Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Національна академія наук України

Інститут проблем кріобіології і кріомедицини

УДК 57.043:[612.111.085+582.282.23]:577.3

Автореферат

на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Спеціальність 03.00.19 - Кріобіологія

Застосування озону для підвищення ефективності кріоконсервування еритроцитів людини та дріжджів saccharomyces cerevisiae

Буряк Ірина Алімівна

Харків-2008

Дисертація є рукописом

Робота виконана в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор Зінченко Василь Демидович, Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, головний науковий співробітник, м. Харків

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор Стародуб Микола Федорович, Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна, головний науковий співробітник, м. Київ кандидат біологічних наук, Реліна Ліана Ісааківна, Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, старший науковий співробітник, м. Харків

Захист дисертації відбудеться “ 18 ” листопада 2008 р. о 13³⁰ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д64.242.01 в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України за адресою 61015, Харків-15, вул. Переяславська, 23

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України за адресою 61015, Харків-15, вул. Переяславська, 23

Автореферат розісланий “ 17 ” жовтня 2008 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, доктор медичних наук, професор, член-кореспондент НАН України Гольцев А.М.

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Розвиток кріобіології завжди був пов'язаний з пошуком методів штучного захисту клітин від пошкоджень під час заморожування-відтанення. Відкриття кріопротекторів стало тою відправною точкою, з якої почалося практичне застосування кріогенних біотехнологій. Однак, поряд з вивченням кріопротекторних методів захисту проводилися дослідження можливих способів підвищення ефективності кріоконсервування клітин з використанням ефектів, які доповнювали б захисну дію кріопротекторів. Розробляли два підходи до рішення даної проблеми: перший полягав у підготовці клітин перед процедурою заморожування-відтанення (Поздняков В.В., 1988; Шпакова Н.М. и др., 1999), другий підхід - в підвищенні ефективності їх відновлення після кріоконсервування (McGann L. et al., 1975; Цуцаева А.А. и др., 1988).

В останні роки з'явилося досить багато публікацій про те, що озон в низьких дозах викликає стимуляцію різних фізіологічних функцій біологічних об'єктів, причому ці ефекти спостерігаються на об'єктах різного рівня організації (Мельникова А.М. и др., 1989; Калер Г.В. и др., 1990; Масленников О.В. и др., 2003; Bocci V., 2006). Низькі дози озону сприяють підвищенню стійкості еритроцитів до літичної дії детергента тритону Х-100, а також підвищенню проліферативної активності мікроорганізмів в нормальних фізіологічних умовах (Мельникова А.М. и др., 1989). В умовах кріоконсервування також спостерігались ефекти стимуляції проліферативної активності деяких мікроорганізмів та зниження гемолізу еритроцитів під дією низьких доз озону (Бєлих І.А., 2006).

Вся сукупність даних, відомих на момент початку виконання дисертаційної роботи, давала підставу припускати, що ефекти біологічної дії низьких доз озону можуть бути використані для підвищення ефективності відновлення біологічних об'єктів після їх кріоконсервування. Ці дослідження можуть бути корисними при розробці протоколів низькотемпературного кріоконсервування та при вивченні механізмів відновлення біологічних об'єктів після дії несприятливих факторів.

Вказані положення визначають актуальність даної роботи.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами.

Дисертація виконана згідно з планами науково-дослідницьких робіт за темою Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України “Підвищення ефективності технологій кріоконсервування біологічних систем шляхом інтенсифікації репараційних процесів після дії холоду та зниження ризику мікробної контамінації на різних етапах кріоконсервування”, номер державної реєстрації 0105U03918.

Мета і задачі дослідження. Мета роботи - визначити можливість застосування озону для підвищення ефективності кріоконсервування еритроцитів людини та дріжджів Saccharomyces cerevisiae.

Для досягнення поставленої мети вирішувались наступні задачі:

1. Відпрацювати процедури обробки еритроцитів та дріжджів озоном для підвищення ефективності їх відновлення після кріоконсервування.

2. Вивчити дію різних доз озону на еритроцити за показниками їхньої осмотичної стійкості та морфології до та після кріоконсервування.

3. Дослідити особливості впливу озону на термостабільність гемоглобіну та мембранозв'язаних білків еритроцитів у складі клітин та в ізольованому стані.

4. З'ясувати, які з мембранозв'язаних білків еритроцитів є найбільш чутливими до дії озону.

5. Вивчити дію різних доз озону на дріжджі S. cerevisiae за показниками життєздатності, цілісності мембран, а також за флуоресцентними характеристиками до та після кріоконсервування.

6. Вивчити поєднану дію низьких температур і різних доз озону на цілісність мембран дріжджів S. cerevisiae за показником проникності клітин для екзогенного барвника.

Об'єкт дослідження. Процеси проліферації дріжджів S. cerevisiae, зміни осмотичної стійкості еритроцитів, агрегація еритроцитів у плазмі, зміни термостабільності гемоглобіну та мембранозв'язаних білків еритроцитів при обробці озоном в різних дозах до та після кріоконсервування.

Предмет дослідження. Озон у водних розчинах, еритроцити донорської крові людини, гемоглобін, ізольовані мембрани еритроцитів людини, культури дріжджів S. cerevisiae.

Методи дослідження: кріоконсервування шляхом швидкого заморожування, спектрофотометрія, спектрофлуориметрія, оптична мікроскопія, флуоресцентна мікроскопія, проточна цитофлуориметрія, диференційна скануюча калориметрія (ДСК), мікробіологічні і статистичні методи. кріоконсервування еритроцит озон гемоглобін

Наукова новизна отриманих результатів.

