Особливості структурно-функціональних характеристик мембран еритроцитів та лімфоцитів при гіперепідермопоезі

17

Размещено на http://www.allbest.ru/

ХЕРСОНСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

03.00.04 - біохімія

ОСОБЛИВОСТІ СТРУКТУРНО-ФУНКЦІОНАЛЬНИХ ХАРАКТЕРИСТИК МЕМБРАН ЕРИТРОЦИТІВ ТА ЛІМФОЦИТІВ ПРИ ГІПЕРЕПІДЕРМОПОЕЗІ

СЕМКО ГАЛИНА ОЛЕКСАНДРІВНА

Херсон - 2009

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. У процесі життєдіяльності мембрана клітин крові зазнає біохімічних змін (Piagnerelli M. et al., 2003; Степовая Е.А. и др., 2004; Рязанцева Н.В. и др., 2004). Одним з основних напрямків сучасної мембранології є з'ясування особливостей структурно-функціональних характеристик біологічних мембран як інформативного показника різних фізіологічних станів організму при ендогенних і екзогенних впливах. Плазматичні мембрани забезпечують найважливішу умову існування біологічних об'єктів - автономність і тісний зв'язок з навколишнім середовищем, виконують бар'єрну, механічну, енергетичну, комунікативну та багато інших функцій (Владимиров Ю.А., 2000). Роль клітинних мембран у життєво важливих процесах пов'язана також з їх сукупною площею, що досягає в організмі людини десятків тисяч квадратних метрів (Геннис Р., 1997). Серед процесів, що відбуваються у крові при різних фізіологічних станах, одне із центральних місць приділяється структурно-функціональним змінам клітинної поверхні, оскільки остання з її величезною кількістю рецепторів відіграє найважливішу роль у здійсненні основних функцій крові (транспортної, газообмінної, регуляторної, захисної, детоксикаційної, гемостатичної та ін.), а також визначає реологічні властивості й мікроциркуляцію. Механізм такого біологічного явища як взаємодія клітин одна з одною та з зовнішнім середовищем неможливо зрозуміти без детального знання біохімії плазматичних мембран і клітинної поверхні. Клітини несуть на зовнішній поверхні плазматичної мембрани тонкий (близько 5 нм) шар - глікокалікс (Luft J.H., 1976; Vannuchi S. еt al., 1982; Parmeley R.T. et al., 1983; Neu B., 2002). Глікокалікс бере участь у регуляції процесів проліферації клітин, їх диференціації й морфогенезі, однак тонкі механізми, за допомогою яких здійснюється вплив з боку глікокаліксу на клітини, недостатньо вивчені.

Вивчення мембранологічних аспектів захворювань із порушенням процесів росту й розмноження клітин епідермісу, які зумовлюють хронічні ураження шкіри займає особливе місце. Прикладом стану організму, при якому відбувається підвищення проліферативної активності епідермісу, зміна кератинізації й диференціювання клітин, є псоріаз - розповсюджений хронічний дерматоз неясної етіології й патогенезу (Беляев Г.С. и др., 2005). Незважаючи на інтенсивне вивчення етіопатогенезу псоріазу, механізми розвитку цього захворювання чітко не визначені. У численних публікаціях цей дерматоз відносять до мультифакторних захворювань (Мордовцев В.Н. и др. 2002; Шульман А.Я. и др., 2007). Багатофакторність розвитку псоріазу здійснюється шляхом реалізації генетичної програми під впливом численних екзо- і ендогенних чинників. Враховуючи значення біохімічних змін мембран клітин крові при патологічних станах, вбачається актуальним і обґрунтованим вивчення впливу на структурно-функціональні характеристики мембран посиленого епідермопоезу.

Незважаючи на активні дослідження щодо участі клітинних мембран у патогенезі псоріазу, проблема далека від вирішення (Блайхр Ц., 2000; Фоменко С.Е., 2006; Albanesi C., 2007). Дотепер не визначені ознаки патології плазматичних мембран, характерні для псоріазу. Недостатня увага приділяється пошуку системних, характерних для багатьох клітин особливостей плазматичної мембрани, не з'ясованим залишається співвідношення конституціональних і придбаних особливостей структури мембрани та її поверхні при гіперепідермопоезі. Неповно досліджені інтегральні біохімічні характеристики мембрани та її поверхні - основна частина досліджень присвячена вивченню спектра ліпідів та жирних кислот у мембранах при псоріазі. Не визначено діагностичне й прогностичне значення структурно-функціонального стану плазматичних мембран, що ускладнює корекцію передбачуваних мембранопатологічних змін при псоріатичній патології.

Актуальність постановки даного питання визначається збільшенням числа важких форм хвороби, відсутністю методів прогнозування рецидивів і науково-обґрунтованої індивідуальної терапії

Отже, зазначене вище свідчить про практичну значимість наукового пошуку особливостей структурно-функціонального стану плазматичних мембран при псоріазі як факторів патогенезу цього захворювання.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана в лабораторії біохімії ДУ «Інститут дерматології та венерології АМН України» (м. Харків) відповідно до планів науково-дослідних робіт: «Розробка та впровадження у медичну практику зовнішніх засобів лікування хворих на псоріаз стосовно до різних клінічних форм та стадії захворювання» (№ державної реєстрації 0199U001200); «Розробка заходів підвищення ефективності діагностики, прогнозування перебігу, лікування та профілактики захворюваності на артропатичний псоріаз» (№ державної реєстрації 0102U004223), «Розробити комплексні методи лікування тяжких форм псоріазу з урахуванням особливостей клінічних проявів та перебігу захворювання» (№ державної реєстрації 0108U012801).

