Молекулярна гетерогенність ферментів енергетичного обміну клітин кісткового мозку та еритроцитів щурів за спільної дії іонізуючого випромінювання малої потужності та введення препарату "відехол"

Размещено на http://www.allbest.ru/

ї

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

IНСТИТУТ БІОХІМIЇ ІМ. O. B. ПAЛЛAДІНA НАН УКPAЇНИ

УДК 577.3:577.15.08:612.111:577.161.2:612.014.481

Молекулярна гетерогенність ферментів енергетичного обміну клітин кісткового мозку та еритроцитів щурів за спільної дії іонізуючого випромінювання малої потужності та введення препарату “відехол”

03.00.04 - біохімія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Бесерріль Арагон Габрієль Альфонсо

Київ 2008

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у Львівському національному університеті імені Івана Франка МОН України

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор

Великий Микола Миколайович,

провідний науковий співробітник

лабораторії медичної біохімії

Інституту біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, старший науковий співробітник

Пархоменко Юлія Михайлівна,

провідний науковий співробітник

відділу біохімії коферментів

Інституту біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України;

доктор біологічних наук, професор

Войціцький Володимир Михайлович,

професор кафедри біохімії Київського національного університету імені Тараса Шевченка.

Захист відбудеться „24” листопада 2008 р. о 14.00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.240.01 при Інституті біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України за адресою: 01601, м. Київ, вул. Леонтовича, 9.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України за адресою: м. Київ, вул. Леонтовича, 9.

Автореферат розісланий „22” жовтня 2008 р.

Учений секретар спеціалізованої вченої ради, кандидат біологічних наук О.В.Кірсенко

рентгенівський проліферативний мозок

АНОТАЦІЯ

Бесерріль Арагон Г. А. “Молекулярна гетерогенність ферментів енергетичного обміну клітин кісткового обміну мозку та еритроцитів щурів за спільної дії іонізуючого випромінювання малої потужності та введення препарату “Відехол”. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 - біохімія. - Інститут біохімії імені О. В. Палладіна НАН України, Київ, 2008.

В дисертації наведені, проаналізовані та обґрунтовані дані досліджень, щодо впливу 1,25(ОН)2-холекальциферолу в складі препарату “Відехол”, на радіаційно-індуковані зміни співвідношення молекулярних форм та активності ензимів енергетичного обміну в еритроїдному, гранулоцито-моноцитарному паростках кісткового мозку і в еритроцитах периферійної крові. Результати дисертаційної роботи свідчать про посилення адаптивної відповіді організму за введення препарату “Відехолу” щурам, що піддавались хронічному рентгенівському опроміненню потужністю 1 сГр на добу до загальної дози 30 сГр та вказують на перспективність подальшого дослідження адаптогенних властивостей вітаміну D3 за дії іонізуючого випромінювання.

Ключові слова: іонізуюче випромінювання малої потужності, вітамін D3, активність та співвідношення ізоформ ензимів, адаптивна відповідь

АННОТАЦИЯ

Бесерриль Арагон Г. А. «Молекулярная гетерогенность ферментов энергетического обмена клеток костного мозга и эритроцитов крыс при совместном воздействии малых доз ионизирующего облучения и введения препарата «Видехол». - Рукопись.

Диссертация на сoискание научной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04 - биохимия. - Институт биохимии имени О. В. Палладина НАН Украины, Киев, 2008.

В диссертации приведены, проанализированы и теоретически обоснованы экспериментальные данные по влиянию 1,25(OH)2-холекальциферола, в составе препарата «Видехол», на радиационно-индуцированные изменения соотношений молекулярних форм и активности ензимов энергетического обмена в эритроидном, гранулоцито-моноцитарном ростках костного мозга и в эритроцитах периферической крови. Результаты диссертационной работы свидетельствуют о усилении адаптивного ответа организма при введении препарата “Видехол» крысам на фоне хронического рентгеновского облучения мощностью 1 сГр в сутки до общей дозы 30 сГр и обосновывают перспективность дальнейших исследований адаптогенных свойств витамина D3 при действии ионизирующего излучения.

Ключевые слова: ионизирующее излучение низкой мощности, витамин D3, соотношение изоформ, ензиматичная активность, адаптивный ответ.

SUMMARY

Becerril Aragon G. A. “Molecular heterogeneity of the enzymes of carbohydrates metabolism in bone marrow cells and erythrocytes of rats submitted to the joint action of chronic low-dose ionising radiation and vitamin D3 dietary supplementation”. - Manuscript.

Thesis for scientific degree of candidate of biological sciences (PhD) in the specialty 3.00.04 - biochemistry. - O.V. Palladin Institute of Biochemistry, National Academy of Sciences of Ukraine, Kiev, 2008.

This dissertation evaluates the effects of vitamin D3 on the changes induced by low dose ionising irradiation to the multiple molecular forms ratio (ММF) and the activity of several enzymes of carbohydrate metabolism in bone marrow and erythrocytes of rats.

The results of the research confirm the high radiosensitivity of haemopoyesis. In rats irradiated daily with 1 cGy, cellular proliferation intensified in bone marrow causing alterations of the proliferative indexes of erythroblasts and neutrophilic granylocytes at an absorbed dose of 20 cGy. Nonetheless, adaptive processes led to normalisation of the composition of the cellular populations when the absorbed dose reached 30 cGy. At metabolic level, the activities of glycolytic enzymes (hexokinase (HK), piruvate kinase (PK) and lactic dehydrogenase (LDH)) significantly increased іn erythrocytes at 20 cGy, while the activities of the Kreb's cycle (TAC) enzymes isocitric (IDH) and malatic dehydrogenases (MDH) grew significantly from 20 to 30 cGy. Similar changes were observed in granulocyte-monocytes cells (GM) of bone marrow, with a more pronounced build-up of IDH and MDH activities. Unlike, in erythroidal cells at 30 cGy the activities of glycolytic enzymes dropped lower basal levels whilst TAC enzymes reached control ranges. The activity of the pentosephosphate pathway enzyme glucose-6-phospate dehydrogenase (G-6-PDH), after being downregulated at 10 cGy, corrected towards control means at 30 cGy, indicating the appearance of adaptive metabolic response in bone marrow cells. In erythrocytes however, the activity of G-6-PDH exceeded basal limits at all doses conditioned by the increase of the activity of the isoform G-6-PDH-3, as showed by the values of the redistribution coefficients (lG6PDH-і). In GM cells the activities of the MMF of all studied enzymes varied constantly, but when the absorbed dose reached 30 cGy their ratio were more similar to the control values than those of erythroidal cells. In erythrocytes, an increase of the activities of PK, G-6-PDH, MDH and IDH minor molecular forms, typical for erythroidal cells, was revealed up to 30 cGy.