Вперше експериментально показано, що при обробці еритроцитів озонованим фізіологічним розчином з концентрацією озону 0,2 мг О₃/л знижуються показники осмотичної ламкості еритроцитів, а також відновлюється конформаційна стабільність гемоглобіну після заморожування-відтанення.

Встановлено, що мембранні білки еритроцитів і гемоглобін у складі клітин більш стійкі до дії озону, ніж в ізольованому стані, що може бути пояснено захисною дією антиоксидантної системи клітин.

Показано, що в мембранах еритроцитів одними з найбільш чутливих до дії озону є анкірин, трансмембранний домен білка смуги 3 (аніонтранспортний), та білок смуги 4.1. Це дає підставу думати, що підвищення осмотичної стійкості еритроцитів та відновлення конформації гемоглобіну під дією озону після кріоконсервування пов'язані з деякими тонкими, недеструктивними ефектами озону на рівні слабких взаємодій між мембранозв'язаними білками, що впливають на регуляторні процеси та іонний транспорт еритроцитів.

На клітинах дріжджів S. cerevisiae експериментально показано, що озон в дозі 1,5Ч10^-12 мгО₃/клітину, введений в суспензію дріжджів після заморожування-відтанення, сприяє підвищенню їхньої життєздатності порівняно з життєздатністю неозонованих клітин, що, ймовірно, пояснюється запуском каскаду захисних реакцій клітини, які призводять до підвищення ефективності її відновлення після кріоконсервування.

Показано, що стан білків дріжджів S. cerevisiae, який оцінюється флуоресцентними методами, змінюється безпорогово, починаючи вже з низьких доз озону. На відміну від дії озону на білки, дія його на клітини дріжджів S. cerevisiae має пороговий характер. Розвиток деструктивних процесів в клітинах починається при перевищенні порогової дози озону 0,5Ч10^-9 мгО₃/кл, яка значно вища за дози, що стимулюють проліферативну активність дріжджів. Припускається, що поріг розвитку деструктивних процесів пов'язаний з вичерпанням компенсаторних ресурсів клітин.

Практичне значення отриманих результатів.

Встановлені в роботі експериментальні факти підвищення осмотичної стійкості еритроцитів і підвищення життєздатності дріжджів S. cerevisiae під дією озону після кріоконсервування може знайти практичне застосування при розробці протоколів кріоконсервування вказаних клітин.

Експериментально доведений факт стимуляції росту культури хлібопекарних дріжджів S. cerevisiae може знайти практичне застосування в хлібопекарній промисловості та в інших технологіях, що використовують даний вид мікроорганізмів.

Отримані результати роблять внесок у розуміння механізмів різнонаправленої, залежної від дози, біологічної дії озону, а також клітинної відповіді на різні дози подразника.

Особистий внесок здобувача. Автором дисертаційної роботи самостійно проведений аналіз наукової літератури, отримані результати експериментальних досліджень і проведена їх статистична обробка. Автором особисто виконаний первинний аналіз результатів і зроблені попередні висновки. Разом з науковим керівником, професором Зінченко В.Д., були визначені мета, задачі роботи і способи їх вирішення, інтерпретовані отримані результати та зроблені остаточні висновки.

В наукових працях, виконаних у співавторстві, особистий внесок здобувача полягає:

- в роботах [1, 9, 16] - в експериментальному дослідженні дії озону на спектральні характеристики гемоглобіну та співвідношення його лігандних форм у розчинах, а також на термостабільність гемоглобіну і мембранозв'язаних білків еритроцитів;

- в роботах [2, 3, 13] - в дослідженні збереженості та здатності кріоконсервованих еритроцитів до агрегації в плазмі після обробки озоном, в узагальненні причин виникнення похибок під час визначення кількості незруйнованих еритроцитів у кріобіологічному експерименті;

- в роботах [4, 8, 12, 15] - в дослідженні впливу різних доз озону та заморожування-відтанення на флуоресцентні характеристики клітин дріжджів S. cerevisiae, цілісність їхніх мембран та життєздатність;

- в роботі [5] - в пошуку літератури по проблемі і в оформленні роботи;

- в роботі [6] - в експериментальному обґрунтуванні застосування охолодженого озонованого фізіологічного розчину для озонотерапії;

- в роботі [7] - в експериментальному обґрунтуванні застосування озонованого фізіологічного розчину з низькими концентраціями озону для підвищення збереженості кріоконсервованих еритроцитів;

- в роботах [10, 11, 14] - в експериментальному дослідженні впливу озону на гемоліз, осмотичну ламкість та форму еритроцитів після кріоконсервування.

Апробація результатів дисертації.

Матеріали дисертації доповідалися та обговорювались на щорічних конференціях молодих вчених “Холод в біології і медицині” (м. Харків, 2005, 2006, 2007); IV Міжнародній науково-практичній конференції “Розвиток наукових досліджень 2005” (м. Полтава, 2005); конференції з міжнародною участю “Актуальні проблеми та досягнення кріобіології і кріомедицини. Структурна і функціональна организація стовбурових клітин під дією низьких температур” (м. Харків, 2005); ІІ Межнародній науковій конференції студентів і аспірантів “Молодь та поступ біології” (м. Львів, 2006), The 43^rd Meeting of the Society for Cryobiology in association with the Society for Low Temperature Biology “CRYO 2006” (м. Гамбург, Німеччина, 2006); 29-му Всеросійському семинарі “Озон и другие экологически чистые окислители. Наука и технологии” (м. Москва, Росія, 2007), The 6^th Parnas conference “Molecular mechanism of cellular signalling” (м. Краков, Польща, 2007), The 44^rd Meeting of the Society for Cryobiology “CRYO 2007” (м. Лейк Луїс, Канада, 2007); VII Харківській конференції молодих науковців “Радіофізика та електороніка” (м. Харків, 2007).