Мета та завдання дослідження. Мета роботи - визначити структурно-функціональні характеристики плазматичних мембран клітин крові (еритроцитів, лімфоцитів) при хронічному гіперепідермопоезі.

Для досягнення мети були поставлені наступні завдання:

1. Дослідити біохімічні показники плазматичних мембран еритроцитів і лімфоцитів при гіперепідермопоезі.

2. Визначити значущість біохімічних показників плазматичних мембран клітин крові, у формування механізмів розвитку патологічного процесу при гіперепідермопоезі.

3. З'ясувати значення вільнорадикальних процесів і рівня ендогенної інтоксикації у порушенні поверхневих властивостей плазматичних мембран клітин крові при гіперепідермопоезі.

4. Виявити вплив ультрафіолетового опромінення крові й мембранотропних речовин на сорбційну ємність глікокаліксу клітин крові при гіперепідермопоезі.

Об'єкт дослідження - система крові при гіперепідермопоезі.

Предмет дослідження - структурно-функціональні характеристики плазматичних мембран клітин крові (еритроцитів, лімфоцитів) при гіперепідермопоезі.

Методи дослідження. Для вирішення поставлених завдань і досягнення мети використані наступні методи дослідження: спектрофотометрія, хемілюмінесценція, хроматографія, електрофорез, атомно-абсорбційна спектроскопія, світлова та растрова електронна мікроскопія.

Статистична обробка результатів проведена прикладними програмами Microsoft Excel 2000, Statistica 7.0 for Windows.

Наукова новизна одержаних результатів. Уперше проведено комплексне дослідження особливостей структурної організації та функціональної активності клітинних мембран та їх поверхні при хронічному рецидивуючому гіперепідермопоезі. Виявлено зміни у структурно-функціональних характеристиках клітинних мембран, що співпадають із інтенсивністю патологічного процесу при псоріазі. Вперше показано, що інтенсифікація окисних процесів і ендотоксикоз впливають на стан глікокаліксу клітин крові. Вперше виявлено значення дестабілізації клітинного глікокаліксу при даній патології.

На підставі отриманих результатів з'ясована роль порушення мембран, і, в першу чергу, їх поверхневих властивостей, у механізмах залучення клітин крові до патологічного процесу при гіперепідермопоезі.

Отримані в роботі результати підтверджують інформативність використання клітин крові як тест-системи для виявлення механізму ушкодження мембран при гіперепідермопоезі.

Обґрунтовано включення в терапію хворих на псоріаз мембранопротекторних терапевтичних засобів.

Практичне значення одержаних результатів. Проведене комплексне вивчення структурно-функціональних змін властивостей мембран клітин крові при гіперепідермопоезі створило передумови використання результатів у клінічній практиці. У закладах охорони здоров'я запропоновано використовувати оцінку сорбційної ємності еритроцитів до альціанового синього як маркер активності псоріатичного процесу (патент № u200800127 «Спосіб доклінічної діагностики артропатичного псоріазу»), та показників обміну кальцію для оцінки ефективності лікування хворих на псоріаз (патент № 20000844675 «Спосіб оцінки ефективності лікування хворих на псоріаз»). Результати проведеного дослідження обґрунтовують нові методи лікування псоріазу шляхом корекції поверхнево-залежних властивостей плазматичних мембран еритроцитів і лімфоцитів. Результати дослідження мають загальнотеоретичне значення для біохімії, створюють нові методологічні підходи для адекватної оцінки патофізіологічних і фармакологічних мембранотропних ефектів і можуть бути основою для фундаментальних та прикладних досліджень в галузі біохімії, мембранології й фармакології. Отримані дані використовуються в лекціях на кафедрі дерматовенерології Харківської медичної академії післядипломної освіти МОЗ України та кафедрі валеології Харківського національного університету імені В.Н. Каразіна МОН України.

Особистий внесок здобувача. Автор самостійно склав і виконав план досліджень, провів аналіз даних літератури, виконав експериментальні дослідження, провів науковий аналіз отриманого матеріалу, сформулював положення й висновки, підготував основні друковані праці. Дисертантом самостійно проводився збір і підготовка матеріалу для досліджень. Лабораторні дослідження виконувалися автором самостійно. Статистична обробка й аналіз отриманих даних здійснювалися дисертантом.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації доповідалися на міжнародних конференціях: IX International Congress of Dermatology (Beijing, China, 2004), VIII Всеросійському з'їзді дерматовенерологів (Москва, 2001); науково-практичних конференціях з міжнародною участю: «Ліки - людині» (Харків, 2007), «Сучасні напрямки розвитку ендокринології» (Харків, 2004), ІХ Конгрес федерації українських лікарських суспільств (Луганськ-Київ-Чикаго, 2002) та всеукраїнських наукових конференціях: «Актуальні проблеми дерматології та венерології» (Одеса, 2003), ІІ Український з'їзд товариства клітинних біологів (Київ, 2007), «Актуальні питання патології шкіри й урогенітальних інфекцій» (Одеса, 2008), «Захворювання шкіри обличчя, волосистої частини голови і дерматози, асоційовані з поразкою слизової оболонки» (Київ, 2008), «Актуальні питання клінічної та лабораторної імунології, алергології та імунореабілітації» (Київ, 2008).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 16 робіт: 6 статей, з них - 4 статті в наукових виданнях, що входять до переліку наукових фахових видань ВАК Україні, та 8 тез доповідей. Отримано 2 патенти України на винахід.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 173 сторінках друкованого тексту та складається зі вступу, огляду літератури, матеріалів і методів дослідження, 2 розділів власних спостережень, обговорення отриманих результатів, висновків, практичних рекомендацій та списку використаних літературних джерел, який містить 282 джерел (133 кирилицею та 149 латиницею). Текст ілюстрований 21 таблицею, 15 рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У огляді літератури представлені сучасні дані щодо структурно-функціональної організації плазматичних мембран клітин крові, порушення їх молекулярної організації при різних фізіологічних і патологічних станах, регуляції проліферативної активності. Відображені особливості біохімічної модифікації та регуляторно-метаболічні порушення функціонування клітин при псоріазі.

