Формування біоплівки моно- та бінарною культурою thiobacillus thioparus та Stenotrophomonas maltophilia

Размещено на http://www.allbest.ru/

національна академія наук україни

Інститут мікробіології і вірусології

ім. Д.К. заболотного

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Формування біоплівки моно- та бінарною культурою thiobacillus thioparus та Stenotrophomonas maltophilia

Борецька Марія Олександрівна

Київ - 2008

Анотація

Борецька М.О. Формування біоплівки моно- та бінарною культурою Thiobacillus thioparus і Stenotrophomonas maltophilia. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.07 - мікробіологія. - Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, Київ, 2008.

Дисертація присвячена вивченню особливостей формування та функціонування біоплівки моно- та бінарних культур корозійно небезпечних бактерій Thiobacillus thioparus 4М та їх гетеротрофного супутника Stenotrophomonas maltophilia 13М. Показано, що корозійно небезпечні ацидофобні тіонові бактерії T.thioparus 4М мешкають переважно у твердій фазі ґрунту, прилеглого до тунелів київського метрополітену. Дослідження адгезивних властивостей T.thioparus 4М, S.maltophilia 13М та їх асоціацій показало, що при сумісному культивування кількість адгезованих клітин до поверхні збільшується в порівнянні із чистою культурою T.thioparus 4М. Проведено спостереження структури біоплівки моно- та бінарних культур за допомогою методів растрової та конфокальної лазерної сканувальної мікроскопії. Відмічено складну структуру бінарної біоплівки із порожнинами, клітинами, що занурені у екзополімери. Визначено, що присутність маловуглецевої сталі впливає на моносахаридний, жирнокислотний склад екзополімеру моно- та бінарних культур. Встановлено, що для всіх варіантів змішаних культур результуюча швидкість корозії перевищувала суму швидкостей, що була спричинена впливом відповідних індивідуальних культур. Створено гіпотетичну модель біоплівки T.thioparus 4М, S.maltophilia 13М, що дозволяє узагальнити та візуалізувати отримані дані щодо досліджуваних культур і, у подальшому, прогнозувати прояв різних механізмів мікробної корозії та агресивності даного угруповання.

Ключові слова: біоплівка, екзополімери, мікробна корозія, Thiobacillus thioparus, Stenotrophomonas maltophilia.

Аннотация

Борецкая М.А. Формирование биопленки моно- и бинарной культурой Thiobacillus thioparus и Stenotrophomonas maltophilia. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.07 - микробиология. - Институт микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного НАН Украины, Киев, 2008.

Диссертация посвящена изучению особенностей формирования и функционирования биопленки моно- и бинарных культур коррозионно опасных бактерий Thiobacillus thioparus 4М и их гетеротрофного спутника Stenotrophomonas maltophilia 13М, которые выделены из-за туннелей киевского метрополитена. Показано, что такое сообщество микроорганизмов существует преимущественно в твердых фазах почвы. Исследование адгезивних свойств T.thioparus 4М, S.maltophilia 13М и их ассоциаций показало, что при совмесном культивировании количество адгезированых клеток на поверхности увеличивается в сравнении с монокультурой T.thioparus 4М почти в пять раз. Благодаря методу растровой электронной микроскопии отмечена сложная и неоднородная структура биопленки бинарных культур в сравнении с монокультурами, сформироваными на металлических матрицах. Так, обнаружены пористые образования в толще биопленки, шарообразные структуры, предположительно колонии клеток, на ее поверхности. Данные элементного анализа благодаря выше указанному методу в десяти точках профиля биопленки свидетельствуют о наибольшем количестве серы (12% от суммы исследованных элементов в данном образце) в смешанной культуре по сравнению с биопленкой монокультур. Исследование нативных биопленок бинарной культуры на металлических матрицах методом конфокальной лазерной сканирующей микроскопии показало, что они сформированы колониями клеток, расположенных на расстоянии 2-4 мкм, погруженных в экзополимерный матрикс.

Проведено исследование моносахаридного состава экзополимерного комплекса моно- и бинарных культур разных моделей роста. Показано, что для биопленки монокультур моносахаридний состав экзополимера качественно одинаковый с доминированием глюкозы. Биопленка бинарной культуры отличается разнообразием моносахаридного состава, а именно присутствуют 8 моносахаридов, 4 из которых (рамноза, рибоза, ксилоза, галактоза) не были отмечены в составе экзополимера биопленки монокультур. Впервые для такой группы бактерий показано, что наличие малоуглеродистой стали в среде влияет на жирнокислотний состав экзополимера разных моделей роста. Было отмечено присутствие ненасыщенных жирных кислот как для моно- так и для бинарной культуры биопленки и планктона. В экзополимере биопленки бинарных культур не обнаружено жирных кислот 2ОН С_16:0 и C_20:0, в отличие от такого для монокультур. Комплексное культивирование тионовых бактерий и гетеротрофного спутника влияет на продукцию жирных кислот в экзополимере, что возможно способствует, как было показано выше, формированию более стойкой биопленки.

Исследованы коррозионные свойства T.thioparus 4М, S.maltophilia 13М в комплексе с коррозионно опасными бактериями Desulfovibrio desulfuricans Киев-45. Для всех вариантов смешанных культур T.thioparus 4М + S.maltophilia 13М + D.desulfuricans К-45 результирующая скорость коррозии превышает сумму таких скоростей под воздействием индивидуальных культур. В связи с полученными данными, изучено влияние экзополимера на скорость микробной коррозии. Переход клеток от свободно плавающего состояния до биопленки способствует увеличению удельной продукции экзополимера клетками, а так же связано с увеличением скорости коррозии. Относительная продукция углеводов в бинарной культуре биопленки была наименьшей, в сравнении с такой для монокультур.

Построена гипотетическая модель биопленки, позволяющая обобщить и визуализировать полученные данные относительно исследуемых культур и в дальнейшем прогнозировать проявления различных механизмов микробной коррозии и агрессивности такой ассоциации.

