Размещено на http://www.allbest.ru/

Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного

Національна академія наук України

Автореферат

Еколого-фізіологічні та морфологічні особливості мікроскопічних грибів, виділених з приміщень 4-го блоку Чорнобильської АЕС

Павличенко Анна Клаудіївна

Київ 2009

Загальна характеристика роботи

мікроскопічний гриб ростовий радіонуклід

Актуальність теми. Вивчення таксономії, екології та фізіології грибів-екстремофілів набуває все більшої актуальності на фоні зростаючого техногенезу довкілля. Ці організми спричиняють деструкцю цілої низки техногенних субстратів: залізобетону, пластмас, нафтопродуктів, металевих та дерев'яних виробів. В той же час перспективним є вивчення їх захистних систем від несприятливих умов існування та пошук серед них продуцентів нових біологічно-активних речовин. (Коваль, Сидоренко, 1987; Богомолова зі співавт., 1997; Sterflinger, 2000; Власов, 2008).

Серед техногенних екотопів не можна не згадати такі, що пов'язані з умовами підвищеної радіоактивності. Катастрофа 1986 року на Чорнобильській атомній електростанції (ЧАЕС) за своєю масштабністю перевищила всі відомі до неї. До 95% радіонуклідів, які мають тривалий період напіврозпаду, залишились в об'єкті “Укриття” після аварії. В приміщеннях 4-го блоку ЧАЕС були виявлені локальні плями грибного ураження на стінах, залізобетонних та дерев'яних конструкціях. Мікобіота цих приміщень відзначалась високою техногенною меланізацією. Кількість меланінвмістних радіорезистентних видів в її складі становила 40 - 60%. Серед них в багатьох приміщеннях постійно зустрічались Hormoconis resinae, Cladosporium sphaerospermum та C. herbarum. (Вембер, 2000; Карпенко, 2003; Иванова зі співавт., 2005; Zhdanova зі співавт., 2005).

З 1986 року у відділі фізіології та систематики мікроміцетів Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАНУ ведуться дослідження анаморфних грибів, виділених з різних субстратів, забруднених радіонуклідами на території 10-км зони відчуження ЧАЕС та в приміщеннях самої станції. В 4-му блоці ЧАЕС мікроскопічні гриби знаходяться під дією двох факторів - радіації та жорсткої лімітації за основними джерелами поживних речовин та енергії. В зв'язку з цим ми вважали за доцільне провести еколого-фізіологічні дослідження з метою одержання більш докладної інформації щодо характеристики таких грибів.

Все зазначене вище обумовлює актуальність та необхідність вивчення грибів-екстремофілів, які існують в оліготрофних, або близьких до оліготрофних екстремальних умовах.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана у відповідності з напрямком науково-дослідних робіт Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України у межах бюджетних тематик відділу фізіології та систематики мікроміцетів “Дослідити еколого-фізіологічну активність мікроміцетів в умовах екстремальних антропогенних навантажень” (№ державної реєстрації 0100U004338) і “Фізіолого-біохімічні особливості трофіки мітоспорових та аскоміцетних грибів (№ державної реєстрації 0105U001411).

Мета і завдання дослідження. Метою роботи було виявлення характерних морфологічних, екологічних та фізіологічних особливостей мікроскопічних грибів, виділених з приміщень 4-го блоку ЧАЕС.

Для досягнення цієї мети були поставлені такі завдання:

1. Провести порівляльні дослідження ростових параметрів ряду анаморфних грибів, виділених з приміщень 4-го блоку ЧАЕС та чистих щодо радіонуклідів регіонів України, в умовах поверхневого та глибинного культивування;

2. Дослідити вплив різних концентрацій органічного вуглецю в поживному середовищі на морфологію досліджених мікроскопічних грибів;

3. Встановити стійкість окремих мікроміцетів до умов тривалого голодування та їх здатність до росту на силікагельному середовищі;

4. Вивчити активність деяких гідролітичних ферментів мікроміцетів - інвертази, амілази, інулінази, протеази, желатинази, ліпази;

5. Вивчити каталазну активність досліджених грибів як компонента системи антиоксидантного захисту грибної клітини.

Об'єкти досліджень - меланінвмістні анаморфні гриби видів Hormoconis resinae, Cladosporium herbarum та C. sphaerospermum, виділених з приміщень 4-го блоку ЧАЕС та чистих щодо радіонуклідів регіонів України.

Предмет досліджень - вивчення ряду морфологічних та фізіолого-біохімічних ознак, які характерні для олігокарботолерантніх видів меланінвмісних мікроміцетів, виділених з приміщень 4-го блоку ЧАЕС.