Матеріали та методи дослідження. У якості моделі, що характеризується посиленим епідермопоезом, був обраний псоріаз. Матеріалами дослідження при вивченні мембранної патології клітини при гіперепідермопоезі були: еритроцити, лімфоцити, сироватка крові практично здорових донорів і хворих на псоріаз у динаміці патологічного процесу з виділенням стадії гіперепідермопоезу - періоду загострення захворювання, стадії зниження швидкості епідермопоезу - період клінічної ремісії. Стадія нормального епідермопоезу - контрольна група.

Обстежена група складалась із 151 хворого на псоріаз, які знаходились на стаціонарному лікуванні в ДУ «Інститут дерматології й венерології АМН України» і 72 практично здорових донора однієї вікової категорії. Забір досліджуваного матеріалу робили з 9 до 10 години ранку натщесерце як у контрольній групі, так і в осіб з гіперепідермопоезом. У якості консерванту використовували гепарин.

Зразки біоматеріалу, отримані від пацієнтів і практично здорових донорів, були розподілені на групи відповідно до завдань дослідження (табл. 1).

Таблиця 1. Розподіл зразків біоматеріалу відповідно до періоду епідермопоезу

Для оцінки впливу мембраностабілізуючих препаратів і аутоопромінення ультрафіолетом крові використовували 32 зразки у період загострення гіперепідермопоезу й 28 зразків періоду нормального епідермопоезу.

Стан зовнішніх надмембранних шарів клітин крові (глікокалікс) оцінювався за зміною сорбції барвника - альціанового синього (Крыленков В.А., 1979). Гангліозидний спектр мембран визначали хроматографічним методом (Дятловицкая Е.В., 1980). Білковий спектр еритроцитів і лімфоцитів досліджували методом електрофорезу в поліакріламідному гелі (Laemmli Y.K., 1970). Для кількісної оцінки гексоз використовувався антроновий метод (Слуцкий Л.І., 1969), гексуронових кислот -- карбазоловий (Bitter Т., 1962) і орціновий методи (Svennerholm L., 1956). Вміст білку у клітинах крові визначали за методом О. Лоурі. Визначення активності Са²⁺-АТФази, Na⁺ K⁺-АТФази в еритроцитах і лімфоцитах проводилося за методом В.В. Петруняки (1989). Рівень загального кальцію в біологічному матеріалі визначали методом атомно-абсорбційної спектроскопії на апараті «Сатурн-1» у розведенні 1:100. Концентрацію АТФ в еритроцитах визначали люцеферазним методом за допомогою автоматизованої системи дослідження хемілюмінесценції «Люцефер 01». Підготовку проб для растрової електронної мікроскопії проводили за методом Л.Д. Кримського й співавт. (1986). Для кількісної оцінки сіалових кислот використовувався тіобарбитуровий метод (Warren L., 1959).

Вивчення молекулярних механізмів пошкодження клітинних мембран при псоріазі проводилося шляхом оцінки рівня спонтанної та індукованої залізом хемілюмінесценції (Зенков Н.К., 1990), визначення рівня малонового диальдегіду за методом V. Ishihara (1978). Для характеристики процесів окисної модифікації білків використовували показники вмісту 2,4-динітрофенілгідразонів нейтрального (ДНФГ₃₇₀) та основного (ДНФГ₄₃₀) характеру, які визначали за методом І.Ф. Мещишена (1998). Оцінка перекисної резистентності еритроцитів ґрунтувалася на методі K. Barker (1976) у модифікації М.С. Гончаренко (1982). Визначення молекул середньої маси здійснювали за методом Н.І. Габриелян (1984).

Для активації окисних процесів використовували систему 10^-5М аскорбат/1,2х10^-7М Fe²⁺ (Лущак В.I., 2004). Оцінка впливу молекул середньої маси на сорбційну ємність глікокаліксу до альціанового синього проводилась за методом Т.В. Копитової (2004).

При здійсненні аутоопромінення ультрафіолетом (254 нм) крові на апараті «Ізольда МД-73» застосовувався метод E. Knott (1948).

Статистичну обробку отриманих результатів проводили з використанням параметричних методів статистичного аналізу. Оцінку вірогідності розходжень між статистичними вибірками здійснювали за t-критерієм Стьюдента. Оцінку однорідності розподілу і його відповідність нормальному проводили на основі показників дисперсії та середньоквадратичного відхилення.

Основні результати дослідження та їх обговорення

Аналіз отриманих результатів показав, що при гіперепідермопоезі рівень сорбційної ємності глікокаліксу до альціанового синього (СЄГАС) еритроцитів був вище на 22% (Р<0,01) у порівнянні із показником групи практично здорових донорів. Лімфоцити хворих на псоріаз демонструють прямо протилежну картину. У даних клітинах у хворих на псоріаз спостерігається зниження сорбційної ємності на 25%. Відомо, що рецептори плазматичних мембран, що специфічно зв'язують різні сполуки, являють собою найважливіші функціональні елементи клітини, тому порушення мембранного зв'язування може спричинити зміни окремих властивостей плазматичної мембрани та вплинути на метаболізм клітини в цілому.

