Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Внутрішньосортова молекулярно-генетична мінливість винограду роду Vitis L.

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Вивчення організації і мінливості геномів рослин є одним з основних напрямів генетики. Процес створення нових форм ґрунтується на генетичній різноманітності рослин і методах її використання в селекції. Особливу увагу в цьому плані привертає виноград - багаторічна, сільськогосподарська культура, яка розмножується вегетативно.

Порівняно з однорічними зерновими культурами виноград є мало вивченим об'єктом. Більшість культивованих сортів винограду представлено популяцією клонів. Клони одного сорту фенотипово можуть бути однорідні або відмінні. Клонова селекція винограду спрямована на відбір форм з певними якісними варіаціями і найкращими значеннями кількісних ознак, які мають безперервний характер варіювання у певних умовах зовнішнього середовища. Цим і визначається складність відбору за фенотипом. При цьому порівняльне випробування клонів одного вегетативного покоління селекційними методами потребує значних грошових витрат і становить близько 20 років. Роздільна здатність каріологічних і біохімічних методів досліджень не завжди дозволяє детектувати внутрішньосортову генетичну мінливість. З огляду на це актуальними є дослідження внутрішньосортової мінливості за допомогою ДНК-технологій. За кордоном проведено дослідження генетичної мінливості клонів невеликої кількості сортів. Важливе значення має вивчення на їх основі вітчизняних та інтродукованих сортів і клонів, що культивують в Україні. Ретельного вивчення потребує ідентифікація ділянок ДНК, пов'язаних з мінливістю якісних і кількісних ознак клонів.

У зв'язку з цим теоретичний і практичний інтерес являють дослідження молекулярної структури геному винограду, молекулярно-генетичний аналіз послідовностей нуклеотидів фракції частих повторів, проведення відбору комбінацій проба / фермент і праймерів для дослідження внутрішньосортової мінливості ДНК, дослідження поліморфізму ДНК клонів сортів винограду та оцінка зв'язку між поліморфізмом фрагментів ДНК і варіаціями фенотипових ознак.

Дослідження внутрішньосортової мінливості різними типами молекулярних ДНК-маркерів (ПДРФ і методом ампліфікації з довільними і ISSR-праймерами) дає змогу детектувати поліморфізм різних ділянок геному винограду. Відбір за допомогою молекулярних ДНК-маркерів, що ґрунтується на специфічності зв'язку між поліморфними фрагментами ДНК та фенотиповою варіацією якісних і кількісних ознак, дасть можливість на новому рівні проводити етапи практичної селекції клонів сортів винограду і вести спрямований відбір переважно за генотипом.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Роботу виконано у відділі молекулярної генетики Південного біотехнологічного центру у рослинництві УААН (до 2000 р. у складі Селекційно-генетичного інституту, м. Одеса) з 1991 по 1995 роки у рамках наукової програми: «Разработать методы идентификации сортов и клонов винограда с помощью ДНК-зондов», у відділенні агробіотехнології Інституту агроекології УААН (м. Київ) з 2002 по 2006 рр. і в лабораторії вірусології і мікробіології ННЦ «ІВіВ ім. В.Є. Таїрова» УААН (м. Одеса) з 2002 по 2006 рр. у рамках наукової програми (НТП): «Розробка и впровадження ДНК-технологій, культури тканин та органів in vitro для розвитку теорії і практики селекції рослин» та НТП УААН «Біотехнологія культурних рослин (2001-2005 рр.)», Підпрограма 1 «Новітні біотехнології в рослинництві», що затверджена загальним наказом Міністерства аграрної політики України і Української академії аграрних наук від 24 жовтня 2001 р. №318/92 і Постановою Президії УААН від 29.01.2002 р., протокол №2 і включена до переліку науково-технічних програм УААН на 2001-2005 рр., за напрямом 03 «Використання молекулярно-біологічних методів у генетико-селекційній роботі».

Мета і завдання дослідження. Метою роботи є детекція генетичної мінливості та аналіз її зв'язку з мінливістю фенотипових ознак клонів сортів винограду для підвищення ефективності селекційного процесу.

Для досягнення поставленої мети вирішували такі завдання:

1. Аналіз молекулярної структури ДНК винограду сорту.

2. Створення геномної бібліотеки винограду. Скринінг геномної бібліотеки винограду для відбору часто повторюваних послідовностей в якості молекулярних проб.

3. Підбір комбінацій проба / фермент та праймерів для аналізу внутрішньосортової мінливості ДНК винограду.

4. Вивчення внутрішньосортової генетичної мінливості.

5. Аналіз зв'язку мінливості фенотипових ознак клонів досліджених сортів з поліморфізмом фрагментів ДНК.

Об'єкт дослідження - геном винограду.

Предмет дослідження - внутрішньосортова генетична мінливість.

Методи дослідження - реасоціація ДНК у розчині, ПДРФ, ампліфікація ДНК з довільними і ISSR-праймерами. Результати досліджень обробляли стандартними статистичними методами.

Наукова новизна одержаних результатів. Одержані результати досліджень розширюють уявлення про молекулярну організацію геному винограду і певні послідовності ДНК. Уперше проведено кількісну оцінку та отримано характеристики фракцій різної частоти повторення за даними кінетики реасоціації ДНК винограду. Визначено температуру термічної денатурації тотальної ДНК винограду. Запропоновано принцип підбору праймерів для детекції внутрішньосортової мінливості ДНК винограду. Критерієм підбору праймерів є рівень поліморфізму ДНК сортів V. vinifera, що становить 55%. Уперше встановлено, що внутрішньосортова мінливість ДНК винограду зумовлена варіаціями послідовностей нуклеотидів рибосомної ДНК (рДНК). Виявлено, що внутрішньосортова мінливість ДНК винограду пов'язана з мінливістю послідовностей нуклеотидів, розташованих між простими повторами (ISSR), і так само послідовностей нуклеотидів, одержаних за допомогою ампліфікації ДНК з довільними праймерами. Зазначено, що клони сортів Ріпаріа х Рупестріс 101-14, Ріпаріа Глуар де Монпельє і Каберне Совіньон становлять кілька генетично різних груп. Запропоновано спосіб добору клонів на підставі статистичного аналізу зв'язку мінливості фенотипових ознак з поліморфізмом фрагментів ДНК. З популяцій клонів підщепного сорту Ріпаріа х Рупестріс 101-14 і технічного сорту Каберне Совіньон виділено групи клонів з певною морфологією та перспективних за врожайністю, які є цінним вихідним матералом для подальшої селекції.

