Хоча за період спостережень показник загальної твердості води зменшився у воді кар'єру на 5,45 мг-екв/л, все ж його величина залишається досить високою і перевищує значення гранично допустимої концентрації (ГДК) у 3,6 раза. В інших водоймах цей показних залишився практично на одному рівні (4,76-6,23 мг-екв/л). Встановлено також, що зниження концентрації сульфатів у воді кар'єру протягом 2001-2002 рр. з 866,0 мг/л до 784,0 мг/л пов'язане із розбавленням їх вмісту водою, що наповнювала кар'єр, а різке зростання, зареєстроване у 2003 р. (до 1700,0 мг/л), очевидно, зумовлене постійним контактом води новоутвореної водойми з поверхнею сірковмісної руди та активізацією діяльності сіркоокиснювальних бактерій. Значення pH води досліджуваних водойм знаходиться у межах 7,0-8,5.

Виявлено, що поверхневі шари води всіх досліджуваних водойм у зоні родовища мають підвищений вміст сірководню (8,5-29,1 мг/л), тоді ж як у поверхневих шарах природної водойми ця сполука відсутня. За період проведених спостережень у воді кар'єру та в інших водоймах родовища виявлено зниження концентрації сірководню, що свідчить про проходження у них процесів хімічного та біологічного окиснення цієї токсичної сполуки. Проте, за даними 2003 року, вміст сірководню у річці Терешці перевищував значення ГДК (0,3 мг/л) у середньому в 11,7 раза, у річці Шкло - в 21,07; у водосховищі Руське в - 14,6; у річці Гноєнець - в 19,33 та у кар'єрі - в 8,9 раза. У річці Шкло вміст сірководню практично не змінився. Це, очевидно, пов'язано із попаданням у неї підземних вод збагачених сірководнем.

Результати проведених мікробіологічних досліджень показали, що у складі мікрофлори досліджуваних водойм у зоні сірковидобувального родовища, як і в контрольній водоймі (озера на території природного заповідника “Розточчя”), домінують сапрофіти (508 ·10⁶ колонійутворюючих одиниць (КУО) /г мулу) та олігонітрофіли (325 ·10⁶ КУО/г мулу). Зростання кількості цих бактерій у водоймах (до 556 ·10⁶ КУО/г мулу і 367 ·10⁶ КУО/г мулу, відповідно) свідчить про те, що у них відбувається поступове нагромадження органічної речовини, а це, у свою чергу, стимулює розвиток сульфатвідновлювальних бактерій, що виявляється у поступовому зростанні їх чисельності (кар'єр і водосховище Гноєнець). Адже відомо (Іванов, 1961), що основним фактором, який обмежує їх ріст і утворення ними сірководню у процесі дисиміляційної сульфатредукції, є наявність у водоймах розчинених органічних речовин. Найбільша кількість сульфатвідновлювальних бактерій виявлена, зокрема, у мікробіоценозі мулу кар'єру (5200 КУО/г мулу).

Внаслідок життєдіяльності сульфатвідновлювальних бактерій у сірковидобувальному кар'єрі утворюється велика кількість сірководню, значна частина якого розчиняється у воді. Тому великої уваги заслуговує виявлення у досліджуваних водоймах бактерій здатних окиснювати цю сполуку. З'ясовано, що кількість фототрофних сіркобактерій у мікробних матах мулу коливається у різних водоймах приблизно від 15700 до 23800 КУО/г мулу. Поступове зростання їх чисельності супроводжується зменшенням вмісту сірководню у водоймах.

Серед специфічних груп бактерій, які здатні окиснювати сірководень, у водоймах у зоні Яворівського сіркового родовища виявлені також безбарвні сіркоокиснювальні (тіонові) бактерії роду Thiobacillus. Їх чисельність у мікробіоценозі водосховищ Руське (525 КУО/мл) і Гноєнець (455 КУО/мл), у порівнянні з фотосинтезувальними сіркобактеріями (39500 КУО /г мулу) є незначна, а це свідчить про те, що очищення води від сірководню у цих водоймах відбувається переважно завдяки життєдіяльності аноксифототрофів.

