Размещено на http://www.allbest.ru/

МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ

ОДЕСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ імені І.І. МЕЧНИКОВА

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

ПОЛІМОРФІЗМ WX-ГЕНІВ І РОЗРОБКА БІОТЕХНОЛОГІЇ ОЦІНКИ ТА КОНТРОЛЮ ВМІСТУ АМІЛОЗИ В ПРОЦЕСІ СЕЛЕКЦІЇ ПШЕНИЦІ

03.00.20 - біотехнологія

ПЕТРОВА ІРИНА ВОЛОДИМИРІВНА

Одеса - 2009

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у відділі молекулярної генетики Південного біотехнологічного центру в рослинництві УААН (м. Одеса).

Науковий керівник: доктор біологічних наук,

професор, академік УААН

Сиволап Юрій Михайлович

Південний біотехнологічний центр в рослинництві УААН

директор

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук,

професор, член-кореспондент УААН

Левицький Анатолій Павлович

Державна установа «Інститут стоматології АМН України»

кандидат біологічних наук,

Зеленіна Галина Артемівна

Південний біотехнологічний центр в рослинництві УААН

вчений секретар

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Одним із напрямів рослинництва є створення за допомогою молекулярно-генетичних, біохімічних методів біотехнологій підвищення ефективності селекції сільськогосподарських рослин. Дослідження більшості селекційних центрів спрямовані на створення сортів озимої м'якої пшениці з покращеними якісними та технологічними показниками зерна. Крім генетичного контролю запасних білків, що впливають на хлібопекарні властивості та технологічні якості зерна, в останній час особлива увага надається такому показникові, як вміст амілози в пшеничному крохмалі. Низький або нульовий вміст амілози обумовлюється мутантним станом Wx-генів, які кодують фермент, що контролює синтез даного полімеру. Дані гени ідентифіковано та локалізовано у пшениці Wx-А1 (7AS), Wx-В1 (4AL), Wx-D1 (7DS) [Nakamura et al., 1993].

Відсутність сукупності оптимізованих методів, які надали б можливість контролювати вміст амілози на різних етапах вегетації рослин, сповільнює процес створення сортів та ліній м'якої пшениці з низьким або нульовим вмістом амілози.

У зв'язку з цим теоретичний та практичний інтерес представляє вивчення питань, що стосуються ефективності використання різноманітних методів для оцінки та контролю вмісту амілози у крохмалі та детекції Wx-генів. Розробка біотехнології оцінки та контролю вмісту амілози має велике значення для генетико-селекційних досліджень, оскільки дозволяє створювати сорти пшениці з низьким або нульовим вмістом амілози в крохмалі зерна. Крохмаль зерна таких сортів матиме технологічні якості, властиві окремій групі модифікованих крохмалів. Тобто, не вдаючись до хімічної, фізичної та ферментативної обробки, можна буде отримувати високоякісну сировину для різних галузей промисловості. Використання борошна із зерна з такими якостями відкриває широкі перспективи для хлібопекарної промисловості, для розширення асортименту харчових продуктів та виробництва біоетанолу [Рибалка та ін., 2005; Рибалка та ін., 2007], що свідчить про актуальність досліджень у даному напрямі.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Роботу виконано у відділі молекулярної генетики Південного біотехнологічного центру в рослинництві (ПБЦ) у рамках державної науково-технічної програми „Сільськогосподарська біотехнологія 2006-2010 рр.”, підпрограми 1 „Розробити біотехнології створення нових генотипів в рослинництві та генетичного контролю кількісних ознак”. Дослідження провадили згідно з завданням 01.02 „Розробка ДНК-технології визначення показників зерна м'якої пшениці: твердозерність/м'якозерність, низький вміст амілози” (номер державної реєстрації 0106U002663).

Мета і завдання досліджень. Метою роботи є розробка біотехнології оцінки та контролю вмісту амілози в процесі селекції пшениці.

Для досягнення поставленої мети вирішували такі завдання:

1. Удосконалити методики визначення вмісту амілози у крохмалі зерна.

2. За допомогою ДНК-технології детекції алельного стану Wx-генів дослідити генетичний поліморфізм Wx-локусів сортів пшениці української селекції та окремих представників роду Aegilops.

3. Здійснити генетичний аналіз популяції F₅, одержаної від схрещування сорту Куяльник Ч Wx-12 (99ID524), за результатами молекулярно-генетичного тестування алелів Wx-локусів.

4. Дослідити алельний стан мікросателітних локусів у рослин з низьким вмістом амілози у крохмалі (Wx-A1b, Wx-B1b, Wx-D1b).

Об'єкт дослідження - алельний стан Wx-генів сортів та ліній м'якої пшениці, гранулометричний склад крохмалю, абсорбція амілози.

Предмет дослідження - ДНК-технологія детекції алельного стану Wx-генів сортів та ліній м'якої пшениці

Методи дослідження - ПЛР-аналіз (алель-специфічна ПЛР, STS, SSR), генетичний аналіз, фізичні (спектрофотометрія в діапазоні довжин хвиль 400-800 нм), біохімічні (забарвлювання препаратів крохмальних гранул розчином КI-I₂) методи, статистичний аналіз (критерій ч², дисперсійний аналіз).

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведено комплексне молекулярно-генетичне, біофізичне та біохімічне дослідження вмісту амілози в крохмалі зерна сортів пшениці української селекції. Визначено ефекти впливу окремих алелів Wx-генів (Wx-A1a - 0,050; Wx-B1a - 0,054;
Wx-D1a - 0,082) на вміст амілози в селекційному матеріалі, відносно альтернативних нуль-алелів. Вперше в Україні запропоновано біотехнологію оцінки та контролю вмісту амілози в крохмалі зерна. Біотехнологія базується на використанні ПЛР-аналізу і спектрофотометрії та дозволяє провадити контрольовану селекцію пшениці з низьким вмістом амілози. Вперше запропоновано при створенні Wx-аналогів сортів пшениці використовувати визначення генетичних дистанцій і контрольований добір генотипів із потрібними комбінаціями алелів. Встановлено ефективність застосування даної біотехнології для прогнозування вмісту амілози та добору генотипів із низьким або нульовим вмістом цього полімеру на стадії паростка.