Виявлено, що при гіперепідермопоезі ультраструктурна організація еритроцитів значно відрізняється. Метод світлової та растрової електронної мікроскопії дозволив установити, що в популяції клітин крові спостерігається зростання кількості ехіноцитів.

При псоріазі відбувається перерозподіл кальцію між середовищем і клітиною. У хворих на псоріаз вміст загального кальцію в сироватці вірогідно нижче у порівнянні з контролем (псоріаз - 2,58±0,06 ммоль/л, контроль - 2,81±0,05 ммоль/л), а вміст кальцію в еритроцитах вірогідно вище за показник контрольної групи (псоріаз - 0,95±0,06 ммоль/л ер., контроль - 0,73±0,04 ммоль/л ер.) Встановлені зміни у кальцієвому обміні еритроцитів при гіперепідермопоезі співпадають із літературними даними про підвищення вмісту кальцію у шкірі (Довжанский С.И. Утц С.Р., 1992; Суворов А.П., 2005). Тобто зміни внутрішньоклітинного кальцієвого гомеостазу однотипні як в еритроцитах, так і в клітинах-мішенях патології - епідермоцитах.

Показано, що при гіперепідермопоезі на 40% зростає інтенсивність гемолізу еритроцитів у перекис-генеруючій системі глюкоза-глюкозооксидаза у порівнянні з контролем, що може свідчити про більшу окисність їх ліпідного бішару в період загострення захворювання. Можливо, особливості структурної організації збільшують чутливість клітини до окисного ушкодження.

Встановлено, що псоріатичний процес характеризується збільшенням вмісту АТФ в еритроцитах (псоріаз - 0,688±0,045 ммоль/л, контроль - 0,532±0,050 ммоль/л, Р<0,05). Відомо, що еритробласт у порівнянні з еритроцитом характеризується більш високим рівнем АТФ, який зменшується при дозріванні клітини (Kim H.D. et al., 1991). Можна припустити, що виявлена зміна вмісту АТФ пов'язана з відставанням у диференціальному розвитку еритроцитів.

Кореляційний аналіз (рис. 1) виявив у групі практично здорових осіб значимі прямі взаємозв'язки між СЄГАС еритроцитів та вмістом ехіноцитів (r=0,48), рівнем кальцію в еритроцитах (r=0,60) і стійкістю до перекисного гемолізу (r=0,79). Це свідчить про тісний взаємозв'язок поверхневих властивостей, кальцієвого гомеостазу й антиоксидантних властивостей у нормально функціонуючій клітині.

При гіперепідермопоезі зазначені зв'язки стають слабкими або зворотними, що може бути підтвердженням патогенетичного вектору ушкодження структурно-функціональних характеристик клітинних мембран при псоріазі.

Оскільки глікокалікс є складною функціональною системою, органічно пов'язаною з плазматичними мембранами клітин, то були досліджені особливості хімічного складу мембран еритроцитів і лімфоцитів. Встановлено, що при гіперепідермопоезі у мембранах еритроцитів вірогідно знижено вміст спектринової смуги на 20% (Р<0,05) у порівнянні з контролем. Вміст білка смуги 3 і білка смуги 4 при гіперепідермопоезі достовірно вищий за показник контрольної групи (на 11% і 31%, відповідно). У лімфоцитах також відбувається зниження відносного вмісту високомолекулярних білкових фракцій при одночасному зростанні частки поліпептидів із більш низькою молекулярною масою. Можливо, це пов'язане із протеолізом мембранних білків. Виявлені порушення білкового спектру мембран відбивають зміни поверхневих властивостей клітин крові при досліджуваній патології. Зміни у білковому складі мембран клітин крові співпадають зі змінами складу і вмісту білків епідермису. При гіперепідермопоезі в епідермоцитах спостерігаються чіткі порушення в розвитку цитоскелету й клітинних контактів, що відзначають дослідники (Чернух А.М., 1982, Stankler L., 2008).

Істотні кількісні і якісні відмінності спостерігаються в гангліозидному спектрі еритроцитарних мембран при гіперепідермопоезі зі (табл. 2). Період активної проліферації супроводжується зниженням вмісту ганзліозидів G_M2 і G_M3, появою нового сіаломоноглобозиду G_x. У період клінічної ремісії у хворих на псоріаз ця фракція зникає, і гангліозидний спектр наближається до норми. Оскільки гангліозиди є багатофункціональними структурними елементами клітинних мембран, що беруть участь у процесах міжклітинної взаємодії, рецепції, регуляції транспорту іонів, то можливо припустити, що гангліозиди є однією з ланок, через які реалізується патогенетичні механізми при гіперепідермопоезі.

