Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ КЛІТИННОЇ БІОЛОГІЇ І ГЕНЕТИЧНОЇ ІНЖЕНЕРІЇ

• УДК 581.143.6:576.5+663.1576.53

ДИНАМІКА КЛІТИННИХ ПОПУЛЯЦІЙ РАУВОЛЬФІЇ ЗМІЇНОЇ ЗА ЗМІНИ УМОВ ВИРОЩУВАННЯ IN VITRO

03.00.11 - цитологія, клітинна біологія, гістологія

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

ПАРНІКОЗА Іван Юрійович

Київ 2009

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано на кафедрі загальної та молекулярної генетики біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка та у відділі генетики клітинних популяцій Інституту молекулярної біології і генетики НАН України

Об'єкт дослідження - динаміка популяцій культивованих клітин штаму К-27 Rauwolfia serpentina у різних умовах вирощування.

Предмет дослідження - особливості змін пасажної та добової динаміки структури клітинної популяції штаму К-27 за адаптації до промислових умов культивування.

Методи дослідження: фізіолого-біохімічні, цитологічні, математичні.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше досліджено вплив зміни умов культивування на пасажну та добову динаміку структури клітинної популяції культури тканин Rauwolfia serpentina - продуцента індолінових алкалоїдів за показниками вмісту ДНК в ядрі та площі ядерця. В цих же умовах вивчено зміну внесків динаміки груп клітин з певним значенням вмісту ДНК в ядрі чи площі ядерця - субпопуляцій - у динаміку показників питомої швидкості накопичення сухої біомаси, індолінових алкалоїдів та трахеїд. Встановлено особливості залежності добової динаміки кількісного складу субпопуляцій клітин за вмістом ДНК та площею ядерця від динаміки проліфераційної активності.

Практичне значення одержаних результатів. Робота є частиною комплексного експерименту, спрямованого на адаптацію штаму К-27 Rauwolfia serpentina до умов промислового виробництва, зокрема оптимізацію умов його вирощування в рідкому живильному середовищі. Результати роботи мають важливе практичне значення для біотехнології, оскільки демонструють участь цитологічних механізмів у забезпеченні продуктивності за зміни умов культивування та є корисними при розробці методів контролю продуктивності тканинних культур-продуцентів та критеріїв паспортизації клітинних штамів.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційну роботу виконано під керівництвом д.б.н., професора, члена-кореспондента НАН України Кунаха В. А. Результати, викладені в дисертації, отримані та проаналізовані особисто дослідником чи за його безпосередньої участі. Усі дослідження проводилися за безпосередньої участі здобувача. Обробка та аналіз отриманих результатів виконані дослідником сумісно з к.б.н. Мірютою Н. Ю., частина експериментальної роботи з аналізу продуктивності виконана в співробітництві з к.б.н. Аль-Аммурі Ю., з якими автор має спільні публікації. Дисертант висловлює глибоку й щиру подяку за суттєву допомогу при проведенні досліджень д.б.н. Кунаху В. А., к.б.н. Мірюті Н. Ю. та м.н.с. Адоніну В. І., за критичні зауваження при аналізі результатів та оформленні роботи к.б.н. Андрєєву І. О., к.б.н. Спірідоновій К. В., к.б.н. Пороннік О. О. та к.б.н. Перерві Т. П., а також іншим співробітникам відділу за моральну підтримку і допомогу при виконанні та оформленні роботи.

Апробація результатів дисертації. Результати роботи доповідалися на Конференції молодих дослідників, аспірантів та студентів (Київ, 2003); на Міжнародній конференції “Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития” (Москва, 2004); на VI Міжнародній конференції “Молекулярная генетика соматических клеток” (Звенигород, Москва, 2005), Міжнародній конференції “Генетика в России и мире” присвяченій 40-річчю Інституту загальної генетики ім. М. І. Вавилова РАН (Москва, 2006), читаннях, присвячених 300-річчю з дня народження К. Ліннея (Луганськ, 2007), а також на наукових семінарах відділу генетики клітинних популяцій Інституту молекулярної біології та генетики НАН України.