Практичне значення одержаних результатів. Дані щодо кількісного вмісту повторюваних і унікальних послідовностей нуклеотидів є важливими для проведення подальшого дослідження молекулярної організації геному винограду, його структурних особливостей. Характеристики різних за частотою повторення фракцій послідовностей нуклеотидів є практичною інформацією для виділення і аналізу як окремої фракції, так і специфічних послідовностей нуклеотидів. Дані щодо температури термічної денатурації ДНК винограду можна використати для проведення досліджень за допомогою методу ПДРФ з блот-гібридизацією за Саузерном. Підбір праймерів для ідентифікації клонів других сортів винограду можна здійснювати на підставі зазначеного принципу. Одержані поліморфні фрагменти ДНК можна застосовувати як молекулярні маркери для ідентифікації клонів вивчених сортів, для молекулярно-генетичного контролю клону або сорту в процесі розмноження і розповсюдження.

Виділені групи клонів сортів Ріпаріа х Рупестріс 101-14 і Каберне Совіньон використовують для подальшого отримання і розмноження базового і сертифікованого садивного матеріалу. У розсадницьких господарствах України закладено базові і сертифіковані насадження виділених клонів підщепного сорту Ріпаріа х Рупестріс 101-14 загальною площею понад 20 га.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційну роботу виконано під керівництвом д.с.-г.н., професора, академіка НАНУ і УААН О.О. Созінова. Здобувачем проаналізовано літературні дані за темою дисертаційної роботи. Проведено експериментальну частину роботи: виділення ДНК, проведення експериментів з дослідження кінетики відновлення вторинної структури ДНК, експериментів зі створення і Саузерн-аналізу клонотекі ДНК винограду, дослідження мінливості ДНК представлених форм винограду методами ПДРФ та ампіфікації. Здобувачем проведено статистичне оброблення результатів досліджень. Оптимізовано умови проведення реакції ампліфікації з довільними та ISSR-праймерами, запропоновано принцип для підбору праймерів, що детектують внутрішньосортову мінливість, запропоновано спосіб добору перспективних клонів.

Обговорення, аналіз, інтерпретацію отриманих експериментальних даних, а також підготовку частини публікацій до друку проводили разом із д.с.-г.н., професором, академіком НАНУ і УААН О.О. Созіновим, д.б.н., професором, академіком УААН, директором ЮБЦ Ю.М. Сиволапом, к.б.н., с.н.с. НДІ молекулярно-генетичної і клітинної медицини ОДМУ Т.Г. Вербицькою, к.б.н., зав. відділом селекції і сортовивчення ННЦ «ІВіВ ім. В.Є. Таїрова» М.І. Тулаєвою, к.б.н., зав. лабораторії вірусології і мікробіології ННЦ «ІВіВ ім. В.Є. Таїрова» Н.А. Мулюкіною. Усім цим вченим автор висловлює щиру подяку.

Вивчення якісних і кількісних ознак клонів досліджених сортів винограду проведено к.б.н., зав. відділом селекції і сортовивчення ННЦ «ІВіВ ім. В.Є. Таїрова» М.І. Тулаєвою, д.с.-г.н., зав. лабораторії клонової селекції ННЦ «ІВіВ ім. В.Є. Таїрова» В.Ф.Хільком, к.с.-г.н., с.н.с. лабораторії клонової селекції ННЦ «ІВіВ ім. В.Є. Таїрова» В.С.Чісніковим, н.с. лабораторії клонової селекції ННЦ «ІВіВ ім. В.Є. Таїрова» І.А. Ковальовою, н.с. лабораторії клонової селекції ННЦ «ІВіВ ім. В.Є. Таїрова» Л.С. Мазуренко, тестування данного матеpіала на латентне ураження вірусами і бактеріальним раком сортів і клонів винограду - к.б.н., зав. лабораторії вірусології і мікробіології ННЦ «ІВіВ ім. В.Є. Таїрова» Н.А. Мулюкіною.

Апробація результатів дисертації. Основні результати наукової роботи відображено в публікаціях у фахових виданнях. Результати роботи доповідались і обговорювались на міжнародному симпозиумі «Управление генетической изменчивостью сельскохозяйственных растений» (м. Ялта, 1992); міжнародній конференції «Plant Genome III» (San Diego, USA, 1995); міжнародній науково-практичній конференції молодих вчених і спеціалістів «Наслідки наукових пошуків молодих вчених-аграрників в умовах реформування АПК» (смт. Чабани, 1996); науково-практичній конференції «Пути повышения эффективности хранения и переработки сельскохозяйственной продукции» (м. Одесcа, 1999).

Публікації. Результати дисертаційної роботи опубліковано у п'яти статтях і тезах чотирьох доповідей, розділі науково-методичного посібника.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, матеріалів і методів, експериментальної частини, аналізу та узагальнення результатів дослідження, висновків.

Роботу викладено на 191 сторінках машинописного тексту. Дисертацію проілюстровано 13 рисунками і 19 таблицями. Список використаної літератури охоплює 227 джерел.