Дослідження сезонної динаміки чисельності мікроорганізмів різних фізіологічних груп показало, що найбільша кількість їх виявляється у літній період, а найменша взимку. Що стосується сульфатвідновлювальних і фотосинтезувальних сіркобактерій, то найбільша кількість цих бактерій виявляється у весняний період (від 2000 до 150000 КУО/г мулу - сульфатвідновлювальних і від 10000 до 100000 КУО/г мулу - фотосинтезувальних бактерій, відповідно).

Зростання і коливання загальної чисельності мікроорганізмів різних фізіологічних груп у воді та мулі всіх досліджуваних водойм і, особливо, кар'єру, вказує на те, що мікробіоценоз даної гідросистеми знаходиться на стадії формування, найбільший вплив на який на даному етапі мають фізико-хімічні властивості розкритих порід, різних за мінералогічним складом.

Нагромаджувальні та чисті культури пурпурових сіркобактерій з водойм Яворівського сіркового родовища. Із зразків води і мулу, відібраних із водойм Яворівського сіркового родовища, одержано нагромаджувальні культури фотосинтезувальних сіркобактерій. Швидкий розвиток пурпурових сіркобактерій у перших нагромаджувальних культурах фотосинтезувальних сіркобактерій може бути непрямим свідченням того, що у даних водоймах серед аноксифототрофних бактерій переважають саме пурпурові сіркобактерії. Подібні спостереження можна знайти у літературі (Caumette, 1986; Elshahed et al, 2003). З ізоляту шляхом багатократних пересівів вдалось виділити три чисті культури пурпурових сіркобактерій, позначені як YT 1001, YТ 1002 і YG 1003. На основі цитоморфологічних і фізіологічних ознак вони були ідентифіковані як Thiocapsa sp., Lamprocystis sp. і Chromatium sp., відповідно (рис. 1). Крім них у нагромаджувальних культурах пурпурових сіркобактерій були виявлені представники родів Thiospirillum і Thiodictyon.

З'ясовано, що у водоймах, які прилягають до Яворівського сіркового родовища пурпурові сіркові бактерії представлені багатьма родами, серед яких найчастіше зустрічаються Chromatium, Lamprocystis, Thiocapsa і Thiospirillum.

Пігменти пурпурових сіркобактерій. Аналіз спектрів поглинання суспензій інтактних клітин пурпурових сіркобактерій засвідчив, що спектральні властивості досліджуваних культур дуже близькі. Наприклад, in vivo значні максимуми поглинання пігментів цих бактерій припадали на довгохвильову ділянку спектра 800-860 нм. Крім того, були виявлені максимуми поглинання пігментів, які припадали на 373-377, 400-490, 514 і 590 нм. Відхилення окремих максимумів поглинання від вказаних величин становило 1-4 нм у довгохвильовій і 9 нм у короткохвильовій частинах спектра (рис. 2). Спектри поглинання інтактних клітин досліджуваних культур пурпурових сіркобактерій були подібні до опублікованих (Coolen et al, 1998; Gitelson et al, 1999).

Максимуми поглинання спиртових екстрактів пігментів, порівняно із спектрами поглинання живих клітин, були зсунуті дещо вліво і припадали на 360, 590-600, 670, 689 і 760 нм.

Відомо, що сильна абсорбція світла клітинами фотосинтезувальних бактерій у довгохвильовій ділянці спектра (800-860 нм), а також у 590 і 375 нм обумовлена бактеріохлорофілом а (Oelse, 1985; Gitelson et al., 1999). Наявність цього пігменту в усіх досліджуваних культурах пурпурових сіркобактерій підтверджують виявлені у них максимуми поглинання, що припадають на відповідні ділянки спектра.

Серед каротиноїдів, максимуми поглинання яких у спиртовому розчині припадали на ділянку 400-600 нм, виявлені лікопін (Lamprocystis sp., Thiocapsa sp.), спірилоксантин (Thiocapsa sp.) і окенон (Chromatium sp.). Крім того, у клітинах усіх досліджуваних культур вперше виявлено яскраво-жовтий не ідентифікований пігмент з максимумом поглинання 419,5 нм (рис. 3).

Кількісний аналіз виділених пігментів засвідчив, що у клітинах пурпурових сіркобактерій міститься приблизно від 0,092 до 0,178 мг/г каротиноїдів, що приблизно у 2-30 разів більше, ніж кількість бактеріохлорофілів (табл. 1).

