Ґрунтові водорості при взаємодії із вірусами вищих рослин: реакція культур та структурно-функціональні зміни в клітинах

Размещено на http://www.allbest.ru/

КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ІМЕНІ ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук 03.00.05 - ботаніка

ҐРУНТОВІ ВОДОРОСТІ ПРИ ВЗАЄМОДІЇ ІЗ ВІРУСАМИ ВИЩИХ РОСЛИН: РЕАКЦІЯ КУЛЬТУР ТА СТРУКТУРНО-ФУНКЦІОНАЛЬНІ ЗМІНИ В КЛІТИНАХ

Бойко Вікторія Ростиславівна

Київ - 2008

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Починаючи з другої половини ХХ сторіччя в Україні було розгорнуто системні дослідження в галузі ґрунтової альгології, в результаті чого наша держава наразі посідає одне з провідних місць в світі за ступенем вивченості фітоедафону (Костіков та ін., 2000).

Численні дослідження свідчать про виключно позитивну роль ґрунтових водоростей в природі та господарський діяльності людини (Штина, Голлербах, 1976; Hoffmann, 1989; Buscot, Varma, 2005; та ін.). Фактів щодо можливої негативної ролі ґрунтових водоростей як резервуарів вірусних інфекцій вищих рослин не наводились не лише у вітчизняній, але й у світовій літературі. Відповідно, присутність в агробіоценозах ґрунтових водоростей як можливих резервуарів вірусних інфекцій досі не враховується при дослідженні ймовірних шляхів циркуляції та зберігання фітовірусів.

В той же час ціла низка непрямих фактів свідчить, що питання про негативну роль ґрунтових водоростей як природних резервуарів фітовірусів заслуговує на увагу.

Зокрема, зростає кількість робіт фітовірусологічного та екологічного спрямування, що містять повідомлення про знахідки у ґрунтах фітовірусів та їх антигенів (Шпаар, 1995; Поліщук та ін., 2001). Причому лише для небагатьох з цих вірусів з'ясовано спосіб зберігання в ґрунті. При цьому, з одного боку, експериментально доведено, що віруси, виявлені у ґрунті здатні зберігатись в ньому протягом досить тривалого періоду, а з іншого показано, що більшість з цих вірусів нестійкі поза межами клітин і в принципі зберігатися в ґрунті у вільному стані протягом тривалого часу не можуть. Цей парадокс поки що не має достатньо повного і задовільного пояснення.

Відомо, що ґрунтові водорості мешкають у безпосередній близькості з корінням вищих рослин та концентруються в зоні кореневих волосків, обумовлюючи т.зв. "ризосферний ефект" (Голлербах, Штина, 1969). Аналіз біологічних особливостей ґрунтових водоростей свідчить, що вони демонструють властивості, характерні як для векторів, так і для резервуарів вірусів, включаючи фітовіруси.

Наразі віруси та вірусоподібні частки виявлені більше ніж у 50-и видів евкаріотичних водоростей з 11-и відділів. Деякі з цих вірусів є РНК-вмісними та подібні до вірусів вищих рослин (Gibbs et al., 1975). Пошукові дослідження щодо взаємодії зелених водоростей з родів Chlamydomonas, Chlorococcum та Chlorella з вірусами вищих рослин (ВТМ та ХВК) показали чутливість цих водоростей до обробки їх інфекційною вірусною РНК (Suss et al., 1965; Шелудько и др., 1970).

Вищенаведені факти свідчать, що питання про ґрунтові водорості як резервуари вірусних інфекцій вищих рослин заслуговує на увагу. Вивчення реакції ґрунтових водоростей при взаємодії із фітовірусами дозволить встановити роль ґрунтових водоростей як одного із можливих резервуарів вірусних інфекцій вищих рослин. В такому разі уявлення про шляхи циркуляції та зберігання фітовірусів у природі можуть суттєво розширитись, а методи прогнозування вірусних епіфітотій - поточнитись.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалась у межах науково-дослідної теми кафедри ботаніки Київського національного університету імені Тараса Шевченка "Молекулярно-генетичні маркери в систематиці, еволюції та сортовій ідентифікації рослин" (номер держреєстрації № 0101U001596), міжкафедральної науково-дослідної теми Київського національного університету імені Тараса Шевченка "Вивчення екологічних особливостей та біоіндикаторних властивостей різних організмів та їх угруповань в умовах трансформованого середовища для розв'язання проблем біобезпеки України" (номер держреєстрації 0106U005749) та індивідуального дослідницького гранту НАТО (2004 р.)

Мета та задачі дослідження. Метою роботи було встановити реакцію культур ґрунтових водоростей та біоморфологічні зміни в їх клітинах при взаємодії із вірусами вищих рослин.

Досягнення мети вимагало вирішення таких задач:

Окреслити коло ґрунтових водоростей, які з найбільшою ймовірністю будуть проявляти чутливість до вірусів вищих рослин;

Створити колекцію чистих культур водоростей, виділених з ґрунтів агроценозів з ознаками вірусних епіфітотій та провести скринінг отриманих культур на наявність антигенів фітовірусів;

Перевірити сприйнятливість модельних видів ґрунтових водоростей до деяких (модельних) вірусів вищих рослин;

Дослідити залежність між морфобіологічним станом ґрунтових водоростей та здатністю фітовірусів проникати в клітини ґрунтових водоростей.

Об'єкт дослідження. Біогеоценотична роль ґрунтових водоростей.

Предмет дослідження. Структурно-функціональні зміни в клітинах ґрунтових водоростей при взаємодії їх із вірусами вищих рослин.

Методи дослідження. Світлова мікроскопія, люмінесцентна мікроскопія, трансмісійна електронна мікроскопія, метод рослин-індикаторів, імуноферментний аналіз, поверхневий плазмонний резонанс, полімеразна ланцюгова реакція, секвенування, електрофорез в агарозному гелі.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше експериментально доведено можливість штучного ураження деяких ґрунтових зелених водоростей вірусами вищих рослин. Вперше встановлено, що в клітинах водоростей, виділених з ґрунтів природних ценозів детектуються антигени фітовірусів. Обґрунтовано та експериментально перевірено гіпотезу щодо шляхів проникнення фітовірусів у клітини ґрунтових водоростей залежно від вікового та морфологічного стану останніх (т.зв. "гіпотеза вхідних воріт інфекції"). При дослідженні ультраструктури клітин Bracteacoccus minor із контрольних ліній вперше зареєстровано спосіб поділу внутрішніх хлоропластів, розроблено схему класифікації вікових станів Bracteacoccus minor на ультратонкому рівні, виявлено та описано комплекси асоційованих органел.

