Дослідження фотоіндукованого переносу електрона в фотосинтетичних реакційних центрах бактерій

Размещено на http://www.allbest.ru//

Размещено на http://www.allbest.ru//

СЕВАСТОПОЛЬСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ ТЕХНІЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

03.00.02-Біофізика

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата фізико-математичних наук

«Дослідження фотоіндукованого переносу електрона в фотосинтетичних реакційних центрах бактерій»

Оленчук Марина Володимирівна

Севастополь-2009

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті фізики Національної Академії наук України.

Науковий керівник: доктор фізико-математичних наук,

професор Харкянен Валерій Миколайович,

Інститут фізики НАН України, завідуючий

відділом фізики біологічних систем

Офіційні опоненти:

доктор фізико-математичних наук, професор Остапенко Ніна Іванівна, Інститут фізики НАН України, провідний науковий співробітник відділу фотоактивності (м. Київ);

кандидат фізико-математичних наук, доцент Пахомов Валерій Інокентійович, Севастопольський національний технічний університет Міністерства освіти та науки України, доцент кафедри фізики (м. Севастополь).

Захист відбудеться ” 22 “ травня 2009 р. о 1500 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради К 50.052.05 Севастопольського національного технічного університету, 99053, м. Севастополь, вул. Університетська, 33, ауд. А-201.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Севастопольського національного технічного університету за адресою: 99053, м. Севастополь, вул. Університетська, 33.

Автореферат розіслано ” 17 “ квітня 2009 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої радиРогова О.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Встановлення механізмів і шляхів регуляції початкового розділення зарядів і транспорту електронів між молекулами-перенощиками у первинних процесах фотосинтезу є однією з центральних проблем біофізики. Численні дослідження показують тісний зв'язок між електронними переходами та конформаційними перебудовами у білку багатокомпонентних макромолекулярних комплексів перенощиків, об'єднаних в єдиний так званий фотосинтетичний реакційний центр (РЦ). Бактеріальний РЦ завдяки простішому, ніж у вищих рослин, фотосинтетичному апарату, здатності до поглинання світла, світлоіндукованого розділення зарядів та високому квантовому виходу первинних процесів фотосинтезу залишається однією з найбільш досліджуваних систем. Відомо, що процеси електронного переносу між донором і акцептором бактеріальних РЦ відбуваються в два етапи: спочатку електрон локалізується на вторинному хінонному акцепторі з втратою частини енергії шляхом коливальної релаксації; далі молекула акцептора переходить у новий конформаційно-рівноважний стан у відповідності з її новим електронним станом. Тим самим індукується каскад конформаційних змін. Проведені раніше дослідження електронного переносу у РЦ виявили існування незначних повільних структурних перебудов РЦ навіть при імпульсній фотоактивації зразка. Більш тривала фотоактивація зразка приводить до того, що структурні зміни накопичуються і зберігаються тривалий час. Саме структурні зміни, спричинені електрон--конформаційними взаємодіями, в свою чергу, впливають на ефективність електронного транспорту у РЦ. Існування такого зворотного зв'язку спричиняє появу нелінійних ефектів у процесі фотоактивації реакційного центру. Одним із проявів такого зворотного зв'язку може бути суттєве уповільнення швидкості розпаду фотозбудженого стану після припинення тривалої фотоактивації у порівнянні з релаксацією цього стану після імпульсної фотоактивації. Однак кінетичні механізми таких структурних перебудов не досліджувались. Тому дослідження кінетики фотозбудження і релаксації електрона при різних режимах фотоактивації РЦ має важливе значення у розумінні як процесів електрон-конформаційної взаємодії, так і шляхів керування потоком фотозбуджених електронів. В роботі визначались кінетичні параметри фотозбудження і релаксації РЦ при різних тривалостях фотоактиваціях зразка. При цьому використовувались як відомі, так і нові методи аналізу, розроблені під час виконання даної роботи.

Зв'язок дисертації з науковими програмами, планами, темами.

Дисертаційна робота виконана відповідно до планів наукової діяльності відділу фізики біологічних систем Інституту фізики НАН України в межах тем: “Електронні та іонні процеси в біологічних об'єктах та органічних напівпровідниках” (2001-2006, № Держреєстрації 0102U007063); “Дослідження” фізичних принципів структурної організації та динамічної поведінки біологічних макромолекул” (2005-2007, № Держреєстрації 0105U001136); “Дослідження фізичних властивостей і структурної динаміки біомакромолекул та нанокомплексів на їх основі” (2008-2012, № Держреєстрації 0108U000253).

Мета і задачі дослідження. Метою даної роботи було встановлення кінетичних механізмів фотоіндукованого електронного транспорту та пов'язаних з ним структурних перебудов макромолекули РЦ в різних умовах фотоактивації зразка. Для досягнення цієї мети були поставлені і вирішені такі задачі:

з'ясувати особливості взаємодії світла з макромолекулами РЦ, що здатні тривалий час перебувати у стані з розділеними зарядами;

методами адсорбційної спектроскопії дослідити часові залежності зміни оптичного поглинання розчинів РЦ у різних режимах фотоактивації;

розробити методи знаходження кінетичних параметрів фотозбудження і релаксації РЦ;

визначити кінетичні параметри системи РЦ пурпурових бактерій, що описують процеси фотозбудження і релаксації, при сталому часі фотоактивації і різній інтенсивності збуджуючого світла;

встановити кінетичні параметри релаксації системи РЦ при сталій інтенсивності фотозбуджуючого світла різної тривалості: 1) при різній величині інтенсивності світла; 2) при різних температурах; 3) з різними детергентами. реакційний центр бактерія макромолекула

Об'єкт дослідження -- фотоіндукований електронний перенос у РЦ на первинній стадії фотосинтезу бактерій виду Rb. Sphaeroides.