Публикації. По матеріалам дисертації опубліковано 16 робіт, з них 4 статті в наукових фахових виданнях; 9 - тези доповідей на конференціях; 3 - деклараційні патенти на винаходи.

Обсяг і структура дисертації. Загальний обсяг дисертації складає 150 сторінок друкованого тексту, з яких 117 сторінок основного змісту.

Дисертаційна робота складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів дослідження, результатів власних досліджень та їх обговорення, висновків і переліку цитованої літератури, який містить 263 джерела і розміщений на 29 сторінках. Робота проілюстрована 28 рисунками, 11 мікрофотографіями, 2 таблицями і 1 схемою.

Основний зміст роботи

У вступі обґрунтована актуальність теми дисертації, розкрита суть наукової проблеми, сформульовані мета, задачі, об'єкт, предмет і методи дослідження, наукова новизна та практичне значення отриманих результатів.

Перший розділ - огляд літератури - присвячений аналізу відомих результатів досліджень дії озону на живі системи, фізико-хімічних властивостей озону, нелетальних ушкоджень та їх репарації. На підставі аналізу літератури обґрунтовується мета роботи.

Матеріали і методи досліджень.

Дослідження проводили на еритроцитах донорської крові людини, гемоглобіні, ізольованих мембранах еритроцитів людини та культурах дріжджів S. cerevisiae.

Еритроцити та дріжджі були обрані в якості предмета дослідження, виходячи з відмін у їх будові та фізіології. Це поширювало можливості різнобічного дослідження біологічної дії озону.

Еритроцити отримували з донорської крові людини, яка була надана Харківською обласною станцією переливання крові. Забір крові здійснювався співробітниками станції. Культури хлібопекарних дріжджів S. cerevisiae (промисловий штам, отриманий в Санкт-Петербурзькому відділенні Російського НДІ Хлібопекарної промисловості) були надані відділом довгострокового зберігання біологічних об'єктів при низьких температурах ІПК і К НАН України.

Дріжджі S. cerevisiae вирощували на сусло-агарі протягом 48 годин при 30 С і змивали з живильного середовища фізіологічним розчином. Суспензії клітин дріжджів у фізіологічному розчині заморожували в кріопробирках фірми Corning до -196 С зануренням у рідкий азот. Зразки відтавали на водяній бані при 30 С.

При кріоконсервуванні еритроцитів за основу був взятий метод, запропонований Рамазановим зі співавт. (Рамазанов В.В. та ін., 2005). Еритроцити заморожували у водному розчині наступного складу: декстран (М.м.=10000) - 20 %, ДМСО - 5 %, глюкоза - 2 %, сахароза - 7 %, хлорид натрію - 0,3 %. Еритроцити з кріозахисним середовищем в об'ємному співвідношенні 1:1 інкубували в контейнерах місткістю 1 мл протягом 30 хвилин при кімнатній температурі і заморожували зануренням у рідкий азот. Зразки відтавали на водяній бані при 40 С. Еритроцити тричі відмивали від кріоконсерванта фізіологічним розчином, центрифугуючи суспензію при 800 g. Для заморожування еритроцитів використовували також кріозахисне середовище аналогічного складу, що містило 10 % декстрану.

Мембрани еритроцитів і гемоглобін отримували шляхом осмотичного лізису (Fairbanks G. et al., 1971) з нативних клітин та з еритроцитів, оброблених озоном в різних концентраціях.

Озон для досліджень отримували з газоподібного кисню виробництва Харківського кисневого заводу (ГОСТ 5583-78) на озонаторі безбар'єрного типу, розробленому в ІПК і К НАН України (Зинченко В.Д. и др., 2006). Концентрацію озону в розчині визначали за величиною екстинкції на довжині хвилі 255 нм (смуга Хартлі) (Лунин В.В. и др., 1998) на спектрофотометрі Specord UV VIS (Німеччина).

Осмотичну стійкість еритроцитів визначали за виходом гемоглобіну з клітин (Wagner C.T. et al., 2000) в гіпотонічних розчинах хлориду натрію на спектрофотометрі СФ - 4А при довжині хвилі 543 нм.

Форму еритроцитів та їхню здатність до агрегації в плазмі досліджували методом світлової мікроскопії за допомогою оптичного мікроскопа МБР-3, обладнаного цифровою відеокамерою Panasonic WW-CP 470, при збільшенні Ч40.

Термостабільність гемоглобіну та ізольованих мембран еритроцитів вивчали методом диференційної скануючої калориметрії (ДСК) на мікрокалориметрі DASM- 4 (Пущино, СКББП).

Спектри власної флуоресценції реєстрували на спектрофлуориметрі Cary Eclipse (Varian, США).

Для спостереження за змінами бар'єрних властивостей мембран дріжджів використовували мероцианіновий флуоресцентний зонд К8-3010 (Setabiomedicals, США). Локалізацію зонда в клітинах визначали за допомогою флуоресцентного мікроскопу Olympus IX 71, обладнаного цифровою камерою Olympus C-5060, при довжині хвилі збудження 470 нм і збільшенні Ч96. Розподіл клітин за інтенсивністю флуоресценції барвника реєстрували з допомогою проточного цитофлуориметра BD FACS Calibur (США) при довжині хвилі збудження 488 нм.