Доведено, що методи імуноферментного аналізу, поверхневого плазмонного резонансу та полімеразної ланцюгової реакції можуть бути використані для детекції вірусів вищих рослин (або їх антигенів) в клітинах ґрунтових водоростей.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані результати відкривають новий напрямок досліджень взаємовідносин між ґрунтовими водоростями та вірусами вищих рослин при вивченні нових шляхів передачі та зберігання фітовірусів у природі. Запропоновані в роботі схеми зараження та детекції фітовірусів у клітинах ґрунтових водоростей дозволяють використовувати систему "Ґрунтові водорості - Віруси вищих рослин" як модель для вивчення взаємовідносин між фітовірусами та рослинними клітинами. Отримані дані можуть бути враховані при встановленні нових шляхів циркуляції та зберігання фітовірусів у природі та при прогнозуванні виникнення та поширення вірусних епіфітотій.

Особистий внесок здобувача. Автором було самостійно проаналізовано наукову літературу за темою дисертації. Гіпотеза про роль водоростей як резервуарів вірусів вищих рослин належить І.Ю. Костікову та В.П. Поліщуку. Основний об'єм експериментальної роботи, обробка та аналіз отриманих результатів, формулювання висновків дисертаційної роботи здійснені здобувачем особисто. Безпосередньо автором було розроблено методики та проведено експерименти по штучному зараженню ґрунтових водоростей вірусами вищих рослин. Контроль ефективності зараження методами світлової, люмінесцентної та електронної мікроскопії, рослин-індикаторів, ІФА та ПЛР виконувався автором особисто.

Дослідження вірусних антигенів методом ППР було здійснено спільно з П.М. Болтовець (ін-т мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного); секвенування отриманих автором ампліконів гену капсидного білка ВТМ в водоростевих культурах було виконано І.І. Бубряком (Оксфордський університет), які є співавторами відповідних публікацій.

ВТМ був отриманий від Т.П. Шевченко, ВБТ - від Н.А. Сенчугової (Київський національний університет імені Тараса Шевченка).

Апробація результатів дисертації. Основні матеріали дисертації були оприлюднені на міжнародному конгресі "1-st European Phycologycal Congress" (Кельн, Німеччина, 1996), міжнародних симпозіумах "Biology and Taxonomy of Green Algae: IV. International Symposium" (Смолениця, Словаччина, 2002), "Biology and Taxonomy of Green Algae: V. International Symposium" (Смолениця, Словаччина, 2007), міжнародних конференціях "Bioresourses and viruses: II International conference" (Київ, Україна, 1998), "Bioresourses and viruses: III International conference" (Київ, Україна, 2001), "Algae in terrestrial ecosystems" (Канів, Україна, 2005), наукових читаннях "Біорізноманіття України, його динаміка та шляхи збереження", присвячених 100-річчю з дня народження Д.І. Сакала (Мелітополь, Україна, 2004), науковій конференції професорсько-викладацького складу, наукових співробітників та аспірантів НАУ (Київ, Україна, 2000), конкурсі експериментальних робіт молодих дослідників Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАНУ (Київ, Україна, 2001).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 12 робіт, з яких 6 статей у профільних журналах та 6 тез доповідей на міжнародних симпозіумах та конференціях.

Структура дисертації. Дисертація складається зі вступу, шести розділів, заключення, висновків та списку використаних літературних джерел, який містить 166 позицій. Робота викладена на 149 сторінках друкованого тексту, містить 35 рисунків та 15 таблиць.

Подяки. Автор висловлює глибоку подяку своїм вчителям - професорам Костікову І.Ю. та Поліщуку В.П. за оригінальну гіпотезу, яку покладено в основу даної роботи та за постійну і всебічну допомогу під час виконання роботи. За цінні поради та зауваження, які суттєво вплинули на остаточний варіант роботи автор щиро дякує акад. А.Л. Бойку, д-ру Л. Гоффманну (Люксембург) та д-ру І.І. Бубряку (Велика Британія).

Автор щиро дякує І.Ю. Костікову, Е.М. Демченку, Т.М. Дарієнко, П.О. Романенку, Т.П. Шевченко та Н.А. Сенчуговій, які люб'язно надали штами ґрунтових водоростей та вірусів вищих рослин із персональних колекцій. П.М. Болтовець за допомогу в частині роботи, пов'язаній із застосуванням ППР, І.І. Бубряку за допомогу в частині роботи, пов'язаній із молекулярними дослідженнями та А. Массальскому (Польща) за допомогу в частині роботи, пов'язаній із фіксацію препаратів для електронної мікроскопії.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

ґрунтовий водорість вірус рослина

РОЗДІЛ 1. ҐРУНТОВІ ВОДОРОСТІ ЯК ПОТЕНЦІЙНІ РЕЗЕРВУАРИ ВІРУСІВ ВИЩИХ РОСЛИН (ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ)

Станом на 2000 р. загалом у ґрунтах виявлено 3012 видів водоростей (Костіков та ін., 2001). Вони належать до 9-и відділів: Cyanophyta, Euglenophyta, Eustigmatophyta, Xanthophyta, Bacillariophyta, Dinophyta, Cryptophyta, Rhodophyta та Chlorophyta. За видовим багатством, траплянням та чисельністю серед цих відділів абсолютно переважають зелені та синьозелені водорості, далі - жовтозелені та діатомові. Досить регулярно в ґрунтах виявляються евстигматофітові. Представники решти відділів зустрічаються спорадично, і представлені майже виключно заносними гідрофільними видами (Штина, Голлербах, 1969; Костіков та ін., 2001).

Серед багатьох біотичних та абіотичних факторів, які впливають на водорості, віруси найчастіше не враховуються. Хоча за літературними даними віруси та ВПЧ знайдені у більше ніж 50-ти видів евкаріотичних водоростей з 11 відділів (Euglenophyta, Raphidophyta, Chrysophyta, Eustigmatophyta, Phaeophyta, Bacillariophyta, Dinophyta, Haptophyta, Cryptophyta, Rhodophyta, Chlorophyta), причому деякі з цих вірусів є РНК-вмісними та подібні до вірусів вищих рослин (див. огляди: Van Etten, 1991; Reisser, 1992; Zingone, 1995; а також: Cosper, 1994; Friess-Klebl, et al., 1994; Kostikov et.al., 1994; Suttle, Chan, 1995; Van Etten, 1995; Milligan et al., 1996; Mьller et all., 1996; Kapp et al., 1997; Gastrich et al., 1998; Wolf et al., 1998; Shin, Boo, 1999;. Krienitz et al., 2000;.Sandaa et al., 2001; Lawrence et al., 2001; Castberg et al., 2002; Brussaard et al., 2004; Nagasaki et al., 2004; Kang et al., 2005; Nagasaki et al., 2005; Tarutani et al., 2005; Степанова и др., 2005; та ін.).