Ключевые слова: биопленка, экзополимеры, микробная коррозия, Thiobacillus thioparus, Stenotrophomonas maltophilia.

Summary

Boretska M.O. Biofilm formation by mono- and binary culture of Thiobacillus thioparus and Stenotrophomonas maltophilia

The thesis for obtaining the degree of candidate of biological science, speciality 03.00.07 - microbiology. - D.K. Zabolotny Institute of microbiology and virology. - Kyiv. - 2008.

The dissertation is devoted studying of features of formation and biofilm functioning mono- and binary cultures Thiobacillus thioparus 4М and heterotrophic companion Stenotrophomonas maltophilia 13М. It is shown, that corrosion dangerous acidophobic thiobacteria T.thioparus exist mainly in firm phases of the soil which adjoins to tunnels of the Kiev underground. Research adhesive properties T.thioparus 4М, S.maltophilia 13М and their associations has shown, that at mixed cultivation a quantity of adhisiv cells to a surface increases in comparison with pure culture T.thioparus 4М. Supervision of structure of a biofilm mono-and binary cultures by means of REMMA and CLSM is spent. It is noted difficult structure of a binary biofilm (porosity, cells are shipped in exopolymer). It is defined, that mild steel are influence on monosaccharid and fatty acid structure of exopolymer mono- and binary cultures.

For all variants mixed cultures a resultant speed of corrosion exceeds the sum of speeds under the influence of monocultures. It is created hypothetical model of biofilm T.thioparus 4М and S.maltophilia 13М, that allows to generalize and visualize the obtained data concerning investigated cultures. Allows to predict displays of different mechanisms of microbic corrosion and aggression of the given community.

Key words: biofilm, exopolymers, microbial corrosion, Thiobacillus thioparus, Stenotrophomonas maltophilia.

1. Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Мікробна корозія підземних металевих споруд є одним з найбільш небезпечних і розповсюджених видів корозії. Від неї потерпають тунелі, трубопроводи, кабелі зв'язку, цистерни та ін. Таку корозію спричиняють бактерії циклу сірки, що утворюють біоплівки, в яких відбувається біоелектрохімічний процес як наслідок біомінералізації з утворенням сульфідів та елементної сірки (Lewandowski Z., 2000; O'tool G.A., 2000; Козлова І.П. та ін., 2002; Андреюк К.І. та ін., 2005). Аналогічні процеси відбуваються на поверхні тунелів київського метрополітену, що пролягають у корозійно небезпечних геологічних відкладах палеогену та неогену. Такі відклади являють собою екосистему, де функціонують сульфатвідновлювальні та тіонові бактерії, у т.ч. ацидофобні Thiobacillus thioparus. Геохімічною функцією T.thioparus є утворення елементної сірки як в геологічних відкладах, так і в біоплівці на поверхні металу, де, згідно сучасним уявленням, відбуваються процеси мікробної корозії.

За визначенням (Beveridge J. et al., 1997), біоплівка - це сукупність мікроорганізмів та їх метаболітів на твердій поверхні. Екзополімери як метаболіти біоплівки обумовлюють її міцність і стійкість завдяки наявності вуглеводів, білків, ліпідів, неорганічних елементів, таких як елементна сірка. У корозійному угрупованні обов'язковим супутником T.thioparus є гетеротрофні бактерії Stenotrophomonas maltophilia (Антоновская Н., 1986), які продукують слизові сполуки і сприяють формуванню змішаної біоплівки (Sutherland I., 1997). Дані щодо формування біоплівки T.thioparus і S.maltophilia та їх корозійного впливу на поверхню маловуглецевої сталі в літературі відсутні.

Співробітниками Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України показано, що екзополімери бактерій циклу сірки відіграють вирішальну роль у визначенні їх корозійної активності і запропоновано експрес-метод дослідження агресивності біоплівок корозійно небезпечних бактерій за допомогою тонких металевих матриць (Андреюк К.І. та ін., 2005).

Використання сучасних методів дослідження біоплівок - растрова електронна та конфокальна лазерна сканувальна мікроскопія у комплексі з тонкими металевими матрицями є необхідним для дослідження структури біоплівок культур T.thioparus і S. maltophilia, їх архітектоніки і елементного складу. Проведення такої роботи є важливим і актуальним з точки зору пізнання як фундаментальних закономірностей функціонування бактерій ? збудників корозії, так і в прикладному аспекті запобігання негативного впливу мікробної корозії на металеві споруди.

Зв'язок роботи з науковими програмами. Представлені дослідження є частиною роботи, що проводилась у відділі загальної та ґрунтової мікробіології Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України в рамках держбюджетної теми 2.28.9.10 „Мікробно індукована корозія в біоплівці як модельна система для вивчення метал-мікробної взаємодії”.

Мета та задачі дослідження. Метою роботи було дослідити особливості формування біоплівки моно- і бінарною культурою T.thioparus 4М та S.maltophilia 13М на поверхні маловуглецевої сталі. Для досягнення цієї мети були поставлені такі задачі:

- виділити чисті культури T.thioparus та S.maltophilia з ґрунтів та ґрунтових вод поза тунельною обкладинкою київського метрополітену;

- дослідити адгезивні властивості монокультур T.thioparus та S.maltophilia і їх асоціацій;

- вивчити мікроструктуру біоплівки культур T.thioparus та S.maltophilia, що сформована на тонких металевих матрицях;

- визначити елементний та біохімічний склад екзополімерного комплексу монокультур T.thioparus та S.maltophilia та їх асоціацій за умов планктонної та біоплівкової форми росту;

- визначити корозійну активність моно- і бінарної культури досліджуваних бактерій з використанням сталевих пластин та стрижнів;

- побудувати гіпотетичну модель біоплівки;

Об'єкти дослідження - ацидофобні тіонові бактерії Thiobacillus thioparus 4М, а також гетеротрофні бактерії Stenotrophomonas maltophilia 13М, що були виділені із ґрунтів з-за тунельної обкладинки київського метрополітену; сульфатвідновлювальні бактерії Desulfovibrio desulfuricans Київ - 45 (колекція відділу загальної та ґрунтової мікробіології, ІМВ НАНУ).