The per os administration of “Videchol” (28 IU of D3/100 g body weight every third day) to irradiated rats led to values of redistribuition coefficients (leі ) different from those of the irradiated rats. An increment of the activity of the LDH isoforms containing the peptide M (A) in all cellular populations was registered. In erythrocytic MDH, IDH and PK isozymes ratio the activities of molecular forms that are major for erythroidal cells increased. The lack of reciprocity between the changes of the activities of PK and IDH and the concentration levels of their effectors and substrates (NAD+, ATP, lactate, pyruvate) indicated that vitamin D effects are exerted not only at metabolic level in target cells.

The assessment of initial rate values of erythrocytic LDH as function of protein concentration in control, irradiated (20cGy), irradiated and supplied with “Videchol” and only supplied with “Videchol” rats evidenced that the kinetic properties (initial rate vo and Michaelis constant Km) of the enzymes under those experimental conditions differ. These changes are caused by modification of the peptidic structure and oligomeric state exerted upon genetic and epigenetic regulation. The corrective effect of “Videchol” in irradiated animals was also detected on LDH initial rate. The administration of vitamin D3 led to normalisation of the activities of the glycolytic enzymes at an absorbed dose of 20 cGy; to normalisation of TAC enzymes activities in bone marrow cells at 30 cGy and to correction of G-6-PDH in all cellular lines to values 25% closer to the basal means than in irradiated rats. The activities of TAC enzymes did not reach basal limits in erythrocytes of irradiated rats following “Videchol” supplementation because of the major impact of the earlier intensification of erythroidal proliferation on the composition of the erythroid population in peripheral blood within the time frame of the experiments.

The changes of MMF ratio and activity of enzymes recorded during this research support the conclusion that the induced adaptive response to carbohydrate metabolism in erythrocytes relate to the effect induced by 1,25(OH)2-cholecalcipherol on the proliferative activity of erythroidal cells in earlier terms of the experiment and on the structure of the cellular membrane. In bone marrow cellular populations the changes mainly are caused by the action of the nucleophilic vitamin D3-receptor complex on the regulation of biosynthesis and modification of the enzymes. The intensification of G-6-PDH activity from a dose of 20 cGy in all the studied cellular lines of irradiated animals supplemented with `Videchol' points to the adaptation of carbohydrates metabolism towards an effective supply of the energetic demand of the antioxіdative processes. The assessment of the potential use of the MMF ratio as indicator of radio-induced damage is prospective. The evidences provided by the supplement “Videchol” acting as an adaptogen following low-dose chronic irradiation urge to further the integrative understanding of the corrective action of vitamin D3 and its analogs at genomic, proteomic and metabolic levels.

Key words: low dose radiation, vitamin D3, isozymes ratio, enzymаtic activity, adaptation

1. ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми: Дія стресових чинників, зокрема іонізуючого випромінювання малої потужності, на живі організми призводить до ураження структурних елементів клітин, порушення різних ланок метаболізму, помилок у реалізації генетичної інформації та зниження імунітету. Класичні уявлення про радіаційно-індуковане пошкодження клітин - “принцип попадання” (Тимофеев-Реcовский Н.В., 1968) доповнились доказами наявності “нецільових” ефектів, таких як зниження геномної стабільності та ушкодження “оточуючих” клітин (Wright E., 2004). Механізми їх реалізації включають зміни рівня експресії сигнальних факторів індукції стресу, вмісту високореактивних сполук кисню, порушення процесів диференціації та проліферації, затримку клітинного циклу, що зрештою обумовлюють апоптоз і некроз клітин. Ряд ефекторів сигнальних шляхів, впливаючи на процеси репарації ДНК, клітинного захисту, фагоцитарного перехоплення, ініціації та промоції потенційно канцерогенних клітин, здатні обумовлювати подальший розвиток радіаційного пошкодження або його подолання, тобто ініціацію адаптивних процесів (Amudson S. et al., 2003).

Іонізуюче випромінювання малої потужності викликає проліферативні зсуви у клітинних популяціях системи гемопоезу та зміни активності ензимів енергетичного обміну кровотворних клітин (Кузин А.М., 1992, Кучеренко М.Є., 2002). Пошкодження системи кровотворення є критичним фактором перебігу радіаційної хвороби у ссавців. Гемопоетична тканина реагує приблизно однаково на однократну або багатократну дію випромінювання малої потужності. Репаративні процеси здатні забезпечити відновлення функції кровотворної тканини якщо сумарна хронічна доза не перевищує 0,7-1,0 Гр. Для регенерації кісткового мозку необхідно, щоб принаймні 5% стовбурових клітин були житєздатні (Fliedner T.M. et al., 1996). за опромінення тван більш високими дозами (6-7 Гр) лише 2-3% кровотворних клітин зберігають здатність до проліферації (Miller W.T. et al., 1997). Генетична та структурно-метаболічна регуляція клітинних функцій реалізуються через процеси синтезу та функціонування множинних молекулярних форм ензимів, тому вивчення розподілу їх відносних активностей на ранніх стадіях клітинної проліферації дасть можливість передбачити особливості розвитку радіаційно-індукованого патологічного процесу.

З метою корекції радіаційних ушкоджень застосовують антиоксиданти, імуномодулятори та адаптогени природного походження, тривале застосування яких не має шкідливих наслідків. На особливу увагу заслуговують вітамін D3 та його аналоги, що проявляють чітко виражений нормалізуючий ефект за дії несприятливих факторів середовища. Виявлення рецепторів вітаміну D3 у клітинах багатьох тканин дозволило обгрунтувати гіпотезу про його вплив на регуляцію процесів клітинної диференціації, проліферації, а також репродукції, стійкості та адаптації організмів (Lin et a., 2007; Autier et al., 2007; Stumpf W.E. et al., 1995).

Багаторівневий вплив холекальциферолу на фізіологічні функції організму робить актуальним дослідження його адаптогенних властивостей за дії іонізуючого випромінювання малої потужності на проліферативну активність, а також на співвідношення активностей множинних молекулярних форм ензимів енергетичного обміну еритроцитів, еритроїдної та гранулоцито-моноцитарної клітинних популяцій.

Зв'язок роботи з науковими програмами: Дисертаційна робота виконана на кафедрі біохімії Львівського національного університету імені Івана Франка згідно з планом роботи по темі Бх-13Б: “Дослідження мембранотропної дії малих доз хронічного рентгенівського опромінення низької потужності” (номер державної реєстрації 0100U001438).

Мета і задачі дослідження. Метою дисертаційної роботи було встановити зміни активності і розподілу ізоформ ензимів гліколізу, пентозофосфатного шляху та циклу трикарбонових кислот еритроїдних, гранулоцито-моноцитарних клітин кісткового мозку і еритроцитів периферичної крові за хронічної дії іонізуючого випромінювання малої потужності та можливість корекції цих порушень за введення вітамін D3-вмісного перепарату “Відехол”.