Методи дослідження - сучасні методи експериментальної мікології та екології: мікробіологічні та біохімічні.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше встановлені ряд морологічних та фізіологічних особливостей досліджених штамів 3-ох видів грибів, які визначають їх постійне виявлення в приміщеннях 4-го блоку Чорнобильської атомної станції.

Вперше показана стійкість темнопігментованих грибів, виділених з приміщень 4-го блоку ЧАЕС, до тривалого голодування (200 діб), здатність до росту на силікагельному середовищі при наявності слідових кількостей вуглецю, а також до росту на поживних середовищах, кількість вуглецю в яких становила 100 мг/л та менше, що дає можливість віднести такі гриби до групи олігокарботолерантних організмів. Виявлений високий рівень адаптації досліджених грибних штамів до різних концентрацій вуглецю, яка різнилась на 6 порядків.

Вперше встановлено два типи морфологічних змін серед досліджених нами видів грибів в умовах низької концентрації вуглецю в поживному середовищі (100 мг/л та менше): втрата репродуктивного апарату та перехід до утворення фрагментованого міцелію, що був притаманний H. resinae; та редукція спороношень, яка була характерна для C. herbarum та C. sphaerospermum.

Вперше показано, що дослідженим видам грибів був притаманий повільний ріст: вихід на стаціонарну фазу росту (в умовах поверхневого культивування - після 20-ої, глибинного культивуваня - після 9-ої доби). Питома швидкість росту в умовах поверхневого (0,0020 - 0,02 год^-1) та глибинного культивування (0,006 - 0,06 год^-1). Останнє характерно для групи олігокарботолерантних грибів.

Вперше встановлено, що переважна більшість досліджених нами штамів H. resinae, C. herbarum та C. sphaerospermum проявляли низьку активність гідролітичних екзоферментів, а в 26% випадків була відсутня. Показано, що практично у всіх досліджених штамів мікроміцетів встановлена висока внутрішньоклітинна каталазна активність, що свідчить про їх участь в захисті грибіних клітин від надмірного окислення при дії іонізуючого опромінення.

Практичне значення одержаних результатів. Вивчення фізіологічних і морфологічних особливостей темнозабарвлених грибів, виділених з приміщень 4-го блоку ЧАЕС, розширяє уявлення про існування та біологічну активність грибів в цьому екотопі.

Запропоновані два перспективних для біотехнологічних розробок штами H. resinae 63, 77 з високою ліполітичною активністю, яка перевищувала таку штаму продуценту ліпази Rhizopus cohni.

Матеріали дисертаційної роботи включені в курс лекцій з мікології на кафедрі мікробіології та загальної імунології в Київському національному університеті ім. Тараса Шевченка.

Особистий внесок здобувача. Автором дисертації самостійно проведено аналіз наукової літератури за темою дисертації, особисто виконані та викладені експериментальні дані, проведена статистична обробка результатів та підготовлено публікації до друку.

Дисертант визначив ростові параметри в умовах періодичного культивування: побудував криві росту, визначив питому швидкість росту, константу спорідненості та інгібування; визначив їх зв'язок з радіоактивністю місця виділення штаму; визначив динаміку споживання глюкози; вивчив здатність грибів до тривалого голодування та здатність до росту на силікагельному середовищі; вивчено морфологію досліджених мікроскопічних грибів на середовищах з різними концентраціями глюкози; а також активність ряду гідролітичних екзоферментів: інвертази, амілази, інулінази, протеази, желатинази, ліпази та активність поза- та внутрішньоклітинної каталази.

Мікроміцети, використані в роботі, були надані к.б.н. Захарченко В.О. та Наконечною Л.Т. Визначення ростових параметрів було проведено за консультаційної допомоги д.б.н. Громозової О.М. та к.б.н. Войчука С.І. (ІМВ НАНУ). Визначення активності гідролітичних ферментів проводили спільно з к.б.н. Айзенберг В.Л. та Капичон Г.П., які є співавторами відповідних публікацій.

Аналіз одержаних результатів, їх узагальнення, інтерпретацію даних та формулювання основних положень і висновків дисертації здобувачем проведено під керивництвом д.б.н., проф. Н.М. Жданової.

Апробація результатів дисертації. Результати дисертаційної роботи були представлені на Конкурсі експериментальних робіт молодих дослідників у Інституті мікробіології і вірусології НАН України (грудень 2004 р., грудень 2005 р., грудень 2006 р., грудень 2007 р.); на засіданні мікологічної секції Українського Ботанічного Товариства (Інститут ботаніки ім. Холодного НАН України, червень 2007 р., березень 2008 р.); Х з'їзді Товариства мікробіологів України (м. Одеса, вересень, 2004 р.); Першій міжнародній конференції студентів та аспірантів “Молодь і поступ в біології” (м. Львів, квітень, 2005 р.); Міжнародній науковій конференції “Мікробні біотехнології” (м. Одеса, вересень, 2006 р.); Міжнародній науковій конференції “Plant microbial enzymes: isolation, characterization and biotechnology applications (м. Тбілісі, Грузія, липень, 2007 р.), 2-му з'їзді мікологів Росії (м. Москва, Росія, квітень, 2008 р.), ХІІ з'їзді Українського ботанічного товариства (м. Одеса, травень, 2006 р.).