Таблиця 1. Загальний вміст пігментів у клітинах пурпурових сіркобактерій, вирощених на середовищі Ван Ніля

Особливості метаболізму фототрофних пурпурових сіркобактерій.

Результати дослідження здатності виділених культур засвоювати органічні речовини показали, що деякі з них стимулюють нагромадження біомаси бактерій. Зокрема, висока біомаса Thiocapsa sp. зареєстрована на середовищі з мальтозою, рамнозою, інозитом, молочнокислим і щавлевокислим натрієм, а Lamprocystis sp. - на середовищі з галактозою, глюкозою і сукцинатом натрію (рис.1).

Рис. 1. Ріст Thiocapsa sp. (А) і Lamprocystis sp. (Б) на середовищі Ван Ніля з додаванням органічних сполук: 1 - контроль; 2 - глюкоза; 3 - рамноза; 4 - галактоза; 5 - мальтоза; 6 - інозит, 7 - оксалат; 8 - цитрат; 9 - ацетат; 10 - пропіонат; 11 - лактат; 12 - винна кислота, 13 - сукцинат.

Позитивно на ріст Thiocapsa sp. і Lamprocystis sp. впливали також метіонін і цистеїн у концентрації 0,005 %. Біомаса культур, вирощених на середовищі з метіоніном становила приблизно 0,475 і 0,73 мг/см², а з цистеїном - 0,75 і 0,68 мг/см², відповідно. Культура Chromatium sp. добре росла на середовищі з оцтовокислим (приблизно до 0,5 мг/см²) і пропіоновокислим натрієм (приблизно до 0,6 мг/см²), але на середовищі з амінокислотами росту цієї культури не спостерігали або він був дуже незначним. Це свідчить про те, що Chromatium sp. не здатні використовувати у своєму метаболізмі екзогенні амінокислоти. Отже, з'ясовано, що виділені пурпурові сіркобактерії за своїми властивостями дуже схожі з типовими представниками облігатних фотолітоавтотрофних бактерій, які здатні використовувати органічні сполуки лише як додаткові джерела вуглецевого живлення. Свідченням цього є те, що ріст виділених культур пурпурових сіркобактерій на середовищі з органічними речовинами відбувався лише за наявності у ньому гідрокарбонату натрію як основного джерела вуглецевого живлення і сульфіду натрію як джерела електронів для здійснення ними фотосинтезу.

Здатність бактерій засвоювати органічні речовини тісно пов'язана з функціонуванням у їхніх клітинах циклу трикарбонових кислот, який у фототрофів має певні особливості (Кондратьева, 1989), для виявлення яких у Chromatium sp., Thiocapsa sp. і Lamprocystis sp. було досліджено активність б-кетоглутаратдегідрогенази, ізоцитратліази, НАД- і НАДФ-залежної ізоцитратдегідрогенази (карбоксилюючої), АТФ-залежної цитратліази, б-кетоглутаратсинтази. Встановлено, що у досліджуваних бактерій ЦТК перерваний на стадії окиснення б-кетоглутарату в сукцинат, про що свідчить відсутність у безклітинних екстрактах Thiocapsa sp., Lamprocystis sp., Chromatium sp. б-кетоглутаратдегідрогеназної активності. У всіх досліджуваних культурах не виявлена активність АТФ-залежної цитратліази і б-кетоглутаратсинтази - ферментів циклу Арнона, що засвідчує відсутність у них цього циклу. У клітинах Chromatium sp., Thiocapsa sp. і Lamprocystis sp. виявлена активність НАДФ- і НАД-залежної ізоцитратдегідрогенази. Причому активність НАДФ-залежної ізоцитратдегідрогенази була значно вища, ніж НАД-залежної. Очевидно, цикл трикарбонових кислот у пурпурових сіркобактерій має обмежене значення для генерації енергії і виконує переважно біосинтетичну функцію. Поповнення інтермедіатів ЦТК у клітинах пурпурових сіркобактерій відбувається у реакціях гліоксилатного шунта, на функціонування якого вказує виявлена в усіх досліджуваних культур висока активність ключового ферменту даного шляху - ізоцитратліази.

Пурпурові сіркобактерії належать до облігатно анаеробних мікроорганізмів. Серед них зустрічаються види, здатні певний час перебувати в аеробних або мікроаерофільних умовах і залишатись при цьому життєздатними (De Wit et al., 1990; Thar et al., 2001). Проведено визначення активності ферментів антиоксидантного захисту - каталази і суперокиддисмутази (СОД) у виділених культур.