Публікації. Результати досліджень представлені у вигляді 5 експериментальних статей, опублікованих в спеціалізованих наукових журналах, і 5 тез доповідей на наукових конференціях та з'їздах.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із списку умовних скорочень, вступу, огляду літератури, матеріалів і методів, результатів досліджень та їх обговорення, підсумків, висновків і списку літератури, що містить 242 посилання. Роботу викладено на 162 сторінках, вона включає 18 таблиць та 60 рисунків.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

клітинний ядро штам культивування

Матеріали і методи дослідження. Вивчали генетично стабільний впродовж понад 20 років вирощування (понад 150 пасажів), штам К-27 R. serpentina, детально описаний в роботах (Кунах, 2005; Мирюта и др., 2006). Досліджено три варіанти його вирощування, що відрізнялися способом культивування, вмістом сахарози та макро- і мікросолей у живильному середовищі, а саме: 1) К-27(10С) - вирощується в стандартних умовах на агаризованому середовищі 10С (Воллосович и др., 1985); 2) К-27(5С) - вирощується на збідненому агаризованому середовищі 5С (Воллосович та ін., 1979); 3) К-27(Рж) - глибинна культура, що культивується в рідкому середовищі Рж (Каухова та ін., 1981), рекомендованому до промислового вирощування (Кунах та ін., 2006 патент), (Рис.1).

Культуру тканин вирощували в колбах об'ємом 250 мл, які містили 50 мл середовища. Маса експланта - 4-5 г живої тканини на колбу. Глибинну культуру вирощували на шейкерах з частотою 60-70 коливань за хв. Усі варіанти культивували при температурі 25-27С, без освітлення та при відносній вологості повітря 70-80%. Тривалість пасажу до пересадки складала 35-40 діб, а до збирання врожаю - 60 діб.

Для одержання показників продуктивності кожну п'яту добу культивування відбирали 3-5 колб з середнім темпом росту тканин. Вихід свіжої та сухої біомаси після її висушування при 551С визначали зважуванням. Алкалоїди групи індоліну екстрагували хлороформом і визначали фотометричним методом за якісною реакцією з концентрованою азотною кислотою з утворенням нітрозопохідних сполук, що мають яскраво-пурпурове забарвлення (Воллосович и др., 1977).

Крім того, як характеристику одного з шляхів диференціації клітин, яка супроводжує диференціацію культури тканин до синтезу вторинних метаболітів, вивчали накопичення трахеїд.

Для цитологічного аналізу зразки відбирали кожної доби об 11 годині ранку протягом 40 діб. Для з'ясування впливу процесів проліферації на динаміку структури популяції культивованих клітин було вивчено добовий (циркадний) індекс клітин, що ділилися мітотично, та клітин, які щойно закінчили поділ, а також структуру клітинної популяції за вмістом ДНК та площею ядерця на короткому проміжку пасажу, а саме впродовж трьох діб: 12-15-ї діб пасажу для варіанту К-27(10С) та 9-11 добу - для варіанту К-27(Рж).

Вміст ДНК (відносний - ввДНК) та площу ядерця вивчали в препаратах інтерфазних клітин, забарвлених за Фьольгеном та імпрегнованих сріблом за (Kiernon, 1990; Архипчук, 1995). Для денситометрії застосовували оптичну систему, яка складалася з зеленого світлофільтра мікроскопа NU-2E (Carl Zeiss), червоного світлофільтра цифрової камери CCD Sac-410 PA, відеоадаптера Asus V 3000. Вимірювання щільності зображення у відносних одиницях проводили за допомогою програми Scion Image на цифрових фотографіях відносно забарвленої за Фьольгеном анафази. Вимірювання площі ядерця проводилося з використанням програми Corel Photo-Paint. Загалом для кожного параметру проаналізовано 14400 клітин.

Індекси проліферації та накопичення трахеїд оцінювали на давлених препаратах, забарвлених ацетоорсеїном. Для кожної точки аналізували по 5 тис. клітин, всього було вивчено понад 7 млн. клітин.