Наразі близько 30-и фітовірусів та їх антигенів детектуються в ґрунтах та дренажних водах. Далеко не для всіх з них з'ясовано способи попадання в ґрунт, а також завдяки чому віруси, які є нестійкими в навколишньому середовищі, здатні зберігатись у ґрунті досить тривалий час (Поліщук та ін., 2001).

Ці факти, а також відомості про віруси евкаріотичних водоростей дають підстави для припущення про можливу роль ґрунтових водоростей як одного з потенційних резервуарів вірусів вищих рослин.

Аналіз літературних даних, а також факти про еволюційну спорідненість деяких ґрунтових водоростей, зокрема з відділу Chlorophyta із вищими рослинами (Marin, Melkonian, 1999; Chapman, Waters, 2002) та подібність будови їх клітин свідчить, що ґрунтові водорості можуть проявляти чутливість до вірусів вищих рослин і відігравати роль резервуарів вірусних інфекцій вищих рослин. Проте експериментальні підтвердження цієї гіпотези у сучасній літературі повністю відсутні.

РОЗДІЛ 2. МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЬ

Матеріалом при дослідженні були альгологічно чисті культури ґрунтових мікроводоростей - Eustigmatos magnus (B.Petersen) Hibberd; Pleurochloris commutata Pasher; Chlamydomonas actinochloris Deason et Bold; Chlamydomonas globosa Snow; Chlamydomonas culleus Ettl; Chlamydomonas lobulata Ettl; Tetracystis pulchra Brown et Bold; Chlorosarcinopsis bastropiensis Groover et Bold; Chlorosarcinopsis dissociata Herndon; Chlorosarcinopsis gelatinosa Chantanachat et Bold; Neochlorosarcina negevensis (Fridmann et Ocampo-Paus) Watanabe; Chlorococcum elkhartiense Archibald et Bold; Bracteacoccus grandis Bischoff et Bold; Bracteacoccus minor (Chodat) Petrova; Dictyococcus cf.varians Gerneck em. Starr; Dictyochloropsis cf. splendida Geitler; Chlorella minutissima Fott et Novakova; Сoccomyxa subellipsoidea Acton (= Pseudococcomyxa subellipsoidea (Acton) Kostikov, Hoffmann et Friedl, ad. int.) та віруси вищих рослин, а саме - вірус тютюнової мозаїки (ВТМ), вірус бронзовості томатів (ВБТ) та Х-вірус картоплі (ХВК).

Ґрунтово-альгологічні проби відбирали за загальноприйнятою у ґрунтовій альгології методикою (Голлербах, Штина, 1969; Костіков та ін., 2001).

Водорості з відібраних ґрунтово-альгологічних проб нарощувались у накопичувальних культурах на агаризованому (1.5%) та рідкому середовищі Болда з нормальним (1N) та потрійним (3N) вмістом азоту, далі з накопичувальних культур за прийнятою у ґрунтово-альгологічних дослідженнях методикою виділяли альгологічно чисті культури (Голлербах, Штина, 1969). Для отримання аксенічних культур деякі штами доочищувались та клонувались за допомогою серійних пересівів у культурах на рідкому та агаризованому поживному середовищі Болда з нормальним (1N) та потрійним (3N) вмістом азоту.

Штами культивували на люміностаті з люмінесцентними лампами ЛБ-40 з 12-и годинним чергуванням світлової та темнової фаз при температурі +18-22⁰С.

Ідентифікацію водоростей проводили за допомогою мікроскопа "Біолам Р-14" (об'єктиви 20Ч, 40Ч, 90Ч). При ідентифікації використовували визначники "Syllabus der Boden-, Luft- und Flechtenalgen", "Почвенные и аэрофильные зеленые водоросли (Chlorophyta: Tetrasporales, Chlorococcales, Chlorosarcinales)", а також іншу довідкову літературу та публікації з першоописами таксонів, використаних у дослідженнях.

Для інокуляції фітовірусами водоростей досліджуваних видів було підібрано умови, при яких спостерігається масове утворення зооспор.

Для проведення імуноферментного аналізу, поверхневого плазмонного резонансу, полімеразної ланцюгової реакції, імуносорбентної електронної мікроскопії та тестів на рослинах-індикаторах використовували гомогенат клітин ґрунтових водоростей. Перед гомогенізацією культури тричі відмивали в фосфатно-буферному розчині (PBS) (рН 6.8) та центрифугували зі швидкістю 3000 об\хв (для видалення вірусу з культурального середовища). Отриманий осад гомогенізували з карборундом у PBS. Далі гомогенат центрифугували протягом 15 хв. зі швидкістю 4000 об\хв. Отриманий після центрифугування надосад (далі в тексті - гомогенат) використовували для подальших досліджень.

Світлова мікроскопія проводилась за допомогою мікроскопа "Біолам Р-14" (об'єктиви 20Ч, 40Ч, 90Ч) та "Leica" (об'єктиви 40Ч та 100Ч). Результати документувались фотографуванням за допомогою цифрової фотокамери "Olympus" та цифрової відеокамери "Sony", встановленими на даних мікроскопах та з'єднаних з персональним комп'ютером. Статистичну обробку отриманих кількісних даних проведено за допомогою програмного пакету STATASTICA 5.0.

Люмінесцентну мікроскопію використовували для виявлення вірусних включень в клітинах ґрунтових водоростей. Препарати виготовляли з використанням 3% розчину трихлороцтової кислоти та розчином акридиноранжу в PBS (робоче розведення 1:10000). Препарати переглядали та фотографували на люмінесцентному мікроскопі "Люмам И1" (обєктив 90Ч), оснащеному фотокамерою "Зеніт".

Для детекції фітовірусів в гомогенатах клітин ґрунтових водоростей використовували метод імуносорбентної електронної мікроскопії (ІСЕМ) з використання кролячої анти-ВТМ сироватки (розведення 1:100). Спостереження проводили при інструментальному збільшенні 25-40 тис разів на електронному мікроскопі JEM-1200 (JEOL, Японія).