Предмет дослідження - вивчення особливостей структури і функції біоплівок, сформованих монокультурами T.thioparus 4М та S.maltophilia 13М і їх асоціацій.

Методи дослідження - мікробіологічні, фізичні, біохімічні, статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше встановлено особливості формування біоплівки моно- і бінарними культурами T.thioparus 4М та S.maltophilia 13М на поверхні мало вуглецевої сталі, а саме:

· показано, що біоплівки монокультур T.thioparus 4М та S.maltophilia 13М відрізняються від таких у асоціації на поверхні маловуглецевої сталі;

· комплексне використання конфокального лазерного сканувального мікроскопу (КЛСМ), растрового електронного мікроскопу-мікроаналізатору (РЕММА) та тонких металевих матриць дозволило вперше встановити суттєві розбіжності у структурі, біохімічному і елементному складі біоплівок T.thioparus 4М та S.maltophilia 13М;

· виявлено більш структуровану біоплівку бінарної культури, якій притаманне формування конгломератів клітин, оточених екзосполуками з підвищеним вмістом сірки;

· встановлено, що бінарна культура досліджуваних бактерій більш корозійно активна у порівнянні із дією монокультур на зразки маловуглецевої сталі; на основі отриманих даних було запропоновано гіпотетичну модель біоплівки, що формується T.thioparus та S.maltophilia та їх асоціацією;

Практичне значення одержаних результатів. Запропоновано новий комплекс мікроскопічних методів дослідження РЕММА та КЛСМ із використанням тонких металевих матриць, що дозволяє визначити структуру, елементний склад, архітектоніку біоплівки, оцінити агресивність ізольованих культур і може бути використана для прогнозування корозійно небезпечних ситуацій. Матеріали дисертації використані у спецкурсі „Біопошкодження” біологічних факультетів вищих навчальних закладів України.

Особистий внесок здобувача. Дисертація є самостійною роботою автора. Автором було особисто виділено чисті культури бактерій циклу сірки та ідентифікована їх родова і видова належність, досліджено етапи формування біоплівки на модельних поверхнях (скло, маловуглецева сталь), виділено екзополімерні комплекси моно- та бінарної культури та визначено їх моносахаридний та жирнокислотний склад, проведено визначення корозійної активності бактерій циклу сірки на зразках маловуглецевої сталі.

Автором було проаналізовано наукову літературу з даної проблеми.

Напилення металевих матриць було проведено в Інституті проблем матеріалознавства НАН України спільно із к.т.н. Андрєєвою А.Ф., хімічний аналіз біоплівки проводили на базі Національного технічного університету „Київського політехнічного інституту”, РЕММА (РЕМ 103, Україна), мікроскопіювання біоплівки за допомогою КЛСМ (CLSM Pascal 5, Carl Zeiss, Німеччина) було проведено на базі Інституту ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України з люб'язного дозволу чл.-кор. НАН України, д.б.н. Кордюм Є.Л.

Планування основних напрямків роботи та обговорення її результатів проходило за участі наукового керівника д.б.н. Козлової І.П.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації доповідались та були представлені на Х з'їзді Товариства мікробіологів України (Україна, Одеса, 2004 р.); І та ІІ міжнародній конференції студентів та аспірантів «Молодь і поступ в біології» (Україна, Львів-2005, 2006); 9-ій міжнародній Пущинській школі-конференції молодих вчених «Биология - наука ХХ1 века» (Росія, Пущино, 2005); ІІ міжнародній науковій конференції молодих учених „Молодь і досягнення науки у вирішенні проблем сучасності” (біологія, географія, оптика, фізика) (Україна, Чернівці, 2006; доповідь була відмічена грамотою); 13-IBBS Congress (Іспанія, м. Мадрид, 2005); 16 International Corrosion Congress (Китай, м. Бейджин, 2005); науковій конференції-конкурсі молодих вчених ІМВ НАН України (Україна, Київ, 2004, 2005; доповіді були відмічена премією); ІІ міжнародній конференції молодих вчених „Біологія: від молекули до біосфери” (Україна, Харків, 2007).

Публікації. За результатами дисертації опубліковано 14 наукових праць, з них 5 статей у профільних журналах; 9 - у збірниках тез.

Структура та обсяг роботи. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, методів досліджень, результатів досліджень та їх обговорення, висновків та списку використаних джерел 204, з яких 33 кирилицею. Робота включає 30 рисунків та 6 таблиць, додатки.

2. Основний зміст роботи

Огляд літератури. У першому розділі огляду літератури розглянуті сучасні уявлення щодо поняття та основні гіпотези формування і функціонування біоплівки. Другий розділ присвячений етапам адгезії, колонізації та формуванню зрілої біоплівки на поверхні, генетичній регуляції цього процесу. Третій розділ літературного огляду присвячений сучасним уявленням щодо мікробної корозії анаеробного та аеробного типу.

Матеріали та методи досліджень

Об'єктами досліджень були ацидофобні тіонові бактерії Thiobacillus thioparus 4М та їх гетеротрофний супутник Stenotrophomonas maltophilia 13М, які були виділені з твердих фракцій з-за тунельної обкладинки київського метрополітену на ділянках станцій “Контрактова площа”-“Тараса Шевченка” і станцій метро “Тараса Шевченка”-“Петрівка”. У досліді з визначення корозійної активності бактерій циклу сірки було використано Desulfovibrio desulfuricans Київ - 45 (колекція відділу загальної та ґрунтової мікробіології).