Для отримання кривих питомої швидкості накопичення сухої біомаси та індолінових алкалоїдів, що порівнювані з динамікою груп клітин за вмістом ДНК та площею ядерця, здійснювали чисельне диференціювання та підбір кривої, яка найкраще описує отримані результати методом найменших квадратів. Кореляцію динаміки параметрів, які порівнювалися, знаходили методом парної лінійної регресії. В роботі також застосовано елементи математичного моделювання на основі термодинамічного принципу.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Динаміка продуктивності, структура клітинної популяції за вмістом ДНК в ядрах та площею ядерця та їх зв'язок за зміни умов культивування. На пасажному рівні показники продуктивності вивчали кожні 5 діб впродовж 60 діб росту (звичайна тривалість пасажу до пересадки - 35-40 діб). Для аналізу динаміки шляхом математичного диференціювання визначали питому швидкість накопичення сухої біомаси, індолінових алкалоїдів та трахеїд. У варіантів К-27(10С) та К-27(Рж) в динаміці цих показників було виділено дві часові складові, а у варіанта К-27(5С) для усіх показників виділено одну часову складову (Рис. 2).

Гетерогенність клітинної популяції оцінювали за двома показниками: вмістом ДНК в ядрі та площею ядерця (рис. 3).

На відміну від підрахунку числа хромосом, дослідження кількості ДНК дозволяє охопити всю клітинну популяцію, адже більшість клітин калюсної тканини на момент дослідження перебуває в інтерфазі.

Вміст ДНК може характеризувати функціональну активність клітин, тому цей показник дозволяє виділити функціонально-відмінні частини із загальної клітинної популяції.

З цією ж метою можна використовувати площу ядерця, яка є показником білоксинтетичної активності клітин.

На дослідженому часовому відрізку культивування (0-40 доба) в усіх варіантів штаму К-27 розмах мінливості за ознакою “вміст ДНК” складав від 1C до 11С.

У вихідного варіанта культивування К-27(10С) розмах мінливості за ознакою “площа ядерця” складав від 3 до 19 мкм², та від 0,9 до 11 мкм² у варіантів К-27(5С) та К-27(Рж).

Клітини за обома ознаками групували у морфометричні класи, для кожного з яких будували криву динаміки. Окремі класи, для динамік яких виявлено кореляцію, об'єднували в групи, функціональне значення яких визначали на підставі наявності лінійної кореляції сумарної динаміки цих класів з динамікою першої чи другої складової показників продуктивності. Виділені функціональні групи клітин з певним вмістом ДНК чи площею ядерця розглядали як субпопуляції, які певним чином впливали на показники продуктивності.

У всіх досліджених варіантів за вмістом ДНК виділено дві субпопуляції клітин, які у варіантів К-27(10С) і К-27(5С) охоплювали клітини із вмістом ДНК 1,0-2,9С та 3,0-6,9С; а у К-27(Рж) - з 1,0-2,9С та з 3,0-8,9С. Варіанти відрізнялися за співвідношенням цих груп клітин. Так, у вихідного штаму К-27(10С) обидві субпопуляції клітин були представлені майже у рівних кількостях (45% та 52% популяції). У варіанту К-27(5С) домінували клітини з 1,0-2,9С ДНК (60%), тоді як у варіанту К-27(Рж) - клітини з 3,0-8,9С (75 %).

За площею ядерця (ПЯ) у кожного з варіантів культивування виділили по дві функціональні субпопуляції клітин, які були різними на першій та другій часових складових пасажної динаміки показників продуктивності. Зокрема, для К-27(10С) на першій складовій виділено субпопуляції клітин з ПЯ понад 17 мкм² та 12,0-16,9 мкм² (тут і далі друга субпопуляція домінуюча). На другій складовій - клітини з ПЯ 12,0-16,9 мкм² та менше 10,9 мкм². Для варіанту К_27(5С) виділено групи клітин з ПЯ менше 4 мкм² та понад 5 мкм². Для К-27(Рж) на першій складовій виділено лише одну субпопуляцію клітин з ПЯ понад 8 мкм², а на другій складовій - дві субпопуляції клітин з ПЯ 2,0-4,9 мкм² та понад 8 мкм².