Практичне значення отриманих результатів. На основі отриманих результатів розроблено біотехнологію оцінки та контролю вмісту амілози в процесі

селекції сортів та ліній м'якої пшениці з низьким або нульовим вмістом даного полімеру у крохмалі.

Розроблено методичні рекомендації, щодо діагностики алельного стану Wx-генів генотипів озимої м'якої пшениці за допомогою ПЛР-аналізу.

Результати цих досліджень підтверджено патентом України на корисну модель „Спосіб діагностики та контролю Wx-генів при створенні сортів пшениці з низьким або нульовим вмістом амілози”.

Особовий внесок здобувача. Здобувачем зроблено огляд даних літератури щодо ефективності застосування молекулярних маркерів для генетико-селекційних досліджень при селекції зернових культур з поліпшеними якісними та технологічними показниками зерна. Планування досліджень, проводилось разом із керівником акад. УААН Ю.М. Сиволапом та провідним науковим співробітником відділу молекулярної генетики ПБЦ, к.б.н., с.н.с. С.В. Чеботар. Інтерпретацію одержаних результатів та підготовку до друку наукових статей проводили спільно з к.б.н., с.н.с. С.В. Чеботар, та к.с-г.н. О.М. Хохловим (Селекційно-генетичний інститут - Національний центр насіннєзнавства та сортовивчення, СГІ). Автором особисто сформульовано основну мету та завдання досліджень, проведено експериментальну роботу. В процесі роботи над матеріалом дисертації розроблено методичні рекомендації, сформульовано основні висновки і опубліковано наукові статті. Написання дисертації та її оформлення здійснено автором самостійно.

Апробація результатів дисертації. Матеріали, викладені у дисертаційній роботі, було представлено на III Міжнародній науковій конференції „Фактори експериментальної еволюції організмів”: АР Крим, Алушта, 25 - 28 вересня 2006 р.; на III International Young Scientists conference „Biodiversity. Ecology. Adaptation. Evolution”: Ukraine, Odessa, 15-18 May 2007; на VIII з'їзді товариства генетиків та селекціонерів імені М.І. Вавилова: АР Крим, Алушта, 24 - 28 вересня 2007 р.; на V Міжнародній науковій конференції „Геном рослин”: Україна, Одеса, 13 - 16 жовтня 2008 р.

Публікації. За темою дисертаційної роботи опубліковано вісім наукових праць, що відображають основний зміст дисертації. З них дві статті у виданнях, затверджених ВАК України фаховими для галузі біологічних наук, чотири публікації - у вигляді тез та матеріалів конференцій.

За результатами досліджень отримано патент України на корисну модель, опубліковано методичні рекомендації.

Структура і обсяг дисертації. Дисертація складається з вступу, огляду літератури, матеріалів і методів, експериментальної частини, аналізу та узагальнення результатів, висновків і практичних рекомендацій, списку використаних літературних джерел, що налічує 125 найменувань (з них 91 іншомовні). амілоз спектрофотометрія біотехнологія селекція

Дисертація викладена на 118 сторінках друкарського тексту, вміщує 22 таблиці, 31 рисунок.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

РОЗРОБКА БІОТЕХНОЛОГІЇ ОЦІНКИ І КОНТРОЛЮ ВМІСТУ АМІЛОЗИ В ПРОЦЕСІ СЕЛЕКЦІЇ ПШЕНИЦІ

Огляд літератури. Wx-гени - синтез амілози. У розділі проведено аналіз публікацій за результатами досліджень вітчизняних та зарубіжних науковців з питань застосування молекулярних маркерів для генетико-селекційних досліджень при селекції зернових культур з поліпшеними якісними та технологічними показниками зерна. Особлива увага приділялась вивченню такого показника, як низький або нульовий вміст амілози в пшеничному крохмалі. Відсутність сукупності ефективних методів прогнозування вмісту амілози у крохмалі рослин на етапі до колосіння, сповільнює процес селекції пшениці спрямованої на низький вміст даного полімеру. У зв'язку з цим актуальним напрямом є вивчення ефективності використання різноманітних методів для оцінки та контролю вмісту амілози, їх удосконалення та створення на їх основі біотехнології. З'ясуванню даних невирішених питань і присвячена дана дисертаційна робота.

Матеріали та методи досліджень. Дослідження проводили протягом 2004 - 2007 років у відділі молекулярної генетики ПБЦ. Матеріалом для дослідження слугували 46 сортів озимої м'якої пшениці з різних центрів створення, зареєстрованих в Державному реєстрі сортів рослин України 2006 року (Альбатрос одеський, Одеська 162, Українка одеська, Херсонська остиста, Київська остиста, Фантазія, Красуня одеська, Струмок, Вікторія одеська, Миронівська 33, Мірич, Білоцерківська напівкарликова, Леля, Лада одеська, Любава одеська, Українка полтавська, Лузанівка одеська, Знахідка одеська, Ятрань 60, Прима одеська, Застава одеська, Зустріч, Куяльник, Диканька, Побєда, Станічна, Фаворитка, Писанка, Либідь, Білосніжка, Краснодарська 99, Апогей луганський, Світанок 1, Батько, Супутниця, Ренан, Фарандоль, Обрій, Одеська 133, Тіра, Вимпел, Порада, Миронівська 27, Альбідум 117, Лютесценс 7), 11 ліній Wx-пшениці, створених Р. Грейбошем (University of Nebraska, Lincoln, USA). Селекційні популяції озимої м'якої пшениці F₃ та F₅, одержані від схрещування сорту Куяльник (Wx-A1a, Wx-B1a, Wx-D1a) з лінією Wx-12 (Wx-A1b, Wx-B1b, Wx-D1b), надано для дослідження д.б.н. О.І. Рибалкою (СГІ).

Забарвлювання препаратів крохмалю розчином KI-I₂ . Крохмаль виділяли з 12 зерен за методикою, запропонованою M. Oda [1980] та забарвлювали розчином 0,4 % KI/0,004 % I₂ згідно [Fujitа et al., 2001].