Методи досліджень. Штам T.thioparus 4М виділяли методом розведень на рідкому середовищі Бейєрінка із подальшим висівом на тіосульфатний агар при наявності у культурі характерної появи елементної сірки білого чи жовтого кольору. Окремі колонії T.thioparus 4М пересівали на середовище МПА та картопляний агар для перевірки чистоти виділеної культури автотрофних бактерій. Виділення гетеротрофних супутників T.thioparus 4М із зразків ґрунту та ґрунтових вод проводили на МПА та картопляного агару методом розведень та штриха, що виснажується, із подальшим виділенням окремих колоній. Для ідентифікації S.maltophilia 13М використовували середовища, що описані в літературі (Смирнов В.В. и др., 1990).

Здатність клітин до адгезії визначали на предметних скельцях як модельній поверхні (густина суспензії T.thioparus 4М - 1·10³ кл/см², S.maltophilia 13М - 1·10⁵ кл/см²). Скельця експонувалися в середовищі Бейєрінка протягом 5, 15, 30 хвилин та 1, 2, 4, 6, 8 годин та 1-7 діб за температури 28⁰С. Дослід було проведено у 4-кратній повторності.

Дослідження структури біоплівок, сформованих культурами T.thioparus 4М, S.maltophilia 13М на металевих матрицях, проводили за допомогою РЕММА (РЕМ 103, Україна) та КЛСМ (CLSM Pascal 5, Carl Zeiss, Німеччина). Дослідження за допомогою РЕММА проводилися з метою збереження природної структури біоплівки, тому зразки попередньо відмивали та висушували при кімнатній температурі та аналізували без застосування напилення. Аналіз проводили у десяти точках за допомогою рентгенівського спектрометра з дисперсією по енергії з діапазоном чутливості від натрію до урану. При застосуванні КЛСМ об'єкти мікроскопіювали за довжини хвилі лазерного випромінювання 480-700 нм без застосування барвників. З метою отримання даних щодо розташування клітин та екзополімерів у товщі біоплівки на осі координат XZ, відскановано 18-24 шарів нативної біоплівки за товщини зрізу від 2 до 4 мкм із застосуванням програми мікроскопу.

Вміст вуглеводів у екзополімерному комплексі культур визначали колориметричним методом за реакцією з фенолом та сірчаною кислотою (Dubois M. et al., 1956), уронових кислот - за реакцією з карбазолом за методом Dische в модифікації Bitter та Muir (Bitter T. et al., 1962). Вміст зазначених компонентів виражали в% до маси умовно сухої речовини. За умовно суху приймали речовину, що не втрачає маси у процесі висушування у вакуумі при 40?С. Екзополімерний комплекс клітин T.thioparus 4М, S.maltophilia 13М планктонної та біоплівкової форми росту осаджували із супернатанту трикратним об'ємом ацетону за температури 4?С згідно загальноприйнятій методиці (Захарова И.Я. та ін., 1982). Кількість екзополімеру визначали ваговим методом, після висушування при 103-105?С в сушильній шафі до постійної маси. Для проведення хімічних досліджень полімерів бактерій циклу сірки осад після видалення ацетону діалізували проти дистильованої води впродовж 3 діб, потім висушували ліофільно. Визначення моносахаридного складу проводили за методом Albersheim (Albersheim P. et al., 1967) на хромато-маспектрометричній системі Agilent 6890N/5973 inert. Колонка капілярна DB-225 MS 30 мм·0,25мм·0,25мкм. Температурний режим ізокритичний 220⁰С, газ-носій гелій, швидкість протоку 1 мл / хв. Температура випаровування 250 ⁰С.

Виділення екзоліпополімерів T.thioparus 4М, S.maltophilia 13М проводили за методикою (Kefner J. et al., 1963). Визначення метилових ефірів жирних кислот екзоліпополімерного комплексу проводили на хромато-масспектрометричній системі Agilent 6890 N/ 5973 inert. Колонка капілярна HP-5 MS довжина 30 мм, внутрішній діаметр 0,25 мм, товщина фази 0,25 мкм. Температурний режим 150-250 ⁰С, градієнт температури 4 ⁰С/хв., газ-носій - гелій, швидкість протоку через колонку 1,2 мл/хв. Температура випаровування 250 ⁰С, з поділом потоку 1:100. Обробку результатів проводили за допомогою персонального комп'ютера.

Корозійну активність моно- та бінарної культури T.thioparus 4М, S.maltophilia 13М визначали гравіметричним методом (Асауленко Л.Г. та інш., 2004). Металеві матриці отримали шляхом напилення. Мішенню для матриці було обрано сталь марки ВСт3СП, що використовується для виготовлення зварних та безшовних газопроводів. Сталь напилювали у вигляді тонких плівок на скляні пластинки марки К-8 розміром 27Ч76 мм. Напилення проводили у вакуумній установці марки УРМЗ3.279.036 з використанням магнетронного пристрою типу УМ-4 на постійному струмі (Андреева А.Ф. и др., 2003).

Для статистичного аналізу результатів досліджень використовували методи варіаційної статистики (Лакин Г.Ф., 1990). Усі отримані результати були оброблені статистично за допомогою пакету програм Exсel 2002.

Формування біоплівки культурами бактерій циклу сірки. В пробах ґрунту, що були відібрані з-за тунельної обкладинки київського метрополітену, виявлено тіонові бактерії Thiobacillus thioparus 4М, які росли на середовищі Бейєрінка та активно утворювали елементну сірку. Виділено і протестовано 14 штамів гетеротрофних грамнегативних бактерій - супутників тіонових, що були оксидазонегативні, розрізнялись за здатністю засвоювали метіонін, розкладати аргінін, гідролізувати крохмаль, ескулін, здатністю до денітрифікації, засвоювати лізин. За вказаними ознаками виділені штами ідентифіковані як Stenotrophomonas maltophilia 13М.