Внесок кожної з виділених субпопуляцій у динаміку відповідного показника продуктивності або диференціації в різних варіантах штаму визначали шляхом розрахунку коефіцієнтів кореляції методом парної лінійної регресії. При цьому, виходячи з посилання про лінійність залежності біологічної сили - динаміки частки клітин певної субпопуляції - з відповідним потоком (показником продуктивності або диференціації), матрицю коефіцієнтів кореляції R_mn (табл. 1) записували у вигляді 33 за принципом взаємності Онзагера). Такий запис з точки зору біології може свідчити про диференціацію внеску однієї субпопуляції клітин (ймовірно, за рахунок диференціації клітин різними шляхами) в динаміку питомих швидкостей накопичення біомаси, алкалоїдів та трахеїд.

Аналіз коефіцієнтів кореляції, розрахованих для пасажної динаміки питомої швидкості накопичення алкалоїдів, показує, що на першій часовій складовій пасажу у вихідного варіанту К-27(10С) динаміка частки клітин субпопуляції з вмістом ДНК 1,0-2,9 С має позитивний внесок в динаміку питомої швидкості накопичення алкалоїдів, тоді як динаміка частки клітин субпопуляції 3,0-6,9С впливає на нього негативно. У варіанту К-27(5С) ці дві субпопуляції мають протилежні внески.

У варіанту К-27(Рж) субпопуляція клітин з вмістом ДНК 1,0-2,9 С негативно впливає на динаміку накопичення алкалоїдів, а субпопуляція 3,0-6,9С розпадається на дві частини, одна з яких має позитивний внесок в динаміку цього показника, а інша - негативний. На другій складовій динаміки накопичення алкалоїдів картина внесків динамік виділених субпопуляцій клітин суттєво змінюється лише для варіанту К-27(Рж), у якого вони набувають протилежного значення. При розгляді питомої швидкості накопичення біомаси варіанти штаму відрізняються між собою за внеском окремих популяцій, крім того, цей внесок протилежний на різних часових складових пасажу у варіантів К-27(10С) та К-27(Рж). Найбільш стабільним є позитивний зв'язок між динамікою частки клітин субпопуляції з вмістом ДНК 3,0-6,9С та питомою швидкістю накопичення трахеїд, який виявлено у варіантів К-27(10С) та К-27(Рж) на обох часових складових пасажу, в той же час у варіанту К-27(5С) цей показник позитивно корелює з динамікою частки клітин субпопуляції з вмістом ДНК 1,0-2,9 С (див. табл.1).

Таблиця 1

Коефіцієнти кореляції R_mn динаміки окремих складових показників продуктивності і динаміки частки клітин певної субпопуляції різних варіантів культивування штаму К-27

Примітки. m - питома швидкість накопичення: g - сухої біомаси; dt - трахеїд; dc - індолінових алкалоїдів

У результаті аналізу внесків у показники продуктивності субпопуляцій, виділених за площею ядерця, виявлено відміну між варіантами за напрямком внеску субпопуляцій клітин з певною площею ядерця, а також зміни напрямку внеску на різних часових складових пасажу (див. табл.1). Виявлено, що в порівнянні з варіантом К-27(10С), в якого внески у динаміку всіх показників продуктивності роблять клітини з площею ядерця від 12 до понад 17 мкм², в інших варіантів культивування внесок демонструють клітини порівняно менших класів: 1,0-3,9 та 4,0-10,9мкм² у варіанту К-27(5С) та 2,0-4,9 та 8,0-10,9 мкм² у К-27(Рж).

Вплив проліферації на динаміку структури популяції культивованих клітин за вмістом ДНК в ядрах та площею ядерця. В цій частині роботи вивчали залежність динаміки структури популяції культивованих клітин від процесів клітинної проліферації. Зважаючи на невелику тривалість процесів клітинного поділу, дослідження структури популяції проводили впродовж короткого проміжку часу. Було вивчено динаміку мітотичного індексу (МІ) та індексу клітин, які щойно закінчили поділ (КІ), а також структуру клітинної популяції за вмістом ДНК та площею ядерця. Для дослідження вибрано період, який характеризується максимальним приростом біомаси та продукцією індолінових алкалоїдів, а саме з 12-ї по 15-ту добу пасажу для варіанту К-27(10С) та 9-11-ї доба для варіанту К-27(Рж). Матеріал відбирали кожні 2 години.