Спектрофотометричне визначення вмісту амілози в крохмалі. Зразки для проведення аналізу було підготовлено згідно методу, описаному Fujitа et al. [2001]. Спектральні дані отримували на спектрофотометрі Cary Win UV фірми „Varian” (Австрія) у режимі повного сканування в діапазоні 350-800 нм з кроком 1 нм. Формою первинного представлення даних були показники абсорбції. Визначення параметрів багатовимірної лінійної регресії та оцінку метрологічних характеристик у системі трьохфакторного дисперсійного аналізу (генотип: блок: серія) провадили за відповідною процедурою у спеціалізованому програмному пакеті Agrobase 21 „Agronomix” (Канада).

Виділення ДНК. Виділення ДНК з фрагменту паростка проводили згідно стандартної методики з використанням СТАВ-буферу [Сиволап, 1998]. Концентрацію виділеної ДНК визначали на флюориметрі „ТКО 100 Dedicated mini Fluorometer” („Hoefer Scientific Instruments”, США) у 1ЧTNE буфері (3 М NaCl, 50 мM Na₂HPO₄) в присутності флюорисцентного барвника Hoechst 33258 згідно інструкції виробника обладнання.

Ампліфікація ДНК з STS та SSR - праймерами. Ампліфікацію проводили на приладі „Терцик” („ДНК - технологія”, Росія). Реакційна суміш для проведення ПЛР з праймерами до локусів Wx-A1, Wx-B1, Wx-D1 об'ємом 20 мкл містила: 100 нг ДНК, 1,5 мМ MgCl₂, 10 пмоль кожного праймера, 0,2 мМ кожного dATP, dCTP, dTTP, dGTP, 2 мкл 10ЧПЛР буферу и 1 од. Taq-полімерази. Нуклеотидні послідовності праймерів для детекції алельного стану за Wx-локусами наведено в табл. 1. В епендорфи поверх реакційної суміші нашаровували 30 мкл мінеральної олії.

Температурний режим ампліфікації для пар праймерів до локусів Wx-B1, Wx-D1 був таким: перша денатурація 95 єС - 5 хв.; 95 єС - 30 сек, 55 єС - 30 сек, 72 єС - 2 хв. - 32 цикли; остання елонгація 72 єС - 7 хв. Ампліфікацію з парами праймерів до локусу Wx-A1 проводили в наступному режимі: перша денатурація 94 єС - 1,3 хв.; 94 єС - 1 хв., 62 єС - 40 сек, 72 єС - 1 хв. - 35 циклів; остання елонгація 72 єС - 2 хв.

Таблиця 1

Пари праймерів для детекції алельного стану за Wx-локусами

Назва праймерів	Локус	Послідовність праймерів (5?-3?)	Літературне джерело
AFC AR2	Wx-A1 (7АS)	tcgtgttcgtcggcgccgagatgg ccgcgcttgtagcagtggaagtacc	[Nakamura et al., 2003]
Wx98F1 Wx98R1	Wx-B1 (4AL)	tcctcctccttcctgccaattcc tcaccaccttcttcacgtcg	[McLauchlan et al., 2001]
WxD1b1F WxD1b1R	Wx-D1 (7DS)	acaggatctctcctggaag gcaaggaaaatagtgaagc	[McLauchlan et al., 2001]
WMC 262	Wx-B1 (4AL)	gctttaacaaagatccaagtggcat gtaaacatccaaacaaagtcgaagg	[McLauchlan et al., 2001]

Для проведення SSR-аналізу використовували пари праймерів до мікросателітних локусів: Xgwm18 (1В), Xgwm382 (2А), Xgwm261 (2D), Xgwm155 (3A), Xgwm389 (3B), Xgwm186 (5A), Xgwm179 (5A), Xgwm156 (5A), Xgwm304 (5A), Xgwm595 (5A), Xgwm408 (5B), Xgwm499 (5B), Xgwm443 (5B), Xgwm190 (5D), Xgwm577 (7B), Xgwm437 (7D). ПЛР виконували згідно рекомендацій [Rцder et al., 1998].

Реакційна суміш для проведення SSR - ПЛР об'ємом 20 мкл містила: 100 нг ДНК, 2,0 мМ MgCl₂ , 10 пмоль кожного праймера, 0,2 мМ кожного dATP, dCTP, dTTP, dGTP, 2 мкл 10ЧПЛР буферу та 1од. Taq полимерази. Температурний режим ампліфікації для SSR - праймерів був таким: перша денатурація 94 єС - 1,3 хв.; 94 єС - 1 хв., 60 єС - 40 сек, 72 єС - 1 хв. - 35 циклів; остання елонгація 72 єС - 2 хв.

Електрофорез та візуалізація продуктів ПЛР. Для ідентифікації алельного складу досліджуваних локусів продукти ПЛР фракціонували у 10 % денатуруючому (10 % акріламід, 10 Ч ТВЕ, 8 М сечовина) та 7 % (30 % акріламід, 10 Ч ТВЕ, дистильована Н₂О) поліакриламідних гелях в 1ЧТВЕ-буфері (89,0 мM трис, 89,0 мM борна кислота, 2,0 мM Na₃EDTA) за постійної напруги 550 В 2-3 години залежно від довжини фрагментів ампліфікації. Електрофорез проводили на обладнанні Helicon (Росія). Продукти ампліфікації ДНК у гелях забарвлювали за допогою 0,012 М AgNO₃ згідно з Silver sequence TMDNA Sequencing Sistem Technical Manual (Promega). Отримані електрофореграми документували за допомогою системи „Image Master VDS” (Amersham Pharmacia Biotech). Розмір ампліфікованих фрагментів визначали, використовуючи програмний пакет „Image Master 1D Elite v 3.1”. Калібровку молекулярної маси здійснювали з використанням стандартів молекулярної маси (pGem, pBR 322, pUC 19/Msp1, pBlue/Msp1).

Визначення генетичних дистанцій та кластерний аналіз. Для встановлення генетичних дистанцій за даними поліморфізму продуктів ампліфікації мікросателітних локусів використовували алгоритм Nei et al. [1979]. Кластерний аналіз генетичних дистанцій здійснювали, використовуючи незважений парногруповий метод із арифметичним усередненням UPGMA [Sneath et al., 1973]. Для побудови дендрограми використовували програму “TREES” [Календарь, 1994].