Основний зміст

геномний молекулярний виноград праймер

Матеріали та методи досліджень

Матеріалом для дослідження слугували: сорт Рупестріс дю Ло (Vitis rupestris Sheele), сорт Ріпаріа Глуар де Монпельє (Vitis riparia Michx.), міжвидові гібриди Ріпаріа х Рупестріс 101-14 (РхР 101-14, V. riparia х V. rupestris), Роднічок ([(V. vinifera х Vitis amurensis Rupr.) х V. vinifera] х (V. riparia х V. rupestris х V. vinifera)), Голубок ((V. vinifera х V. amurensis) х V. vinifera), Оригінал (V. vinifera х (V. riparia х V. rupestris х V. vinifera)); сорти V. vinifera: Каберне Совіньон, Рислінг рейнський, Ркацителі, Мускат гамбурзький, Мускат таїровський; 11 клонів підщепного соpту Ріпаріа х Рупестріс 101-14 (4923, 832, 992, 1182, 6733, 672, 4244, 6114, 2382, 12161, 22121), 3 клони підщепного соpту Ріпаpіа Глуаp де Монпельє (454, 852, 3121), 10 клонів Кабеpне Совіньон (143113, 1441, 1473, 2043, 22103, 30251, 1076, 441, ІНРА, ЄНТАВ), 5 клонів технічного соpту Рислінг pейнський (13101, 14161, 2071, 6846, 8121); 10 індивідуальних рослин клону 4923 сорту Ріпаріа х Рупестріс 101-14, по 5 індивідуальних рослин клонів 1076, 441, ЄНТАВ сорту Каберне Совіньон. Мускат гамбурзький і Мускат таїровській є близькоспорідненими сортами. Матеріал для дослідження надано відділом клонової селекції ННЦ «ІВіВ ім. В.Є. Таїрова». Клони сорту Ріпаріа х Рупестріс 101-14 розрізнялись за якісними ознаками: «тип квітки», «забарвлення верхівки пагона»; за кількісними ознаками: «навантаження кущів пагонами», «кількість чубуків з куща», «діаметр чубука», «кількість повних серцевинних променів», «прошарки твердого лубу», «відношення діаметра чубука до діаметра серцевини», «сума вуглеводів». Клони технічного сорту Каберне Совіньон розрізнялись за якісною ознакою: «форма грона»; за кількісними ознаками: «маса урожаю з пагона», «маса грона», «маса 100 ягід», «продуктивність пагона», «концентрація цукру», «кислотність соку». Селекцію клонів 30251, 22103, 2043, 441, 1473, 1076, 1441, 143113 проведено в ННЦ «ІВіВ ім. В.Є. Таїрова», ІНРА, ЄНТАВ - клони французької селекції.

Дані якісних і кількісних ознак клонів сорту Ріпаріа х Рупестріс 101-14, що отримані за 1991-1995 рр., надані: к.б.н., зав. відділу селекції і сортовивчення Тулаєвою М.І, д.с.-г.н., зав. лабораторії клонової селекції Хільком В.Ф, к.с.-г.н., с.н.с. лабораторії клонової селекції Чісніковим В.С; за 2002-2004 рр. - д.с.-г.н., зав. лабораторії клонової селекції Хільком В.Ф, н.с. лабораторії клонової селекції Ковальовою І.А.

Дані якісних і кількісних ознак клонів сорту Каберне Совіньон, що отримані за 1991-1995 рр., надані: к.б.н., зав. відділу селекції і сортовивчення Тулаєвою М.І, д.с.-г.н., зав. лабораторії клонової селекції Хільком В.Ф, к.с.-г.н., с.н.с. лабораторії клонової селекції Чісніковим В.С, н.с. лабораторії клонової селекції Мазуренко Л.С.; за 2002-2004 рр. - к.б.н., зав. відділу селекції і сортовивчення Тулаєвою М.І, д.с.-г.н., зав. лабораторії клонової селекції Хільком В.Ф, н.с. лабораторії клонової селекції Мазуренко Л.С.

За результатами тестування лабораторією вірусології і мікробіології матеріал для дослідження є вільним від віpусів, що спричиняють коротковузля (GFLV), скручування листя (GLRaV), мармуровість (GFkV), збудника бактеріального раку Agrobacterium tumefaciens.

Виділення ДНК. Для виділення ДНК винограду з тканини листа використано метод із застосуванням антиоксідантних речовин [Cиволап и др., 1992]. Для отримання геномної бібліотеки виділення ДНК плазмід проводили методом лужного лізису [Бирнбойм и др., 1979]. Для масового аналізу рекомбінантних клонів плазмідну ДНК виділяли швидким методом із використанням цетавлону [Дел Сал и др., 1988].

Термальна денатурація і реасоціація ДНК у розчині. Для проведення термічної денатурації і реасоціації ДНК винограду полимерну ДНК фрагментували за допомогою ультразвукового дезінтегратора «УЗДН-1» у кавітаційному режимі 10 сек х 30 з інтервалом 1 хв до утворення фрагментів ДНК середнього розміру 600-700 пар нуклеотидів.

Розділення одноланцюгової і дволанцюгової ДНК проводили за допомогою хроматографії на гідроксиапатиті. Кожну порцію елюйованої дволанцюгової ДНК оцінювали спектрофотометрично та відбирали ті, що задовольняли спектральним характеристикам: ОП₂₆₀/ОП₂₃₀ = 2, ОП₂₆₀/ОП₂₈₀ = 2,2. Термальну денатурацію ДНК винограду виконано у термостатованих кюветах спектрофотометра Acta M-4. Концентрація розчину ДНК становила 20-25 мкг/мл у 0,06 М, 0,12 М, 0,48 М Na-фосфатному буфері. Нуклеотидний вміст ДНК винограду визначено за температурою плавлення [Мандель и др., 1970]. Молекулярний вміст ГЦ-пар обчислено за емпіричною залежністю між вмістом ГЦ-пар і температурою плавлення [Мандель и др., 1970]. Реєстрацію ступеня реасоціації ДНК проведено оптичним методом. Кінетичну складність і повторюваність ДНК визначено за даними кінетики реасоціації її фрагментів, які отримано спектрофотометрично при 260 нм [Бриттен и др., 1974].

Отримання молекулярних проб. Клонування ДНК винограду проведено з використанням вектора - плазміди pUC18, рестриктази Sau3AI і ДНК-лігази фагу Т4 [Маниатис и др., 1984]. Для трансформації використали компетентні клітини E. coli штаму NM 522, оброблені CaCl_2. Скринінг клонованих фрагментів ДНК винограду проведено шляхом гібридизації з [б-³²P] - міченою фракцією послідовностей ДНК винограду [Фейнберг и др., 1983] з С₀t = 10^-2 моль * сек/л.

Перенесення ДНК за Cаузерном. Перенесення ДНК з агарозного гелю на мембрани Hybond N (Amersham) проводили капілярним методом [Маниатис и др., 1984].

Ферментативний гідроліз ДНК. Для гідролізу ДНК винограду і плазмідної ДНК застосовано рестрикційні ендонуклеази: AluI, BamHI, BglII, EcoRI, EcoRV, MspI, PstI, Sau3AI, TaqI. Реакцію гідролізу ДНК проводили відповідно до рекомендацій фірми-постачальника рестрикційних ендонуклеаз (Fermentas).