Таблиця 2. Вміст гангліозидів у еритроцитах при гіперепідермопоезі (%)

Примітка. * - Р<0,001 - відносно контрольної групи

Дослідження вуглеводного складу мембран свідчить, що при гіперепідермопоезі відбувається зниження вмісту сіалових кислот в еритроцитах і лімфоцитах (відповідно на 20% (Р<0,01) і 15 % (P<0,05)), гексоз (відповідно на 18% (Р<0,05) і 23% (Р<0,05)) й гексуронових кислот (відповідно на 20% (Р<0,05) і 30% (Р<0,05)) у порівнянні з контролем. У контрольній групі в клітинах крові переважають глікозаміноглікани, що містять ідуронові кислоти і характеризуються коефіцієнтом К/О менше за одиницю. При загостренні захворювання коефіцієнт К/О вірогідно зростає, його значення і в еритроцитах і в лімфоцитах більше за одиницю, що свідчить про перевагу у клітинах крові хворих на псоріаз глікозаміногліканів, що містять в основному глюкуронові кислоти. Встановлені порушення вуглеводного складу мембран еритроцитів і лімфоцитів у період активації епідермальної проліферації вказують на особливості організації клітинної поверхні при даному дерматозі, що зумовлює значні зміни їх функціональної активності.

Зміни, що спостерігаються у хімічному складі мембран сприяють порушенню ліпідно-білкових, ліпідно-ліпідних і білок-білкових взаємодій, зміни їх функціонування й чутливості до дії різних фізико-хімічних факторів. Важливим доказом цих тверджень є дані про зміну бар'єрно-транспортних властивостей мембран еритроцитів при гіперепідермопоезі.

Визначення активності Na⁺,K⁺-АТФази, основною функцією якої є забезпечення іонного гомеостазу клітини, у мембранах клітин червоної крові при гіперепідермопоезі показало зниження (Р<0,05) активності ферменту під час загострення патологічного процесу (рис. 2). Не виключено, що інгібування активності ферменту є результатом структурної модифікації клітинної поверхні, тому що відомо, що Na⁺,K⁺-АТФаза розглядається не тільки як система активного транспорту іонів, але і як система рецепції й передачі сигналів у клітину (Лопина О.Д., 2001; Xie Z., 2003). Крім того, пригнічення активності Na⁺,K⁺-АТФази можливо шляхом прямого впливу на фермент вільнорадикальних з'єднань за умов посиленої ліпопероксидації. Максимальна активність Са²⁺-АТФази у період загострення гіперепідермопоезу не відрізняється від активності цього ферменту у практично здорових донорів.

Попередніми дослідженнями було встановлено, що швидкість пасивного входу кальцію в еритроцити при гіперепідермопоезі в 1,6 рази вище за показник контрольної групи (Гончаренко М.С., 1990). Імовірно, що такої низької активності Са²⁺-АТФази недостатньо для компенсації підвищеного пасивного входу кальцію. У результаті дисбалансу вхідних і вихідних потоків кальцію через мембрани в еритроцитах при гіперепідермопоезі, можливо, встановлюється рівновага при більш високій початковій концентрації клітинного кальцію.

У лімфоцитах в період загострення гіперепідермопоезу відбувається активація роботи Са²⁺-АТФази (псоріаз - 157,8±10,9 мкмольР_н/10⁷ кл. хв, контроль - 84,6±6,7 мкмольР_н/10⁷кл. хв). У період ремісії активність ферменту знижується й незначно перевищує даний показник у нормі (91,0±17,8мкмольР_н/10⁷кл. хв). Підвищення активності ензиму у лімфоцитах при псоріазі можна вважати наслідком оборотних змін у цих клітинах.

Зміни стану поверхні клітин крові та пов'язаних із нею функціональних властивостей при гіперепідермопоезі можуть бути наслідком окисної деградації плазматичних мембран, що підтверджується достовірним збільшенням індексу стимуляції як при спонтанній, так і при зімозан-індукованій хемілюмінесценції у порівнянні із контрольною групою.

Також було показано, що при гіперепідермопоезі в еритроцитах активується Fe²⁺-індукована хемілюмінесценція, що пов'язано з інтенсивним накопиченням продуктів, що люмінесцирують. Генерація вільних радикалів у еритроцитах при активації патологічного процесу перевищує контрольні величини в 1,5-2 рази. Інтенсивний синтез активованих кисневих метаболітів є загрозою для клітин, оскільки ці речовини мають здатність ініціювати вільнорадикальне окиснення ліпідів мембран і активізувати ендогенні фосфоліпази, що може призвести до порушення структурної цілісності клітинних мембран і викликати деструкцію тканин.

Дослідження рівня малонового диальдегіду в клітинах крові й плазмі свідчать про посилення процесів перекисного окиснення ліпідів при гіперепідермопоезі, яке характеризується підвищеним рівнем малонового диальдегіду в еритроцитах, лімфоцитах і сироватці крові (табл. 3). Продукти окиснення ліпідів, у тому числі й малоновий диальдегід, можє утворювати стабільні комплекси з білками та ініціювати полімеризацію білкових молекул, що сприяє руйнуванню клітинних структур. Також малоновий диальдегід токсично впливає на клітинну рецепцію.

Таблиця 3. Вміст малонового диальдегіду в крові при гіперепідермопоезі (M±m)

Примітки: * - Р<0,05 - відносно контрольної групи,

** - Р<0,01 - відносно контрольної групи.

У результаті взаємодій вільних радикалів з ліпідами, білками або нуклеїновими кислотами виникають деструктивні процеси, у клітинах і в плазмі крові з'являються гетерогенні продукти окиснення й деградації біополімерів, відомі як молекули середньої маси. Оцінка вмісту молекул середньої маси у сироватці крові при гіперепідермопоезі показала, що в період загострення захворювання спостерігається розвиток ендогенної інтоксикації (псоріаз - 0,268± 0,017 ум. од, контроль - 0,197±0,012 ум. од.; P<0,001), що збігається з літературними даними (Химкина Л.Н. і ін., 2008).