Життєздатність дріжджів оцінювали “чашковим методом” Коха (Лабинская В.С., 1978). Серійні розведення проводили фізіологічним розчином.

Статистичну обробку отриманих результатів здійснювали за допомогою програми Statgraphics plus for Windows.

Результати власних досліджень та їх обговорення.

Вплив озону на мембрани еритроцитів в умовах кріоконсервування.

Відмивання еритроцитів озонованим фізіологічним розчином з концентрацією озону 0,2 мгО₃/л призводить до зниження коефіцієнта осмотичної ламкості як після інкубації у кріозахисному середовищі, так і після заморожування-відтанення, що свідчить про підвищення осмотичної стійкості клітин. При підвищенні концентрації озону у відмивочному розчині до 0,8 і 1,6 мгО₃/л даний ефект не спостерігається. Підвищення осмотичної стійкості еритроцитів після відмивання озонованим розчином , який містить 0,2 мгО₃/л, узгоджується з результатами досліджень Bayer et. al., які показали, що під дією певних доз озону знижується механічна ламкість еритроцитів.(Bayer R. et. al., 1993). При цьому нами було показано, що при такій обробці озоном деконсервованих еритроцитів їхня форма та здатність до агрегації в плазмі не відрізняється від контрольних показників, а при підвищенні концентрації озону у відмивочному розчині до 8,7 мгО₃/л у полі зору спостерігаються клітини, які відрізняються від нормальних еритроцитів за формою та розміром. Здатність еритроцитів до утворення стовпчиків в цьому випадку знижується.

Відомо, що при дії озону на клітинну мембрану відбувається її модифікація. При цьому змінюється стан мембранних білків та ліпідів, причому деструктивна дія озону більше виявляється на мембранних білках (Матус В.К. и др., 1987; Матус В.К. и др., 1989; Mudd J.B. et al., 1997; Мельникова А.М. и др., 1998; Онищенко Е.В., 2005).

Для з'ясування молекулярних механізмів взаємодії різних доз озону з мембранозв'язаними білками був застосований метод ДСК, який є одним з прямих експериментальних методів вивчення конформаційної стабільності білків (Sturvevant J.M., 1974; Pfeil W. et al., 1979; Sturvevant J.M., 1987; Privalov P.L., 1989; Hensley P., 1996). Одночасно ми досліджували дію озону в різних дозах на гемоглобін. Ми використовували два способи впливу озону на мембрани та гемоглобін еритроцитів - в ізольованому стані та у складі клітин. Перший спосіб полягав у тому, що гемоглобін і мембрани еритроцитів виділяли з нативних клітин, а потім в розчини гемоглобіну або в суспензії мембран вводили дозовані кількості озону. При другому способі суспензії нативних еритроцитів відмивали озонованим фізіологічним розчином з різними концентраціями озону і з отриманих озонованих клітин виділяли гемоглобін і мембрани для калориметричних досліджень

Термограми мембран еритроцитів, містять інформацію про зміни стану мембранозв'язаних білків під дією озону.

При обробці мембран озоном в концентрації 0,2 мгО3/л суспензії мембран, що відповідає дозі 0,13 мгО3/г білка (рис. 2 б), на термограмах присутні всі описані в літературі переходи (Snow J.W. et al., 1978; Snow J.W. et al., 1981; Заводник И.Б. и др., 1994; Матвеев А.В. и др., 1997).

Підвищення концентрації озону більше 2 мгО₃/л суспензії мембран (доза 1,23 мг О₃/г білка) призводить до зниження інтенсивності піків, які відповідають згаданим вище переходам (рис. 2 в). Найбільш чутливими до дії озону є білки, плавленню яких відповідають піки В і С на термограмах (рис. 2 г). Найбільш вірогідно, це анкірин, трансмембранний домен білка смуги 3 (аніонтранспортний білок) та білок смуги 4.1. Це дає підставу думати, що підвищення осмотичної стійкості еритроцитів під дією озону після кріоконсервування пов'язане зі слабкими структурними модифікаціями мембран та зміною їхньої транспортної функції.

При озонуванні ізольованого гемоглобіну зі збільшенням дози озону спостерігається тенденція до уширення піків його термоденатурації, що свідчить про зниження термостабільності гемоглобіна, яке пов'язане з розрихленням його молекул (Sturvevant J.M., 1987; Privalov P.L., 1989).

Уширення піка плавлення ізольованого гемоглобіну спостерігається вже при концентрації озону 0,8 мг О₃/л розчину гемоглобіну (доза 5,93 г О₃/моль Hb).

Гемоглобін, оброблений озоном у складі еритроцитів, більш стійкий до дії озону, ніж в ізольованому стані. Більш висока стійкість до озону гемоглобіну у складі клітин пояснюється, насамперед, бар'єрною функцією плазматичної мембрани для озону (Калер Г.В., 1986). Крім того, не слід виключати захисну дію антиоксидантної системи еритроцитів (Travagli V. et al., 2007).

Калориметричні дослідження гемоглобіну з деконсервованих еритроцитів, відмитих неозонованим фізіологічним розчином, показали, що температура плавлення гемоглобіну таких еритроцитів знижується, а ширина піка плавлення зростає що, ймовірно, викликано розрихленням його молекул. Відмивання кріоконсервованих еритроцитів озонованим фізіологічним розчином, що містить 0,2 мгО₃/л, призводить до відновлення конформаційної стабільності гемоглобіну, що підтверджується значенням температури та формою піка плавлення.