Результати дослідження та їх обговорення. Розробка та вдосконалення методів аналізу генотипів м'якої пшениці з різним вмістом амілози в крохмалі зерна. Для оцінювання вмісту амілози у крохмалі існують різні методичні підходи, що мають як позитивні так і негативні риси. Найбільш простою методикою визначення Wx-фенотипів є забарвлювання зернівки розчинами, що містять сполуки йоду. Даний метод дає можливість отримати інформацію про якісну характеристику крохмалю (наявність/відсутність амілози) на стадії дозрілого зерна.

Ще одним методичним підходом є оцінка вмісту амілози за допомогою спектрофотометрії у видимому та інфрачервоному діапазонах довжин хвиль [Foley et al., 1998; Fujita et al., 2001; Delwiche et al., 2002]. Використання даного підходу дає можливість проводити кількісний аналіз та оцінювати ефекти впливу дози Wx-генів на вміст амілози в пшеничному крохмалі.

Wx-протеїни також детектують за допомогою електрофорезу [Nakamura et al., 1993].

Для детекції алельного стану Wx-генів у різних генотипах ефективним є застосування ПЛР-аналізу з алель-специфічними маркерами [Nakamura et al., 1995], який дозволяє прогнозувати вміст амілози в індивідуальних рослинах на стадії паростка.

Описані вище методичні підходи було використано для створення біотехнології оцінки та контролю вмісту амілози в процесі селекції сортів пшениці з низьким або нульовим вмістом даного полімеру у крохмалі.

Аналіз варіації інтенсивності забарвлювання та гранулометричного складу крохмалю генотипів озимої м'якої пшениці та видів Aegilops. Одним із найбільш простих способів визначення Wx-фенотипів є забарвлення ендосперму зерна за допомогою розчину KI-I₂. Різні за вмістом функціональних та не функціональних генів зразки дають різне забарвлення. Wx-генотипи (комбiнацiя всiх нуль-алелiв) мають червоно-коричневий колір забарвлення. Зразки з іншими комбінаціями функціональних та не функціональних алелів Wx-генів мають темне фіолетове-чорне забарвлення. Різницю у забарвленні пояснює різна афінність амілози та амілопектину до сполук йоду_. Здатність амілози зв?язувати I₂ майже у тринадцять разів перевищує цей показник амілопектину [Schulman et al., 1995].

За результатами проведених досліджень зроблено висновок, що даний метод може бути застосований для диференціації генотипів контрастних за алельним станом Wx-локусів (рис. 1), але не має достатньої розрізняльної здатності для визначення генотипів з різними комбінаціями алелів Wx-генів.

У досліджених зразках крохмалю представників роду Aegilops: Ae. caudata, Ae. crassa, Ae. tauschii ssp. strangulata, Ae. umbellulata, Ae. ovata, Ae. boeticum при мікроскопії виявлено низький вміст гранул типу «Б» у порівнянні з гексаплоїдною пшеницею, що узгоджується з даними, отриманими Стодардом та Саркером [2000].

Оптимізація методу спектрофотометричної оцінки вмісту амілози в зерновому крохмалі озимої м'якої пшениці. Для оцінки вмісту амілози використовують спектрофотометрію у видимому та інфрачервоному діапазонах довжин хвиль. Використання даного підходу дає змогу провести кількісний аналіз, а також оцінити ефекти впливу активних алелів Wx-генів на вміст амілози в пшеничному крохмалі. Ми обрали один із стандартних способів контролю, що базується на використанні реакції між крохмалем та сполуками йоду. При їх взаємодії утворюється блакитно забарвлений комплекс - клатрат, кількість якого вимірюється спектрофотометрично у діапазоні (400-800 нм) з подальшим визначенням довжини хвилі, за якої спостерігається максимальна абсорбція [Fujitа et al., 2001]. За даними літературних джерел пік абсорбції йоду для амілози

спостерігається за довжини хвилі 600 нм [Schulman et al., 1995]. Дослідження в даному напряму полягали у встановленні оптимальних параметрів цього методу, які забезпечували б найвищу роздільну здатність.

За результатами аналізу визначено оптимальні діапазони довжин хвиль для оцінювання вмісту амілози спектрофотометричним методом. Для абсорбції найбільш виразний пік приходиться на діапазон 600-750 нм (рис. 2 а).

Спектри першої похідної мають більш складні профілі (рис. 2 б). В діапазоні 400-800 нм є два локальні мінімуми (430 нм, 550 нм) та два максимуми (480 нм, 760 нм). В обох випадках оптимальні діапазони лежали поза межами головного піку 600 нм, рекомендованого [Schulman et al., 1995].

У діапазоні концентрацій амілози 0 - 23 % оптимізований метод дозволяє достовірно розпізнавати приблизно 5-6 градацій, що достатньо як для прямого застосування в селекції, так і в дослідженнях з розробки нових простих та експресних методів. Для придадів сканувального типу показано доцільність використання градуювань з застосуванням двох чи більшої кількості довжин хвиль за типом багатовимірної лінійної регресії. Це забезпечує в 1,5 рази вищу розподільчу здатність у порівнянні з вимірюваннями на одній довжині хвилі.

Метрологічна характеристика методу спектрофотометричної оцінки вмісту амілози в зерновому крохмалі селекційних ліній пшениці. У ході метрологічної характеристики методу оцінено повторюваність, відтворюваність результатів дослідів та диференційну здатність. У даному аспекті для характеристики різниць, обумовлених генотипами, показані переваги застосування спектральних даних отриманих на довших хвилях (700-750 нм), які є більш інформативними.

В процесі роботи було визначено ефекти впливу алельного стану Wx-локусів на вміст амілози в крохмалі зерна селекційних форм пшениці.

Середні ефекти впливу функціональних алелів локусів Wx-A1а, Wx-B1a, Wx-D1a на вміст амілози в крохмалі зерна генотипів пшениці, добраних з популяції F₅ (96 родин), що розщеплюється, отриманої від схрещування сорту Куяльник Ч Wx-12 (99ID524) відносно альтернативних нуль-алелів, склали 0,050, 0,054, 0,082 одиниць абсорбції, відповідно.