Дослідження спонтанної окисної модифікації білків мембран еритроцитів, лімфоцитів і сироватки свідчать про статистично достовірні зміни вмісту динітрофенолгідразонів у порівнянні із практично здоровими донорами при довжині хвилі 370 нм, а при довжині хвилі 430 нм вірогідно збільшується вміст динітрофенолгідразонів тільки в еритроцитах (табл. 4). Інтенсифікація окисної модифікації глікопротеінів рецепторного апарату мембран клітин крові обумовлює зміни у сприйнятті сигналів. Окисна модифікація впливає на показник ізоелектричної точки, термостабільності, протеолітичної чутливості й призводить до втрати ферментативної активності. При цьому згідно із літературними даними, відновлення окиснених білків практично не відбувається. Вони стають мішенню для дії специфічних нейтральних і лужних протеаз (Карімов І.З., 2005). Окиснення білків не може не впливати на функції глікокаліксу тому, що глікозаміноглікани клітини, що перебувають на поверхні, міцно пов'язані з мембранними білками.

Таблиця 4. Вміст динітрофенолгідразонів в крові при гіперепідермопоезі (M±m)

Примітки: * _ Р<0,05 _ відносно контрольної групи, ** _ Р<0,01 _ відносно контрольної групи, *** _ Р<0,001 _ відносно контрольної групи.

Пусковим механізмом дезорганізації плазматичних мембран при даній патології може бути інтенсифікація процесів вільнорадикального окиснення білків. Тобто стан поверхні клітин крові при гіперепідермопоезі й пов'язаних із нею функціональних властивостей можуть змінюватися внаслідок окисної деградації плазматичних мембран.

Для оцінки значення активації окисних процесів на поверхні клітин крові при гіперепідермопоезі було проведене дослідження впливу системи аскорбат/Fe²⁺ на сорбційну ємність еритроцитів і лімфоцитів. Виявлено, що під впливом прооксидантної системи відбувається достовірне збільшення CЄГАС еритроцитів хворих і тієї частини здорових донорів, у якої цей показник до інкубації із прооксидантами був вище, ніж у іншої частини донорів.

Отримані дані свідчать про те, що ступінь зміни сорбційної ємності еритроцитів під впливом прооксидантної системи визначається значною мірою початковим її рівнем. При вивченні дії прооксидантної системи на СЄГАС лімфоцитів було виявлено, що в цих умовах у практично здорових донорів не відбувається змін значень СЄГАС, а при гіперепідермопоезі СЄГАС лімфоцитів вірогідно збільшується. Імовірно дія системи аскорбат/Fe²⁺ поширюється на ділянки зв'язування цього барвника, а посилення окисних процесів впливає на сорбційну ємність еритроцитів і лімфоцитів при епідермопоезі.

Порівняльне вивчення впливу молекул середньої маси на поверхневі властивості мембран еритроцитів і лімфоцитів показало, що молекули середньої маси, що мають токсичну природу, по різному діють на клітини крові при нормальному та підвищеному епідермопоезі. Сорбційна ємність еритроцитів вірогідно збільшується тільки в здорових осіб, а при гіперепідермопоезі не змінюється. Отже, підвищення СЄГАС еритроцитів при гіперепідермопоезі може бути обумовлено фізіологічною реакцією організму на накопичення ендотоксинів. У експерименті з лімфоцитами показано зниження сорбційної ємності після інкубації із молекулами середньої маси при нормальному та підвищеному епідермопоезі. Можна припустити, що до складу молекул середньої маси, крім речовин, що мають ендотоксичні властивості, входять також продукти, які виступають у ролі клітинних регуляторів або модуляторів імунних процесів.

Дослідження впливу трансфузії аутоопроміненої ультрафіолетом крові на сорбційну ємність глікокаліксу клітин крові хворих показало, що після 1 сеансу аутоопромінення ультрафіолетом через 3 години відбувається достовірне зниження цього показника в еритроцитах. Цей ефект зберігається через 6 годин після опромінення. Показано, що тільки після 2 сеансу через 3 години після аутоопромінення ультрафіолетом при гіперепідермопоезі відбувається достовірне збільшення СЄГАС лімфоцитів, яке зберігається через 6 і 24 години. Імовірно, у результаті зміни глікокаліксу лімфоцитів під впливом ультрафіолетового опромінення може зростати активність локалізованих на їхній поверхні імунорецепторів.

Відомо, що зміна функціональної активності імунокомпетентних клітин після дії аутоопромінення ультрафіолетом на кров може призвести до змін імунореактивності організму. Можливо, при ультрафіолетовому опроміненні крові модифікуються мембранні рецептори, а також активність пов'язаних із поверхнею клітини антигенів і ферментних ансамблів еритроцитів і лімфоцитів.

У експерименті було показано, що на СЄГАС еритроцитів і лімфоцитів впливають лікарські засоби, що застосовуються при лікуванні гіперепідермопоезу, а саме кальцієві антагоністи (финоптин, етмозин), мембрано-стабілізуючий препарат лимонтар а також імуномоделюючий препарат тимоген. При застосуванні кальцієвих антагоністів відбувається позитивна динаміка зміни СЕГАС клітин крові, що вказує на можливість терапевтичної корекції порушень мембранної організації клітини.

На прикладі лимонтара та тимогена показана ефективність комплексної терапії, від якої залежить захист структури і функції клітинних мембран. Ці результати продемонстрували обґрунтованість включення в лікувальний комплекс мебранотропних лікарських препаратів при даній патології.