Фракціонування і візуалізація фрагментів ДНК. Продукти ферментативного гідролізу ДНК фракціонували електрофорезом в 0,8 або 1% агарозному гелі (залежно від розмірів фрагментів), в трис-ацетатному або трис-боратному буферах [Маниатис и др., 1984]. Аналіз пpодуктів довільно праймованої (ДП) ампліфікації ДНК фракціонували у 2% агаpозному гелі в тpис-боpатному буфеpі. Агарозні гелі фарбували етідіум бромідом, візуалізували в УФ-світлі і фотографували на плівку «Мікрат-300». Аналіз пpодуктів ISSR-ампліфікації ДНК проводили у 6% або 8% поліакріламідному гелі в тpис-боpатному буфеpі [Маниатис и др., 1984]. Результати електрофорезу фрагментів ДНК візуалізували фарбуванням азотнокислим сріблом [Будовл и др., 1991].

Для отримання радіоавтографів після блот-гібридизації ДНК мембрани експонували на рентгенівську плівку РМ-1 від 20 год до двох тижнів.

Саузерн-аналіз. Для Саузерн-аналізу послідовностей рДНК винограду використали гібридизаційну пробу рТU3, яка містила міжгенний спейсер рДНК, фланкований фрагментами послідовностей 18S і 26S рДНК диплоїдної пшениці Titicum urartu Thum. ex Gandil. Загальний розмір проби pTU3 становить 4,17 т. п.н. Саузерн-аналіз генів теплового шоку провели із застосуванням гібридизаційної проби рСI, яка є послідовністю нуклеотидів гена білка теплового шоку (БТШ) 70 ячменю, розміром 2,1 т. п.н., що гомологічна генам БТШ 70 дрозофіли.

Пpоби мітили б-³²P, гібpидизували в буфері 4 Х SSPE, 0,1% (w/v) ПВП 350, 0,4% (w/v) ДСН 24-36 год при 58,6°С. Мембрани відмивали 2 pази по 20 хв у 2 Х SSC, 0,1% SDS, далі у 0,1 Х SSC, 0,1% SDS 2 pази по 10 хв [Маниатис и др., 1984].

Ампліфікація фрагментів ДНК. Ампліфікацію проводили на приладах Біотерм М91 і Терцік. Для проведення ДП-ампліфікації здійснювали модіфікацію методик [Каэтано-Аноллес и др., 1991, Каэтано-Аноллес 1993, Виллиамс и др., 1990, 1993, Жан-Жак и др., 1993]. Для ДП-ампліфікації як пpаймеpи використали 22 олігонуклеотиди довільної послідовності, від 15 до 28 нуклеотидів завдовжки. Реакційна суміш містила: 25 нг геномної ДНК, 200 мкМ кожного dNTP, 0,05 M KCl, 0,02 М трис-НСl pH 8,4, 4,5 mM MgCl₂, 0,01% твін 20, 0,2 мкМ праймера, 1 од. Taq-полімерази. Етапи ампліфікації містили такі температурні режими: денатурацію, гібридизацію, елонгацію. Ампліфікацію проводили в чотири етапи: 1. 94°С - 4 хв, 42°С - 1,8 хв, 72°С - 2 хв; 2. 94°С - 1 хв, 42°С - 1,8 хв, 72°С - 2 хв, (5 циклів); 3. 94°С - 1 хв, 52°С - 1,8 хв, 72°С - 2 хв, (35 циклів); 4: 94°С - 1 хв, 52°С - 4 хв, 72°С - 10 хв. Для всіх довільних праймерів дотримано зазначені умови ампліфікації.

Для проведення ISSR-ампліфікації (inter simple sequence repeats) здійснювали модіфікацію методик [Ботта и др., 1995, Морено и др., 1998, Сефк и др., 1999]. Для ампліфікації як праймери використали 8 динуклеотидних і 8 тринуклеотидних повторів з виродженими нуклеодидами в якості якоря. Реакційна суміш містила: 25 нг геномної ДНК, 200 мкМ кожного dNTP, 0,05 M KCl, 0,02 М трис-НСl pH 9,0, 1,5-3 mM MgCl₂ (залежно від послідовності праймера), 0,01% твін 20, 0,2 мкМ праймера, 1 од. Taq-полімерази. Етапи ампліфікації містили такі температурні режими: денатурацію, гібридизацію, елонгацію. Ампліфікацію проводили в три етапи: 1. 94°С - 4 хв, 52-62°С - 0,5 хв. (в залежності від послідовності праймера), 72°С - 2 хв; 2. 94°С - 0,5 хв; 52-62°С - 0,5 хв; 72°С - 2 хв. (35 циклів); 3. 94°С - 0,5 хв, 52-62°С - 0,5 хв, 72°С - 5 хв.

Статистична обробка даних. Криві кінетики реасоціації ДНК винограду обраховували за алгоритмом програми, яка знаходить рішення за виділенням складників за допомогою методу найменших квадратів [Бриттен и др., 1974]. Отримані результати обробляли стандартними статистичними методами. Розміри фрагментів ДНК винограду розраховували в залежності логарифма розміру фрагмента від руху фрагментів у гелі відносно маркерів - рUС19R: MspI, рUС18R: TaqI, лR: HindIII, лR: PstI, (Fermentas) [Биарден, 1979]. Оцінку рівня міжсортового поліморфізму проводили із співвідношення кількості поліморфних і загальної суми фрагментів, отриманих за допомогою гібридизації та ампліфікації. Наявність зв'язку мінливості фенотипових ознак з поліморфізмом ДНК оцінювали за допомогою комп'терних програм «Statistica».

Результати дослідження та їх обговорення

Аналіз молекулярної структури ДНК винограду. Вивчення процесу кінетики відновлення вторинної стуктури ДНК дає змогу отримати характеристики фракцій з різною частотою повторення, оцінити їх кількісний вміст. Для аналізу молекулярної структури використано ДНК сорту Рислінг рейнський.

За допомогою cпектрофотометричного методу реєстрації термічної денатурації ДНК одержано ГЦ-склад ДНК винограду, який становить 35,2%. За даними термічної денатурації визначено температуру плавлення - 83,6°С.