Адгезію та формування колоній на склі моно- та бінарними культурами бактерій циклу сірки спостерігали після 5 хв. інкубації (рис.1). Через 8 год. культивування кількість адгезованих клітин T.thioparus 4М збільшувалась майже у 2 рази. Інкубація досліджених бактерій протягом 6 - 8 год. супроводжувалася зростанням кількості адгезованих клітин як у моно-, так і у бінарній культурах. На проміжку часу між 1 та 2 годинами інкубації відмічали формування конгломератів, тобто формування біоплівки (рис. 1, відмічено стрілкою). При сумісному культивуванні T.thioparus 4М і S.maltophilia 13М відмічено, що колонізація поверхні майже у 5 разів вища в порівнянні з монокультурою T.thioparus 4М. Наступним завданням було дослідити здатність T.thioparus 4М, S.maltophilia 13М формувати біоплівку на поверхні скла протягом 7 діб. Чисельність клітин T.thioparus 4М, які були прикріплені до скла протягом 7 діб не перевищувала 10·10⁴ кл/см², і була максимальною на четверту добу культивування. Для монокультури S.maltophilia 13М було відмічено поступове зниження кількості прикріплених клітин із максимальною чисельністю 22,910,75·10⁴ кл/см² на першу добу культивування та до 11,920,90·10⁴ кл/см² на сьому добу.

Отримані результати дозволяють припустити, що T.thioparus формує у природі біоплівку завдяки властивості S.maltophilia продукувати екзополімерні клейкі сполуки. Максимальна кількість адгезованих клітин, які формують біоплівку, спостерігається на четверту добу культивування, тобто асоційована біоплівка найбільш активна саме у цей проміжок часу.

В зв'язку з цим було доцільним вивчити структуру сформованої біоплівки більш детально.

Використання РЕММА дозволило дослідити структуру біоплівок, які сформовані на металевих матрицях: товщину, наявність порожнин, а також її елементний склад. Товщина біоплівки монокультур T.thioparus 4М та S.maltophilia 13М сягала у середньому 94 мкм та 34 мкм відповідно (рис. 2, А, В). Структура біоплівки S.maltophilia 13М (рис. 2, В), мала розвинений рельєф: були присутні поодинокі порожнини, внутрішня структура зерниста. Згідно даних літератури, така біоплівка містить переважно екзополімери (Christensen B., 1989). Біоплівка, що сформована бінарною культурою T.thioparus 4М, S.maltophilia 13М, мала товщину у середньому 53 мкм (рис.2, С). Структура цієї біоплівки була гетерогенна, поверхня нерівномірна, наявні порожнини за розмірами були значно більші, ніж у монокультур. Порожнини, що спостерігалися, подібні тим, які були описані Lewandowski (Lewandowski Z., 2000). За допомогою РЕММА був також проведений елементний аналіз біоплівок. Зважаючи на важливість сірки як корозійно активного елементу, розглянуто її вміст у десяти точках профілю моно- та бінарної біоплівки. У біоплівці бінарної культури T.thioparus 4М, S.maltophilia 13М вміст сірки та сірковмісних сполук складає у середньому 12% від загальної кількості визначених елементів в даному зразку, в порівнянні з чистою культурою T.thioparus 4М - 7,74%, S.maltophilia 13М- 1,38%.

Спостереження фронтального рельєфу біоплівок на металевих матрицях були проведені за умови дослідження на ділянці загальною площею 160х160 мкм. Біоплівка T.thioparus 4М, мала вигляд дрібнозернистої маси. Елементний аналіз площини методом РЕММА показав присутність ділянок з хаотичними відкладеннями сірки, що складала у перерахунку на вибрану площу поверхні 1,72% від загальної кількості визначених елементів. Біоплівка S.maltophilia 13М візуально відрізнялась за структурою від такої T.thioparus 13М, мала вигляд пухкої маси. Така структура обумовлена слизовими органічними утвореннями, продукування яких властиве досліджуваній культурі.

Загальний вміст сірки складав 1,25% у перерахунку на вибрану площу поверхні. Для асоціації T.thioparus 4М, S.maltophilia 13М була характерна кількість сірки 2,68% на площу поверхні та структуризація цього елементу у вигляді кулькоподібних конгломератів (кулькоподібні утворення - 1,28%, інші структури - 0,68% сірки від загальної кількості визначених елементів). Отже, сірка продукується T.thioparus 4М і накопичується у товщі біоплівки бінарних культур та фіксується завдяки значній продукції екзосполук S.maltophilia 13М.

Мікроскопіювання за допомогою КЛСМ дало змогу спостерігати нативну біоплівку T.thioparus 4М на металевій матриці. Біоплівка містила незначні екзосполуки та поодинокі колонії, що були розташовані на відстані близько 30 мкм одна від одної.

Біоплівка, сформована монокультурою S.maltophilia 13М, містила переважну кількість екзосполук, які мали слабку автолюмінісценцію і вигляд зернистої структури з включенням поодиноких колоній, розташованих на відстані у середньому 130 мкм. Пошарове сканування такої біоплівки показало, що екзосполуки з поодинокими колоніями повністю покривають поверхню, а окремі колонії занурені у цей матрикс. Отримані дані корелюють з даними літератури (Christensen B., 1989; Fletcher M., 1979; Ford T., et al., 1990). Дослідження бінарної біоплівки показало велике скупчення колоній бактерій на відстані майже 2-4 мкм одна від одної, колонії занурені в об'ємний матрикс на глибині у середньому 21 мкм при загальній товщині зрізу у середньому 34 мкм. Отже, вперше застосований комплексний підхід з використанням металевих матриць та методів РЕММА і КЛСМ дає можливість визначити структуру та елементний склад біоплівки моно- та бінарних культур T.thioparus 4М, S.maltophilia 13М.

Дослідження екзополімерного комплексу T.thioparus 4М, S.maltophilia 13М в умовах планктонної та біоплівкової форм росту. Як зазначено у літературі, склад екзополімерного комплексу може змінюватися в залежності від видового складу, умов існування, часу генерації біоплівки, а також відрізнятися у планктонних та біоплівкових клітин одного штаму (Lewandowski Z., 2000). Для розуміння механізмів взаємодії угруповання клітин T.thioparus 4М, S.maltophilia 13М та його вплив на метал, було доцільно дослідити компонентний склад та вплив продукції екзополімерів біоплівки на швидкість мікробної корозії.