Таким чином, отримані в роботі результати є доказом того, що фізіологічні перебудови організму реалізуються через єдиний механізм модифікації клітинних мембран. Можливо, що патологічний процес при гіперепідермопоезі починається з руйнування глікокаліксу й ослаблення його захисних функцій у різних тканинах.

У цілому викладені результати розкривають і уточнюють мембранологічний аспект патогенезу гіперепідермопоезу та обґрунтовують необхідність стабілізації глікокаліксу і його рецепторів при даній патології, тому що ефективність комплексної терапії обумовлена ступенем захисту структури й функції клітинних мембран.

ВИСНОВКИ

клітина кров плазматичний гіперепідермопоез

У дисертації представлені обґрунтування і нове рішення наукової задачі -- оцінка змін структурно-функціональних характеристик мембран еритроцитів та лімфоцитів при хронічному гіперепідермопоезі. На підставі отриманих результатів висунуте припущення, що визначальну роль у залученні клітин крові до патологічного процесу при псоріазі відіграють порушення плазматичних мембран і, в першу чергу, їх поверхневих властивостей.

Вивчення структурно-функціонального стану клітин крові при гіперепідермопоезі дозволяє зробити наступні висновки:

1. Виявлено зміни поверхневих властивостей мембран еритроцитів і лімфоцитів в період загострення гіперепідермопоезу, що виражаються в підвищенні сорбційної ємності глікокаліксу еритроцитів і зниженні сорбційної ємності глікокаліксу лімфоцитів. Вуглеводний склад плазматичних мембран перетерплює істотні зміни: знижуються в еритроцитах і лімфоцитах вміст сіалових кислот, гексоз й гексуронових кислот і збільшується рівень глікозаміногліканів, що містять в основному глюкуронові кислоти. Зміни поверхневих властивостей клітин крові пов'язані з динамікою патологічного процесу.

2. Встановлено зміни білкового, гангліозидного складів і ультраструктурної організації еритроцитарних мембран, що полягають у зменшенні вмісту спектринової смуги, G_M2, G_M3-подібних гангліозидів, появі нового гангліозиду, збільшенні вмісту білка смуги 3, білка смуги 4 та кількості ехіноцитів у загальній популяції клітин крові. В мембранах лімфоцитів відбувається зменшення відносного вмісту високомолекулярних білкових фракцій.

3. Механізми розвитку гіперепідермопоезу реалізуються внаслідок змін вуглеводного, білкового і гангліозидного складу мембран клітин крові. У результаті деструктивних змін мембранних структур спостерігається порушення їх функцій: відбувається підвищення рівня АТФ, збільшення вмісту кальцію в еритроцитах на тлі його зменшення в плазмі крові, активація Са²⁺-АТФази в лімфоцитах, зменшення стійкості до перекисного гемолізу та активності Na⁺,K⁺-АТФази в клітинах крові.

4. Установлено, що дестабілізація мембран при гіперепідермопоезі є наслідком активації окисних процесів. Відбувається ініціація хемілюмінесценції крові, що полягає у збільшенні індексу стимуляції як спонтанної, так і зімозан-індукованої хемілюмінесценції, активації Fe²⁺-індукованої хемілюмінесценції в еритроцитах, збільшенні вмісту малонового диальдегіду та інтенсифікації процесів окислювання білків у клітинах і сироватці крові. Система аскорбат/Fe²⁺ викликає зміну поверхневих властивостей еритроцитів і лімфоцитів, яка визначається початковим рівнем сорбційної ємності глікокаліксу.

5. При гіперепідермопоезі виявлено розвиток ендогенної інтоксикації, обумовленої високим рівнем молекул середньої маси у сироватці крові. В експерименті доведено, що молекули середньої маси, виділені із плазми крові хворих на псоріаз, мають токсичний вплив на глікокалікс. Цей ефект полягає в тому, що під дією цих речовин сорбційна ємність еритроцитів та лімфоцитів практично здорових донорів зазнає патологічних змін, що характерні для гіперепідермопоезу.

6. З'ясовано, що ультрафіолетове опромінення стабілізує поверхню клітин крові, про що свідчить нормалізація сорбційної ємності глікокаліксу еритроцитів і лімфоцитів до альціанового синього при гіперепідермопоезі. Препарати мембранотропної дії (финоптин, етмозин, лимонтар, тимоген) ефективно відновлюють поверхневі характеристики клітин крові при гіперепідермопоезі, що обґрунтовує включення їх до лікувального комплексу при псоріатичному процесі.

ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ

Одержані результати дозволяють рекомендувати використовувати дослідження стану зовнішніх примембранних шарів клітин крові (глікокаліксу) за сорбцією барвника - альціанового синього:

- для оцінки активності псоріатичного процесу й прогнозування його ускладнень (Патент «Спосіб доклінічної діагностики артропатичного псоріазу»)

- при тестуванні мембранотропного впливу лікарських препаратів

- для характеристики індивідуальних особливостей стану патологічного процесу при псоріазі і формування тактики лікування із використанням препаратів кальцій-антагоністичної, антиоксидантної та мембранопротекторної дії.

СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Семко Г. А. Структурно-функциональные изменения мембран и внешних примембранных слоев при гиперэпидермопоэзе / Г. А. Семко //Украинский биохимический журнал. - 1998. - Т.70, №3. - С. 113-118.

2. Мавров И. И. Изменения некоторых показателей соединительной ткани и внешних примембранных слоев клеток крови при гиперэпидермопоэзе / И. И. Мавров, Г. А. Семко, Е. В. Ермошенко // Експериментальна і клінічна медицина. - 2002. - № 4. - С. 89-91.