Вивчали субпопуляції клітин за вмістом ДНК і площею ядерця, для яких було встановлено функціональну значимість на пасажному рівні. На дослідженому відрізку пасажу у структурі варіанту К-27(10С) домінувала субпопуляція клітин 3,0-6,9С (70,6%); а у варіанту К-27(Рж) - 3,0-8,9С (82%). За площею ядерця досліджували динаміку частки клітин таких субпопуляцій: у варіанту К-27(10С) - одна, з ПЯ більше 17 мкм², та друга - 12,0-16,9 мкм²; у варіанту К-27(Рж) - клітини з ПЯ понад 8 мкм² та ПЯ менше 8 мкм².

Мітотичний індекс у % вираховували на різних ділянках тканини, при цьому окремо підраховували клітини, що знаходились на різних стадіях мітотичного циклу (Рис. 4).

Обидва варіанти культивування мали подібну циркадну ритміку мітозів, яка включала шість основних піків мітотичної активності (по два піки на добу), положення яких у часі змінювалось від доби до доби. Крім того, вони не відрізнялися і за значенням середньої величини мітотичного індексу, який становив 0,14%. У динаміці індексу клітин, які перебували в мітозі та клітин, які щойно закінчили поділ в обох варіантах також спостерігали шість основних піків (рис. 5).

Максимальне значення КІ було вищим у К-27(10С) - 2,5% проти 1,2% у К-27(Рж). На дослідженому часовому відрізку пасажу за величиною середнього значення індекс клітин, які щойно закінчили поділ перевищував мітотичний індекс: у варіанту К-27 (10С) середній КІ (1,1%) перевищував МІ (0,14%) майже на порядок, тоді як у варіанту К-27(Рж) він був 0,52%, і перевищував МІ (0,14%) майже в 3 рази.

За допомогою методу парної лінійної регресії вивчили залежність між динамікою індексів проліферації та динамікою частки клітин субпопуляцій з певним вмістом ДНК і площею ядерця. Визначали наявність лінійної залежності між динаміками показників проліферації (МІ та КІ) і досліджуваних субпопуляцій клітин. Встановлено лінійність цієї залежності.

З метою визначення впливу проліфераційних механізмів на структуру популяції культивованих клітин аналізували кореляційний зв'язок між динамікою мітотичного індексу, а також індексу клітин, які щойно закінчили поділ, з динамікою кількості клітин певних субпопуляцій. Формування клітин з певними значеннями площі ядерця та вмістом ДНК може відбуватися через деякий час після поділу. Щоб урахувати це явище, був додатково проведений розрахунок коефіцієнтів кореляції із послідовним зсувом динаміки поділів відносно динаміки відповідної субпопуляції вперед у часі із кроком, рівним двом годинам (див. приклад розрахунку на рис. 6, б, г). Визначені таким чином коефіцієнти кореляції наведено в табл. 2, 3.

Зважаючи на несинхронність процесів диференціації клітин, утворених тим чи іншим проліферативним шляхом, біологічне значення представленого в таблицях 2, 3 набору кореляцій полягає в тому, що він відображає часові проміжки, впродовж яких ці клітини можуть поповнювати відповідні субпопуляції як за вмістом ДНК, так і за площею ядерця.

Отримані внаслідок проведеного кореляційного аналізу дані (табл. 2), вказують на те, що у варіанту К-27(10С) зміни динаміки КІ можуть викликати відповідні зміни в структурі популяції культивованих клітин за вмістом ДНК із відставанням на 0-12 годин, тоді як зміни динаміки МІ - через 0, 22-26 і 32-36 годин. У варіанту К-27 (Рж) вплив динаміки КІ на структуру популяції може виявлятися із відставанням на 0-16 годин, а вплив динаміки МІ - із затримкою 0, 18-20 та 26-28 годин.

В різних умовах культивування спостерігали відмінності у спрямованості впливу динаміки проліфераційних процесів на структуру клітинної популяції. У варіанту К-27 (10С) відмічено позитивну кореляцію динаміки КІ та МІ із змінами частки клітин субпопуляції з вмістом ДНК 3,0-6,9С, що відбуваються із відставанням на 0-12 годин, та негативну - із змінами, що відбуваються із зсувом на 22-36 годин. Відповідний вплив на кількісні зміни субпопуляції з вмістом ДНК 1,0-2,9С має протилежну спрямованість. У варіанту К-27 (Рж) спостерігали протилежну картину: динаміка КІ та МІ позитивно корелювала із змінами кількості клітин з 1,0-2,9С, що відбуваються із зсувом у часі на 0-16 годин.