Таблиця 2. Питома активність ферментів окиснювального/відновлювального циклу трикарбонових кислот, мкмоль мг білка^-1 · хв^-1

Оскільки пурпурові сіркобактерії є більш толерантними до високих концентрацій сірководню, ніж зелені сіркові, тіонові та інші сіркометаболізуючі бактерії, про що свідчать власні дослідження і дані літератури (Громов и др., 1989; Pfennig et al., 1982; Widhuis et al., 1986), то, очевидно, у водоймах з підвищеним його вмістом саме вони виконують роль головних детоксикаторів H₂S. Можливо, що окиснення сірководню у водосховищах Руське і Гноєнець відбувається переважно за участю аноксигенних фотосинтезувальних бактерій, у тому числі й пурпурових сіркобактерій, кількість яких у цих двох водоймах за даними 2003 року перевищує кількість тіонових бактерій приблизно у 52,80 і 86,8 разів відповідно. З цього випливає, що аноксигенні фотосинтезувальні бактерії відіграють важливу, а іноді й ключову роль в очистці водойм від сірководню.

ВИСНОВКИ

У результаті комплексного хімічного і мікробіологічного аналізу вперше отримано дані щодо хімічного складу води та складу мікрофлори водойм у зоні Яворівського сіркового родовища. Отримано нові дані з екології аноксигенних фотосинтезувальних бактерій, вивчено морфофізіологічні та біохімічні властивості виділених чистих культур пурпурових сіркобактерій (Thiocapsa sp., Lamprocystis sp., Chromatium sp.), з'ясована їх роль у процесах очистки води від сірководню.

1. Встановлено домінування сапрофітних та олігонітрофільних мікроорганізмів у мікрофлорі водойм, які знаходяться у зоні Яворівського сіркового родовища. У складі мікробного ценозу кар'єру виявлено поступове зростання кількості аноксигенних фотосинтезувальних сіркобактерій.

2. Модифіковано методи одержання нагромаджувальних культур фотосинтезувальних пурпурових сіркобактерій (зміною густини вихідного інокуляту і складу поживного середовища) і виділення чистих культур цих мікроорганізмів, що дозволило вдвічі скоротити тривалість їх культивування і спростити процедуру очищення виділених культур від сторонньої мікрофлори.

3. Вперше із водойм Яворівського сіркового родовища виділено чисті культури пурпурових сіркобактерій, ідентифіковані як Thiocapsa sp., Lamprocystis sp., Chromatium sp.

4. Встановлено, що Thiocapsa sp., Lamprocystis sp. і Chromatium sp. мають подібний набір фотосинтезувальних пігментів, серед яких переважають каротиноїди.

5. Встановлено, що всі виділені культури пурпурових сіркобактерій є облігатними фотолітоавтотрофами, для яких характерна наявність перерваного циклу трикарбонових кислот на стадії окиснення б-кетоглутарату і наявність гліоксилатного шунта. Показано, що позитивний вплив на ріст пурпурових сіркобактерій за наявності у середовищі NaHCO₃ і H₂S мають глюкоза, галактоза, мальтоза, лактат, оксалат, ацетат, сукцинат та інозит.

6. Встановлено, що досліджувані бактерії є облігатно анаеробними мікроорганізмами. Thiocapsa sp. і Lamprocystis sp., на відміну від Chromatium sp., володіють помірною аеротолерантністю, що обумовлено наявністю у їхніх клітинах досить високої каталазної і супероксиддисмутазної активності.

7. Встановлено, що за сприятливих умов середовища і кількісного домінування у складі мікробіоценозу водойм аноксифототрофних сіркобактерій над аеробними сіркоокиснювальними (тіоновими) бактеріями очищення води від сірководню може відбуватись переважно за їх участю (вдсх. Руське і Гноєнець).

ЛІТЕРАТУРА

1. Сіркобактерії Яворівського сіркового родовища та проблема рекультивації земель / С.П. Ґудзь, С.О. Гнатуш, І.М., Баран, Л.Я. Кіт, М.Ф. Коструба // Вісн. Одес. ун-ту. Сер. біол. - 2002. - Т. 6, №4. - С. 72-75. (Дисертант здійснила підбір та аналіз літератури, одержала із водойм Яворівського сіркового родовища нагромаджувальні культури пурпурових сіркобактерій, виділила чисті культури цих бактерій та ідентифікувала їх).