Підготовку матеріалу для трансмісійної електронної мікроскопії проводили за стандартною методикою (Massalski et al., 1999). Для дослідження ультратонких зрізів використовували трансмісійний електронний мікроскоп "TESLA BS 500" (інструментальне збільшення 6, 8, 10, 14, 18, 24, 32 тис. разів).

Для детекції антигенів вірусів вищих рослин в клітинах ґрунтових водоростей використовували непрямий варіант імуноферментного аналізу (ІФА) та поверхневий плазмонний резонанс (ППР).

Імуноферментний аналіз проводили за стандартною методикою (Гнутова, 1985). Результати реєстрували на автоматичному ELISA-рідері (“РЕ-2 Sumal”, Німеччина) при довжині хвилі 492 нм (для АТ, мічених пероксидазою) або 405 нм (для АТ, мічених лужною фосфатазою). За позитивний приймався показник Е₄₉₂ або Е₄₀₅, що вдвічі перевищував показник негативного контролю (сік здорової рослини). Досліди по кожному зразку проводили в трикратній повторності. Для порівняння результатів використовували середній показник (середньоарифметичне).

Дослідження методом поверхневого плазмонного резонансу проводили за допомогою ППР-спектрометра “ПЛАЗМОН” (джерело збудження GaAs, лазер, =670 нм), розробленому в Інституті фізики напівпровідників НАН України (Snopok et al., 2001).

Для підтвердження факту проникнення ВТМ в клітини Bracteacoccus minor використовували тест на рослинах-індикаторах. Як тест-об'єкт використовували Datura stramonium L.

Нуклеотидну послідовність гену капсидного білку ВТМ в гомогенатах клітин ґрунтових водоростей, інокульованих ВТМ, детектували методом полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). Для ампліфікації використовували пару праймерів (cp-TMV), яка фланкує ген, що кодує структурний білок ВТМ. Результати ампліфікації маркерного гену перевіряли за допомогою електрофорезу в агарозному гелі з використанням стандартних маркерів (1 kb Plus DNA Ladder, Invitrogen) з подальшим фотографуванням гелів за допомогою трансілюмінатору (Biometra, BioDoc Analise).

Встановлення нуклеотидної послідовності РНК вірусу тютюнової мозаїки, виділеної з уражених культур мікроводоростей, проводили після ампліфікації маркерного гену. Продукти ампліфікації очищали за допомогою Gel Using Mini Elute Columns (Qiagen, UK). Секвенування очищених ампліфікованих фрагментів проводили на Applied Biosystems 3730xl DNA Analyzer з використанням Big Dye terminators, version 3.1 (Applied Biosystems, USA). Для покращення якості сіквенсу у деяких випадках додатково проводили клонування продукту ампліфікації за стандартною методикою з використанням pGem T Easy vector (Promega, UK) і повторне секвенування клонованої послідовності з використанням стандартного праймера M13.

Ідентифікацію отриманих сіквенсів проводили за допомогою пошукової системи BLAST засобами програми BLASTN (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Вирівнювання фрагментів проводили за допомогою програмного пакету GENEDOC.

РОЗДІЛ 3. ВИБІР МОДЕЛЬНИХ СИСТЕМ ДЛЯ ДОСЛІДЖЕННЯ ВЗАЄМОДІЇ ҐРУНТОВИХ ВОДОРОСТЕЙ ТА ВІРУСІВ ВИЩИХ РОСЛИН

Для встановлення первинного кола водоростей, в межах якого з найбільшою ймовірністю можна виявити водорості резервуари вірусних інфекцій вищих рослин, на основі літературних даних було виділено групи видів із найбільшим траплянням у ґрунтах та проаналізовано комплекси морфологічних особливостей цих видів, які можуть впливати на здатність вірусів проникати у клітини ґрунтових водоростей.

Кількість знахідок видів підраховувалась в основному за конспектом флори водоростей ґрунтів України (Костіков та ін., 2001) з використанням даних щодо активно вегетуючих комплексів ґрунтових водоростей (Костіков, 2001).

З літератури відомо, що деякі представники відділу Chlorophyta виявилися чутливими до зараження інфекційною РНК вірусів вищих рослин (зокрема, ВТМ та ХВК) (Suss et al., 1965; Шелудько и др., 1970). Аналіз морфологічних особливостей цих водоростей показав, що на роль чутливих представників едафофільних водоростей можуть претендувати лише ті таксони, що мають додаткові системи сполучення протопласту з навколишнім середовищем наприклад, слизові пори або ослизненні ділянки оболонки. По аналогії з прийнятим у вірусології поняттям "вхідні ворота інфекції" (Синяк, 1993), такі системи сполучення протопласту з навколишнім середовищем ми назвали "воротами". У ґрунтових водоростей можна виділити кілька типів таких "воріт".

Розподіл типів "воріт" серед видів активновегетуючого комплексу ґрунтових водоростей наведено в таблиці 1.

Таблиця 1. Розподіл модельних видів водоростей залежно від типу "воріт"

Тип "воріт"	Вид	Відділ	Кількість знахідок в ґрунтах України
Джгутики. Наявні протягом усього клітинного циклу (тип "1")	Chlamydomonas lobulata Chlamydomonas globosa Chlamydomonas actinochloris	Chlorophyta Chlorophyta Chlorophyta	178 16 18
Джгутики. Наявні на деяких стадіях клітинного циклу (тип "2")	Tetracystis pulchra Chlorococcum elkhartiense	Chlorophyta Chlorophyta	33 17
Плазмалема клітини на деяких стадіях життєвого циклу (голі зооспори) (тип "3")	Chlorosarcinopsis dissociata Bracteacoccus minor Eustigmatos magnus Pleurochloris commutata	Chlorophyta Chlorophyta Eustigmatophyta Xanthophyta	16 331 282 33
Ослизнені ділянки та/або слизові канали на цих ділянках (тип "4")	Pseudococcomyxa subellipsoidea	Chlorophyta	(44)
"Ворота" відсутні (суцільні оболонки протягом усього клітинного циклу) (тип "5")	Chlorella minutissima	Chlorophyta	126

Обрані таким чином, 11 модельних видів ґрунтових водоростей, виділених з ґрунтів природних місцезростань, були перевірені методом непрямого ІФА на наявність антигенів фітовірусів, які стабільно детектуються в ґрунтах України. Було встановлено, що антигени принаймні одного з вірусів детектуються в восьми з досліджених видів. Тобто, ґрунтові водорості характеризуються потенційно високим рівнем вірусоносійства.