За допомогою методу реасоціації ДНК у розчині встановлено, що швидко реасоціююча фракція в геномі винограду становить 11,5%, зі значенням періоду напівреасоціації даної фракції C₀t_1/2 - 5,83 * 10^-4 моль * сек/л і частотою повторення - 6,94 * 10⁶. Фракція з помірною швидкістю реасоціації становить 29%, C₀t_1/2 якої - 1,85 моль * сек/л, частота повторення - 8,53 * 10². Повільно реасоціююча фракція становить 59,5%, при C₀t_1/2 - 380 моль * сек/л і частотою повторення - 2. Відомо, що величина С₀t_1/2 прямо пропорційна розміру геному організму, представленому тільки унікальними послідовностями нуклеотидів. Згідно з отриманими результатами, при використанні як стандартів розміру геному E.coli і значення С₀t_1/2 E.coli, а також значення С₀t_1/2 повільно реасоціюючої фракції ДНК винограду, кінетична складність геному становить 3,88 х10⁸ п.н.

Результати оцінки кількісного вмісту унікальних і малокопійних послідовностей узгоджуються з даними про розмір геному винограду. Відомо, що кількість повторів залежить від розміру геному, і у рослин з масою ядерної ДНК менше 4 пкг унікальні послідовності (повільно реасоціююча фракція) становлять доволі значну частину геному. Розмір геному винограду складає 4,75 * 10⁸ п.н., відповідно повільно реасоціююча фракція - 59,5%. Отже, в геномі винограду кількісно переважають малокопійні та унікальні послідовності, а ті, що часто повторюються, становлять незначну частину, при цьому у дослідженнях Берідзе [1973] показано відсутність сателітних компонентів ядерної ДНК винограду.

Створення геномної бібліотеки ДНК винограду. Відбір і молекулярно-генетична характеристика фрагментів ДНК з фракції часто повторюваних послідовностей. Для створення геномної бібліотеки використано ДНК сорту Рислінг рейнський. Бібліотека фрагментів ДНК містила близько 300 рекомбінантних клонів. Рестрикційний аналіз засвідчив, що розмір вставок становить від 400 п.н. до 2500 п.н. Скринінг клонованих фрагментів ДНК проведено за допомогою гібридизації з фракцією, реасоційованною до значення С₀t = 10^-2 мкг * сек/мл, міченої б-³²Р.

Для оцінки клонованих послідовностей, як молекулярних проб, вибрано сорти, що представляють види V. vinifera, V. rupestris або складний міжвидовий гібрид. Для гідролізу ДНК використано ферменти EcoRI, EcoRV, BglII, BamHI, з сайтом пізнавання 6 п.н. і TaqI, BsuRI, з сайтом пізнавання 4 п.н. Враховуючи чергування повторів з малокопійними і унікальними послідовностями, які переважають у геномі, одержано картини гібридизації, характерні як для часто повторюваних послідовностей, так і для малокопійних. Згідно з даними гібридизації за Саузерном клоновані послідовності розділено на дві групи. Послідовності ДНК першої групи (pRr5, pRr15, pRr31, pRr45, pRr50, pRr58/2, pRr60/1, pRr60/2, pRr66, pRr74, pRr81, pRr87, pRr91, pRr134/1, pRr134/2, pRr145) гібридизувались з геномною ДНК по всій довжині треку, що вказує на певний розподіл по геному. До другої групи належать клоновані послідовності: pRr1, pRr41, pRr49, pRr61, pRr63, pRr71, pRr73, pRr133, pRr156. Згідно з результати гібридизації цих послідовностей з геномною ДНК отримано від однієї до кількох смуг, іноді зі слабким гібридизаційним фоном. Перша група клонованих фрагментів ДНК винограду, можливо, належить до розсіяних по геному диспергованих повторів. Друга група клонованих послідовностей ДНК винограду, певно, має складну організацію, а саме вони розташовані в геномі поряд з унікальними та іншими послідовностями. Але їх не можна віднести до розсіяних по геному у вигляді окремих копій послідовностей, оскільки вони мають обмежене число фрагментів гібридизації з ДНК при гідролізі рестриктазами, що пізнають послідовність з 6 пар нуклеотидів. Таким чином, проведено аналіз 94 комбінацій проба / фермент, фермент EcoRI виявився ефективнішим, оскільки він дав змогу виявити чіткі фрагменти гібридизації у 8 випадках з 24, порівняно з іншими ферментами. Найінформативніші дані одержано за допомогою 3 комбінацій проба / фермент (pRr71/EcoRI, pRr133/EcoRI, pRr133/TaqI) і тому, можливе їх використання для дослідження різноманітності та ідентифікації різних форм винограду.

Підбір комбінацій проба / фермент і праймерів для оцінки внутрішньосортової мінливості ДНК винограду. Для вивчення внутрішньосортової генетичної різноманітності методами ПДРФ з блот-гібридизацією за Саузерном та ампліфікації здійснено скринінг проб і праймерів, що виявляють значну кількість варіабельних локусів серед набору сортів V. vinifera.

Дослідження області рибосомних генів проведено за допомогою 3 комбінацій проба / фермент - pTU3/AluI, pTU3/MspI, pTU3/TaqI, області генів білків теплового шоку - рСI/TaqI. При використанні комбінації pTU3/TaqI отримано фрагменти гібридизації розміром 500 п.н. и 360 п.н. у сортів, що свідчить про наявність TaqI-повторів у регіонах 18S, 26S рДНК. Використання комбінацій pTU3/AluI і pTU3/MspI показало наявність численніх сайтів рестрикції ферментів AluI і MspI у регіонах 18S, 26S рДНК у винограду. Найбільший рівень поліморфізму ДНК серед сортів детектовано за використанням комбінацій рСI/TaqI (57%) і pTU3/AluI (46%). Проте у близькоспоріднених сортів Мускат гамбурзький і Мускат таїровський за допомогою комбінаії рСI/TaqI відмінностей не виявлено. Тому для дослідження внутрішньосортового поліморфізму ДНК відібрано комбінацію pTU3/AluI.

Для вивчення поліморфізму сортів методом ампліфікації використали 22 довільних праймери і 16 ISSR-праймери. Найбільша кількість варіабельних фрагментів ДНК утворювалась з 7 довільними праймерами (Р5, Р8, Р12, Р14, Р18, Р23, Р63) і 7 ISSR-праймерами (Р_i1, Р_i6, Р_i9, Р_i10, Р_i11, Р_i15 Р_i16). На наступному етапі відібрані праймери застосували для детекції генетичної мінливості клонів.