2. Поширення сульфатредукуючих бактерій у водних біотопах Яворівського сіркового родовища / С. Ґудзь, С. Гнатуш, І. Баран, М. Коструба, О. Подопригора, Л. Кіт, Б. Борсукевич, І. Клим // Вісн. Львів. ун-ту. Сер. біол. - 2002. - Вип. 29. - С. 144-148. (Дисертант здійснювала відбір зразків води та мулу з певних глибин водойм сіркового родовища та їх мікробіологічний аналіз).

3. Основні фізіологічні групи мікроорганізмів води та мулу біотопів Яворівського сіркового родовища / С. Ґудзь, С. Гнатуш, І. Баран, О. Подопригора, Л. Кіт, І. Клим, Б. Борсукевич // Вісн. Ужгород. ун-ту. Сер. біол. - 2003. - №12. - С. 196-199. (Дисертант провела дослідження загальної чисельності аноксигенних фотосинтезувальних сіркобактерій у водоймах Яворівського сіркового родовища на першому році після припинення діяльності ДГХП „Сірка”).

4. Екологічний моніторинг водойм Яворівського сіркового родовища; мікробіологічний контроль / І.М. Баран, О.І. Подопригора, Г.В. Грищук, Л.С. Боднар, Л.Я. Кіт, І.Р. Клим, С.О. Гнатуш, С.П. Гудзь // Довкілля та здоров'я. - 2003. - №4. - С. 55-58. (Дисертант брала участь у мікробіологічних дослідженнях зразків води і мулу з водойм Яворівського сіркового родовища, обговоренні отриманих результатів і підготовці матеріалу до друку).

5. Пігментний склад фототрофних пурпурових сіркобактерій / Л.Я. Кіт, С.П. Гудзь, С.О. Гнатуш, А.М. Федорович // Вісн. Львів. ун-ту. Сер. біол. - 2003. - Вип. 34. - C. 186-198. (Дисертант здійснила підбір та аналіз літератури, провела дослідження якісного і кількісного складу фотосинтезувальних пігментів пурпурових сіркобактерій, проаналізувала і узагальнила отримані результати, підготувала матеріал до друку).

6. Метаболізм сульфіду та вуглецевих сполук у фототрофних пурпурових сіркобактерій / Л. Кіт, О. Мороз, А. Федорович, С. Гнатуш, С. Гудзь // Вісн. Львів. ун-ту. Сер. біол. - 2004. - Вип. 35. - С. 199-204. (Дисертант здійснила підбір та аналіз літератури, дослідила здатність пурпурових сіркобактерій використовувати як джерело вуглецю деякі органічні сполуки, провела біохімічні дослідження, визначила інтенсивність окиснення сірководню досліджуваними культурами бактерій, проаналізувала та узагальнила отримані експериментальні дані, підготувала матеріал до друку).

7. Кіт Л.Я. Пурпурові сіркобактерії з водойм Яворівського родовища сірки / Л.Я. Кіт, С.П. Гудзь // Мікробіол. журн. - 2007. - Т.69, №1. - С. 12-19. (Дисертант опрацювала дані літератури, одержала із водойм Яворівського сіркового родовища чисті культури пурпурових сіркобактерій, вивчила морфофізіологічні та культуральні властивості цих бактерій та ідентифікувала їх).

8. Стан водоймищ Яворівського сіркового родовища: мікробіологічний та хімічний аспекти / С.П. Гудзь, І.М. Баран, Л.Я. Кіт, Г.В. Грищук, І.М. Чурко // Політ - 2002: міжнародна наукова конференція студентів та молодих вчених, 11-12 квітня 2002 р.: тези доповідей. - К., 2002. - С. 182.

9. Морфофизиологическая характеристика фотосинтезирующих серобактерий, выделенных из водоемов Яворовского серного месторождения / С. Гудзь, И. Баран, Л. Кит, А. Федорович // Биология - наука XXI века: 6-я Пущинская школа - конференция молодых учених, 20-24 мая 2002 г.: сборник тезисов. - Пущино, Россия. - 2002. - Т3. - С. 7.