Експерименти по штучному ураженню цих же видів ґрунтових водоростей ХВК, ВБТ та ВТМ показали, що деякі культури реагують на присутність фітовірусів у середовищі. Зміна забарвлення спостерігалась в культурах Chlamydomonas globosa, C. actinochloris та Eustigmatos magnus в лініях, куди вносили ХВК та в культурі Bracteacoccus minor в лінії, куди вносили ВТМ. Майже повна загибель клітин спостерігалась в культурі Chlorosarcinopsis dissociata, в лінії, куди вносили ВБТ.

Гомогенати клітин усіх досліджених видів були перевірені методом ІФА на наявність антигенів ВТМ, ХВК та ВБТ. Встановлено, що антигени ХВК та ВБТ не виявлялись в клітинах жодної лінії, а антигени ВТМ детектуються в гомогенатах Bracteacoccus minor в лінії, куди вносили ВТМ.

Результати експериментів по скринінгу антигенів фітовірусів у природних ізолятах 11-и найбільш поширених у ґрунтах видів водоростей з одного боку, та пошукові досліди зі штучного ураження 9-и штамів ґрунтових водоростей фітовірусами з іншого - підтвердили наше припущення про необхідність наявності у евкаріотичних водоростей певних "воріт" для проникнення вірусу в клітину. При цьому чутливість до фітовірусів проявляють, в першу чергу, ті зелені водорості, для яких характерна наявність "воріт" третього типу - голих зооспор.

За результатами пошукових експериментів для подальших досліджень було обрано дві модельні системи: "Chlorosarcinopsis dissociata + ВБТ" та "Bracteacoccus minor + ВТМ".

РОЗДІЛ 4. ЗМІНИ В КУЛЬТУРІ Chlorosarcinopsis dissoсiata ПІД ДІЄЮ ВБТ

Розділ присвячено дослідженню змін в культурі Chlorosarcinopsis dissoсiata під дією ВБТ.

В розділі наведено детальний опис виду. Дослідження життєвого циклу C. dissociata показало, що при культивуванні на твердому та рідкому поживному середовища чітко розрізняються 6 вікових станів: зооспори, проростки, ювеніли, вегетативні клітини, акінетоподібні клітини та зооспорангії. Наведено оригінальні фотографії описаних вікових станів.

В експерименті внесення вірусовмісного матеріалу в культуру C. dissoсiata проводили в момент зооспороутворення.

Експериментально встановлено, що внесення ВБТ в синхронізовану культуру Chlorosarcinopsis dissoсiata пригнічує розвиток культури та викликає загибель більшості клітин культури. Подібний вплив зумовлений саме вірусом, оскільки при внесенні в синхронізовану культуру C. dissoсiata соку з безвірусних рослин томату культура розвивається, хоча розвиток її пригнічується. На світлооптичному рівні, у зразку з лінії, куди вносили вірус, на відміну від клітин з контрольних ліній, переважали знебарвлені або майже знебарвлені клітини. Серед забарвлених клітин переважали поодинокі вегетативні клітини або клітини у стані поділу. Порівняно з контролями в зразках цієї лінії зустрічалось більше акінетоподібних клітин. Аналіз типів клітин, які переважали в лінії C. dissoсiata інокульованого ВБТ свідчить, що присутність віруса в середовищі спричиняє масову загибель зооспор.

Методом ІФА встановлено, що в зразках з усіх ліній (дослідних та контрольних) антигени ВБТ достовірно не виявлялись.

Методом люмінесцентної мікроскопії внутрішньоклітинних включень не було виявлено в клітинах жодної лінії.

Отримані результати свідчать, що Chlorosarcinopsis dissoсiata уражується ВБТ, проявляючи при цьому надчутливість, і при ураженні гине на ранніх стадіях розвитку, тому C. dissoсiata не можна розглядати як резервуар ВБТ в природі.

РОЗДІЛ 5.ЗМІНИ В КУЛЬТУРІ BRACTEACOCCUS MINOR ПІД ДІЄЮ ВТМ

Розділ присвячено дослідженню змін, які відбуваються в клітинах B. minor під дією ВТМ.

В розділі наведено детальний опис виду. Показано, що в життєвому циклі B. minor можна виділити 7 вікових станів, з яких два стани - зооспори та апланоспори - є репродуктивними, два - "проростки" та "ювеніли" - прегенеративними, ще два - вегетативні та субсенільні - генеративними, і один стан являє собою спорангії (зоо- або апланоспорангії). Клітини у кожному віковому стані мають власні морфологічні особливості та певний розмірний діапазон, що дозволяє надалі розпізнавати їх не лише на світлооптичному, але й на ультратонкому рівні.

Наведено морфологічну характеристику станів, отриману на основі оптичної та електронної мікроскопії.

При дослідженні клітин B. minor на ультратонкому рівні виявлено певні закономірності розвитку клітинних оболонок та органел. Встановлено, що з віком клітини збільшення кількості хлоропластів відбувається за рахунок поперечного поділу парієтальних хлоропластів та поздовжнього поділу внутрішніх хлоропластів.

У клітинах контрольних ліній B. minor на ультратонкому рівні спостерігаються два топологічно асоційовані комплекси органел та клітинних структур: по-перше, хлоропласт-мітохондріальний комплекс; по друге, асоційований ядерний комплекс, що складається з асоційованих з ядерною оболонкою пари центріолей та комплексу Гольджі. На різних стадіях клітинного циклу ядерний комплекс залишається сталим за кількістю його компонентів (дві центріолі, один комплекс Гольджі), але змінює форму - від асиметричної грушоподібної до симетричної "метеликоподібної". У хлоропласт-мітохондріальних комплексах з віком кількість хлоропластних профілів, асоційованих з одним мітохондріальним профілем, збільшується, а в межах окремого хлоропласту зростає кількість ламел.

У серії дослідів по штучному інфікуванню клітин B. minor, які знаходяться у трьох вікових станах - зооспори, ювенільні клітини та вегетативні клітини, встановлено, що чутливість культури до ВТМ залежить від вікового стану клітин, які переважають в культурі.