Відповідно до поставленої мети в роботі вирішувались наступні задачі:

1. Провести цитоморфологічну ідентифікацію, оцінити проліферативну активність клітин кісткового мозку, визначити рівень диференціювання гранулоцито-моноцитарної та еритроїдної клітинних популяції за дії рентгенівського випромінювання малої потужності.

2. Дослідити зміни активності гексокінази (ГК), піруваткінази (ПК), лактатдегідрогенази (ЛДГ), глюкозо-6-фосфатдегідрогенази (Г-6-ФДГ), ізоцитратдегідрогенази (ІДГ) та малатдегідрогенази (МДГ) в клітинних популяціях кісткового мозку та еритроцитах за хронічної дії рентгенівського випромінювання малої потужності.

3. Дослідити ефективність використання вітамін D3-вмісного препарату „Відехол” з метою корекції виявлених порушень ензимів енергетичного обміну.

4. Встановити зміни співвідношень множинних молекулярних форм ГК, ПК, ЛДГ, Г-6-ФДГ, ІДГ та МДГ МДГ в нормі, за дії випромінювання малої потужності та введення препарату “Відехол”.

5. Обґрунтувати механізми модифікуючого ефекту вітаміну D3 на радіоіндуковані порушення активності та склад ізоформ ензимів енергетичного обміну клітинних популяцій кісткового мозку та еритроцитів щурів.

Об'єкт дослідження: гранулоцито-моноцитарна, еритроїдна популяції клітин кісткового мозку та еритроцити периферичної крові.

Предмет дослідження: активність, молекулярна гетерогенність ензимів енергетичного обміну та адаптогенний ефект вітаміну D3 у складі препарату “Відехол” за хронічної дії іонізуючої радіації малої потужності.

Методи дослідження: біохімічні (спектрофотометрія, ензиматичні методи визначення вмісту метаболітів та ефекторів, нативний диск-електрофорез у поліакриламідному гелі, денситометрія), гістохімічні та морфоцитологічні методи.

Наукова новизна одержаних результатів. В дисертаційній роботі встановлено, що за хронічної дії іонізуючого випромінювання малої потужності в поглинутих дозах 10, 20 та 30 сГр, у щурів спостерігаються порушення проліферативної активності та енергетичного метаболізму гемопоетичних клітин. Зокрема, інтенсифікація проліферації у початкові терміни опромінення до сумарної дози 20 сГр, яка проявляється у зростанні кількості клітин кісткового мозку на тлі зменшення долі зрілих форм, змінювалась гальмуванням до рівня контрольних значень за поглинутої дози 30 сГр.

Вперше виявлено, що радіоіндуковані зміни активності та розподілу множинних молекулярних форм ензимів системи гемопоезу за щодобового опромінення у дозі 1 сГр є найбільш вираженими за сумарної дози 20 сГр: в клітинах еритроїдного та гранулоцито-моноцитарного паростків кісткового мозку підвищується активність ензимів гліколізу (ГК, ПК та ЛДГ) за одночасного зниження активності Г-6-ФДГ, NADP-ІДГ та МДГ. Суттєвий вклад у результуючу зміну активності індивідуальних ензимів вносять їх ізоензими: для гексокінази - ізоформи ГК-ІІІ та ГК-IV, для піруваткінази - ізоформи ПК-R2 (характерна для молодих еритроцитів) та ПК-М1 (еритроїдний та ГМ-ний паростки), для лактатдегідрогенази - ЛДГ-4 та ЛДГ-5, для Г-6-ФДГ - ізоформи Г-6-ФДГ-1 та Г-6-ФДГ-3, для NADP-ІДГ та МДГ - їх мітохондріальні ізоформи. Вперше застосовано положення теорії метаболічного контролю (Lion, 2004; Hofmeyr, 2001) та введено коефіцієнт локального перерозподілу ізоформ (lеі) для оцінки вкладу зміни активності кожної з множинних молекулярних форм у результуючу активність відповідного ензиму (Aе) за опромінення та введення препарату „Відехол”.

У роботі вперше показано, що у кровотворних клітинах, корегуючий ефект вітаміну D3 у складі препарату „Відехол” на радіоіндуквані пошкодження ензимних систем енергетичного обміну за щодобового опромінення в дозі 1 сГр реалізується через перерозподіл їх множинних молекулярних форм. Оскільки енергетичний метаболізм клітин еритроїдного паростку кісткового мозку є більш чутливим до дії іонізуючої радіації ніж у клітин гранулоцито-моноцитарного паростку, а отже і корегуючий ефект препарату “Відехол” також є більш вираженим в еритроїдних клітинах, видається виправданим використування клітин системи еритрону, в якості моделі для оцінки ступеня ураження та адаптації організму за дії випромінювання малої потужності. Результати дисертаційної роботи експериментально підтверджують положення про гормон-подібну дію вітаміну D3, метаболічні ефекти якого реалізуються в гемопоетичних клітинах на геномному та протеомному рівнях.

Практичне значення одержаних результатів. Теоретичні положення висунуті та обговорені в роботі і отримані експериментальні результати є основою для використовування природних сполук-адаптогенів, зокрема вітаміну D3 в складі препарату “Відехол”, з метою корекції порушень викликаних хронічною дією іонізуючого випромінювання малої потужності. В дисертації обґрунтована доцільність застосування вітамінних препаратів в якості профілактичних засобів для населення, яке зазнало дії радіації.

Результати використовуються на кафедрі біохімії Львівського національного університету імені Івана Франка при викладанні курсу радіобіології, спецкурсу радіаційної біохімії, проведенні лабораторних занять, а також виконанні курсових та дипломних робіт.

Особистий внесок здобувача. Автором особисто проведені цитоморфологічні дослідження впливу іонізуючого випромінювання малої потужності на проліферативну активність та популяційний склад кістково-мозкових клітинних паростків. Визначені активності та розподіл ізоформ ГК, ПК, ЛДГ, Г-6-ФДГ, МДГ та ІДГ, а також концентрації метаболітів за умов хронічного опромінення та на фоні введення щурам препарату “Відехол”. Здобувачем обґрунтована доцільність розрахунків коефіціенту перерозподілу ізоформ ензимів (lеі) та зроблена статистична обробка експериментальних даних.

На основі значного літературного матеріалу Бесерріль Арагон Г.А. провів детальний аналіз отриманих результатів та теоретичних узагальнень з проблеми дії на організм малих доз радіації. За участю наукового керівника д.б.н., професора Великого М.М. та к.б.н., доцента Старикович Л.С. проведено аналіз експериментальних результатів, обґрунтовано механізм дії вітаміну D3 та сформульовано висновки.

Автор висловлює подяку співробітнику Інституту біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України Л. І. Апуховській за люб'язне надання препарату «Відехол» та Національній раді з питань науки Мексики (CONACYT) за фінансування проекту.

Апробація результатів дисертації.