Таким чином, застосування озонованого фізіологічного розчину з концентрацією озону 0,2 мгО₃/л сприяє підвищенню осмотичної стійкості еритроцитів та відновленню конформаційної стабільності гемоглобіну після кріоконсервування. Співставляючи результати всіх експериментів, описаних вище, можна припустити, що вказані ефекти, ймовірно, пов'язані з деякими тонкими, недеструктивними ефектами озону на рівні слабких взаємодій між мембранозв'язаними білками, що впливають на регуляторні процеси та іонний транспорт еритроцитів.

Вплив озону на клітини дріжджів S. сerevisiae в нормальних фізіологічних умовах і після заморожування-відтанення. Нами були проведені експерименти з вивчення життєздатності кріоконсервованих дріжджів S. сerevisiae, в суспензії яких озон вводили у складі озонованого фізіологічного розчину (0,2 мгО₃/л) до заморожування, в ході заморожування та після нього.

Згідно з результатами, найменшу кількість колоній після кріоконсервування формують дріжджі, оброблені озоном до заморожування. Цей ефект може бути пов'язаний з додатковою ушкоджуючою дією високих концентрацій озону, що виникають в рідких мікрофазах при вимерзанні основної маси води.

Введення озону в суспензію дріжджів до та в ході заморожування виявилося неефективним - життєздатність дріжджів після такої обробки виявляється нижчою, ніж життєздатність необроблених клітин. Тому нами був вивчений вплив озону в різних концентраціях на їхню життєздатність при введенні озону після заморожування-відтанення. При цьому ми намагалися створити такі умови, щоб могли проявитися ефекти стимулюючої дії озону на репараційні процеси в клітинах. Контролем слугували зразки дріжджів, не оброблених озоном. Озон вводили в суспензії відтанених клітин через 5 хвилин після початку відігрівання, інкубували протягом 30 хвилин перед висіванням на агаризоване середовище. Отримані результати представлені на рисунку 6.

Як і в описаних вище експериментах на еритроцитах, дія озону на дріжджі S. cerevisiae має дозо-залежний характер. В діапазоні низьких концентрацій уведеного озону (менше 0,38 мгО₃/л) відмічається тенденція до підвищення життєздатності кріоконсервованих дріжджів. Показники життєздатності дріжджів, оброблених озонованим фізіологічним розчином з кінцевою концентрацією озону 0,09 мгО₃/л (доза 1,5Ч10^-12 мгО₃/кл), достовірно вище, ніж показники життєздатності дріжджів в контрольних зразках, не оброблених озоном.

При вказаній концентрації озону ефект стимуляції колонієутворення максимальний. При досягненні концентраціі озону 0,75 мгО₃/л життєздатність достовірно знижується порівняно до контролю. Більш високі концентрації озону (на рис. 6 не показані) викликають різке зниження життєздатності клітин дріжджів впритул до їх загибелі.

Таким чином, експериментально встановлено, що підвищення життєздатності заморожених-відтанених дріжджів S. cerevisiae проявляється при введенні низьких доз озону в суспензії клітин після їх відтанення. Даний ефект може пояснюватися як стимуляцією репарації нелетальних кріоушкоджень, так і рядом інших механізмів. Наприклад, Мельникова зі співавт. (Мельникова А.М. и др., 1989) показали, що під дією низьких доз озону відбувається активація відділення бруньок від клітин Candida utilis, суттєво скорочується ростова фаза адаптації культури, а також реєструється стимуляція ендогенного дихання, що пояснюється реорганізацією плазматичних мембран. Можна припустити, що стимулююча дія низьких доз озону на проліферативну активність дріжджів S. cerevisiae також є результатом структурних перебудов в плазматичних мембранах.

Для досліджень дії озону на мембрани дріжджів використовували методи флуоресцентної мікроскопії та проточної цитофлуориметрії з флуоресцентним зондом К8-3010 (“Setabiomedicals”, США), молекулярна маса якого складає 418,5.

Барвник К8-3010 фарбує оболонки клітин S. cerevisiae і має обмежену проникність всередину клітин, про що свідчить менш яскраве світіння цитоплазми. Частково барвник також акумулюється в вакуолях нормальних клітин, фарбуючи їх у жовтий колір.

Важливим є той факт, що зонд К8-3010 не виявляє токсичної дії на дріжджі S. cerevisiae.

Вказані властивості зонду К8-3010 дозволяють використовувати його для оцінки цілісності клітинних мембран дріжджів методами флуоресцентної мікроскопії та проточної цитофлуориметрії.

За результатами цитофлуориметрічних досліджень були побудовані залежності флуоресцентних характеристик дріжджів S. cerevisiae, пофарбованих барвником К8-3010, від концентрації озону.

Проникність клітин дріжджів для зонду зростає з ростом концентрації озону, причому при обробці клітин озоном після заморожування даний ефект значно посилюється. Аналіз параметрів прямого світлорозсіювання (FSC) показав, що величина FSC знижується з ростом концентрації озону, що свідчить про зменшення розмірів клітин S. cerevisiae в результаті їх руйнування.

В діапазоні концентрацій до 0,5 мгО₃/л (доза 0,5Ч10^-9 мгО₃/кл) як FSC, так і кількість клітин, що зв'язали барвник (показник FL2), змінюється несуттєво.