На рівні світлової мікроскопії спостерігалось зменшення середнього розміру клітин в дослідній лінії, інокульованій ВТМ на стадії вегетативних клітин. У лініях, інокульованих ВТМ на стадії ювенільних клітин та зооспор, середній розмір клітин збільшувався. Найбільше відхилення від контролю (у сторону збільшення) зареєстровано у культурі B. minor, інокульованій ВТМ на стадії зооспор. Зареєстровані відхилення виявились статистично достовірними для усіх трьох ліній.

Крім збільшення середньостатистичного розміру клітин, на світлооптичному рівні в лабораторних популяціях B. minor, інокульованих на стадії зооспор ВТМ, порівняно з контролем, чітко спостерігалось суттєве потовщення оболонок клітин, деформація спор в апланоспорангіях, мертві спорангії та утворення велетенських спорангіїв із спорами, які швидко гинули. В лініях B. minor, інокульованих на стадії вегетативних та ювенільних клітин, подібні симптоми були відсутні.

При дослідженні методом люмінесцентної мікроскопії, в клітинах із лінії "зооспори" спостерігались аморфні включення, які за морфологією та забарвленням подібні до аморфних включень, що утворюються в клітинах деяких рослин, уражених ВТМ (Гольдин, 1963). В клітинах контрольної лінії включень не спостерігалось.

Методом ІФА в гомогенаті клітин із лінії "зооспори" виявлено антигени ВТМ.

Методом поверхневого плазмонного резонансу в гомогенаті клітин з лінії "зооспори" реєструвався високий, порівняно з контролем, залишковий рівень зв'язаного антигену ВТМ. В клітинах з ліній "вегетативні" та "ювенільні" залишковий рівень зв'язаного антигену ВТМ фактично не відрізнявся від контролю.

Оскільки було встановлено, що саме зооспори B. minor проявляють найбільшу чутливість до внесення ВТМ, дослідна лінія B. minor, інокульована ВТМ на стадії зооспор була досліджена більш детально.

На рослинах Datura stramonium L., інокульованих гомогенатом клітин дослідної лінії, спостерігалось пожовтіння листків та поява точкових некрозів.

Методом імуносорбентної електронної мікроскопії у препаратах, виготовлених із очищеного гомогенату клітин B. minor, інокульованого на стадії зооспор ВТМ, було виявлено паличковидні частки, розміром 30018 нм, які мале "опушення", характерне для об'єктів, оброблених специфічними антитілами.

На ультрамікроскопічному рівні порівняльний аналіз морфології хлоропластів показав, що в клітинах B. minor з дослідної лінії (інокульованих на стадії зооспор ВТМ) спостерігається деструкція оболонок хлоропластів та вмісту самих хлоропластів.

В деяких клітинах як з дослідної, так і з контрольної ліній, спостерігалось стискання внутрішнього вмісту клітини. При цьому в просторі під оболонкою клітин з дослідної лінії спостерігались поодинокі паличковидні частки та їх скупчення, в той час як простір під оболонкою клітин з контрольної лінії залишався порожнім.

Також на деяких зрізах клітин з дослідної лінії біля хлоропластів були помітні включення у вигляді волокнистих утворів. На нашу думку, ці включення можуть бути утворені частками ВТМ. На зрізах клітин з контрольної лінії подібних включень не спостерігалось.

Таким чином, результати ЕМ ультратонких зрізів демонструють, що ВТМ проникає в зооспори B. minor і реплікується в них. При цьому руйнуються оболонки хлоропластів та вміст самих хлоропластів. Дані щодо деградації хлоропластів узгоджуються з даними інших дослідників про те, що в клітинах рослин, уражених ВТМ, саме хлоропласти проявляють найбільшу чутливість до впливу вірусу (Реунов, Лега, 2000; Мельничук и др., 2002).

Методом полімеразної ланцюгової реакції в гомогенаті клітин B. minor, інокульованих ВТМ на стадії зооспор детектували нуклеотидну послідовність гену капсидного білку ВТМ. Отриманий продукт ампліфікації мав розмір ?700 пар нукл. В гомогенаті клітин B. minor з контрольної лінії подібного продукту не виявлено.

Отримані результати свідчать, що ВТМ здатен проникати в клітини B. minor. Ефективність проникнення залежить від стадії життєвого циклу, на якій знаходиться клітина в момент проникнення вірусу. Несприйнятливими для проникнення вірусу виявились вегетативні клітини B. minor, які мають щільну оболонку з шаром кристалічної целюлози. Навпаки, зооспори B. minor, які не мають клітинної стінки і відділені від навколишнього середовища тільки плазмалемою, виявились сприйнятливими до проникнення вірусу. Ювенільні клітини B. minor, в принципі можна вважати нечутливими до ураження вірусом, оскільки позитивні результати, отримані для клітин цього типу були невисокими та реєструвались тільки за допомогою високочутливих методів. Такий результат можна пояснити тим, що при отриманні ювенільних клітин у культурі присутня невелика кількість зооспор, які є сприйнятливими до проникнення вірусу.

Отже, чутливою до впливу вірусу є стадія зооспор, які вкриті лише плазмалемою. Саме в культурі, інфікованій на цій стадії, відмічається найбільший вплив вірусної інфекції на клітини.

РОЗДІЛ 6. ОЦІНКА ПОТЕНЦІЙНОЇ СПРИЙНЯТЛИВОСТІ ДЕЯКИХ ВИДІВ ГРУНТОВИХ ЗЕЛЕНИХ ВОДОРОСТЕЙ ДО ПРОНИКНЕННЯ ФІТОВІРУСІВ (НА ПРИКЛАДІ ВТМ)

Метою даного розділу було перевірити, наскільки поширена серед ґрунтових водоростей сприйнятливість до фітовірусів. Для оцінки поширеності даного явища у природі ми підібрали види ґрунтових водоростей із чотирьох порядків з двох класів відділу Chlorophyta.

Обрані для експерименту види мали три (найпоширеніші) типи вхідних воріт інфекції (див. розділ 3). Розподіл видів водоростей, використаних в експерименті за типами воріт та систематичним положенням наведений в таблиці 2.