Заслуговує на увагу факт, що для біоплівкової форми росту моносахаридний склад екзополімерного комплексу монокультур T.thioparus 4М, S.maltophilia 13М виявився різним в кількісному співвідношенні фукози, арабінози та манози.

Екзополімери бінарної культури T.thioparus 4М, S.maltophilia 13М за умов біоплівкової форми росту відрізняються різноманітністю моносахаридного складу. Для полімеру асоційованої біоплівки відмічено присутність чотирьох моносахаридів: фукоза, рибоза, маноза, галактоза, які не виявлені у планктонній формі. Найбільший відсоток у складі цього екзополісахариду належить галактозі (33,2% від загальної кількості визначених моносахаридів).

При порівнянні моносахаридного складу екзополімерного комплексу моно- та бінарної культури T.thioparus 4М, S.maltophilia 13М біоплівкової моделі росту слід відмітити утворення таких моносахаридів, як рамноза, рибоза, ксилоза, галактоза у екзополімері бінарних культур на відміну від монокультури T.thioparus 4М, S.maltophilia 13М. Отже, можна констатувати залежність моносахаридного складу екзополімеру бактерій від моделі росту клітин. Такий висновок треба враховувати при подальших дослідженнях корозійно небезпечних асоціацій саме у біоплівках. Як видно з отриманих даних, суттєвим чинником, що впливає на якісний склад моносахаридів, є наявність маловуглецевої сталі. Можливо, в процесі її розчинення у середовище переходять іони деяких металів, що входять до складу сталі, наприклад іони Fe²⁺. Визначення Fe в культуральному середовищі різних варіантів досліду за присутності сталевих зразків методом РЕММА показало наступний його вміст: S.maltophilia 13М - 0, 99%, T.thioparus 4М - 0, 83%, асоціація T.thioparus 4М і S.maltophilia 13М - 0, 32% від загального вмісту визначених елементів.

Можна припустити, що біоплівка, сформована T.thioparus 4М, S.maltophilia 13М, активніше поглинає іони заліза із середовища і утримує їх за рахунок утворених екзополімерів. Зокрема, I.Beech показала, що іони Fe³⁺ зв'язували тільки ті екзополімери Desulfovibrio indonensis, які росли за присутності металу (Beech I.B. et al, 1999).

Вміст уронових кислот у екзополімерному комплексі моно- та бінарної культури T.thioparus 4М, S.maltophilia 13М не перевищував 0,1% від загальної кількості екзополімерного комплексу як для планктону, так і для біоплівки, за виключенням таких варіантів як S.maltophilia 13М (планктон без маловуглецевої сталі) та T.thioparus 4М (планктонна форма росту+метал) - майже 0,53% та 0,16% відповідно.

За біоплівкової форми росту T.thioparus 4М екзополімер містив п'ять жирних кислот (С_16:0- 15,9±0,4%; 2ОНС_16:0 - 12,3±0,7%; С_18:0 - 3,7±0,5%; Сis-С_18:1 - 23,4±0,8%; C_20:0 - 44,7±0,5% у відсотках до суми площ піків)_, серед яких відмічено одну ненасичену. За даними літератури (Рубан Е.Л., 1977, Fulko A.J., 1983), присутність ненасичених жирних кислот у полімерному комплексі сприяє збільшенню його активності, що направлена на зв'язування із вуглеводами, білками та іншими полімерами. У випадку формування біоплівки така властивість екзоліпополімеру може сприяти зміцненню структури матриксу. У складі екзополімеру біоплівки S.maltophilia 13М - десять кислот, серед яких були присутні ненасичені кислоти С_16:1 - 7,6±1,033%, Сis-С_18:1 - 10,4±0,6%, C_18:2 - 10,4±0,6% до загальної суми площ піків. Отже, внесення сталевого зразку у середовище відіграє суттєву роль у зміні жирнокислотного складу монокультур.

За умови біоплівкової моделі росту асоціації T.thioparus 4М та S.maltophilia 13М у екзополімері, на відміну від полімеру обох монокультур, не відмічено синтез 2ОН С_16:0 та С_20:0 кислот. Можливо, комплексне культивування тіонових бактерій та гетеротрофного асоціанта впливає на продукування жирних кислот у екзополімерному комплексі.

Дослідження швидкості корозії маловуглецевої сталі під впливом бактерій циклу сірки. Для дослідження швидкості корозії маловуглецевої сталі використовували металеві стрижні. Для всіх варіантів асоційованих культур T.thioparus 4М +S.maltophilia 13М, D.desulfuricans К-45 +T.thioparus 4М, T.thioparus 4М +S.maltophilia 13М +D.desulfuricans К-45 результуюча швидкість корозії перевищувала суму швидкостей, що була спричинена впливом відповідних індивідуальних культур. Так, для суміші T.thioparus 4М, S.maltophilia 13М це підсилення складало 12%, для пари D.desulfuricans К-45 та T.thioparus 4М - 30%, а для всіх трьох культур одночасно - 63%.

Отже, можна стверджувати, що при сумісному впливі на металеві зразки двох або більше видів бактерій спостерігається синергічний ефект. Порівнюючи елементний склад продуктів корозії поверхневого шару зразків, які знаходились під впливом моно- та бінарних культур мікроорганізмів, можна зазначити, що відсоток сірки зростав у відповідності до ускладнення модельної системи і складав 0,47% (від суми визначених елементів) для індивідуальної культури D.desulfuricans К-45, у варіанті з одночасним культивуванням T.thioparus 4М + D.desulfuricans К-45 -7,85%, і був максимальним 18,3% для суміші трьох культур. В процесі дослідження монокультур T.thioparus 4М, S.maltophilia 13М показано, що питоме продукування екзополімеру за умов планктонної форми росту більше за таке в умовах біоплівкової.