Підбір відповідних праймерів для виявлення внутрішньосортової варіабельності грунтувався на оцінці міжсортового поліморфізму ДНК. Відібрані довільні праймери мали значення показника «рівень внутрішньовидового поліморфізму ДНК» 60-89%, ISSR-праймери - 57-75%. Показник «рівень внутрішньовидового поліморфізму ДНК» визначено як критерій інформативності праймера. Згідно з одержаними результатами довільні і ISSR-праймери, критерій інформативності яких становить понад 55%, придатні для вивчення внутрішньосортової варіабельності.

Детекція внутрішньосортової генетичної мінливості. За допомогою комбінації pTU3/AluI, 4 довільних і 5 ISSR-праймерів детектовано мінливість клонів сортів Ріпаріа х Рупестріс 101-14, Ріпаріа Глуар де Монпельє, Каберне Совіньон. У клонів сорту Рислінг рейнський спостерігали ідентичні спектри продуктів гібридизації і ампліфікації. В таблицях 1 і 2 наведено поліморфні фрагменти ДНК клонів сорту Ріпаріа х Рупестріс 101-14 і сорту Каберне Совіньон.

У клонів сорту Ріпаріа х Рупестріс 101-14 детектовано 3 поліморфних фрагмента гібридизації ДНК, 5 фрагментів ампліфікації з довільними праймерами, 8 - з ISSR-праймерами. У клонів сорту Каберне Совіньон детектовано 4 поліморфних фрагмента гібридизації ДНК, 5 фрагментів ампліфікації з довільними праймерами, 8 - з ISSR-праймерами.

У клонів сорту Ріпаріа Глуар де Монпельє детектовано 1 поліморфний фрагмент ампліфікації ДНК з довільними праймерами, 4 - з ISSR-праймерами. На рисунках 1 і 2 наведено результати електрофорезу фрагментів ампліфікації сортів Ріпаріа х Рупестріс 101-14 і Каберне Совіньон.

Поліморфні фрагменти ДНК клонів сорту Ріпаріа х Рупестріс 101-14

Згідно з отриманими даними популяція клонів сорту Ріпаріа х Рупестріс 101-14 представлена 2 генотипами, популяція клонів сорту Ріпаріа Глуар де Монпельє - 2 генотипами, популяція клонів сорту Каберне Совіньон - 3 генотипами.

Аналіз зв'язку мінливості фенотипових ознак клонів представлених сортів з поліморфізмом фрагментів ДНК. Клони сортів Ріпаріа х Рупестріс 101-14 та Каберне Совіньон відрізнялись за якісними і кількісними ознаками. Отримані фрагменти ампліфікації і гібридизації розглядали як маркерні ДНК-локуси, а відсутність і присутність - як алельні варіанти маркерних локусів.

Для можливості добору клонів за допомогою молекулярних ДНК-маркерів для якісних ознак проведено кореляційний аналіз зв'язаної мінливості морфологічних ознак з алельними варіантами ДНК-локусів. Для оцінки зв'язку алельних варіантів ДНК-локусів з мінливістю кількісних ознак використано підхід за допомогою критерію достовірності різниці середніх значень кількісних ознак між класами популяцій, утворених алелями маркерних локусів. Для оцінювання зв'язаної варіації фенотипових ознак і прогнозування комплексу ознак у відповідних генотипів клонів даних сортів проведено їх кореляційний аналіз. Закономірності зв'язку даних ДНК-аналізу і фенотипових даних досліджено за 1991-1995 та 2002-2004 рр., у зв'язку з тим, що у фенотипових ознак винограду під впливом різних чинників інколи проявляються модифікації. Роки 1992, 1994, 1995, 2002, 2003 характеризувались посушливими погодними умовами і недостатньою кількість опадів.

У клонів сорту Ріпаріа х Рупестріс 101-14 спостерігалась зв'язана мінливість кількісних ознак «кількість чубуків з куща» та «навантаження кущів пагонами», і якісних ознак «тип квітки» та «забарвлення верхівки пагона». Достовірні коефіцієнти кореляції одержано впродовж двох періодів дослідження. Всі інші фенотипові ознаки варіюють незалежно.

У клонів цього сорту розподіл алельних варіантів ДНК-локусів є однотипним, тому за всіма алельними варіантами визначено однаковий розподіл на групи (табл. 1). До першої групи належать клони 4923, 2382, 832, до другої - 6733, 672, 1182, 22121, 992, 4244, 6114, 12161.

У результаті кореляційного аналізу між алельними варіантами ДНК-локусів і варіаціями морфологічних ознак клонів даного сорту одержано достовірні коефіцієнти кореляції, значення яких становили r = 0,77 (достовірно при Р<0,01). Кожний з варіантів ознак «тип квітки» і «забарвлення верхівки пагона» визначатимуться у клонів сорту певними алельними варіантами ДНК-локусів. Великі позитивні значення коефіцієнтів кореляції свідчать на користь поліморфних фрагментів ДНК як молекулярних маркерів, що представляють можливість для добору відповідних генотипів.

Перша група клонів 4923, 2382, 832 характеризувалась більшими значеннями кількісних ознак, порівняно з другою групою 6733, 672, 1182, 22121, 992, 4244, 6114, 12161. Достовірність різниці середніх значень кількісних ознак «навантаження кущів пагонами», «кількість чубуків з куща», «діаметр чубука», «кількість повних серцевинних променів» двох груп клонів у даного сорту виявлено в 1992, 1994, 1995, 2002, 2003 рр. (табл. 3). Достовірності різниці середніх значень кількісних ознак «прошарки твердого лубу», «відношення діаметра чубука до діаметра серцевини», «сума вуглеводів» двох груп клонів за 1991-1995 и 2002-2004 рр. не отримано.

Характеристика маркерних ДНК-локусів клонів сорту Ріпаріа х Рупестріс 101-14

Згідно з одержаними значеннями t-критерію кожний з алельних варіантів ДНК-локусів (або група локусів) виявляє певну здатність до маркірування локусів цих кількісних ознак (ЛКО) сорту Ріпаріа х Рупестріс 101-14. Отримані дані свідчать про можливість використання поліморфних фрагментів ДНК як молекулярних маркерів для добору і подальшого розмноження перспективних генотипів (за певними кількісними ознаками).