Ймовірно, в діапазоні низьких концентрацій озону до 0,5 мг/л (0,5Ч10^-9 мгО₃/кл) має місце часткове порушення бар'єрних властивостей клітинних мембран (часткова пермеабілізація), яка, однак, не призводить до втрати функціональних властивостей мембран клітин. Підставою для такого заключення є описані вище результати експериментів з вивчення впливу озону в низьких концентраціях на життєздатність дріжджів S. cerevisiae. Більш того, О.В. Скоринко було встановлено, що вже при низьких дозах озону порушується бар'єр проникності плазматичних мембран клітин дріжджів C. utilis для низькомолекулярних, фізіологічно активних метаболітів (нуклеотидів, амінокислот, кофакторів) (Скоринко Е.В., 2004), які виявляють протекторну та стимулюючу дію на клітини. Ймовірно, схожий ефект може мати місце і при обробці озоном деконсервованих дріжджів S. cerevisiae, і захисна дія низькомолекулярних метаболітів також сприяє підвищенню життєздатності клітин S. cerevisiae після кріоконсервування. Додатковим доказом може бути той факт, що молекулярна маса метаболітів, які виходили з клітин дріжджів C. utilis під дією низьких доз озону, не перевищувала 350 (Скоринко Е.В., 2004). Оскільки мембрани дріжджів S. cerevisiae вже при низьких дозах озону стають проникними для барвника К8-3010, молекулярна маса якого складає 418,5, вони, очевидно, стають також проникними і для вказаних внутрішньоклітинних метаболітів.

Цілісність мембран дріжджових клітин є інтегральною характеристикою і не дає інформацію про особливості взаємодії озону з компонентами клітинних мембран.

Дослідження методами оптичної і флуоресцентної спектроскопії показали, що під дією озону, починаючи з малих його доз, відбувається зниження інтенсивності власної флуоресценції клітин дріжджів S. Сerevisiae, яка визначається, головним чином, білковими компонентами.

Отримані результати якісно узгоджуються з описаними в літературі результатами досліджень дії озону на інші види мікроорганізмів (Калер Г.В., 1986; Матус В.К., 1990). Отже, мова йде про загальнобіологічні закономірності дії озону.

Як було показано вище, проникність клітин дріжджів S. сerevisiae для екзогенного барвника також підвищується, починаючи вже з малих доз озону, як без заморожування, так і після заморожування-відтанення. Можна припустити, що порушення цілісності мембран дріжджів пов'язане зі змінами стану білків. Однак, стан цілої клітини при зростанні дози озону змінюється не монотонно, а стрибкоподібно при досягненні порогової дози озону.

При дозах озону нижче порогової спостерігаються ефекти підвищення життєздатності дріжджів, що, ймовірно, пов'язано з активізацією захисних механізмів клітин. Отже, підвищення ефективності відновлення деконсервованих клітин дріжджів S. сerevisiae під дією низьких доз озону може бути результатом запуску каскаду захисних реакцій у відповідь на стрес.

Висновки

У роботі наведені теоретичне узагальнення та вирішення наукової проблеми підвищення ефективності кріоконсервування еритроцитів людини та дріжджів S. cerevisiae шляхом підвищення ефективності відновлення клітин після кріоконсервування.

1. Експериментально показано, що застосування озону в низьких концентраціях сприяє підвищенню ефективності кріоконсервування еритроцитів людини та дріжджів S. cerevisiae, збільшуючи осмотичну стійкість еритроцитів, відновлюючи конформаційну стабільність гемоглобіну, а також збільшуючи життєздатність дріжджів після заморожування-відтанення.

2. Відпрацьовані оптимальні процедури обробки еритроцитів та дріжджів озоном для підвищення ефективності їх відновлення після кріоконсервування: відмивання еритроцитів від кріоконсерванта озонованим фізіологічним розчином, що містить 0,2 мгО₃/л, і введення озону в концентрації 0,09 мгО₃/л в суспензію деконсервованих дріжджів (доза озону 1,5Ч10^-12 мгО₃/клітину).

3. Мембранні білки та гемоглобін еритроцитів виявляють меншу чутливість до озону при озонуванні їх у складі клітин, ніж в ізольованому стані.

4. В мембранах еритроцитів одними з найбільш чутливих до дії озону є анкірин, трансмембранний домен білка смуги 3 (аніонпереносячий) та білок смуги 4.1, які беруть участь у підтриманні структури еритроцитарної мембрани та в здійсненні іонного транспорту. Це пояснює один з можливих механізмів підвищення осмотичної стійкості еритроцитів та відновлення конформації гемоглобіну під дією озону після кріоконсервування.

5. Дія озону на життєздатність деконсервованих дріжджів S. cerevisiae має пороговий характер, на відміну від його дії на клітинні білки, які починають зазнавати змін вже при низьких дозах озону. Малі (недеструктивні) зміни мембранних білків в допороговому діапазоні доз озону можуть бути сигналом для запуску каскаду захисних реакцій дріжджових клітин у відповідь на слабку стресорну дію, які призводять до підвищення ефективності відновлення дріжджів S. cerevisiae після кріоконсервування.

6. Чутливість дріжджів до деструктивної дії високих доз озону підвищується після заморожування-відтанення. Ефект поєднаної дії озону в високих дозах та низьких температур на мікроорганізми може знайти практичне застосування в кріобіології для розробки способів низькотемпературної стерилізації.