Для бінарної культури T.thioparus 4М, S.maltophilia 13М спостерігається збільшення питомого продукування для біоплівкової форми росту.

Для бінарної культури бактерій було показано найменше значення відносного вмісту вуглеводів як у планктоні, так і у біоплівці. Можливо, відносна кількість вуглеводів не відіграє суттєвої ролі у формуванні бінарної біоплівки T.thioparus 4М та S.maltophilia 13М, як було показано для інших видів мікроорганізмів (Christensen B., 1989, Beech I. et al., 1999).

Встановлено, що екзополімерний комплекс бінарних культур біоплівки T.thioparus 4М та S.maltophilia 13М складається з 0,4% вуглеводів, 0,1% уронових кислот. Можливо, що основну масу екзополімеру становлять різні білки, глікопротеїни, гліколіпіди та екстрацелюлярні ДНК як зазначено у Froland (Froland B et al., 1996).

Дослідження швидкості корозії сталевого зразку показало, що найбільша швидкість спостерігалась за умов культивування змішаної біоплівки, збільшення швидкості корозії даних культур корелює із збільшенням питомого продукування екзополімеру клітинами бактерій T.thioparus 4М та S.maltophilia 13М.

Як показали наші дослідження, питоме продукування екзополімерів моно-та бінарної культур T.thioparus 4М, S.maltophilia 13М було різне, залежало від моделі росту і досягало максимального значення за умов саме біоплівки.

Створення гіпотетичної моделі біоплівки. На основі комплексу отриманих даних запропоновано гіпотетичну модель біоплівки для монокультур T.thioparus 4М та S.maltophilia 13М та їх асоціації (рис. 8), яка враховує параметри: 1) кількість адгезованих до поверхні клітин T.thioparus 4М, S.maltophilia 13М та їх співвідношення; 2) товщину біоплівки; 3) наявність порожнин; 4) вміст сірки, тобто наявність елементної сірки; 5) відносний вміст вуглеводів; 6) моносахаридний та жирнокислотний склад екзополімеру; 7) вміст уронових кислот; 8)корозійну активність T.thioparus 4М, S.maltophilia 13М по відношенню до маловуглецевої сталі.

Наявність у складі біоплівки екзополімеру, питоме продукування якого становить близько 3%, який містить 4 моносахариди з домінуванням глюкози, 5 жирних кислот створюють умови для утримання елементної сірки і формуванню анодних зон на металі. Відповідно до корозійної активності T.thioparus 4М показано виникнення пітингів.

Біоплівка S.maltophilia 13М містить переважно екзосполуки, що продукуються незначною кількістю клітин. За допомогою даних КЛСМ визначено, що клітини розташовані на відстані 130 мкм одна від одної. Застосування РЕММА дало змогу визначити, що така біоплівка має зернисту структуру із порожнинами 4-6 мкм у діаметрі та середньою товщиною 30 мкм. Екзополімер із питомим продукуванням 0,06% містив 24% відносного вмісту вуглеводу з 4 моносахаридами, серед яких також домінувала глюкоза, 3 ненасичені жирні кислоти. Швидкість корозії маловуглецевої сталі була меншою в порівнянні з такою у T.thioparus 4М, що корелює з утворенням незначних пітингів.

Завдяки КЛСМ визначено, що біоплівка бінарної культури сформована конгломератами, які пронизують товщу матриксу. Клітини таких конгломератів щільно прилягають одна до одної на відстані 2-4 мкм і оточені екзосполуками. Аналіз за допомогою РЕММА виявив порожнини у товщі біоплівки, що у три рази більші за такі у S.maltophilia 13М, та загальну її товщину 50 мкм. Елементний аналіз матриксу показав присутність у ньому майже 12% елементної сірки. У даній асоціації клітини T.thioparus 4М продукують елементну сірку, яка формує конгломерати з екзополімерами і відіграє ключову роль в корозійному процесі.

Екзополімерний комплекс містив 8 моносахаридів, 1 ненасичену жирну кислоту. Корозійна активність такої плівки корелює із питомим продукуванням екзополімеру, що сприяє створенню значних пітингів на поверхні металу.

Отже, створені гіпотетичні моделі біоплівок T.thioparus і S.maltophilia та їх асоціацій свідчать про те, що в умовах техноеконіш змішані біоплівки, які формуються на поверхні маловуглецевої сталі, в порівнянні з моновидовими, за своєю структурою, хімічним і біохімічним складом більш складні, різноманітні і можуть сприяти активному формуванню анодних зон і значною мірою прискорювати корозійний процес.

Stenotrophomonas maltophilia 13М ( А - T.thioparus, В - S.maltophilia, С - T.thioparus та S.maltophilia).

Висновки

За допомогою сучасних методів (РЕММА, КЛСМ, тонких металевих матриць) досліджено формування і функціонування біоплівок моно- і бінарної культур T.thioparus 4М та S.maltophilia 13М на поверхні маловуглецевої сталі. Створено гіпотетичну модель цих біоплівок, які відрізняються за архітектонікою та вмістом сікри, що має не тільки фундаментальне значення, але і дозволить в подальшому запобігати негативному впливу мікробної корозії на металеві споруди.

1. Виділено природну корозійно активну асоціацію літотрофних ацидофобних тіонових бактерій T.thioparus 4М з гетеротрофним супутником S.maltophilia 13М із ґрунту, прилеглого до обкладинки тунелю київського метрополітену.

2. Показано, що адгезована до модельної поверхні асоціація T.thioparus 4М та S.maltophilia 13М містить у 5 разів більше клітин в порівнянні із монокультурою T.thioparus 4М.

3. Вперше встановлено суттєві розбіжності в структурі біоплівок T.thioparus 4М та S.maltophilia 13М і їх асоціації за допомогою РЕММА та КЛСМ. Виявлено більш структуровану біоплівку бінарних культур, якій притаманно формування конгломератів клітин. Клітини оточені екзосполуками та містять підвищену кількість сірки.