Таблиця 2. Систематичне положення та тип воріт видів ґрунтових водоростей, використаних для інокуляції ВТМ

Клас	Порядок	Вид	Тип воріт
Chlorophyceae	Volvocales	Chlamydomonas culleus	Тип "1" (Джгутики. Наявні протягом усього клітинного циклу)
	Scenedesmales	Bracteacoccus minor Bracteacoccus grandis Dictyococcus cf.varians	Тип "3" (Плазмалема клітини на деяких стадіях життєвого циклу - "голі" зооспори)
	Protosiphonales	Chlorosarcinopsis dissociata
		Chlorosarcinopsis gelatinosa
		Chlorosarcinopsis bastropiensis
		Neochlorosarcina negevensis	Тип "2" (Джгутики. Наявні на деяких стадіях клітинного циклу)
Trebouxiophyceae	Trebouxiales	Dictyochloropsis cf. splendida	Тип "3" (Плазмалема клітини на деяких стадіях життєвого циклу - "голі" зооспори)

Підібрані таким чином види ґрунтових водоростей інокулювались ВТМ.

В інокульованих культурах двічі протягом експерименту перевіряли наявність монадних стадій методом світлової мікроскопії. Потім з досліджуваних культур виділяли тотальну РНК, яку перевіряли на наявність нуклеотидних послідовностей ВТМ, що діагностують присутність у клітині даного вірусу методом ПЛР з ВТМ-специфічними праймерами.

Для перевірки якості праймерів, як позитивний контроль, використовували РНК, виділену з рослини тютюну, інфікованої ВТМ. Очікуваний розмір продукту ампліфікації у випадку наявності в водоростевих клітинах ВТМ мав становити ? 700 пар нукл. Результати ампліфікації візуалізували з використанням методу електрофорезу в агарозному гелі.

Контроль наявності монадних стадій в досліджуваних культурах, який проводився під час експерименту, показав, що монадні стадії були присутні в усіх культурах, крім Chlorosarsinopsis bastropiensis.

В ході дослідження було встановлено, що, за винятком C. bastropiensis, в клітинах усіх культур, інокульованих ВТМ, виявлялась специфічна нуклеотидна послідовність гену капсидного білка ВТМ.

Для перевірки відповідності продукту ампліфікації нуклеотидній послідовності гену, який кодує капсидний білок ВТМ, амплікони з Chlorosarsinopsis dissociata та C. gelatinosa були секвеновані, і за результатами сіквенсу проведений пошук відповідних послідовностей у банку генетичної інформації NCBI з використанням пошукової програми BLAST. Для уточнення належності ампліфікованого продукту до гену капсидного білку ВТМ, продукт ампліфікації з інфікованої культури Chlorosarsinopsis dissociata було клоновано та повторно секвеновано за стандартною методикою. Пошук аналогічних послідовностей у Генбанку (GenBank, www.ncbi.nlm.gov) показав, що продукти ампліфікації найбільш схожі з відомими послідовностями гена, який кодує капсидний білок ВТМ (коди сіквенсів AY 140898, AY 633749, AJ 239099). Порівняння даних, отриманих нами, з цими послідовностями показало до 97% гомологій для фрагментів, отриманих як з Chlorosarsinopsis dissociata, так і з C. gelatinosa, інокульованих ВТМ.

Для клонованого амплікону з C. dissociata пошук аналогічних послідовностей у банку генів також показав відповідність ампліфікованого продукту відомим послідовностями гена, який кодує капсидний білок ВТМ (коди сіквенсів AY 140898, AY 633749, AJ 239099). При цьому відсоток гомологій виявився помітно вищим (99%), ніж для неклонованих продуктів ампліфікації.

Використання ПЛР для детекції НК послідовностей ВТМ в клітинах ґрунтових водоростей, штучно інокульованих ВТМ показало, що ВТМ проникає в клітини ґрунтових водоростей, які знаходяться у монадному стані. Позитивний результат було отримано для всіх культур, крім Chlorosarsinopsis bastropiensis.

Отримані результати ще раз підтверджують нашу гіпотезу про те, що здатність вірусу до проникнення в водоростеву клітину залежить від морфобіологічного стану клітини. Саме відсутністю зооспорогенезу в культурі Chlorosarsinopsis bastropiensis під час досліду пояснюється, на нашу думку, негативний результат ПЛР.

В усіх інших культурах, використаних в експерименті, спостерігалось зооспороутворення (для Bracteacoccus minor, B. grandis, Chlorosarcinopsis gelatinosa, C. dissociata, Neochlorosarcina negevensis, Dictyochloropsis cf. splendida, Dictyococcus cf. varians) або утворення монадних стадій (для Chlamydomonas culleus) і результат ПЛР для цих культур був позитивний.

Таким чином, використання ДНК-маркерних технологій на основі ПЛР дало змогу на прикладі Chlamydomonas culleus, Bracteacoccus minor, B. grandis, Chlorosarcinopsis gelatinosa, C. dissociata, Neochlorosarcina negevensis, Dictyochloropsis cf. splendida, Dictyococcus cf. varians довести, що ВТМ здатний проникати в клітини ґрунтових водоростей (переважно тих, що перебувають на стадії зооспор). Факти такого проникнення підтверджені на основі секвенування та подальшої ідентифікації ампліфікованих продуктів шляхом пошуку відповідних послідовностей у банках генетичної інформації. Подібна технологія може бути рекомендована для детекції вірусного геному і в клітинах інших видів ґрунтових водоростей.

Розділ присвячено аналізу та узагальненню результатів, отриманих в роботі. Наведено можливі сценарії взаємодії ґрунтових водоростей із вірусами вищих рослин та кореневою системою рослин у природі, виходячи з експериментальних даних про здатність ґрунтових водоростей уражуватись вірусами вищих рослин, даних про витривалість ґрунтових водоростей до дії несприятливих факторів навколишнього середовища та гіпотези про наявність у деяких ґрунтових водоростей систем сполучення протопласту з навколишнім середовищем (т. зв. "вхідних воріт" вірусної інфекції).

ВИСНОВКИ

Евкаріотичні ґрунтові водорості (зокрема, з відділу Chlorophyta) можуть бути уражені деякими вірусами вищих рослин, що вперше встановлено в умовах лабораторного експерименту за допомогою методів світлової, люмінесцентної та електронної мікроскопії, рослин-індикаторів, імуноферментного аналізу, поверхневого плазмонного резонансу та полімеразної ланцюгової реакції.

Необхідною умовою для проникнення фітовірусів в клітини ґрунтових водоростей є наявність у водоростей стадій, на яких клітина контактує з навколишнім середовищем безпосередньо через ділянки плазмалеми, які не захищені від проникнення віруса клітинною оболонкою (т.зв. "вхідних воріт інфекції"), що показано на модельних системах "Bracteacoccus minor - вірус тютюнової мозаїки" та "Chlorosarcinopsis dissociata - вірус бронзовості томату".