Публікації. За матеріалами дисертації видано 10 наукових праць: 4 статті у наукових фахових виданнях та 6 тез доповідей.

Структура та обсяг роботи. Дисертаційна робота викладена на 131 сторінці машинописного тексту і складається з розділів “Вступ”, “Огляд літаратури”, “Матеріали та методи досліджень”, “Експериментальна частина”, “Заключення”, “Висновки”, “Список використаних джерел”, містить 173 найменування, в тому числі 69 латиницею. Робота проілюстрована 7 таблицями та 37 рисунками.

Основний зміст роботи

Огляд літератури складається з трьох розділів. В першому висвітлені питання, що пов'язані з існуванням грибів в оліготрофних умовах, в другому - охарактеризовано субстрати, на яких часто зустрічаються гриби-екстремофіли, які виділені з приміщень 4-го блоку ЧАЕС і в третьому - охарактеризовано стан вивченості мікроскопічних грибів зони відчуження та об'єкту “Укриття”.

Розділ 2. Матеріали та методи доследжень

Для проведення дослідження було обрано 3 види анаморфних грибів, які зберігаються в колекції відділу фізіології та систематики мікроміцетів Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАНУ - Hormoconis resinae, Cladosporiium herbarum, C. sphaerospermum. Серед них 12 штамів, які виділені з приміщень 4-го блоку ЧАЕС та 3 - з чистих щодо радіонуклідів регіонів України (контрольні). Ці види мікроміцетів належали до тих, що постійно зустрічалися в приміщеннях 4-го блоку ЧАЕС (табл. 1).

Дослідження росту і морфології мікроміцетів проводили за загально прийнятими методами (Перт, 1978; Методы..., 1982; Егоров, 1989; Ленгелер, 2005) на рідких поживних середовищах з різними концентраціями глюкози (від 0 до 20 г/л), а також визначали питому швидкість росту (м), константу спорідненості (К_s) та інгібування (К_і).

Визначення залишкового вмісту редукуючих цукрів проводили за допомогою модифікованої методики Бертрана (Методы..., 1987).

Таблиця 1. Характеристика мікроміцетів, які були використані в роботі

Стійкість грибних культур до голодування визначали шляхом витримання міцеліальних плівок в стерильній дистильованій воді (220 об/хв) протягом 200 діб. Термін вирощування мікроскопічних грибів на силікагельному середовищі становив 30 діб.

Активність гідролітичних ферментів визначали на поживних середовищах з відповідними індукторами як єдиного джерела вуглецю, в концентрації 0,5%. Визначення інуліназної, інвертазної, амілолітичної активностей проводили з використанням реактива Самнера (Айзенберг зі співавт., 2006); визначення протеолітичної активності проводили за методом Ансона (Методы..., 1982); ліполітичної активності за допомогою п-нітрофенілпальмітату (Айзенберг зі співавт., 1995). Каталазну активність визначали за залишковим вмістом Н₂О₂ титрометричним методом (Методы..., 1982; Нікольська зі співавт, 1978; Павловська зі співавт., 2001).

Розділ 3. Ріст та морфологія мікроміцетів на середовищах з різними концентраціями глюкози

Культивування мікроміцетів, виділених з приміщень 4-го блоку ЧАЕС в періодичних умовах. Для встановлення олігокарботолерантності темнопігментованих анаморфних грибів, виділених з приміщень 4-го блоку ЧАЕС, були досліджені особливості їх росту в умовах поверхневого та глибинного культивування. При поверхневому культивуванні на поживному середовищі з 20 г/л глюкози всі досліджені штами 3-ох видів грибів виходили на стаціонарну фазу росту після 20 діб культивування. При культивування мікроміцетів на поживних середовищ з нижчими концентраціями глюкози (0,5 - 10 г/л) вихід на стаціонарну фазу росту відбувався на 4 - 10 добу. На згаданих середовищах після стаціонарної фази, як правило, ми не спостерігали фази відмирання, що свідчить про стійкість цих мікроміцетів до знижених кількостей органічного вуглецю. На поживному середовищі з 20 г/л глюкози відбувалось зменшення накопичення біомаси у H. resinae штами 79, 76, 77 - до 64 - 70% та у С. herbarum - до 76 - 81% порівняно з контролем. Дослідні штами H. resinae штами 79, 77, 76, на поживному середовищі з 1 г/л утворювали більшу біомасу ніж контрольний штам 801 (рис. 1).