4. Показано, що присутність маловуглецевої сталі в середовищі збільшує різноманітність моносахаридів у екзополімерах T.thioparus 4М та S.maltophilia 13М біоплівкової моделі росту відносно планктонної.

5. Визначено, що у біоплівці бінарної культури T.thioparus 4М та S.maltophilia 13М збільшується продукування екзополімеру у порівнянні з таким для монокультур, що корелює із збільшенням корозійної активності цих бактерій у 7 разів.

6. Вперше запропоновано гіпотетичну модель біоплівки T.thioparus і S.maltophilia, що дозволяє узагальнити та візуалізувати отримані дані щодо її структури і прогнозувати перебіг мікробної корозії.

біоплівка корозійний бактерія бінарний

Список робіт, опублікованих за темою дисертації:

1. Протасова М.О. Адгезія і колонізація поверхні скла Thiobacillus thioparus та Stenotrophomonas maltophilia та їх бінарною культурою / Протасова М.О., Собко В.М., Козлова І.П. // Мікробіол. журн. - 2005. - 67, № 6. - С. 57-63 (Здобувачем самостійно було виділено та ідентифіковано культури досліджуваних бактерій, культивування корозійно небезпечних мікроорганізмів).

2. Протасова М.О. Дослідження структури біоплівок, сформованих бактеріями циклу сірки на металевих матрицях / Протасова М.О., Лазарєв В.Г., Козлова І.П. // Мікробіол. журн. - 2006.- 68, № 5. - С. 80 -86 (Здобувачем особисто проводилось культивування досліджуваних бактерій, мікроскопіювання за допомогою методу КЛСМ).

3. Протасова М.О. Вплив індивідуальних та змішаних культур бактерій циклу сірки на корозію маловуглецевої сталі / Протасова М.О., Піляшенко-Новохатний А.І., Козлова І.П. // Вісник Чернівецького університету. - 2006. - С. 186-193 (Здобувачем особисто проводилось культивування досліджуваних бактерій, обробка сталевих зразків, обчислення результатів досліду).

4. Борецька М.О. Вплив екзополімерів біоплівки на швидкість мікробної корозії маловуглецевої сталі / Борецька М.О., Козлова І.П. // Мікробіол. журн. - 2007. -69, № 4.- С.40-44 (Здобувачем особисто проводилось виділення екзополімерних комплексів біоплівки, вуглеводний, білковий аналіз екзополімеру, обчислення результатів).

5. Борецька М.О. Моносахаридний склад екзополімерного комплексу Thiobacillus thioparus і Stenotrophomonas maltophilia / Борецька М.О., Козлова І.П., Остапчук А.М. // Укр. біохім. журн. - 2008. -т. 79, N 5. - С. 25-29 (Здобувачем особисто проводилось виділення моносахаридного комплексу досліджуваних культур).

6.Андреева А.Ф., Двойненко О.К., Протасова М.А., Козлова И.А. Пленочные матрицы для изучения биокоррозии / Современные проблемы материаловедения: достижения и проблемы: сб. наук. роб. по матер. конф. под. ред. акад. НАН Украины Скорохода В.В., 26-30 сентября, г. Киев, Украина. - Киев, 2005. - С. 36 - 41.

7.Протасова М.О. Stenotrophomonas maltophilia як природний супутник Thiobacillus thioparus / Матеріали Х з'їзду Товариства мікробіологів України - збірник тез, 15-17 вересня, Одеса, 2004р. - Одеса, 2004. - 303 с.

8.Протасова М.О., Піляшенко-Новохатний А.І. Мікробна корозія маловуглецевої сталі індукована чистими та змішаними культурами бактерій цикла сірки / Молодь і поступ в біології: Матеріали І міжнародної конференції студентів та аспірантів (Львів, 11-14 квітня 2005р.)- Л.: Львівський держ. унів. ім.. Федьковича, 2005. - 288 с

9. Протасова М.О. Вплив маловуглецевої сталі на моносахаридний склад екзополімерів бактерій циклу сірки / Молодь і поступ в біології: Матеріали ІІ міжнародної конференції студентів та аспірантів, (Львів, 21-24 березня 2006р.)- Л.: Львівський держ. унів. ім. Федьковича, - 485с.

10. Протасова М.А., Пиляшенко-Новохатный А.И. Влияние бактерий цикла серы и их ассоциаций на малоуглеродистую сталь / Биология наука ХХ1 века: 9-ая международная Пущинская школа-конференция молодых ученых, (Пущино, 18-22 апреля.2005 г.) - Пущино, 2005р. - 209 с.

11. Піляшенко-Новохатний А.І., Протасова М.О.*, Андрєєва А.Ф., Лазарєв В.Г., Козлова І.П. Інтенсивність корозійного розчинення маловуглецевої сталі в залежності від архітектоніки біоплівки / Фізико-хімічна механіка матеріалів - Львів, 2006. -Спец. вип. № 5. - С. 906-910.

12. Борецька М.О., Остапчук А. М., Козлова І.П. Дослідження екзополімеру моно- та бінарної культури Thiobacillus thioparus та Stenotrophomonas maltophilia за різних моделей росту / Біологія: від молекули до біосфери: Матеріали ІІ міжнародної конференції, (Харків, 19-21 листопада, 2007р). -Харків, 2007. - 416.с.

13. Protasova M., Sobko V., Kozlova I. Biofilm formation of pure and mixed culture of Thiobacillus thioparus / 13-IBBS Congres, Madrid,- Spain,- Abstract Book.- P. 26-29.

14. Pilyashenko-Novokhatny A I., Protasova M.O., Kozlova I. P. Peculiarity of mild steel corrosion, induced by aggressive sulfur cycle bacterium association / 16 International Corrosion Congress, Beijing China, Sept 19-24, 2005,- Abstracts.- 05-SRB-09.

Размещено на Allbest.ru