Коефіцієнт кореляції (r) суми ефектів впливу Wx-генів на вміст амілози, визначених при дисперсійному аналізі з фактично отриманими даними абсорбції дорівнював 0,9, що вказує на коректність адитивної моделі взаємодії генів за критерієм кореляції. У цілому кореляція (r) сумарного ефекту впливу Wx-генів на вміст амілози з відсотковим вмістом даного полімеру в крохмалі згідно даних Yamamori [1994] складала 0,77.

При дослідженні ознаки Wx слід враховувати особливості її детермінації та прояв компенсаторного ефекту. Компенсаторний ефект полягає у тому, що наявність у генотипі функціонального алеля „а” лише в одному локусі призводить до підвищення накопичення амілози у крохмалію На рис. 3 відображено фактичні величини абсорбції за довжини хвилі 600 нм (вісь У) проти сум ефектів алелів Wx-локусів, визначених за адитивною моделлю взаємодії генів (вісь Х).

На рисунку показані відхилення від адитивності, що обумовлені ефектом компенсації алелів даних генів. За відсутності даних відхилень від адитивності функція мала би лінійний характер. Мінімальна абсорбція, як і очікувалось, спостерігається у гібридів з трьома нуль-алелями bbb за локусами Wx-A1, Wx-B1, Wx-D1.

Наявність лише одного функціонального алеля „a” у будь-якому з трьох локусів підвищувала величину абсорбції в середньому на 0,138 одиниць. У той же час очевидно, що рівень абсорбції амілози сорту Куяльник, що використовувався як

контроль, у селекційних форм з комбінаціями алелів Wx-локусів abb, bba, aba, bab, aab, baa не досягається.

Лише генотипи з трьома алелями ааа за Wx-локусами повністю відтворюють рівень, характерний для батьківської форми сорту Куяльник (табл. 2).

Таблиця 2

Середні величини абсорбції амілози дослідних генотипів

Дослідні генотипи	Одиниці абсорбції амілози	Вміст амілози (%)***
Комбінації алелів генів Wx-A1, Wx-B1, Wx-D1 *	600 нм	650 нм	700 нм	750 нм
Wх-12 (bbb)	0,0032 e**	0,0019 e	0,0007 d	-0,0002 d	0,9
bbb	0,0699 d	0,0637 d	0,0520 c	0,0339 c	0,9
abb	0,1877 c	0,1886 c	0,1672 b	0,1145 b	19,8
bba	0,2421 abc	0,2378 bc	0,2074 b	0,1399 b	22,9
aba	0,2316 bc	0,2311 c	0,2027 b	0,1368 b	25,8
bab	0,1955 c	0,1978 c	0,1755 b	0,1194 b	27,1
aab	0,2212 c	0,2265 c	0,2017 b	0,1374 b	28,0
baa	0,2312 bc	0,2325 c	0,2057 b	0,1408 b	28,5
aaa	0,2981 a	0,3003 a	0,2659 a	0,1804 a	28,7
Куяльник (aaa)	0,2834 ab	0,2922 ab	0,2631 a	0,1816 a	28,7
НІР_05	0,0678	0,0647	0,0558	0,0380

Примітки: * - а - активний алель за певним локусом, b - нуль-алель;

** - буквами позначені групи, що достовірно різняться між собою;

*** - очікуваний вміст амілози відповідно [Yamamori, 1994].

У селекційних форм із повним набором мутантних алелів (Wx-A1b, Wx-B1b, Wx-D1b) спектри абсорбції амілози в трьох серіях спектрофотометричних вимірювань були помітно вищими, ніж у батьківської лінії Wx-12, що використовувалась як контроль. Різниця в залежності від довжини хвилі, складала від 0,03 до 0,06 одиниць абсорбції як видно з табл. 2.

Неповне відтворення Wx-фенотипу при наявності нуль-алелів за
Wx-локусами свідчить про присутність додаткових факторів, що впливають на вміст амілози в крохмалі зерна м'якої пшениці.

Дослідження генетичного поліморфізму Wx-локусів сортів пшениці української селекції та окремих представників роду Aegilops. За допомогою ПЛР-аналізу нами одержано алельні характеристики Wx-локусів 46 сортів пшениці української селекції. У досліджених сортів за Wx-A1 локусом детектували фрагмент ДНК масою 389 п.н. (рис. 4); за Wx-В1 локусом фрагмент ампліфікації розміром 308 п.н. (рис. 5); за Wx-D1 локусом фрагмент ДНК з молекулярною масою 775 п.н. (рис. 6). Усі досліджені сорти озимої м'якої пшениці за Wx-локусами несли алелі дикого типу Wx-A1a, Wx-B1a, Wx-D1a.

Великий інтерес для селекції представляє вивчення поліморфізму Wx-генів, що контролюють синтез амілози крохмалю окремих представників роду Aegilops, тому що широке розмаїття диких видів може використовуватись як резерв генетичного поліпшення культури пшениці за ознакою якості зерна. Проведений нами аналіз дозволив отримати дані з алельного складу Wx-локусів шести видів роду Aegilops. Аналіз ПЛР-продуктів за Wx-А1 локусом дозволив виявити наявність алеля Wx-A1a розміром 389 п.н. у Ae. ovata, Ae. caudatа, Ae. boeticum. Алель Wx-A1b з молекулярною масою 370 п.н. детектовано у Ae. umbellulata, Ae. crassa, Ae. tauschii ssp. strangulatа.

У видів Ae. umbellulata, Ae. ovata, Ae. tauschii ssp. strangulata за Wx-В1 локусом виявлено алель Wx-B1a розміром фрагменту ампліфікації 294 п.н. на відміну від видів Ae. crassa, Ae. caudatа, Ae. boeticum у яких детектовано аллель (Wx-B1a) з молекулярною масою 308 п.н., як у T. aestivum L.

При тестуванні вище зазначених представників роду Aegilops за Wx-D1 локусом виявлено алель Wx-D1b розміром 280 п.н., що також детектовано у проаналізованих нами Wx - ліній пшениці (Wx-A1b, Wx-B1b, Wx-D1b).