Положення та результати дисертації представлені та обговорені на наукових конференціях біологічного факультету Львівського національного університету імені Івана Франка (Львів, 1999-2001) та на міжнародних конференціях: „Проблемы противолучевой защиты”, Российская Академия Наук (Москва, 1998); “Питання біоіндикації та екології” Запорізький державний університет (Запоріжжя, 1998); “Актуальнi проблеми бiофiзичної медицини”, Iнститут фiзiології iм. О. О. Богомольца (Київ, 2007); “Молекулярная медицина и биохимическая фармакология”, Институт фармакологии и биохимии НАН Беларуси (Гродно, 2007).

Публікацій. За темою дисертації опубліковано 7 статей у фахових наукових виданиях і 4 тез доповідей у матеріалах наукових конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається з вступу, огляду літератури, експериментальної частини, трьох розділів власних досліджень, висновків і списку використаної літератури, що включає 295 джерел. Робота викладена на 126 сторінках і містить 11 таблиць та 34 рисунки, які займають 19 сторінок.

2. ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури. Розглянуто особливості механізмів впливу іонізуючого випромінювання малої потужності на живі організми, ензими, як мішені та індикатори радіаційного ураження, біохімічні системи адаптації та дію вітаміну D3 як гормональний адаптогену. Проведено аналіз порушень та радіочутливості окремих клітинних популяцій системи гемопоезу за умов опромінення.

Матеріали та методи дослідження. Досліди проводили протягом 30 діб на білих безпородних щурах-самцях масою 150-180 г, яких утримували в умовах віварію на стандартному раціоні. Тварини були поділені на групи: до групи І належали контрольні тварини, до групи ІІ-щури, яким через кожні дві доби водили per os препарат “Відехол” в розрахунку 0,7 х 10-6 г вітаміну D3 (28 МО) на 100 г маси тіла. Тварин групи ІІІ опромінювали на апараті РУМ-17 (Е = 150 кВ, І = 5 мА) із використанням фільтрів Cu (0,5 мм) та Al (1,0 мм); шкірно-фокусна відстань становила 180 см у щодобовій експозиційній дозі 0,258 мКл?кг-1 або 1 сГр поглинутої дози потужністю 0,33сГр?хв-1 протягом 3 хв. Дозу випромінювання контролювали клінічним дозиметром 27-012 (Otto Schon, Німечінна). Тварин групи ІV піддавали опроміненню та вводили препарат “Відехол” аналогічно до тварин групи ІІ і ІІІ.

Кров отримували за декапітації щурів. Еритроцити гемолізували шляхом заморожування-відтаювання в рідкому азоті. Кістковий мозок виділяли методом аспіраційної і фракціонували в градієнті густини суміші фіколу-верографіну. Цитоморфологічний аналіз клітин кісткового мозку проводили за допомогою світлової мікроскопії мазків зафарбованих розчином Гимзи-Романовського (Borsook H. et al., 1969). Робочу концентрацію клітин кісткового мозку встановлювали підраховуючи забарвлені еозином клітини у камері Горєва (Сибірна Н. О.,1997).

Активність досліджуваних ензимів визначали спектрофотометричними методами (Bergmeyer H. U., 1983): гексокіназну активність [КФ 2.7.1.1] за інтенсивністю відновлення NADP+ у спряженій з глюкозо-6-фосфатдегідрогеназою реакції; піруванкіназну активність [КФ 2.7.1.40] - за інтенсивністю окислення NADH у спряженій з лактатдегідрогеназою реакції; лактатдегідрогеназну активність [КФ 1.1.1.28] - за інтенсивністю окислення NADH; глюкозо-6-фосфатдегідрогеназну активність [КФ 1.1.1.49] - за інтенсивністю відновлення NADP+; NADP-ізоцитратдегідрогеназну активність [КФ 1.1.1.42] - за інтенсивністю відновлення NADP+; малатдегідрогеназну активність [КФ 1.1.1.37] - за інтенсивністю відновлення NAD+ .

У кислотних екстрактах лізатів гемопоетичних клітин, які одержували при їх обробці 0,8 н HClO4 (при температурі 0-4оС), ензиматичними методами визначали вміст лактату та пірувату (з використанням лактатдегідрогенази), NAD+ (з використанням алкогольдегідрогенази) та АТР (з використанням гексокінази та глюкозо-6-фосфатдегідрогенази) (Bergmeyer H. U., 1983, Великий М.М., 2002).

Розділення ізоформ ензимів здійснювали за допомогою нативного диск-електрофорезу у поліакриламідному гелі (Debra M. et al., 1995). Електрофорез проводили в трис-гліциновому буфері рН 8,6 при напрузі 200 В та силі струму 2 мА на трубочку. Після 20 хвилин напругу збільшували до 600 В, а силу струму до 4,0 мА. Швидкість розділення контролювали за переміщенням мітки-індикатора. Після розділення (приблизно 60 хв.) гелі виймали з трубочок, промивали водою і поміщали у пробірки з реакційною сумішшю для забарвлення білкових зон (ізозимів), які мають ензиматичну активність. Активність множинних молекулярних форм (ізоензимів) виявляли методом візуалізація, що ґрунтуються на утворенні забарвлених солей формазану (Корочкин Л.И., 1977; Harris H., Hopkinson D., 1976). В процесі інкубації нітросиній тетразолій відновлюється NADH, утвореним у дегідрогеназній реакції, і перетворюється на забарвлений формазан, вказуючи на положення певного ізоензиму на електрофореграмі. У випадку трансфераз (кіназ) задіяна система спряжених реакцій, де продукт основної реакції залучається далі в процес візуалізації за допомогою індикаторної - дегідрогеназної реакції. Забарвлені гелі (електрофореграми) денситометрували.

Кількісну оцінку одержаних ензимограм здійснювали за допомогою денситометрування на мікрофотометрі МФ-2. За даними денситограм встановлювали відсотковий вміст електрофоретичних фракцій ізоензимів.

Статистичний аналіз проводили з використанням t-критерію Стьюдента для оцінки достовірності різниці показників між групами тварин, вірогідними вважали дані при р?0,05. Розрахунки та побудову графіків виконували з використанням прикладної програми “Microsoft Excel 2003”.

3. РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Морфофункціональна характеристика клітин кісткового мозку. Для оцінки проліферативної активності клітин кісткового мозку було проведено аналіз змін ядерних форм клітин у суспензії нефракціонованого кісткового контрольних та опромінених тварин. Важливою умовою виділення та приготування суспензії клітин є забезпечення сталості робочої концентрації клітин отриманих з нефракціонованого кісткового мозку контрольних тварин - близько 0,5 х 108 клітин•мл-1 (за результатами підрахунку кількості ядерних форм). Чітка залежність між поглинутою тваринами дозою, кількістю загиблих клітин та ініціацією процесу відновлення кістковому мозку дозволяє використовувати зміни кількості клітин в якості показника важкості біологічного пошкодження. Виявлене в наших експериментах збільшення кількості клітин за поглинутої дози 20 сГр (0,78 ± 0,04 х 108 клітин•мл-1) засвідчує посилення інтенсивності процесу проліферації. Однак за подальшої дії іонізуючого випромінювання до загальної дози 30 сГр вміст клітин поступово зменшувався (до 0,62 ± 0,07 х 108 клітин•мл-1) та наближався до значень контрольних тварин ( 0,52 ± 0,03 х 108 клітин•мл-1).