Аналогічну тенденцію спостерігали при рості мікроміцетів в умовах глибинного культивування. При цьому вихід на стаціонарну фазу росту відбувався, як правило, на 8 - 9 добу культивування. Штами H. resinae штами 79, 77, 76 росли в таких умовах гірше за контрольний штам. Вони відрізнялись досить короткою лаг-фазою (менше 1 доби). Штами C. sphaerospermum в таких умовах мали тривалішу лаг-фазу (до 2 діб) (рис. 2) і росли більш рівномірно.

Штами С. herbarum в глибинних умовах культивування мали найбільшу серед досліджених культур тривалість лаг-фази (3 - 4 доби). У H. resinae штами 79, 76, 77 відбувалось зниження накопичення біомаси до 30 - 50% в стаціонарній фазі росту порівняно з контролем. Серед штамів C. sphaerospermum та C. herbarum не було виявлено чіткого взаємозв'язку між радіоактивністю місця виділення та накопиченням ними біомаси.

В цих умовах рівень споживання глюкози складав 13,5 - 75% в залежності від штаму та виду мікроміцета. Споживання глюкози у дослідних штамів H. resinae було нерівномірним, що може свідчити про зміни у метаболізмі цукрів.

а б

Рис. 1. Динаміка накопичення біомаси штамами H. resinae в умовах поверхневого культивування на середовищах з глюкозою: а) 20 г/л; б) 1 г/л.

а б

Рис. 2. Динаміка накопичення біомаси H. resinae (а) та C. sphaerospermum (б) в умовах глибинного культивування.

Питома швидкість росту (м) досліджених мікроскопічних грибів в умовах періодичного культивування була досить повільною і становила від 0,002 до 0,06 год^-1 в залежності від штаму мікроміцета і умов культивування (табл. 2). Взаємозв'язок між величиною питомої швидкості росту (м) та радіоактивністю місця виділення штаму для 2-ох видів C. herbarum та C. sphaerospermum не був встановлений. Лише для H. resinae штами, виділені з місць з високим рівнем радіоактивності, мали в 1,5 - 4 рази меншу питому швидкість росту (м) ніж у контрольного. Низькі значення питомої швидкості росту свідчать про реалізацію такими грибами К-типу життєвої стратегії і характерні для олігокарботолерантних видів грибів.

Значення константи спорідненості (K_s) у більшості досліджених штамів грибів не відрізнялось від такої мікроскопічних грибів, які характерні для більш багатих субстратів. Але у 5 штамів 3-ох видів (H. resinae 76, С. sphaerospermum штами 100 і 7, С. herbarum штами 80 і 3993) вона була меншою за 100 мг/л (в 2 - 3 рази нижчі, ніж у звичайних видів грибів) (табл. 3). Константа інгібування (K_i) дозволяє виявити потенційні можливості існування виду при значному підвищені концентрації органічного вуглецю в поживному середовищі. Ця константа у досліджених грибних штамів мала досить високі значення - 100 - 300 г /л глюкози. Тобто нами виявлена здатність росту досліджених меланінвмістних грибів в широких межах концентрацій глюкози, які відрізнялись на 6 порядків.

Таблиця 2. Питома швидкість росту (м) мікроміцетів на середовищі Чапека

Таблиця 3. Константа спорідненості (К_s) у досліджених мікроміцетів

Таким чином, для досліджених нами мікроскопічних грибів, характерна невисока питома швидкість росту (м) та тривалий розвиток в заданих умовах культивування. За нашими даними, рівень радіоактивності місця виділення грибного ізоляту здебільшого впливав на накопичення біомаси та питому швидкість росту (м) у штамів H. resinae, незважаючи на консервативність ростових параметрів у грибів. Найяскравішим прикладом впливу іонізуючого опромінення на ростові параметри був H. resinae 77. Він проявив найменшу питому швидкість росту та найменше накопичення біомаси в умовах глибиного та поверхневого культивування.

Морфологічні особливості темнозабарвлених мікроскопічних грибів, виділенних з приміщень 4-го блоку ЧАЕС.

Нами було вивчено вплив знижених концентрації глюкози на морфологію досліджених нами мікроміцетів. В умовах концентрацій органічного джерела вуглецю від 20 г/л до його відсутності досліджені штами H. resinae утворювали ростові гіфи та фрагментований міцелій, які в подальшому на середовищах з концентрацією глюкози 1 г/л та вище переходили у звичайний міцелій з утворенням типових конідієносців та конідій. Із зниженням концентрації глюкози до 0,1 г/л та менше розвиток H. resinae зупинявся на стадії фрагментованого міцелію, а звичайний міцелій та конідієносці не утворювались (рис. 3).