На модельній системі "Bracteacoccus minor - вірус тютюнової мозаїки" показано, що B. minor проявляє сприйнятливість до проникнення ВТМ, і, таким чином, може виступати резервуаром даного фітовірусу в природі.

На прикладі модельної системи "Chlorosarcinopsis dissociata - вірус бронзовості томату" показано, що водорість може проявляти надчутливість до дії фітовіруса, внаслідок чого гине і не може виступати резервуаром вірусної інфекції у природі.

На прикладі дев'яти видів ґрунтових зелених водоростей та двох фітовірусів встановлено, що фітовіруси проникають у водоростеві клітини при наявності у життєвому циклі т.зв. “вхідних воріт інфекції”, тобто стадій, на яких плазмалема клітини (у Bracteacoccus minor, B. grandis, Chlorosarcinopsis gelatinosa, C. bastropiensis, C. dissociata, Dictyochloropsis cf. splendida, Dictyococcus cf.varians), або принаймні її окремі ділянки (Chlamydomonas culleus та Neochlorosarcina negevensis) безпосередньо контактує з оточуючим середовищем.

Результати скринінгу антигенів 6-и фітовірусів у природних ізолятах 11-и найбільш поширених у ґрунтах видів евкаріотичних водоростей свідчать, що хоча б один з антигенів цих вірусів виявляється у 81% досліджених водоростей, тобто ґрунтові водорості характеризуються потенційно високим рівнем вірусоносійства.

В експерименті ураження ґрунтових водоростей фітовірусами не відбувається, якщо клітини повністю вкриті клітинними оболонками і не мають ділянок плазмалеми, що безпосередньо контактують із зовнішнім середовищем (вхідних воріт інфекції).

При дослідженні ультраструктури клітин Bracteacoccus minor з контрольної лінії встановлено, що збільшення кількості хлоропластів в клітинах B. minor відбувається за рахунок поділу парієтальних хлоропластів у поперечному напрямку та внутрішніх хлоропластів у поздовжньому напрямку, причому поздовжній тип поділу хлоропласта зафіксовано вперше.

На ультратонкому рівні у клітинах Bracteacoccus minor виявлено два топологічно асоційованих комплекси органел та клітинних структур: хлоропласт-мітохондріальний комплекс та асоційований ядерний комплекс, що складається з асоційованих з ядерною оболонкою пари центріолей та комплексу Гольджі. Отримані дані дозволяють поточнити класифікацію вікових станів та систему діагностичних ознак даного виду.

СПИСОК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Бойко В.Р. Про необхідність вивчення ґрунтових еукаріотичних водоростей як можливих резервуарів вірусної інфекції вищих рослин // Науковий вісник Національного аграрного університету - 1998. - № 7. - С. 144-148.

Болтовець П.М., Бойко В.Р., Дяченко Н.С., Снопок Б.А., Ширшов Ю.М. Застосування поверхневого плазмонного резонансу для виявлення вірусних антигенів // Вісник Київського національного університету імені Тараса Шевченка. Сер. Біологія - 2001. - Вип. 35. - С. 9-11.

Boltovets P.M., Boyko V.R., Kostikov I.Yu., Dyachenko N.S., Snopok B.A., Shirshov Yu.M. Simple method for plant virus detection: effect of antibody immobilization technique // Journal of Virological Methods - 2002. - Vol. 105. - P. 141-146.

Болтовець П.М., Бойко В.Р., Іве М., Снопок Б.А., Ширшов Ю.М., Дяченко Н.С. Дослідження взаємодії імуноглобулінів та виявлення вірусних антигенів у клітинних гомогенатах методом поверхневого плазмонного резонансу // Мікробіологічний журнал - 2003. - Т. 65, № 4. - С.51-61.

Бойко В.Р., Костіков І.Ю., Сенчугова Н.А., Поліщук В.П., Шевченко Т.П. Про можливість штучного ураження ґрунтової водорості Bracteacoccus minor (Chodat) Petrova (Chlorophyta) вірусом тютюнової мозаїки // Вісник Запорізького державного університету - 2004. - № 1. - С.33-39.

Boltovets P.M., Snopok B.A., Boyko V.R., Shevchenko T.P., Dyachenko N.S., Shirshov Yu.M. Detection of plant viruses using a surface plasmon resonance via complexing with specific antibodies // Journal of Virological Methods - 2004. - Vol. 121. - P. 101-106.

Polischuk V.P., Kostikov I.Yu., Romanenko P.A., Boyko V.R. Probably viral ethiology of disease of soil alga Chlorococcum elkhartiense Arch.et Bold // 1-st European Phycological Congress (Cologne (EPC1), August 11-18, 1996). - Kohln, 1996. - Late Abstracs 2.

Бойко В.Р., Костіков І.Ю., Дарієнко Т.М., Бєлашов Є.В. Про можливу вірусну природу захворювання Chlorococcum elchartiense Arh. et Bold, виділенного з грунту // Тези ІІ Міжнародної конференції "Біоресурси та віруси". - 1998. - С.73-75.

Болтовец П.Н., Бойко В.Р., Снопок Б.А., Ширшов Ю.М. Применение метода поверхностного плазмонного резонанса для обнаружения вирусных антигенов в клетках водорослей // Тези ІІІ Міжнародної конференції "Біоресурси та віруси". - 2001. - С.5.

Boyko V., Senchugova N., Polishjuk V., Shevchenko T., Boltovets P., Hoffmann L., Kostikov I. Artificial infection of the soil alga Bracteacoccus minor by Tobacco Mosaic Virus // Programme and Abstracts of International symposium "Byology and Taxonomy of Green Algae IV" (Smolenice, Slovakia, 24-28, 2002) - 2002. - P.20.

Boyko V.R., Kostikov I.Yu., Boubriak I.I., Hoffmann L. Detection of Tobacco Mosaic Virus in green soil algae Chlorosarcinopsis dissociata Hernd. and Chlorosarcinopsis gelatinosa Chant. et Bold // Programme and Abstracts International conference "Algae in terrestrial ecosystems" (Kaniv, 2005). - Nizhyn. - 2005. - P. 21.

Boyko V.R., Kostikov I.Yu., Hoffmann L. Detection of tobacco mosaic virus in green soil algae // Programme and Abstracts of International symposium "Byology and Taxonomy of Green Algae V" (Smolenice, Slovakia, 25-29, 2007) - 2007. - P.16.

Размещено на Allbest.ru

...