Таким чином, на невеликих часових зсувах новоутворені клітини можуть спеціалізуватися у ті субпопуляції за вмістом ДНК, що в обох варіантів культивування на першій часовій складовій пасажної динаміки показників продуктивності мають позитивний внесок у питому швидкість накопичення сухої біомаси і трахеїд (3,0-6,9С у варіанту К-27(10С)), або сухої біомаси (1,0-2,9С у варіанту К-27(Рж)).

На більших же часових зсувах новоутворені клітини спеціалізуються у субпопуляції, які в обох варіантів культивування на пасажному рівні мають внесок в питому швидкість накопичення індолінових алкалоїдів: 1,0-2,9С у варіанту К-27(10С) та 3,0-8,9С у варіанту К-27(Рж).

Подібні особливості внеску проліфераційних механізмів виявлені і для субпопуляцій, виділених за значенням площі ядерця (табл. 3). У вихідного варіанту культивування К-27 (10С) встановлено позитивну кореляцію динаміки МІ із змінами кількості клітин з площею ядерця понад 17 мкм², що відбуваються одразу та із відставанням на 10-12 годин. У варіанту глибинного вирощування К-27 (Рж) виявлено позитивну кореляцію динаміки КІ із змінами частки субпопуляції клітин з площею ядерця понад 8 мкм², що відбуваються із затримкою в часі на 2-8 годин та негативну із змінами, зсунутими на 26-28 годин.

Поряд з цим, спостерігається позитивна кореляція динаміки МІ зі змінами частки субпопуляції клітин з площею ядерця понад 8 мкм², що відбуваються одразу або через 2 години та негативну із змінами, зсунутими на 10-12 годин. Для субпопуляції з площею ядерця менше 8 мкм² зазначені кореляційні зв'язки мають протилежний знак.

Для вихідного варіанту культивування К-27(10С), при зсуві динаміки мітотичного індексу та індексу клітин, які щойно закінчили поділ, вздовж осі часу вправо відносно динаміки субпопуляцій клітин з певними значеннями площі ядерця більше, ніж на 16 годин, виявили позитивну кореляцію з динамікою субпопуляції клітин з площею ядерця понад 17 мкм², яка свідчить про збільшення кількості цих клітин в зазначений часовий проміжок внаслідок проліферації.

Таблиця 2

Коефіцієнти кореляції R динаміки клітин з вмістом ДНК в ядрі 1,0-2,9С та 3,0-6,8С (К-27 (10С)) чи 3,0-8,9С (К-27 (Рж)) та динаміки часток клітин, які перебувають в мітозі (МІ) чи щойно закінчили поділ (КІ)

4. Як за стандартних умов, так і в умовах глибинної культури, ті субпопуляції клітин, які в першій половині пасажу роблять позитивний внесок у приріст сухої біомаси та трахеїд (3-6,9С за стандартних умов), або сухої біомаси (1-2,9С в умовах глибинного вирощування) поповнюються протягом 0-16-ї години після клітинного поділу.

5. На часових проміжках від 0 до 16-ї години після поділу новоутворені клітини поповнюють субпопуляції 1-2,9С в стандартних умовах, та 3-8,9С за глибинного вирощування, які протягом пасажу роблять внесок у накопичення індолінових алкалоїдів. При переході до умов глибинного вирощування виявлено також зміну складу набору субпопуляцій за площею ядерця та зміну часового інтервалу, протягом якого вони поповнюються внаслідок проліферації.

6. Перенесення високопродуктивного штаму К-27 з агаризованого середовища безпосередньо в умови глибинної культури, які пропонуються для промислового вирощування, супроводжується суттєвими змінами складу клітинної популяції та внеску окремих субпопуляцій клітин з різним вмістом ДНК та площею ядерця в динаміку показників продуктивності. Проміжне культивування на збідненому агаризованому середовищі дозволяє уникнути одночасного впливу стресу, пов'язаного зі зміною складу середовища та способу культивування, що сприяє адаптації клітинної популяції та збереженню високої продуктивності.

ПЕРЕЛІК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