Види р. Cladosporium утворювали міцелій та конідієносці з конідіями на всіх досліджених нами середовищах. Але на середовищах з концентрацією глюкози менше 0,1 г/л міцелій ставав тоншим, менш розгалуженим, ніж в контролі (20 г/л); відбувалась редукція конідієносців та конідієносного апарату (конідії ставали дрібнішими та зникала різниця між базальними та верхівковими) (рис. 4). У окремих штамів С. sphaerospermum спостерігали порожнини в міцелії.

Аналогічні зміни спостерігали у штамів C. herbarum. На середовищах з концентрацією глюкози 0,1 г/л та менше також зникала різниця між базальними та верхівковими конідіями.

Підсумовуючи одержані дані, можна сказати, що в заданих умовах експерименту ми спостерігали різну реакцію видів грибів на різке зниження концентрації джерела вуглецю в поживному середовищі. Для H. resinae характерна (при 0,1 г /л глюкози та менше) повна втрата конідієностців та утворення довгих розгалужених фрагментованих гіф. Види роду Cladosporium не втрачали здатності до утворення конідієносного апарату та звичайного міцелію в таких умовах, але їх конідієносний апарат був редукованим.

Розділ 4. Стійкість до тривалого Голодування мікроскопічних грибів та їх ріст на силікагельному середовищі

Однією з ознак олігокарботолерантності у грибів, крім їх відношення до низьких концентрацій вуглецю, є їх стійкість до голодування та ріст на силікагельному середовищі без додавання джерел живлення та енергії.

Під час тривалого голодування всі досліджені грибні ізоляти виживали протягом 200 діб. Відбувалось руйнування міцеліальної плівки, яке розпочиналось у штамів Н. resinae на 7 - 14 добу та у С. sphaerospermum - через 30 - 60 діб. Досліджені нами штами Н. resinae та С. sphaerospermum виживали протягом всього терміну голодування, утворюючи звичайні колонії після висіву на стандартні поживні середовища. Крім того, ми реєстрували вторинний ріст міцелію на стінках пробірок у Н. resinae - на 180 - 200 добу та С. sphaerospermum - на 14 - 30 добу. В таких умовах утворювались нормальний міцелій та конідієносці з конідіями, що свідчить про їх високу стійкість до голодування.

На силікагельному середовищі досліджені види грибів росли протягом 30 діб. Н. resinae та С. sphaerospermum в таких умовах утворювали темнозабарвлені мікроколонії, які були помітні неозброєним оком через 1 - 2 тижні культивування. Штами С. herbarum лише на 21 добу починали утворювати майже безбарвні мікроколонії.

Мікроскопіювання таких колоній показало, що досліджені штами Н. resinae утворювали фрагментований міцелій (від 2 до кількох десятків фрагментів), але одночасно утворювався і нормальний міцелій. Контрольний штам утворював міцелій різної товщини, а також міцеліальні тяжі, що можна трактувати як активний пошук гіфами нових джерел живлення (рис. 5). Утворення фрагментованого міцелію було більш характерним для дослідних штамів, ніж для контрольного.

Штами С. sphaerospermum на силікагельному середовищі утворювали компактні мікроколонії з типовими конідієносцями та нормальним міцелієм (рис. 6а). Конідії С. herbarum в таких умовах проростали лише ростковими гіфами, які далі не росли (рис. 6б). Різниці між контрольними та дослідними штамами цих двох видів виявлено не було.

Таким чином, досліджені нами штами по-різному росли на силікагельному середовищі в залежності від виду гриба. З певною обережністю можна припустити, що ріст грибів може відбуватись за рахунок запасних речовин грибної клітини, інтенсифікації гетеротрофної фіксації СО₂ та засвоєння летючих органічних речовин з повітря лабораторії. Виявлена висока резистентність досліджених штамів H. resinae, С. shpaerospermum та С. herbarum до умов тривалого голодування та їх здатність розвиватись на середовищах з вкрай обмеженою кількістю доступного вуглецю органічної природи. Рівень радіоактивності місця виділення досліджених нами штамів не впливав на стійкість грибів до умов екстремально низьких концентрацій вуглецю в поживному середовищі.

Розділ 5. Ферментативна активність ряду мікроскорічних грибів

Активність деяких позаклітинних гідролаз темнозабарвлених мікроскопічних грибів. Одним з можливих джерел органічного вуглецю на кам'яних або будівельних субстратах можуть бути відмерлі, в тому числі й під дією радіації, клітини мікроорганізмів та видів, які можуть бути традиційними джерелами живлення для олігокарботолерантних грибів. Ця обставина обумовила доцільність визначення у них певних ферментативних активностей. В процесі робити ми вивчали активність амілази, інулінази, інвертази, протеази, желатинази, ліпази, целюлази, які гідролізують різні групи сполук, що входять до складу клітин.