10. Пігменти фототрофних зелених та пурпурових сіркобактерій водойм Яворівського сіркового родовища / Л. Кіт, І. Баран, С. Гнатуш, А. Федорович, С. Гудзь // ІІІ з'їзд Українського біофізичного товариства з міжнародною участю, 8-11 жовтня 2002 р.: тези доповідей. - Львів, 2002. - С. 118.

11. Сіркобактерії водойм Яворівського родовища та Стебницького державного гірничо-хімічного підприємства “Полімінерал” / І.М. Баран, Л.Я. Кіт, М.Ф. Коструба, О.І. Подопригора, І.Р. Клим, С.О. Гнатуш, С.П. Ґудзь // Біорізноманіття. Екологія. Еволюція. Адаптація: ювілейна наукова конференція присвячена 180-річчю з Дня народження Л.С. Ценковського, 2003 р.: тези доповідей. - Одеса, 2003. - С. 11.

12. Утилізація сірководню фотосинтезуючими сіркобактеріями - один із шляхів вирішення екологічної проблеми водойм Яворівського сіркового родовища / І. Баран, Л. Кіт, С. Гнатуш, С. Ґудзь // Екологічні проблеми міст і промислових зон: шляхи їх вирішення: міжнародна конференція студентів і молодих вчених, 11-13 квітня 2003 р.: тези доповідей. - Львів. - С. 261-262.

13. Л. Кит Спектральные свойства фотосинтетических пигментов серных бактерій / Л. Кит, И. Баран, А. Федорович, С. Гнатуш, С. Гудзь // Биология наука XXI века: 7-ая Пущинская школа конференция молодых учених, 14-18 апреля 2003 г.: сборник тезисов. - Пущино, Россия. - 2003. - С. 278.

14. Investigation of isolated photosynthetic sulfur bacteria in order to solve the ecological problem of H₂S containing reservoirs around Yavoriv sulfur deposit / I. Baran, L. Kit, S. Hnatush, S. Gudz // 1^st Congress of Federation of European Microbiological Societies, July 27-29, 2003.: abstract book. - Slovenia, Lublyana, 2003. - P. 361-362.

15. Microbiological water assessment in the reservoirs of Stebnyk SMCO “Polymineral” / S. Gudz, S. Hnatush, M. Kostruba, O. Podopryhora, I. Klym, I. Baran, L. Kit, B. Borsukevych, N. Dluhosh // Microorganism in pathogenesis and the drug resistance: international conference devoted 120-anniversiry of R. Weigle birth, Sept. 11-14, 2003.: abstract book.- Lviv, 2003. - P. 102.

16. Peculiarities of carbone compounds methabolism in purple sulfur bacteria / L. Kit, O. Moroz, S. Gudz, S. Hnatush // Microorganism in pathogenesis and the drug resistance: international conference devoted 120-anniversiry of R. Weigle birth, Sept. 11-14, 2003.: abstract book. - Lviv, 2003. - P. 50.

17. Кіт Л.Я. Еколого-мікробіологічна характеристика водойм Яворівського сіркового родовища / Л.Я. Кіт, С.П. Ґудзь // X з'їзд Товариства мікробіологів України, 15-17 вересня 2004 р.: тези доповідей. - Одеса, 2004. - С. 55.

18. Аноксигенні фотосинтезуючі сіркобактерії Яворівського сіркового родовища / С.О. Гнатуш, Л.Я. Кіт, І.М. Баран, С.П. Ґудзь // X з'їзд Товариства мікробіологів України, 15-17 вересня 2004 р.: тези доповідей. - Одеса, 2004. - С. 204.

19. Кушкевич І.В. Активність каталази та супероксиддисмутази у фототрофних сіркобактерій залежно від умов культивування / І.В. Кушкевич, Л.Я. Кіт, С.О. Гнатуш // Молодь та поступ біології: ІІ міжнародна конференція студентів та аспірантів, 21-24 березня 2006 р.: збірник тез. - Львів, 2006. - С.301-302.

20. Кіт Л.Я. Особливості функціонування циклу трикарбонових кислот у фотосинтезувальних пурпурових сіркобактерій / Л.Я. Кіт, С.П. Ґудзь // Біологія: від молекули до біосфери: ІІ міжнародна конференція молодих учених, 19-21 листопада 2007 р.: тези доповідей. - Харків, 2007. - С. 379-380.

Размещено на Allbest.ru