Кореляційний аналіз показав, що у клонів сорту Каберне Совіньон одержано достовірні коефіцієнти кореляції між кількісними ознаками: «маса грона», «маса урожаю з пагона», «продуктивність пагона». При цьому ознака «маса грона» є складником інших ознак «маса урожаю з пагона», «продуктивність пагона». Усі інші фенотипові ознаки варіюють незалежно.

У клонів цього сорту є два типи розподілу алельних варіантів ДНК-локусів і відповідний розподіл на групи (табл. 2). До першого типу належать ПДРФ-локуси, ISSR-локуси, і 4 ДП-локуса (1387 п.н., 539 п.н., 1556 п.н., 699 п.н. (Р14, Р18)). Згідно з першим типом розподілу алельних варіантів ДНК-локусів першу групу становлять клони 2043, 22103, 30251, другу - 441, 1473, 143113, 1441, 1076, ІНРА, ЄНТАВ. До другого типу належить ДП-локус 788 п.н. (Р14). Згідно з цим розподілом ДНК-локусів клони розділилися на групи: перша - ІНРА, ЄНТАВ, друга - 2043, 22103, 30251, 441, 1473, 143113, 1441, 1076.

Кореляційний аналіз показав відсутність кореляції між варіацією морфологічної ознаки і алельними варіантами ДНК-локусів (r₁ = 0,190, P>0,05, r₂ = -0,054, P>0,05), отже, поліморфні фрагменти ДНК клонів сорту Каберне Совіньон не можуть застосовуватись як молекулярні маркери для добору відповідних генотипів за ознакою «форма грона».

Клони даного сорту відрізнялись за кількісними ознаками: «маса грона», «маса урожаю з пагона», «продуктивність пагона», «маса 100 ягід», «концентрація цукру», «кислотність соку». Відповідно до першого варіанту розподілу алельних варіантів ДНК-локусів група клонів 30251, 22103, 2043 характеризувалась вищими значеннями кількісних ознак порівняно з другою групою клонів (за винятком 2004 р.). Достовірність різниці середніх значень за трьома кількісними ознаками «маса урожаю з пагона», «продуктивність пагона», «маса грона» двох груп клонів виявлено в 1992, 1994, 1995, 2002, 2003 рр., ознакою «маса 100 ягід» - в 1995, 2002 рр. (табл. 4).

Достовірність різниці середніх значень за ознакою «концентрація цукру» спостерігали в 1993, 2004 рр. (табл 4). Згідно з другим варіантом розподілу ДНК-локусів перша група клонів (ІНРА, ЄНТАВ) має нижчі показники продуктивності, ніж друга. Достовірність різниці середніх значень за ознакою «концентрація цукру» виявлено тільки в 1993 р., за ознаками «маса урожаю з пагона», «маса грона», «маса 100 ягід», «продуктивність пагона» - тільки в 2003 р.

Згідно з одержаними значеннями t-критерію кожний з алельних варіантів ДНК-локусів (або група локусів) має певну здатність до маркірування ЛКО у сорту Каберне Совіньон. Отримані дані демонструють можливість використання поліморфних фрагментів ДНК як молекулярних маркерів для добору і подальшого розмноження перспективних генотипів даного сорту (за певними кількісними ознаками). При цьому перевагу для відбору мають ДНК-локуси, що визначають перший варіант розподілу клонів на групи.

Характеристика маркерних ДНК-локусів клонів сорту Каберне Совіньон

Проведене дослідження дало можливість запропонувати спосіб добору перспективних клонів сортів винограду. Спосіб добирання клонів сортів винограду за молекулярними ДНК-маркерами полягає в: 1) вивченні генетичної мінливості популяції клонів сортів винограду переважно полілокусними ДНК-системами; 2) підборі праймерів у невеликій групі сортів, до складу яких входять близькоспоріднені сорти; критерій інформативності для праймера має становити понад 55%; 3) вивченні фенотипових ознак у роки з контрастними погодними умовами; 4) проведенні статистичного аналізу зв'язку поліморфізму фрагментів ДНК з варіаціями фенотипових ознак клонів сортів винограду.

На основі проведених досліджень у період 1991-1995 рр. з популяцій клонів підщепного сорту Ріпаріа х Рупестріс 101-14 і технічного сорту Каберне Совіньон виділені перспективні групи клонів. Дані групи клонів використовують для отримання базових і сертифікованих насаджень. Перевірка закономірностей зв'язку даних ДНК-аналізу з даними за фенотипом клонів цих сортів в період 2002-2004 рр. показала, що виявлений зв'язок зберігається. Починаючи з 2000 р. в 5 розсадницьких господарствах України закладено базові і сертифіковані насадження виділених клонів 4923, 832, 2382 сорту Ріпаріа х Рупестріс 101-14, площі яких становлять понад 20 га, що являє значну частину загальної площі насаджень підщепних сортів селекції ННЦ «ІВіВ ім. В.Є. Таїрова» (83 га). Закладають насадження базових маточників виділених клонів 2043, 22103, 30251 технічного сорту Каберне Совіньон нині в трьох розсадницьких господарствах України.

Висновки

1. Детектовано генетичну мінливість клонів підщепних сортів Ріпаріа х Рупестріс 101-14, Ріпаріа Глуар де Монпельє, технічного сорту Каберне Совіньон. Показано, що клони сортів Ріпаріа х Рупестріс 101-14, Ріпаріа Глуар де Монпельє представлено двома групами, сорту Каберне Совіньон - трьома групами.

2. При вивченні кінетики процесу відновлення вторинної структури ДНК винограду сорту Рислінг рейнський встановлено, що малокопійні і унікальні послідовності становлять 59,5%, повторювані послідовності - 40,5%, з яких фракція частих повторів - 11,5%.

3. Створено бібліотеку фрагментів ДНК винограду сорту Рислінг рейнський. Відібрано 25 клонованих послідовностей фракції ДНК, що часто повторюються, проведено аналіз 94 комбінацій проба / фермент. За результатами Саузерн-аналізу комбінації pRr71/EcoRI, pRr133/EcoRI, pRr133/TaqI є перспективними для детекції варіабельності ДНК винограду.

4. На основі аналізу поліморфізму ДНК сортів V. vinifera запропоновано принцип підбору праймерів для детекції внутрішньосортової варіабельності ДНК винограду. Критерієм інформативності довільних і ISSR-праймерів для відбору є рівень поліморфізму ДНК серед сортів, що становить понад 55%.