В ряду гідролітичних ферментів: амілаза, інуліназа, інвертаза саме амілолітична активність проявлялась найчастіше та була найбільш активною серед досліджених. Вона була зареєстрована у 2-ох видів мікроміцетів - Н. resinae та С. sphaerospermum і не виявлена у С. herbarum. Активність цього ферменту була невисокою, як правило меншою за 2,5 од/мл (рис. 7), порівняно з промисловими штамами активність, яких становила 25 - 150 од/мл. У жодного з досліджених нами видів грибів не було виявлено залежності рівня амілолітичної активності від радіоактивності місця виділення штамів.

Рис. 3. Амілолітична активність вивчених штамів мікроскопічних грибів.

Єдиною гідролітичною активністю, яка виявлена у всіх досліджених штамів мікроміцетів, була протеолітична (рис. 8). Подібно до амілолітичної, інвертазної та інуліназної активності протеолітична також була низькою (2 - 7 од/мл) порівняно з промисловими штамами. Її величина також не залежала від радіоактивності місця виділення.

Рис. 4. Протеолітична активність досліджених штамів мікроскопічних грибів.

Найвищою з досліжених гідролітичних активностей виявилась ліполітична активність. Вона була досить високою у штамів Н. resinae і значно меншою - у С. sphaerospermum (рис. 9). Ліполітична активність у Н. resinae штами 63, 77, 76, 52 була вищою за контрольний штам і досягала величини, яка притаманна в цих умовах промисловим штамам-продуцентам цього ферменту. Останнє можна пояснити тим, що місце знаходження цього виду тісно пов'язано з продуктами нафтопереробки, оскільки боротьба з радіоактивним пилом в приміщеннях об'єкту “Укриття” відбувається з використанням похідних нафти.

Рис. 5. Ліполітична активність досліджених штамів мікроскопічних грибів.

Таким чином, активність переважної більшості досліджених гідролітичних ферментів Н. resinae, С. sphaerospermum та С. herbarum була, як правило, невисокою в порівнянні з промисловими штамами, а у 26% випадків була відсутня. В той же час наявність позаклітинних гідролаз свідчить про можливість використання такими грибами слідових кількостей органічних речовин на залізобетоні та важкодоступних субстратах, що узгоджується з даними літератури (Ребрикова, 1988, Кураков зі співавт. 1999)

Каталазна активність мікроскопічних грибів, виділених з приміщень 4-го блоку ЧАЕС. Різноманітні несприятливі фактори довкілля призводять до підвищення рівня активних форм кисню в грибній клітині, кількість якого регулюється антиоксидантною системою захисту. Тому, згідно з даними літератури, у організмів, що тривалий час знаходились під дією стресових факторів, можуть відбуватись адаптаційні зміни, в тому числі і в антиоксидантній системі, що підвищують їх стійкисть до несприятливих умов існування.

Одним із складових елементів антиоксидантної системи є каталаза. Нами було досліджено поза- та внутрішньоклітинну каталазну активність мікроскопічних грибів, виділених з приміщень об'єкту “Укриття”. Згідно з отриманими нами даними, екзоклітинна каталазна активність всіх штамів 3-ох видів мікроскопічних грибів була на низькому рівні, як правило менше 6 од/мл, окрім H. resinae 63, 30 та 801 та C. herbarum 3993, у яких вона досягала 15; 10,4; 6,2 та 8,8 од/мл, відповідно (рис. 10). У штамів H. resinae з низького та середнього рівнів радіоактивності (до 500 мР/год), спостерігали підвищення позаклітинної каталазної активності в порівняннні з контрольним штамом в 1,5 - 2,5 рази. Ізоляти H. resinae, виділені з місць з високого рівня радіоактивності (більше 5000 мР/год), показали її зниження - в 1,5 - 2,0 рази. Загалом, позаклітинна каталазна активність була вищою у штамів H. resinae.

Рис. 6. Позаклітинна каталазна активність досліджених мікроміцетів.

Внутрішньоклітинна каталазна активність у штамів H. resinae виявила тенденцію до зниження зі зростанням радіоактивності місця виділення з 12 (контрольний штам) до 1,5 од/мг біомаси (штам 79). У С. shpaerospermum достовірної різниці в рівні активності цього ферменту у дослідного та контрольного штамів не було виявлено (рис. 11). Слід відзначити досить високий рівень ендогенної каталазної активності H. resinae порівняно з представниками р. Cladosporium (в 2 - 3 рази вища). Останнє свідчить про значення її в захисті організму від окисного стресу.

Рис. 7. Внутрішньоклітинна каталазна активність досліджених мікроскопічних грибів.