Генетичний аналіз популяції F₅, одержаної від схрещування сорту Куяльник Ч Wx-12 (99ID524) за результатами молекулярно-генетичного тестування алелів Wx-локусів. Для оцінки ефективності прогнозування вмісту амілози в рослинах до квітіння і формування зерна та добору генотипів нами за допомогою молекулярних маркерів протестовано популяцію F₅ , одержану від схрещування сорту Куяльник з лінією Wx-12 (99ID524), яка містила 96 родин, 288 індивідуальних рослин. Популяцію аналізували за Wx-A1, Wx-B1, Wx-D1 локусами з метою добору гомозиготних рослин з алелями Wx-A1b, Wx-B1b, Wx-D1b. Теоретично очікуване відношення розщеплення було 15:2:15. Застосування статистичного критерія достовірності ч² для співставлення теоретично очікуваних та даних, що спостерігались, дозволило отримати наступні результати: Wx-A1 (ч²=5,05; 0,20>Р>0,05); Wx-D1 (ч²=2,132; 0,80>Р>0,50). При статистичній обробці даних за локусом Wx-B1 отримали (ч²=7,65; 0,05>Р>0,01). Так як достовірність розщеплення була низькою, провели ПЛР-аналіз популяції F₃ (43 родини, 215 індивідуальних рослин) з домінантним молекулярним маркером Wx98, рекомендованим для аналізу даного локусу McLauchlan et al. [2001]. У 122 рослин виявили фрагмент ампліфікації ДНК розміром 308 п.н., характерний для алеля Wx-B1а, у 93 рослин даний фрагмент ампліфікації був відсутній, що властиве для генотипів-носіїв алеля Wx-B1b. Очікуване розщеплення 5:3 узгоджується з даними, що спостерігались (ч²=2,844; 0,20>Р>0,05). За результатами аналізу F₅ популяції добрано 10 гомозиготних рецесивних рослин, які мають генотип Wx-A1b, Wx-B1b, Wx-D1b. Слід відмітити, що застосування такої маркерної системи в селекційній практиці дозволяє об'єктивно, на стадії паростку, оцінювати рослинний матеріал за вмістом амілози в крохмалі зерна.

Дослідження алельного стану мікросателітних локусів у рослин з низьким вмістом амілози у крохмалі (Wx-A1b, Wx-B1b, Wx-D1b). В роботі досліджували 10 селекційних форм з алельним складом (Wx-A1b, Wx-B1b, Wx-D1b), добраних із популяції F₅, отриманої від схрещування сорту Куяльник з лінією Wx-12.

Мікросателітний аналіз проводили з метою виявлення рослин максимально генетично подібних вихідній материнській формі сорту Куяльник. За результатами проведеного аналізу встановлено алельні характеристики батьківських та селекційних форм з нульовим вмістом амілози (Wx-A1b, Wx-B1b, Wx-D1b) за 16 мікросателітними локусами.

На основі отриманих даних із поліморфізму мікросателітних локусів розрахували генетичні дистанції, провели кластерний аналіз та побудували дендрограму, що відображає генетичну подібність досліджених селекційних форм.

На представленій дендрограмі (рис. 7) генотипи розподілено на два кластери, в межах яких спостерігається розподілення на субкластери.

Як і очікувалось, максимальна генетична дистанція спостерігалась між вихідними батьківськими формами, сортом Куяльник і лінією Wx-12, яка становила 0,956. Особливу увагу привернули форми 65/1, 65/2, 180/2, 180/3, що складали перший субкластер. Дані генотипи мали з сортом Куяльник 6 - 8 спільних алелів за мікросателітними локусами, порівняно з іншими формами, що тестувались (4 - 5 спільних алелів). Це свідчить про те, що дані генотипи найбільш наближені до материнської форми. Генетична дистанція першого субкластеру по відношенню до сорту Куяльник склала 0,319.

В процесі мікросателітного аналізу також виявлено, що всі досліджені форми за локусом Xgwm261 мають алель 165 п.н., як батьківська форма - лінія Wx-12, тоді як материнська форма має алель 192 п.н. У попередніх дослідженнях [Korzun et al.,1998] було показано, що даний локус є діагностичним для гену короткостебловості Rht8. За даними досліджень Rebetzke et al. [2000] алель 192 п.н. корелятивно пов'язаний з підвищенням таких показників, як кількість зернівок, індекс врожайності, та, в цілому, з урожайністю м'якої пшениці.

За даними молекулярно-генетичного аналізу досліджені генотипи є високими та схильними до полягання за несприятливих кліматичних умов, так як несуть алель дикого типу за геном короткостебловості Rht8а. Це узгоджується з даними польової оцінки рослин.

Для створення сортів на основі селекційних форм, носіїв трьох нуль-алелів за Wx-генами, які максимально наближені до генотипу вихідної материнської форми сорту Куяльник, нами запропоновано провести додаткові схрещування вищевказаних форм з сортом Куяльник та добрати рослини з Wx нуль-алелями та алелем Rht8с за допомогою молекулярних маркерів.

За підсумками проведених досліджень для ефективного прогнозування та добору форм пшениці з низьким або нульовим вмістом амілози у крохмалі пропонуємо розроблену біотехнологію, схема якої представлена на рис. 8.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 8. Схема біотехнології оцінки та контролю вмісту амілози в процесі селекції пшениці

Запропонована біотехнологія надасть можливість селекціонерам проводити цілеспрямований добір вихідного матеріалу, а також проводити контрольовану селекцію сортів пшениці, що мають низький або нульовий вміст амілози у крохмалі.

ВИСНОВКИ

У дисертації наведені теоретичне узагальнення і нові шляхи вирішення наукової задачі, що полягають в удосконаленні методів прогнозування та контролю вмісту амілози в процесі селекції озимої м'якої пшениці, з низьким вмістом даного полімеру у крохмалі та розробці на їх основі ефективної біотехнології. Результати досліджень дають змогу зробити наступні висновки:

1. Виявлено значну варіацію гранулометричного складу та інтенсивності забарвлювання крохмальних гранул у досліджених сортів, селекційних ліній пшениці, видів роду Aegilops. У порівнянні з гексаплоїдною пшеницею в досліджених зразках крохмалю представників роду Aegilops виявлено низький вміст гранул типу «Б».