Внаслідок відносного зменшення кількості зрілих клітин (паличкоядерних нейтрофілів) за поглинутої дози 20 сГр, індекс проліферації нейтрофільних гранулоцитів зростав на 24% але наближався до значень контролю за дози 30 сГр. Індекс проліферації клітин еритробластів перебільшував норму з поглинутої дози 20сГр. Триваліший процес інтенсифікації проліферації в еритроїдній популяції обумовлюється довшим життєвим циклом та набагато більшою кількістю клітин в цьому паростку. Активація репаративних процесів у стовбурових гемопоетичних елементах в ранні строки опромінення сприяє відновленню функції кровотворної системи, утворенню достатньої кількості зрілих клітин та виживанню організму (Millar W.T., Hendry J.H, 1997). Здатність організму щурів до відновлення клітинного складу кісткового мозку в межах досліджуваних доз та тривалості експерименту засвідчує, що радіаційний ефект реалізується в першу чергу у змінах регуляції функціонального стану, тобто метаболізму клітини.

Введення опроміненим щурам вітаміну D3 у складі препарату „Відехол” обумовлювало посилення репаративних процесів у клітинних популяціях гранулоцито-моноцитарного та еритроїдного паростків кісткового мозку. За спільної дії випромінювання малої потужності та вітаміну D3, власне і виявляється адаптогенний ефект вітаміну D3 на рівні посилення проліферативної активності клітин кісткового мозку.

Активність та розподіл ізоформ гексокінази, піруваткінази та лактатдегідрогенази за дії рентгенівського випромінювання малої потужності.

З метою оцінки хронічного впливу випромінювання малої потужності на енергетичний обмін у клітинних популяціях кісткового мозку та еритроцитах, досліджували активність та ізоензимний склад деяких ензимів гліколізу. Спрямованість змін активності гексокінази (ГК), що каталізує ключову реакцію вуглеводного обміну, а саме фосфорилювання глюкози, характеризується спільною для всіх клітинних популяцій закономірністю та виявляється у достовірному зростанні активності порівняно з контролем за дії сумарної дози 20 сГр і зниженні практично до значень контролю за дози 30 сГр (рис. 1). Індивідуальні особливості досліджуваних клітинних популяцій проявлялись у значно (приблизно у 8-9 разів) більш високій вихідній ензиматичній активності еритроїдних та ГМ-них клітин порівняно з еритроцитами, а також у ступені зростання активності за опромінення. Так за дози 20 сГр активність ГК в еритроїдних та ГМ-них клітинах збільшувалась понад 50%, тоді як в еритроцитах - на 30%.

Виявлені порушення активності ГК можуть обумовлюватись одночасно, як радіоіндукованими порушеннями структурно-функціональної цілісності мембран і гліколітичного метаболону, так і впливом змін вмісту алостеричних ефекторів - іонів Mg+2, ATP та субстратів. За умов стресу зростають енергетичні потреби клітини, а відповідно зростає і споживання глюкози. Крім того, зміни проліферативної активності еритрону, що спостерігались в межах тривалості експерименту, ведуть до збільшення в периферичній крові популяції еритроцитів з більш високою активністю ГК.

Зміни активності ензимів енергетичного обміну зумовлюються фізіологічним станом організму та величиною поглинутої піддослідними тваринами дози. Для оцінювання впливу зміни активності певної множинної молекулярної форми (ММФ) на активність відповідного ензиму (Aе), тобто на активність всіх інших ММФ в межах однієї реакції метаболічного шляху, ми ввели коефіцієнт локального перерозподілу (lеі) (Бесерріль, 2007). Ця величина узгоджується з системою показників, якою користуються в теоретичних та експериментальних роботах, присвячених метаболічному контролю (Lion, 2007). Коефіцієнт перерозподілу характеризує здатність ензиму відповідати на дію різноманітних чинників шляхом змін активності його парціальних ММФ. Коефіцієнт перерозподілу (lеі) ізоформи ензиму (еі) за переходу активності між станами Ае та А'е можна описати рівнянням (1):

lеі = ДAе/Aе = (A'е - Aе) /Aе = ДlnAе (1)

ДAеі/Aеі (A'еі -Aеі )/Aеі ДlnAеі

При електрофоретичному розділенні виявлено чотири ММФ гекзокінази, серед яких ізоформа ІІ є основною. Зважаючи на найбільш високу спорідненість ГК-ІІ до субстрату - глюкози, саме ця ізоформа визначає загальну активність гексокіназної реакції у еритроцитах та клітинах попередниках еритроцитів. Разом з тим за опромінення, ізоформа ГК-ІІІ вносить більший вклад у загальну зміну активності ГК-ної реакції, як витікає зі значень коефіцієнтів перерозподілу (lГКІІІ). Зокрема, за поглинутої дози 10 сГр знижувалась як активність ГК-ІІІ на 28% так і загальна активність гексокінази на 13%. Протягом подальшого опромінення до дози 30 сГр зберігалась однакова спрямованість змін активності ГК-ІІІ та активності ГК-ої реакції. Однак, за дози 30 сГр, хоча розподіл активностей ММФ відповідав контрольним значенням, ензиматична активність ГК була зменшеною на 20% порівняно з нормою. Це вказує на високу радіочутливість ензимів гліколізу в клітинах системи еритрону.

В контролі доля ГК-ІV (глюкокінази) в ензиматичній активності ГК складає 23% в клітинах еритроїдного паростку і лише 3% в еритроцитах. Однак саме для ізоформи ГК-ІV еритроцитів виявлено найбільш суттєві зміни за опромінення, активність зростала на 190% за поглинутої дози 20сГр та на 62% за дози 30 сГр. Найвірогідніше, ця динаміка є наслідком ранніх проліферативних змін в еритроні. За дози 30 сГр спідвідношення ізоформ ГК та загальна ензиматична активність наближались до значень контролю, що відображає розвиток адаптивних змін до дії випромінювання малої потужності (Эйдус Л.Х., 1996). Отримані результати щодо активності та перерозподілу ізоформ гексокінази узгоджуються зі змінами вмісту пірувату та лактату в клітинах, тобто активності протікання гліколізу (Островський Ю.М. и др., 1984).