Перелік робіт, опублікованих за темою дисертації

1. Зинченко В.Д., Белых И.А., Мусина И.А. Озоновые методы в криобиологии // Проблемы криобиологии. - 2005. - Т. 15, №3. - С. 286 - 288

2. Буряк И.А., Зинченко В.Д., Воловельская Е.Л., Репин Н.В., Рамазанов В.В. Изучение сохранности криоконсервированных эритроцитов после обработки озоном // Вісник Харківського національного університету імені В.Н. Каразіна. - 2007. - № 788, серія: біологія, випуск 6. - С. 129 - 133

3. Зинченко В.Д., Буряк И.А., Воловельская Е.Л. Погрешности при определении относительного количества негемолизировавших эритроцитов в криобиологических экспериментах // Проблемы криобиологии. - 2007. - Т. 17, № 3. - С. 251 - 255

4. Мусина И.А., Белых И.А., Онищенко Е.В, Зинченко В.Д., Дюбко Т.С.. Исследование влияния озона на биологические системы методами оптической спектроскопии // Вісник ХНУ №716. Біофіз. Вісн. - 2005. - Вип. 2(16). - С. 33 - 36

5. Патент № 8660, Україна, МПК⁷ С12N1/38. № 200500928. Спосіб підвищення проліферативної активності мікроорганізмів / Грищенко В.І., Висеканцев І.П., Зінченко В.Д., Бєлих І.А., Мусіна І.А. Заявл.: 02.02.2005. Публ. 15.08.2005. Бюл. №8

6. Патент №11354, Україна, МПК⁷ A61N1/44. №200506392. Пристрій для проведення озонотерапії / Зінченко В.Д., Мусіна І.А., Бєлих І.А., Ганічев В.В. Заявл. 29.06.2005. Публ. 15.12.2005. Бюл. №12

7. Патент №18571, Україна, МПК⁷ A01N1/02. № u200605129. Спосіб кріоконсервування еритроцитів / Воловельська Є.Л., Мусіна І.А., Зінченко В.Д., Рамазанов В.В., Бондаренко В.А. Заявл. 10.05.2006. Публ. 15.11.2006. Бюл. № 11

8. Мусина И.А., Зинченко В.Д., Дюбко Т.С., Высеканцев И.П. О влиянии степени разведения суспензии клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae на их взаимодействие с озоном // Матеріали Міжнародної науково-практичної конференції “Розвиток наукових досліджень 2005”. - 2005. - Полтава. - С. 105 - 107

9. Мусина И.А. Исследование влияния озона на состояние гемоглобина в эритроцитах донорской крови в нормальных условиях и после гипотермического хранения // Проблемы криобиологии. - 2005. - Т.15, №4. - С. 749 - 750

10. Мусіна І.А., Зінченко В.Д., Бєлих І.А., Воловельська Є.Л. Дослідження дії озону на стабільність еритроцитів людини за умов кріоконсервування // Зб. тез ІІ Міжнародної наукової конференції студентів і аспірантів “Молодь та поступ біології”. - Львів. - С. 437

11. Musina I.A, Zinchenko V.D., Volovelskaya Y.L. On possibility of low ozone doses application to increase cryopreserved erythrocytes survival // Proceedings of the 43^rd Meeting of the Society for Cryobiology in association with the Society for Low Temperature Biology “CRYO 2006”. - 2006 - Hamburg. - P. 48

12. Буряк И.А. Исследование криоповреждений дрожей Saccharomyces cerevisiae флуоресцентными методами // Проблемы криобиологии. - 2007. - Т. 17, № 2. - С. 197

13. Grischenko V., Zinchenko V., Buriak I., Volovelskaya Y., Lupoyad V., Lupoyad K. Correction of hypoxic state of intrauterine fetus using ozone // Abstracts of the 6^th Parnas conference “Molecular mechanism of cellular signalling”. - 2007. - Krakow. - P. 35

14. Зинченко В.Д., Буряк И.А., Дюбко Т.С. Применение биологических эффектов малых доз озона в криобиологии // Сб. материалов 29-го Всероссийского семинара “Озон и другие экологически чистые окислители. Наука и технологии”. - 2007. - Москва. - С. 141 - 149

15. Buriak I.A., Vysekantsev I.P., Martsenyuk V.F., Grischenko V.I., Dyubko T.S., Zinchenko V.D., Patsenker L.D., Sokolik O.A. Revealing of latent membrane damages after freeze - thawing // Proceedings of the 44^th Meeting of the Society for Cryobiology in association with the Society for Low Temperature Biology “CRYO 2007”, Lake Louise, 2007. - Cryobiology. - 2007. - Vol. 55, №3. - P. 333 - 334

16. Буряк И.А., Зинченко А.В., Зинченко В.Д. Влияние озона на термостабильность гемоглобина и мембраносвязанных белков эритроцитов // Зб. анотацій VII Харківської конференції молодих науковців “Радіофізика та електроніка”. - 2007. - Харків. - С. 44

Анотація

Буряк І.А. Застосування озону для підвищення ефективності кріоконсервування еритроцитів людини та дріжджів Saccharomyces cerevisiae. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.19 - кріобіологія. - Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, Харків, 2008.

Дисертаційна робота присвячена проблемі підвищення ефективності кріоконсервування еритроцитів людини та дріжджів S. cerevisiae шляхом підвищення ефективності відновлення клітин після кріоконсервування.