2. Для оцінки вмісту амілози спектрофотометричним методом оптимальними діапазонами довжин хвиль є: для абсорбції - 600-750 нм, першої похідної абсорбції -480-760 нм.

3. Середні величини ефектів впливу функціональних алелів Wx-A1а, Wx-B1а, Wx-D1а на вміст амілози в крохмалі зерна м'якої пшениці відносно альтернативних нуль-алелів склали 0,050, 0,054, 0,082 одиниць абсорбції, відповідно. Неповне відтворення Wx-фенотипу за наявності нуль-алелів по Wx-локусах свідчить про присутність додаткових генетичних факторів, що впливають на вміст амілози в крохмалі зерна м'якої пшениці.

4. З використанням ПЛР-аналізу із алель-специфічними праймерами при тестуванні алельного стану Wx-генів 46 сортів пшениці української селекції детектовано алелі дикого типу (Wx-A1а, Wx-B1а, Wx-D1а). У видів Ae. umbellulata, Ae. ovata, Ae. tauschii ssp. strangulata за Wx-В1 локусом виявлено алель Wx-B1a розміром фрагменту ампліфікації 294 п.н. на відміну від видів Ae. crassa, Ae. caudatа, Ae. boeticum у яких детектовано аллель (Wx-B1a) з молекулярною масою 308 п.н., як у T. aestivum L.

5. За результатами молекулярно-генетичного тестування алелів Wx-локусів у рослин популяції F₅ (Куяльник Ч Wx-12) та проведеного генетичного аналізу, добрано 10 рослин з генотипом Wx-A1b, Wx-B1b, Wx-D1b. Мікросателітний аналіз індивідуальних рослин - носіїв трьох нуль-алелів за Wx-генами (Wx-A1b, Wx-B1b, Wx-D1b) та кластерний аналіз (UPGMA) показав, що генотипи 65/1, 65/2, 180/2, 180/3, є найбільш генетично наближеними до сорту Куяльник.

6. Розроблена біотехнологія, що базується на використанні ПЛР-аналізу та методу спектрофотометрії дозволяє в процесі селекції пшениці прогнозувати вміст амілози і проводити контрольований добір генотипів з потрібними комбінаціями алелів на стадіїї паростка, та контролювати вміст даного полімеру у дозрілому зерні.

ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ

Розроблена біотехнологія оцінки та контролю вмісту амілози в генотипах озимої м'якої пшениці рекомендована для використання в генетико-селекційних дослідженнях при створенні форм з низьким або нульовим вмістом амілози.

ПЕРЕЛІК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Петрова И.В. Идентификация Wx-генотипов среди сортов озимой мягкой пшеницы / И.В. Петрова, С.В. Чеботарь, А.И. Рыбалка, Ю.М. Сиволап // Цитология и генетика - 2007. - Т. 41. - № 6.- С. 11-17. (Особисто здобувачем проведено експериментальну роботу з детекції алельного стану Wx-генів сортів пшениці української селекції, разом із співавторами - аналіз результатів, формулювання основних положень та висновків, підготовлено публікацію до друку).

2. Петрова І.В. Оптимізація спектрофотометричного визначення вмісту амілози в зерновому крохмалі селекційного матеріалу пшениці / І.В. Петрова, О.М. Хохлов, С.В. Чеботар, О.І. Рибалка, Ю.М. Сиволап // Фізіологія та біохімія культурних рослин. - 2008. - Т. 40. - № 3 (233). - С. 223-230. (Здобувачем сплановано основні напрями досліджень, проведено добір, підготовку матеріалу для аналізу, серії дослідів із спектрофотометричної оцінки вмісту амілози у крохмалі. Разом із співавторами проведено статистичний аналіз результатів, формулювання основних положень і висновків, підготовку статті до друку).

3. Пат. 37137 Україна, МПК (2006) А01Н1/00. Спосіб діагностики та контролю Wx-генів при створенні сортів пшениці з низьким або нульовим вмістом амілози / І.В. Петрова, С.В. Чеботар, О.І. Рибалка, О.М. Хохлов, Ю.М. Сиволап; заявник та патентовласник Південний біотехнологічний центр в рослинництві УААН. - № u200801321; заявка 04.02.08; опубл. 25.11.2008, Бюл. № 22. (Особисто дисертантом проведено експериментальну роботу, статистичну обробку матеріалу, разом із співавторами проаналізовано результати дослідження, зроблено висновки та рекомендації, що слугували основою отримання патенту).

4. Сиволап Ю.М. Детекція Wx-генів в селекції озимої м'якої пшениці на низький вміст амілози в крохмалі / Ю.М. Сиволап, І.В. Петрова,
С.В. Чеботар, О.І. Рибалка - Одеса: Південний біотехнологічний центр в рослинництві УААН, 2008. - 12 с. (методичні рекомендації). (Дисертантом проведено експериментальну роботу, статистичну обробку матеріалу, разом із співавторами здійснено аналіз одержаних даних, сформовано висновки і підготовлено методичні рекомендації до друку).

5. Петрова І.В. ПЛР-аналіз алельного стану Wx-генів у сортів пшениці/ І.В. Петрова, С.В. Чеботар, О.І. Рибалка, Ю.М. Сиволап // Фактори експериментальної еволюції організмів: зб. наук. праць. - 2006. - Т.3. - С. 127-132. (Особисто здобувачем проведено експериментальну роботу з детекції алельного стану Wx-генів сортів пшениці української селекції, разом із співавторами - аналіз результатів, формулювання основних положень та висновків, підготовлено публікацію до друку).

6. Петрова И.В. Контроль Wx-генов в процессе селекции при создании форм мягкой пшеницы с нулевым и низким содержанием амилозы / И.В. Петрова, С.В. Чеботарь, А.И. Рыбалка, Ю.М. Сиволап // Досягнення і проблеми генетики, селекції та біотехнології. - 2007. - Т. 1. - С. 162-164. (Особисто дисертантом проведено добір матеріалу, експериментальну роботу, статистичну обробку одержаних даних, разом із співавторами проведено аналіз результатів, формулювання основних положень і висновків, написання та підготовку статті до друку).