Дисертант проводила дослідження глікокаліксу клітин крові.

3. Семко Г. О. Окиснювальна деструкція білків сироватки крові та структурно-функціональний стан еритроцитів у хворих на псоріаз / Г. О. Семко // Досягнення біології та медицини. - 2004.- №2 (4). - С. 99-101.

4. Семко Г. О. Особливості поверхневих характеристик мембран лімфоцитів у хворих на псоріаз / Г. О. Семко // Досягнення біології та медицини. - 2008.- №1 (11). - С. 45-47.

5. Барьерно-транспортные и структурные свойства мембран эритроцитов при псориазе / И. И. Мавров, М. С. Гончаренко, А. К. Кондакова, Г. А. Семко, Е. В. Ермошенко // Дерматологія та венерологія. - 2002. - № 2 (16). - С. 15-19.

Дисертант проводила дослідження білкового, гангліозидного спектрів мембран еритроцитів, сорбційної ємності клітин крові та обміну кальцію.

6. Кондакова А. К. Методы коррекции структурно-функциональных нарушений плазматических мембран при псориатической болезни / А. К. Кондакова, Е. В. Ермошенко, Г. А. Семко // Doctor. - 2005. - № 1 (27). - С. 18-19.

Дисертант проводила дослідження обміну кальцію та рівня АТФ у нормі та при гіперепідермопоезі.

7. Пат. 38631 А Україна, МПК⁷ А 61 В 10/00. Спосіб оцінки ефективності лікування хворих на псоріаз / Мавров І. І., Гончаренко М. С., Семко Г. О., Кондакова А. К.; заявник та патентовласник «Український науково-дослідний інститут дерматології та венерології». - № 2000084675; заявл. 04.08.2000; опубл. 15.05.2001, Бюл. № 4.

Дисертант проводила дослідження рівня загального та іонізованого кальцію у сироватці крові, рівня кальцію у еритроцитах.

8. Пат. 32300 Україна, МПК А 61 В 10/00. Спосіб доклінічної діагностики артропатичного псоріазу / Мавров І. І., Кондакова Г. К., Семко Г. О., Олійник І. О.; заявник та патентовласник ДУ „Інститут дерматології та венерології АМН України”. - № u200800127; заявл. 02.01.2008; опубл. 12.05.2008, Бюл. № 9.

Дисертант проводила дослідження глікокаліксу клітин крові.

9. Семко Г. А. Взаимосвязь между поверхностными свойствами и некоторыми структурно-функциональными характеристиками клеток крови при псориазе / Г. А. Семко // VIII Всерос. съезд дерматовенерологов, 22-24 марта 2001 г.: тезисы научн. робот. - Москва, 2001. - ч. 1. - С. 225-226.

10. Структурні властивості мембран еритроцитів при псоріазі / І. І. Мавров, О. М. Бродська, Г. О. Семко, О. В. Єрмошенко // ІХ конгрес світової федерації українських лікарських товариств, 19-22 серпня 2002 р.: тези доповідей. - Луганськ-Київ-Чикаго, 2002. - С. 378.

11. Свободно-радикальное окисление белков и нарушение структурно-функционального состояния клеток крови в патогенезе псориаза / И. И. Мавров, Г. А. Семко, А. К. Кондакова, Е. В. Ермошенко, Е. А. Ерещенко // Актуальные проблемы дерматологии и венерологи: научно-практ. конф., посвященная 75-летию Одесского областного кожно-венерологического диспансера, 21-22 нояб. 2003 г.: тезисы докл. - Одесса, 2003. - С. 77-78.

12. Семко Г.А. Роль гормональной регуляции в нарушении гомеостаза кальция при псориазе / Г. А. Семко, Е. В. Ермошенко // Сучасні напрямки розвитку ендокринології (Треті Данілевські читання): науково-практ. конф. з міжд. участю, 26-27 лют. 2004 р.: матеріали конф. С. 154--155.

13. Семко Г. А. Влияние кальциевых антагонистов на сорбционную емкость гликокаликса эритроцитов и лимфоцитов при псориазе / Г. А. Семко, О. Н. Стулий // Лекарства - человеку. Современные проблемы создания, исследования и апробации лекарственных средств: научно-практ. конф. с межд. участием, 22 марта 2007 г.: мат. конф. - Харьков, 2007. - С. 110-111.

14. Семко Г. О. Деякі зміни поверхневих властивостей мембран лімфоцитів при псоріазі / Г. О. Семко // 2-й з`їзд українського товариства клітинної біології, 23-26 жовтня 2007 р.: збірник тез. - Київ, 2007. - С. 205.

15. Семко Г. О. Поверхневі властивості еритроцитів у хворих на артропатичний псоріаз / Г. О. Семко // Захворювання шкіри обличчя, волосистої частини голови та дерматози, асоційовані з ураженням слизової оболонки: науково-практ. конф., 20-21 березня 2008 р.: матеріали конф. - Київ, 2008 - С. 97-98.

16. Семко Г. А. Лимфоциты при псориазе: поверхностные свойства, белковый спектр и функциональная активность / Г. А. Семко, Е. А. Ерещенко, Т. В. Земляная // Імунологія та алергологія. - 2008. - № 1: Актуальні питання клінічної та лабораторної імунології, алергології та імунореабілітації: наук.-практ конф., 7 квітня 2008 р.: матеріали конф. - С. 56.

Размещено на Allbest.ru