В ГМ-ому паростку активність ізоформ ГК-І та ГК-ІІ знижувалась впродовж опромінення до загальної дози 30 сГр, натомість активність ГК-ІІІ зростала на 40% а ГК-IV на 24%. Саме ГК-ІV відзначилась вищими значеннями коефіцієнта перерозподілу (lГКІV). Різноспрямовані зміни відносних активності ММФ є ознакою вищих радіоадаптивних можливостей ГМ-ої популяції. Ці клітини поглинають значно більше глюкози ніж еритроїдні і завдяки високій інтенсивності реакцій ЦТК клітини краще забезпечуються енергією.

Піруваткіназна реакція відіграє ключову роль в регулюванні забезпечення клітин енергією за рахунок гліколізу. В еритроцитах активність ПК прямо залежить від вмісту АТР та інгібується 2,3-ДФГ. Дія цього модулятора посилюється за дії стресових чинників різної природи і, зокрема, іонізуючого випромінювання. В наших дослідах, за поглинтої дози 10 сГр активність ПК зростала в еритроїдних клітинах на 27% , та в ГМ-их клітинах - на 88% порівняно з контролем. В еритроцитах за дози 20 сГр значення активності ПК перевищувало контрольні на 43% (рис. 2).

При подальшому опроміненні щурів відмічалось зниження активності ензиму. В еритроїдних клітинах зниження ПК-ої активності на 31% відносно контролю, збігалося зі зростанням вмісту ATР за дози 30 сГр порівняно до дози 20 сГр (рис. 3). За той же період, загальна активність ПК в еритроцитах сягала контрольних значень, а в ГМ-ій популяції - перевищувала норму на 39%.

В еритроцитах виявлено дві ізоформи піруваткінази, причому ПК-R2 в 2,5 рази перевищує активність ПК-R1. За поглинутої дози 20 сГр зростає активність ізоформи ПК-R1, характерної для молодих еритроцитів. Це свідчить про інтенсифікацію еритропоезу, оскільки ізоформа ПК-R2 утворюється з ПК-R1 в процесі старіння еритроциту. Відповідно до значень коефіцієнтів перерозподілу ММФ (lПКR1) за умов опромінення, активація ізоформи ПК-R1 є вирішальною для протікання реакції. Крім того, нами виявлено фракцію ПК-L', що за електрофоретичною рухомістю є подібною до ПК-L попередників. Ізоформи ПК-L та ПК-R1 кодуються одним геном і утворюються шляхом альтернативного сплайсингу мРНК [Jurica M. et al., 1998].

В клітинах еритроїдного та ГМ-го паростків виявляються М-ізоформи ПК. У еритроїдному паростку в нормі доля ізоформи ПК-М2 в активності ензиму є найбільш вагомою - 80%. Але за опромінення до дози 10 сГр активність ізоформи ПК-М1 зростає на 52%, а її відносна зміна (lПКМ1) визначає подальшу динаміку ПК-ої реакції. В ГМ-му паростку відносна активність основного ізозиму ПК-М2 зменшувалась на 25% за дози 10 сГр. Відносне зменшення загальної ензиматичної активності ПК-зи можна пояснити радіоіндукованими змінами рівнів алостеричних ефекторів таких як K+, Ca+2, Mg+2, АТP (Parkhomenko I. et al., 1992). Отже, за умов опромінення динаміка змін активності ПК-М1 (lПКМ1) є визначальною в обох клітинних паростках.

За переважання анаеробних умов в опромінених тканинах, NADH, утворений в гліцеральдегід-3-фосфатдегідрогеназній реакції, не включається в дихальний ланцюг, а використовується для відновлення пірувату в лактат за участю ензиму - лактатдегідрогенази. Швидке видалення NADH за участю ЛДГ забезпечує високу ефективність протікання гліколізу. Після початкового зниження за дози 10 сГр, активність ЛДГ зростала на 13% в еритроїдній та на 21% в ГМ-ій клітинних популяціях за поглинутої дози 20 сГр. При збільшенні дози до 30 сГр, активність ензиму в еритроїдних клітинах та в ГМ-ому паростку наближалась до значень контролю. Натомість, у еритроцитах активність ЛДГ спочатку зростала на 32% за поглинутої дози 20 сГр а потім знижувалась за 30 сГр.

Активність та розподіл ізоформ глюкозо-6-фосфат дегідрогенази, ізоцитратдегідрогенази та малатдегідрогенази за дії рентгенівського випромінювання малої потужності. На початковій стадії пентозофосфатного шляху окислення глюкози, Г-6-ФДГ генерує відновні еквіваленти, необхідні для реакцій біосинтезу та підтримання цілісності і функціональної активності мембран, оскільки утворений NADPH є субстратом і кофактором для системи глутатіон-залежних ензимів антиоксидантного захисту. У клітинах еритроїдного та ГМ-го паростків активність Г-6-ФДГ знижувалась (на 40-50%) за опромінення в дозі 10 сГр і залишалась нижчою від контролю за 20 та 30 сГр (рис. 4). Натомість в еритроцитах активність Г-6-ФДГ за всіх доз опромінення суттєво перевищувала контрольні значення, що узгоджується зі змінами активності ензимів гліколізу. Відомо, що глюкозо-6-фосфатізомераза конкурує з Г-6-ФДГ за субстрат і тому посилення гліколізу може викликати зниження активності Г-6-ФДГ, однак за умов стресу внесок пентозофосфатного шляху окислення глюкози складає до 11% енергії, що споживається еритроцитом (Барабой В.А., 1983).

Синтез Г-6-ФДГ успадковується зчеплено зі статтю та піддається впливу генів-модифікаторів, локалізованих в аутосомних хромосомах (Laurie-Ahlberg C.C., et al., 1989). Як наслідок, утворюється значна кількість молекулярних варіантів ензиму, активні форми якого є гомодимерами. У еритроцитах найбільшої за чисельністю фенотипової групи щурів, окрім активності двох основних анодних компонентів - Г-6-ФДГ-1 та Г-6-ФДГ-2, а також двох мінорних - Г-6-ФДГ-3 та Г-6-ФДГ-4, нами виявлено активність додаткової фракцій Г-6-ФДГ-1'. Ми вважаємо, що вона є гіперанодною формою, характерною для гранулоцитів (Khan А., 1978), а її поява пояснюється ковалентним зв'язуванням у активному центрі ензиму продукту деградації кофактору NAD+. Подібна модифікація служить проміжною стадією на шляху до повного руйнування ензиму. Обмежений протеоліз С-кінця молекули Г-6-ФДГ переважно спостерігається у процесі старіння еритроїдних клітин.