5. Встановлено, що генетична мінливість клонів досліджених сортів винограду зумовлена поліморфізмом ДНК, виявленим за допомогою методів ПДРФ (комбінація проба / фермент - pTU3/AluI) та ампліфікації з довільними (Р5, Р8, Р14, Р18) і ISSR-праймерами ((GTG)₇A, (ACC)₆G, (GAG)₆C, (AG)₉C, (GA)₉C).

6. На основі статистичного аналізу зв'язку мінливості фенотипових ознак з поліморфізмом фрагментів ДНК клонів сортів Ріпаріа х Рупестріс 101-14 і Каберне Совіньон запропоновано спосіб добору перспективних клонів та клонів з певною морфологією.

Перелік наукових праць, опублікованих за темою дисертації

1. Сиволап Ю.М. Анализ генетических дистанций ПДРФ у винограда / Ю.М. Сиволап, Т.Г. Вербицкая, М.И. Тулаева, И.А. Барышева // Цитология и генетика. - 1993. - №6. - С. 24-29.

Особистий внесок дисертанта: проведено генотипування видів, сортів і клонів винограду ПДРФ-методом за допомогою чотирьох проба / фермент комбінацій. Визначено генетичні дистанції між представленими видами, сортами і клонами. Для подальшої роботи відібрано одну комбінацію проба / фермент.

2. Барышева И.А. Исследование внутрисортовой изменчивости ДНК винограда ПДРФ и ПЦР-методами / И.А. Барышева, М.И. Тулаева, В.С. Чисников // Цитология и генетика. - 2003. - Т. 37. - №6. - С. 31-38.

Особистий внесок дисертанта: проведено детекцію варіабельності клонів сортів винограду за допомогою відібранних комбінації проба / фермент, довільних, ISSR-праймерів. Отримано специфічні ДНК-локуси для клонів кожного сорту. Запропоновано спосіб підбору праймерів для детекції внутрішньосортової мінливості ДНК. Показано ефективність аналізу за допомогою ампліфікації з довільними та ISSR-праймерами порівняно з ПДРФ-аналізом для визначення внутрішньосортової мінливості ДНК.

3. Барышева И.А. ДНК-маркерные системы для идентификации сортов винограда / И.А. Барышева // Физиология и биохимия культурных растений. - 2004. - Т. 36. - №6. - С. 463-477.

4. Баришева І.А. Аналіз молекулярної структури ДНК винограду Рислінг рейнський (Vitis vinifera) / І.А. Баришева // Науковий вісник Національного аграрного університету. - 2006. - №102. - С. 24-30.

5. Баришева І.А. Аналіз зв'язку мінливості фенотипових ознак з поліморфізмом локусів ДНК клонів підщепного сорту винограду Ріпаріа х Рупестріс 101-14 / І.А. Баришева, І.А. Ковальова, М.І. Тулаєва, В.С.Чісніков // Науковий вісник Національного аграрного університету. - 2007. - №105. - С. 57 - 66.

Особистий внесок дисертанта: проведено статистичний аналіз зв'язку мінливості фенотипових ознак з даними ДНК-аналізу підщепного сорту Ріпаріа х Рупестріс 101-14. Одержано достовірні коефіцієнти кореляції між якісними ознаками «тип квітки», «забарвлення верхівки пагона» і поліморфними фрагментами ДНК та достовірність різниці середніх значень кількісних ознак у груп клонів підщепного сорту, утворених на основі ДНК-аналізу. Визначено можливість добору клонів перспективних за врожайністю та певною морфологією.

6. Вербицкая Т.Г. ПДРФ-анализ различных генотипов винорада / Т.Г. Вербицкая, Ю.М. Сиволап, М.И. Тулаева, И.А. Барышева // Управление генетической изменчивостью сельскохозяйственных растений: материалы международного симпозиума; 29.09. - 01.10. 1992 г.: тези докл. - Ялта, 1992. - С. 8.

Особистий внесок дисертанта: проведено молекулярно-генетичний аналіз видів, сортів і клонів винограду ПДРФ-методом. Виявлено специфічні фрагменти ДНК у досліджених видів і сортів.

7. Barysheva I. RAPD-analysis of different genotipes of grape / I. Barysheva, T. Verbiskaya, Yu. Sivolap // Plant Genom ІІІ: The international conference on the status of plant genome research; 15-19 jan. 1995. - San Diego, USA, 1995. - Р. 83.

Особистий внесок дисертанта: проведено молекулярно-генетичний аналіз видів, сортів і клонів винограду методом ампліфікації з довільними праймерами. Визначено генетичні дистанції між представленими видами, сортами і клонами.

8. Баришева І.А. Дослідження міжвидової та внутрішньовидової мінливості винограду з допомогою ПЛР / І.А. Баришева, Т.Г. Вербицька, Ю.М. Сиволап // Наслідки наукових пошуків молодих вчених-аграрників в умовах реформування АПК: Матеріали міжнародної науково-практичної конференції молодих вчених та спеціалістів. Частина І; 18 січ. 1996 р.: тези докл. - Чабани, 1996. - С. 219.

Особистий внесок дисертанта: проведено генотипування клонів винограду методом ампліфікації з довільними праймерами. Виявлено можливість детекції внутрішньосортової мінливості даним типом метода ампліфікації. Отримано специфічні фрагменти ДНК для різних генотипів.

9. Балашова И.А. Молекулярно-генетический полиморфизм винограда / И.А. Балашова, И.А. Барышева, Ю.М. Сиволап // Использование ПЦР-анализа в генетико-селекционых исследованиях: науч.-метод. руков.; под ред. Ю.М. Сиволапа. - К: Аграрна наука, 1998. - С. 116-120.

Особистий внесок дисертанта: перевірено 22 довільних праймера для виявлення молекулярно-генетичного поліморфізму клонів винограду. Відібрано 7 для детекції внутрішньосортової мінливості.

10. Барышева И.А. Оценка сопряженности ДНК-маркеров с морфологическими и хозяйственными признаками клонов сортов винограда Рипариа х Рупестрис 101-14 и Каберене Совиньон / И.А. Барышева // Пути повышения эффективности хранения и переработки сельскохозяйственной продукции: сб. научных статей. - ОЦНТЭИ, Одесса, 1999. - С. 15-20.

Размещено на Allbest.ru