Експериментально показано, що застосування озону в низьких концентрація сприяє підвищенню ефективності кріоконсервування еритроцитів людини та дріжджів S. cerevisiae, збільшуючи осмотичну стійкість еритроцитів, відновлюючи конформаційну стабільність гемоглобіну, а також збільшуючи життєздатність дріжджів після заморожування-відтанення. Відпрацьовані оптимальні процедури обробки еритроцитів та дріжджів озоном для підвищення ефективності їх відновлення після кріоконсервування: відмивання еритроцитів від кріоконсерванта озонованим фізіологічним розчином, що містить 0,2 мгО₃/л, і введення озону в концентрації 0,09 мгО₃/л в суспензію деконсервованих дріжджів (доза озону 1,5Ч10^-12 мгО₃/клітину). Стимулююча дія озону на еритроцити та дріжджі після кріоконсервування може бути пояснена модификацією цитоплазматичних мембран еритроцитів та активацією захисних механізмів дріжджових клітин у відповідь на дію слабкого стресорного фактора (озону).

Ключові слова: кріоконсервування, еритроцити, дріжджі S. cerevisiae, озон, флуоресценція, цитофлуориметрія, флуоресцентна мікроскопія, ДСК, спектрофотометрія.

Аннотация

Буряк И.А. Применение озона для повышения эффективности криоконсервирования эритроцитов человека и дрожжей Saccharomyces cerevisiae. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.19 - криобиология. Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, Харьков, 2008.

Диссертационная работа посвящена проблеме повышения эффективности криоконсервирования эритроцитов человека и дрожжей S. cerevisiae путем повышения эффективности восстановления клеток после замораживания - оттаивания.

В результате проведения экспериментальных исследований установлено, что при обработке эритроцитов озонированным физиологическим раствором с концентрацией озона 0,2 мг О₃/л снижаются показатели осмотической хрупкости эритроцитов, а также восстанавливается конформационная стабильность гемоглобина после замораживания-оттаивания.

Установлено, что мембранные белки эритроцитов и гемоглобин повреждаются меньшими дозами озона в изолированном состоянии, чем в составе клеток, что может быть объяснено защитным действием антиоксидантной системы клеток.

Показано, что в мембранах эритроцитов одними из наиболее чувствительных к действию озона являются анкирин, трансмембранный домен белка полосы 3 (анионпереносящий) и белок полосы 4.1. Это дает основание думать, что повышение осмотической устойчивости эритроцитов и восстановление конформации гемоглобина под действием озона после криоконсервирования связано некими тонкими недеструктивными эффектами озона на уровне слабых взаимодействий между мембраносвязанными белками, влияющих на регуляторные процессы и ионный транспорт эритроцитов.

На клетках дрожжей S. cerevisiae экспериментально показано, что введение озона в суспензию дрожжей до замораживания вызывает снижение жизнеспособности клеток после оттаивания. Предполагается, что данный эффект связан с дополнительным повреждающим действием высоких концентраций озона, возникающих в жидких микрофазах при вымерзании основной массы воды.

Озон в дозе 1,5Ч10^-12 мгО3/клетку, введенный в суспензию дрожжей после замораживания-оттаивания, способствует повышению их жизнеспособности по сравнению с жизнеспособностью неозонированных клеток, что, вероятно, объясняется запуском каскада защитных реакций клетки, приводящих к повышению эффективности ее восстановления после криоконсервирования.

Показано, что состояние белков дрожжей S. cerevisiae, оцениваемое флуоресцентными методами, меняется беспорогово: интенсивность собственной флуоресценции клеток, определяющейся, главным образом, белковыми компонентами, снижается уже при низких дозах озона. В отличие от действия озона на белки, действие его на клетки дрожжей S. cerevisiae имеет пороговый характер. Развитие деструктивных процессов в клетках начинается при превышении пороговой дозы озона. (0,5Ч10^-9 мгО3/кл), которая значительно выше доз озона, стимулирующих пролиферативную активность дрожжей.

Ключевые слова: криоконсервирование, эритроциты, дрожжи S. cerevisiae, озон, флуоресценция, цитофлуориметрия, флуоресцентная микроскопия, ДСК, спектрофотометрия.

Summary

Buriak I.A. Use of ozone for enhancement of cryopreservation efficiency of human erythrocytes and yeast Saccharomyces cerevisiae. - Manuscript.

The dissertation for the candidate of biological sciences degree (PhD equivalent) in specialty 03.00.19 - cryobiology. - Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, 2008.

The thesis is dedicated to the problem of enhancement of cryopreservation efficiency of human erythrocytes and yeast S. cerevisiae by the increase of potency of cell recovery after cryopreservation.

It was shown experimentally, that use of ozone under low concentrations contributed to a rise of cryopreservation efficiency of human erythrocytes and yeast S. cerevisiae, by increasing the erythrocytes' osmotic resistance, recovering hemoglobin conformational stability and elevating the yeast viability after freeze-thawing.

Optimal procedures of ozone treatment of erythrocytes and yeast for the increase of efficiency of their recovery after cryopreservation are: washing-out of the erythrocytes from cryoprotectant with ozonated physiological saline, containing 0.2 mgО₃/L, and introduction of ozone under concentration of 0.09 mgО₃/L in yeast suspension after cryopreservation (ozone dose of 1.5Ч10^-12 mgО₃/cell).

Stimulating ozone effect on the erythrocytes and yeast after cryopreservation can be explained by modification of cytoplasm membranes of erythrocytes and activation of defense mechanisms of the yeast cells in response to the effect of slight stress factor (ozone).

Key words: cryopreservation, erythrocytes, yeast S. cerevisiae, ozone, fluorescence, cytofluorimetry, fluorescent microscopy, DSC, spectrophotometry.

Размещено на Allbest.ru

...