В обох клітинних популяціях кісткового мозку динаміка змін співвідношень ММФ за дії випромінювання малої потужноті була подібною: за дози 10 сГр знижувалась відносна активність ізоформи Г-6-ФДГ-1 та зростав внесок Г-6-ФДГ-2 і Г-6-ФДГ-3. За дози 30 сГр відносна активність всіх компонентів знаходяться в межах контрольних величин, хоча загальна активність Г-6-ФДГ була зниженою. Впродовж опромінення Г-6-ФДГ-1 характеризується найбільш вираженими змінами коефіцієнту перерозподілу (lГ6ФДГ-1) в обох паростках. В еритроцитах зростання активності Г-6-ФДГ у всьому діапазоні досліджених доз, корелює зі збільшенням вмісту мінорного компоненту Г-6-ФДГ-3, який має найбільший вплив на загальну активність в межах доз від 10 до 30 сГр. Разом з тим активація нетипової форми Г-6-ФДГ-1' є визначальною за опромінення в дозі 10 сГр,. Значення коефіцієнту перерозподілу Г-6-ФДГ-1' (lГ6ФДГ-1') становить 2,0±0,04, тоді як для Г-6-ФДГ-3 (lГ6ФДГ-3) лише 0,30±0,05.

Виявлене стійке пригнічення загальної активності Г-6-ФДГ на тлі різно- направленого перерозподілу ММФ ензиму під дією досліджуваних доз опромінення, за умови стехіометрії субстратів (NADP+ і Г-6-Ф), дозволяє припустити, що випромінювання малої потужності спричинює зміни в регуляції біосинтезу та модифікації ізоформ Г-6-ФДГ в клітинах кісткового мозку.

Ізоцитратдегідрогеназа (ІДГ) є регуляторним ензимом ЦТК та складовим компонентом системи енергозабезпечення клітин кісткового мозку. Ензим активується АDP та інгібується ATP і NADH (NADPH). Описано дві NADP-залежні ІДГ (цитоплазматична і мітохондріальна) і одна мітохондріальна NAD-залежна ІДГ. У контрольній групі тварин активність NADP-ІДГ в еритроцитах (8,07±1,32 нмоль NADР·хв-1·мг-1білка) була значно нижчою ніж у клітинних популяціях кісткового мозку (25,31±2,85 в еритроїдній та 27,18±1,86 нмольNADР+·хв-1·мг-1білка в ГМ-ій). У клітинах еритроїдного паростку активність NADP-ІДГ знижувалась на 23% за поглинутої дози 10 сГр та зростала на 28% за дози 20 сГр. Вихід у кровообіг недозрілих ретикулоцитів, які вмістять мітохондрії призводило до зростання в 5 разів активності NADP+-ІДГ в еритроцитах за поглинутої дози 20 сГр. Далі активність NADP-ІДГ поступово знижувалась, але навіть за дози 30 сГр її значення ще перевищувало контрольні на 150%. Виявлені зміни можна пов'язати з регуляторним впливом АТР як в попередниках, так і в зрілих еритроцитах (рис. 2). У ГМ-ному паростку активність NADP-ІДГ залишалась в межах норми до дози 20 сГр, але за 30 сГр зростала у 2,5 рази. Виявлені порушення підтверджують більш високу радіостійкість енергетичного метаболізму в ГМ клітинах.

Електрофоретично нами були розділені цитоплазматична (s) та мітохондріальна (м) форми NADP-ІДГ. Синтез цих протеїнів кодується окремо локусaми idhs та idhm. Згідно значень коефіцієнтів перерозподілу зміна активності мітоходріальної NADP-ІДГ (lІДГ-м) обумовлює зміни активності NADP-ІДГ в еритроцитах та його попередниках впродовж всього часу опромінення. Натомість, в ГМ-ому паростку цитоплазматична форма (lІДГ-s) визначає зміни активності NADP-ІДГ за дози 20 сГр .

Транспорт відновних еквівалентів NADH між цитозолем та мітохондріями запезпечується малат-аспартатною човниковою системою завдяки існування цитоплазматичної (-s) та мітохондріальної (-м) ізоформ МДГ. Характер змін активності МДГ впродовж всього часу опромінення був однаковий в обох паростках кісткового мозку: активність суттєво знижувалась за сумарної дози 20 сГр, а надалі зростала до рівня контролю в еритроїдних клітинах та на 27% перевищувала норму в ГМ-их клітинах. В еритроцитах, як у випадку ІДГ, активність МДГ значною мірою зростала за всіх доз в порівнянні з контролем. В еритроцитах найбільш суттєвий вплив на зміни активності МДГ належав мітохондріальній ізоформі (lМДГм), активність якої практично не виявлялась у контролі (сліди). Саме активація гіперанодної ізоформи - МДГ-s' в ГМ-ому паростку визначала спрямованість реакції за дози 20 сГр. За 30 сГр, внесок активності МДГ- м є найвагомішим в ГМ-их клітинах (lМДГм=1,57), а МДГ-s (lМДГs = 0,68) - у еритроїдних.

За умов щодобового опромінення до поглинутої дози 20 сГр, в еритроцитах знижується вміст NAD+ та зростає величина співвідношення лактату до пірувату (рис. 5). Ці дані узгоджуються з достовірним підвищенням активності ЛДГ та інших дегідрогеназ, зокрема Г-3-ФДГ, у кровотворних клітинах за опромінення (Білько Н.М., 1998).

Вплив препарату “Відехол” на ізоензимний спектр та активність ензимів енергетичного обміну за дії рентгенівського випромінювання малої потужності.

Дія вітаміну D3 спричинює зміни у ліпідному оточенні білка смуги-3 (БС-3), і впливає на регуляцію активності асоціату ензимів гліколітичного метаболону, «заякореного» на внутрішньому боці мембрани еритроцита за допомогою БС-3 (Никифорова Т.Н., 1989). За дії вітаміну D3 підвищується концентрація іонів Ca+2, які взаємодіючи з білками цитоскелету, зумовлюють активацію білків-переносників глюкози (Матус, 1979). “Швидкі ефекти” вітаміну D3 включають активацію мембранного рецептора анексину (Baran, 2001), модуляцію сигнальних механізмів за участю G-білків (Коцюруба, 1993), мітоген-активованих протеїнкіназних механізмів (Schwartz,1999) і реалізуються у специфічній відповіді. У ядрі клітин вітамін-рецепторний комплекс взаємодіє з консенсусною промоторною ділянкою ДНК і здійснює регуляторний вплив на біосинтетичні процеси (Autier H., 2007).

Нормалізуючий ефект вітаміну D3 на активність ПК найбільш чітко проявлявся за дози 20 сГр, активність становила: в еритроцитах 101%, у еритроїдних 94% та у ГМ-их клітинах 138% від контролю. За поглинутої дози 30 сГр активність ПК перевищувала норму лише в ГМ-ому паростку (див. рис. 2). За спільної дії обох чинників, в еритроїдних клітинах відносні активності ізоформ ПК (М1 і М2) знаходились в межах норми вже за 20 сГр, а в еритроцитах розподіл ізоформ ПК (R1 і R2) збігався з контрольним зa дози 30 сГр. В еритроцитах за поглинутої дози 10 сГр виявлена активність нетипової форми L' (3,15 ± 0,6 %). Ця ММФ є основною в інших тканинах, а тому її eкспресія вказує на пряму участь вітаміну D3 у регуляції генної активності. Найбільш суттєвим ефектом препарату «Відехол» на ПК-ну активність у ГМ-ій популяції, було збільшення внеску ізозиму М2 за дози 20 сГр (рис. 6). Однак, за загальної дози 30 сГр внесок ізоформи ПК-М1 переважав у прояві змін активності ПК-ої реакції (lПК-М1) у обох популяціях кісткового мозку. В еритроцитах найбільше значення коефіцієнту перерозподілу було характерне для ізоформи ПК-R2 (lПК-R2), типовій для зрілих клітин.