Отже, рівень каталазної активністі досліджених штамів H. resinae, С. shpaerospermum та C. herbarum залежав від радіоактивності місця виділення штаму, виду гриба та локалізації ферменту. Відмічена висока внутрішньоклітинна каталазна активність і низька позаклітинна практично у всіх досліджених штамів мікроскопічних грибів.

Висновки

Таким чином, у темнозабарвлених мікроміцетів, що часто зустрічались в приміщеннях 4-го блоку ЧАЕС, було виявлено ряд ознак, харатерних для групи олігокарботолерантних грибів. До них відносяться: стійкість досліджених мікроміцетів до тривалого голодування; резистентність до знижених концентрацій органічного вуглецю в поживному середовищі; низькі питомі швидкості росту (м) у досліджених мікроскопічних грибів в умовах поверхневого та глибинного культивування; здатність рости та утворювати спороношення на силікагельному середовищі без додавання джерел живлення та енергії.

Саме ці ознаки, а також утворення ряду позаклітинних гідролітичних ферментів та підвищений рівень внутрішньоклітинної каталазної активності, на нашу думку, обумовлюють постійну частоту зустрічальності цих видів меланінвмісних мікроміцетів в приміщеннях об'єкту “Укриття”.

1. Вперше досліджений характер росту Hormoconis resinae, Cladosporium herbarum та C. sphaerospermum. Для H. resinae 79, 77, 76, виділених з приміщень з високим рівнем радіоактивності (більше 10000 мР/год) відбувалось зниження питомої швидкості росту порівняно з контролем в 1,5 - 4 рази. В цілому остання була малою в умовах поверхневого (0,002 - 0,02 год^-1) та глибинного (0,006 - 0,06 год^-1) культивування в усіх досліджених штамів грибів.

2. Виявлено повільний перехід всіх досліджених штамів мікроміцетів до стаціонарної фази росту в умовах поверхневого (на 20-ту добу) і глибинного (на 9-ту добу) культивування. Зниження накопичення біомаси, порівняно з контролем, відбувалось лише у H. resinae штамів 79, 76, 77 - на 64 - 70% в умовах поверхневого культивування та - на 29 - 52% в глибинних умовах.

3. Вперше визначенні константи спорідненості (К_s) (40 - 210 мг глюкози/л) та інгібування (К_i) (100 -300 г глюкози/л), значення яких свідчать про широкий діапазон адаптації досліджених грибних штамів до різних концентрацій вуглецю, який коливався в межах 6 порядків.

4. В умовах знижених концентрацій органічного вуглецю в поживному середовищі (0,1 г/л та менше) у всіх досліджених штамів H. resinae відбувався перехід до утворення фрагментованого міцелію з одночасною втратою репродуктивних структур, а всі досліджені штами C. herbarum та C. sphaerospermum характеризувались редукцією конідієносного апарату.

5. Виживання дослідних та контрольних мікроміцетів в умовах тривалого голодування (200 діб) в глибинній культурі на дистильованій воді та здатність до утворення вторинного міцелію та конідій в таких умовах свідчить про їх високу резистентність до екстремально низьких концентрацій вуглецю.

6. Вперше виявлена здатність досліджених штамів H. resinae та C. sphaerospermum до росту на силікагельному середовищі. На ньому спостерігали утворення звичайного і фрагментованого міцелію у штамів H. resinae та редукція конідієносців у штамів C. sphaerospermum. Всі штами C. herbarum в таких умовах практично не росли, утворюючи лише росткові гіфи.

7. Встановлена висока ліполітична активність досліджених штамів H. resinae 77, 76, 52, 63 (5,9 - 8,9 од/мл). Остання може бути повґязана зі здатністю видів цього роду до росту та біодеструкції нафтових субстратів, на основі яких створені речовини для зниження рівня радіоактивного пилу в приміщеннях об'єкту “Укриття”. Активність гідролітичних ферментів меланінвмісних мікроміцетів (амілази, інулінази, інвертази, протеази, желатинази та ліпази), як правило, була низькою.

8. Позаклітинна каталазна активність досліджених штамів меланінвмісних H. resinae, C. herbarum, C. sphaerospermum була досить низькою - менше 6 од/мл; внутрішньоклітинна каталазна активність цих грибів становила до 14 од/мг, що свідчить про захистну роль такого ферменту в грибній клітині в умовах тривалої дії підвищеної радіоактивності довкілля (приміщення 4-го блоку ЧАЕС).

9. За наведеними морфологічними, екологічними та фізіологічними ознаками досліджені мікроміцети запропоновано віднести до окремої еколого-трофічної групи організмів - олігокарботолерантних грибів.