7. Petrova I. Diversity allelic state of the Wx genes / I. Petrova, S. Chebotar, Yu. Sivolap // Biodiversity. Ecology. Adaptation. Evolution: III International Young Scientists conference, 15-18 May 2007: abstracts - Odessa, 2007. - P. 215. (Дисертантом особисто проведено аналіз літературних джерел, разом із співавторами оформлено та підготовлено до друку тези).

8. Петрова І.В. SSR-аналіз селекційних форм м'якої пшениці з нульовим вмістом амілози у крохмалі / І.В. Петрова, С.В. Чеботар, О.І. Рибалка, Ю.М. Сиволап // V Міжнародна конференція «Геном рослин»: зб. наук. ст. - 2008. - С. 110-115. (Особисто здобувачем проведено експериментальну роботу, статистичну обробку одержаних даних, разом із співавторами - аналіз результатів, формулювання основних положень та висновків, підготовку публікації до друку).

АНОТАЦІЯ

Петрова І.В. Поліморфізм Wx-генів та розробка біотехнології визначення вмісту амілози в процесі селекції пшениці - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.20 - біотехнологія. - Одеський національний університет імені І.І.Мечникова МОН України, Одеса, 2009.

Дисертація містить теоретичний та експериментальний матеріал із визначення вмісту амілози у крохмалі зерна м'якої пшениці за допомогою різних методичних підходів з метою розробки біотехнології для підвищення ефективності селекції пшениці з низьким вмістом даного полімеру.

Проведені дослідження показали, що найбільш ефективними методами оцінки та контролю вмісту амілози є спектрофотометрія та ПЛР-детекція
Wx-генів, що кодують фермент синтезу амілози у крохмалі.

Визначені оптимальні діапазони довжин хвиль для оцінки вмісту амілози за допомогою спектрофотометрії при різному представленні оптичних параметрів - абсорбції - 400-600 нм, її першої похідної - 480-760 нм.

Показано, що використання ПЛР-аналізу з праймерами до Wx-локусів геному T.aestivum L. на ранніх етапах вегетації (стадія паростку) дозволяє проводити контрольований добір генотипів з потрібними комбінаціями алелів, при створенні сортів пшениці з низьким рівнем вмісту амілози.

На основі результатів аналізу молекулярно-генетичного поліморфізму генотипів пшениці та методу спектрофотометрії розроблено біотехнологію оцінки і контролю вмісту амілози в процесі селекції пшениці.

Ключові слова: T.aestivum L., спектрофотометрія, амілоза, Wx-гени, мікросателіти.

Петрова И.В. Полиморфизм Wx-генов и разработка биотехнологии определения содержания амилозы в процессе селекции пшеницы - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.20. - биотехнология. - Одесский национальный университет имени И.И.Мечникова МОН Украины, Одесса, 2009.

Диссертация содержит теоретический и экспериментальный материал по определению содержания амилозы в крахмале зерна мягкой пшеницы с помощью различных методических подходов с целью разработки биотехнологии для повышения эффективности селекции пшеницы с низким содержанием данного полимера.

Проведенные исследования показали, что наиболее эффективными методами оценки и контроля содержания амилозы являются спектрофотометрия и ПЦР-детекция Wx-генов, кодирующих фермент синтеза амилозы в крахмале.

Выявлены оптимальные диапазоны длин волн для определения содержания амилозы с помощью спектрофотометрии при разном представлении оптических параметров - абсорбции - 400-600 нм, ее первой производной - 480-760 нм

Показано, что использование, ПЦР-анализа с праймерами к Wx-локусам генома T.aestivum L. на ранних этапах вегетации (стадия проростка) позволяет проводить контролированный отбор генотипов с интересующими комбинациями аллелей, при создании сортов пшеницы с низким уровнем содержания амилозы.

На основе результатов анализа молекулярно-генетического полиморфизма генотипов пшеницы и метода спектрофотометрии разработана биотехнология оценки и контроля содержания амилозы в процессе селекции пшеницы.

Ключевые слова: T.aestivum L., спектрофотометрия, амилоза, Wx-гены, микросателлиты.

Petrova I.V. Polymorphism of Wx-genes and development of the biotechnology of the amylose content determination and control in the wheat breeding process - Manuscript.

Thesis for degree of Philosophy Doctor (Ph.D.) in Biology, specialty 03.00.20 - Biotechnology. - Mechnykov Odessa National University, Odessa, 2009.

The dissertation contains theoretical and experimental material in the aim of amylose content determination in the wheat starch by means of the staining of the starch granules by KI-I₂, spectrophotometry in the wavelengths range 400-800 nm, PCR-detection of the Wx-genes encoding the amylose synthesis enzyme (GBSS1) in the starch. The purpose of current investigation using modern biotechnological approaches to increase efficiency breeding of wheat with low amylose content.

The conducted researches showed, that the most effective methods of estimation and amylose content control are combination of spectrofotometry and PCR-detection of Wx-genes encoding enzyme GBSSI in starch.

The optimal ranges of wavelengths for determination of amylose content by means of spectrofotometry were different depending of optical data mode: 400-600 nm for absorbtion, and 480-760 nm for 1 ^st derivative of absorbtion.

The average effects of functional alleles Wx-A1a, Wx-B1a, Wx-D1a on amylose content have been determined as 0,050; 0,054; 0,082 units of absorbtion, accordingly.

Allele characteristics of Wx - were reveald by using of PCR-analysis with allele specific primers for Ukrainian wheat varieties. Among modern winter wheat varieties having wild type alleles Wx-A1a, Wx-B1a, Wx-D1a were found.

It was shown, that the use of PCR-analysis with primers to Wx-loci of genome T. aestivum L. at a sprout stage allows to conduct the markers assisted selection (MAS) of genotypes with desired allele combination in developing of wheat varieties with low amylose content.

Based on analyse results concerning molecular-genetic polymorphism and spectrophotometric characteristics of wheat genotypes of effective biotechnological methods determination and control of the amylose content in the process of the wheat variety breeding for low or null amylose content in the starch were developed.

Key words: T.aestivum L., spectrofotometry, amylose, Wx-genes, microsatellite.

Размещено на Allbest.ru

...