У опромінених тварин за дії вітаміну D3 зміни активності ЛДГ в клітинах обох паростках кісткового мозку були подібними. За поглинутої дози 20 сГр активність

ЛДГ в еритроїдній популяції складала 113% від контролю, а у ГМ-ій - 121% а за дози 30 сГр активність ЛДГ не відрізнялась від значень контролю. Нормалізуючий ефект “Відехолy” в еритроїдному паростку полягає у зростанні відносних активностей гетеромерних ізоформ ЛДГ-3 та ЛДГ-4. Згідно значень коефіцієнтів перерозподілу (lЛДГ3=0,9±0,16) за 30 дози сГр ізоформа ЛДГ-3 вносить найбільший вклад у зміни загальної активності ензиму. В еритроцитах введення препарату “Відехол” опроміненим щурам призводило до збільшення вмісту ізоформ ЛДГ-4 та ЛДГ-5 впродовж всього періоду досліду. Саме ЛДГ-4 визначає зміни активності ЛДГ: lЛДГ4= 1,07±0,15 за дози 30 сГр в еритроцитах. Зазначені ММФ мають високу спорідненість до пірувату та каталізують його ефективне відновлення до лактату. Активація може бути пов'язана як з вивільненням мембранно-зв'язаної частки цих ізоформ за дії радіації та вітаміну D3 на структуру мембран, так і з інтенсифікацією синтезу продукту гена ldh-A в попередниках еритроцитів. Виявлене зменшення активностей ЛДГ-1 та ЛДГ-2 в клітинах еритрону не може обумовлюватись їх чутливістю до інгібуючої дії надлишку пірувату, оскільки за умов опромінювання в клітинах зростає вміст лактату.

Дослідження кінетики ЛДГ-ної реакції за умов насичуючої концентрації субстрату свідчать, що залежність початкової швидкості (v0) від концентрації білка в інкубаційному середовищі за різних дослідних умов відрізняється нахилом кривих. У разі опромінення цей показник зростає (tg б =1,00±0,07) порівняно з нормою (tg б=0,66±0,08), (рис. 7). Еритроцитарні ізоформи ЛДГ мають різну спорідненість до субстрату, а отже різні значення констант Міхаеліса-Ментен (КМ). У контролі найбільш активною є ЛДГ-5 (М4), що характеризується високою спорідненістю до пірувату. Отже, зміну кута нахилу прямих можна пояснити перерозподілом вмісту ізоформ в розчинній та мембрано зв'язаній фракціях ензиму. Зміна кінетичних параметрів ензиму (vo, Vmах, Kм), за різних експериментальних умов вказує на те, що ефекти викликані опроміненням та введенням вітаміну D3 тваринам реалізуються на генетичному та протеомному рівнях регуляції процесів адаптації клітин до дії факторів середовища.

Введення препарату “Відехол” опроміненим тваринам обумовлювало корекцію активності Г-6-ФДГ лише в пізні строки досліду. Зокрема, за поглинутої дози 30 сГр її значення в еритроїдних клітинах становило 93%, в ГМ-гх - 94% та в еритроцитах 93% від контролю (див. рис. 4). В клітинах еритрону спільна дія опромінення та вітаміну D3 стимулювала активність основної ізоформи Г-6-ФДГ-1. Проте, в ГМ-ій популяції в 2 рази зростав вміст ізоензиму Г-6-ФДГ-4 за поглинутої дози 20, на тлі зниження активності основних ММФ (див. табл.2). В обох паростках кісткового мозку, як і у разі опромінення, динаміка активності Г-6-ФДГ-1 (lГ6ФДГ-1) визначала зміни загальної активності Г-6-ФДГ-ної реакції. В еритроцитах відносна активність Г-6-ФДГ-3 зростала впродовж всього строку досліду. Натомість активність основої еритроцитаної ізоформи Г-6-ФДГ-1, після початкового зростання, була зменшеною в 2.5 рази за дози 30 сГр. Вклад ізоформи Г-6-ФДГ-1 у активність Г-6-ФДГ в еритроцитах підтверджується значеннями коефіцієнтів перерозподілу. Зокрема, за дози 30 сГр значення lГ6ФДГ-1 дорівнює 9,84±1,53 тоді як для Г-6-ФДГ-3 - lГ6ФДГ-3 = 0,24±0,05. Крім того за дії вітаміну D3 усувався вплив нетипової ізоформи Г-6-ФДГ-1'.

Нормалізуючий ефект препарату “Відехол” нa ІДГ-ну реакцію в еритроїдних клітинах опромінених тварин проявляється лише на 30-ту добу, коли значення активності NADP-ІДГ складало 104% від контрольного рівня. В еритроцитах за тих же умов активність NADP-ІДГ була збільшено впродовж всього періоду досліду: за дози 30 сГр активність NADP-ІДГ складала 186% від контролю, тоді як у опромінених тварин, що не одержували препарату „Відехол” - 256%. В ГМ-ій популяції за поглитнутої дози 30 сГр активність NADP-ІДГ під дією препарату зменшувалась на 82%. Введення щурам “Відехолу” на фоні опромінення сприяло нормалізації вмісту інгібитору IДГ - АТР. В еритроцитах концентрація АТР перебувала в межах норми до 20 сГр, а за 30 сГр знижувалась на 20% порівняно з контролем. За дій випромінювання малої потужності та введення вітаміну D3 ізоформа NADP-ІДГ-м складала основну частку активності - (lІДГм) у досліджених клітинних популяціях. У ГМ-ому паростку за дози 30 сГр відбувалась заміна на ізоформу NADP-ІДГ-s ( lІ ДГs = 0,79±0,07 проти lІ ДГ м = -0,59±0,16 ).

Дані про активність та перерозподіл ізозимного спектру ІДГ в клітинах еритрону на фоні введення препарату “Відехол” підтвердили, наше припущення щодо корегуючого впливу вітаміну D3 на активність NADP-ІДГ-зи у опромінених щурів. Його участь у регуляції експресії генів може реалізуватись шляхом фосфорилювання вітамін-рецепторного комплексу зв'язаного з промоторною ділянкою гена-мішені під дією казеїнкінази-ІІ, протеїнкінази-С, або сАМР залежної протеїнкінази, що призводить до зміни конфігурації комплексу, запуску реaлізації геномної відповіді і до змін процесів клітинної диференціації та проліферації (Kitagawa Н., 2003).