Список робіт опублікованих за темою дисертації

1. Павличенко А.К. Особенности роста и развития штаммов Hormoconis resinae (Lindau) v. Arx & de Vries, выделенных из 4-го энергоблока ЧАЕС / Павличенко А.К., Карпенко Ю.В., Жданова Н.Н. // Мікробіологічний журнал. - 2006. - Т. 68, №1. - C. 11 - 20. (Здобувачем особисто досліджено ріст в умовах поверхневого культивування та морфологію 7 штамів Hormoconis resinae на рідкому середовищі при різних концентраціях глюкози. Визначено морфологічні зміни при зниженні концентрації глюкози в поживному середовищі та зв'язок між накопиченням біомаси мікроміцетом та радіоактивністю місця виділення штаму).

2. Павличенко А.К. Особенности роста и развития штаммов Hormoconis resinae (Lindau) v. Arx & de Vries f. resinae и Cladosporium sphaerospermum Penz. / Павличенко А.К., Жданова Н.Н. // Мікробіологічний журнал. - 2006. - Т. 68, №2. - C. 58 - 64. (Здобувачем особисто досліджено ріст в умовах поверхневого культивування та морфологію 7 штамів Hormoconis resinae та 4 штамів Cladosporium sphaerospermum на рідкому середовищі при різних концентраціях глюкози. Визначено морфологічні зміни при зниженні концентрації глюкози в поживному середовищі та відсутність зв'язку між накопиченням біомаси C. sphaerospermum та радіоактивністю місця виділення штаму).

3. Pavlichenko A.K. Fermentative activity specific for the ecologic group of oligotolerant fungi / Pavlichenko A.K., Aisenberg V.L., Nakonechnaya L.T., Zhdanova N.N. // Plant and microbial enzymes: isolation, characterization and biotechnology applications: 2 - 5 July 2007, Tbilisi, Georgia. - p. 103 - 105. (Здобувачем особисто проведено визначення інуліназної, амілолітичної та ліполітичної активностей на 21 штамі 4 видів мікроміцетів: H. resinae, C. sphaerospermum, C. herbarum та A. alternata)

4. Айзенберг В.Л. Методика количественного определения активности грибной инулиназы с использованием реактива Самнера / Айзенберг В.Л., Стойко В.И., Демиденок Е.А., Пичко В.Б., Захарченко В.А., Павличенко А.К., Капичон А.П. // Биотехнология. - №5. - с. 95 - 96. (Здобувачем особисто проведена апробація методики визначення інуліназної активності на 21 штамі 4 видів мікроміцетів: H. resinae, C. sphaerospermum, C. herbarum та A. alternata)

5. Жданова Н.Н. Грибное поражение помещений объекта «Укрытие» / Жданова Н.Н., Захарченко В.А., Тугай Т.И., Карпенко Ю.В., Наконечная Л.Т., Павличенко А.К., Желтоножский В.А., Жидков А.В., Сенюк О.Ф. // Проблеми безпеки атомних електростанцій і Чорнобиля. - 2005. - №3. - с. 78 - 86. (Здобувачем особисто досліджено морфологію Hormoconis resinae).

6. Жданова Н.М. Життєві стратегії мікроскопічних грибів в есктремальних умовах існування / Жданова Н.М., Захарченко В.О., Василевська А.І., Наконечна Л.Т., Артишкова Л.В., Павличенко А.К. // Матеріали ХІІ з'їзду Українського ботанічного товариства: 15 - 18 травня 2006, Одеса. - с. 213.

7. Павличенко А.К. Некоторые ферментативные свойства микромицетов, выделенных из зоны отчуждения / Павличенко А.К., Наконечная Л.Т., Айзенберг В.Л. и др. // Тези доповідей Міжнародної наукової конференції “Мікробні біотехнології”: 11 - 15 вересня 2006, Одеса. - с. 144.

8. Айзенберг В.Л. Методика кількісного визначення активності грибної інулінази з використанням реактиву Самнера / Айзенберг В.Л., Стойко В.И., Павличенко А.К. та ін. // Матеріали ХІІ з'їзду Українського ботанічного товариства: 15 - 18 травня 2006, Одеса. - с. 184.

9. Павличенко А.К. Вплив низьких концентрацій глюкози на ростові процеси штамів Сladosporium chlorocephalum, виділених з приміщень 4-го блоку ЧАЕС / Павличенко А.К. // Тези доповідей Х з'їзду Товариства мікробіологів України: 15 - 17 вересня 2004, Одеса. - с. 227.

10. Павличенко А.К. Особливості росту і розвитку штамів Hormoconis resinae та Cladosporium sphaerospermum / Павличенко А.К. // Тези доповідей Першої Міжнародної конференції студентів аспірантів: 11 - 14 квітня 2005, Львів. - с. 179 - 180.

Размещено на Allbest.ru