Предмет дослідження--кінетичні параметри зарядово-транспортних процесів у РЦ в різних режимах його фотозбудження.

Методи дослідження--електронна адсорбційна спектроскопія; математичне моделювання та комп'ютерний аналіз експериментальних даних з використанням самостійно розроблених комп'ютерних програм.

Наукова новизна отриманих результатів. Описано фізичні механізми взаємодії світла з фотоактивними (фоточутливими) біологічними макромолекулами бактеріальних РЦ з аномально великим (протягом секунд і більше) часом життя у стані з фоторозділеним зарядом. Вперше показано суттєву відмінність поглинання світла, що проходить крізь середовище з такими молекулами, від класичного закону поглинання світла Бугера-Ламберта-Бера, і виявлено, за яких умов можливий рівномірний розподіл збуджуючого світла вздовж його оптичного шляху, а також розроблено нову методику обробки експериментальних результатів, що враховує нелінійний характер поглинання світла молекулами у зразку.

Подальший розвиток набула самоузгоджена адіабатична теорія зарядового переносу і структурних рухів у фоточутливих біомакромолекулах. В роботі було показано, що константи швидкостей рекомбінації електрону зі стану з розділеним зарядом залежать від умов попереднього освітлення (інтенсивності та тривалості збуджуючого світла), а отже, під дією світла у макромолекулі відбуваються конформаційні перебудови. В роботі встановлено, що дія світла інтенсивністю до 2мВт/см2 тривалістю до 5 секунд не спричиняє суттєвих конформаційних перебудов у РЦ. Показано, що при тривалій фотоактивації РЦ розподіляються між кількома конформаційними підстанами, які виникають та змінюються в залежності від умов фотозбудження. Зростання конформаційних змін у РЦ, що відбувається при збільшенні тривалості фотоактивації, супроводжується прогресивним уповільненням характерного часу темнового повернення електрона з вторинного хінонного акцептору на донор і пов'язане з появою нових конформаційних підстанів РЦ.

Практичне значення отриманих результатів. Ґрунтовне дослідження кінетики фотозбудження і релаксації електрона у РЦ пурпурових бактерій при різних режимах фотоактивації РЦ має значення для фундаментального вивчення процесів переносу заряду у білкових макромолекулах та розуміння механізмів електрон-конформаційної взаємодії. Встановлені ефекти конформаційних змін можуть стати основою керування потоком фотозбуджених електронів РЦ і застосовуватись при створенні штучних систем молекулярної електроніки. Розроблені методики та комп'ютерні програми для обробки експериментальних даних можуть бути використані в подальших дослідженнях процесів електронного транспорту у біосистемах.

Особистий внесок здобувача: наукові праці [3,5,9,10,12,13,14] написані без співавторів; у наукових працях, опублікованих зі співавторами, особистий внесок здобувача полягає у наступному: в роботі [1] ? участь у розвитку теорії та написанні програми і статті, обробка даних, розрахунки; у роботах [2,8] ? обробка даних, розрахунки, участь в обговоренні результатів; у роботі [4] ? розробка моделі, обробка даних, розрахунки, написання статті, участь у інтерпретації результатів та постановці експерименту; у роботах [6,11,16] ? обробка даних, розрахунки, участь у написанні програми і інтерпретації результатів; у роботах [7,15] ? участь у написанні програми, обробка даних, аналіз і інтерпретація результатів, аналіз літературних даних, написання статті, тез.

Апробація роботи. Основні результати досліджень, що увійшли в дисертаційну роботу, були представлені та обговорені на XV міжнародній школі-семінарі “Spectroscopy of molecules and crystals”, Чернігів, 23-30 червня 2001; 5-ій міжнародній конференції молодих вчених “Problems of optics and high technology material science”, Київ, 28-31 жовтня 2004; 1-ій, 2-ій, 4-ій всеукраїнських науково-технічних конференціях “Физика. Биофизика”, Севастополь, 4-9 квітня 2005, 17-22 квітня 2006, 21-26 квітня 2008; The Geilo NATO ASI “Evolution from Cellular to Social Scales”, Geilo, Apr 10-20, 2007, Norway 2007; XVIII міжнародній школі-семінарі “Spectrosсopy of molecules and crystals”, Берегове, 20-28 вересня 2007; 4-ій міжнародній конференції “Physics of Liquid Matter: Modern Problems”, Київ, 23-26 травня 2008; 7-ій міжнародній конференції по електронним процесам у органічних матеріалах, Львів, 26-30 травня 2008.

Публікації. Основні матеріали дисертації опубліковані у 16 наукових працях, у тому числі у 7 статтях у наукових фахових журналах та 9 тезах доповідей на наукових конференціях.

Структура дисертації. Дисертація складається зі вступу, п'яти основних розділів, висновків, списку використаних джерел. Загальний обсяг дисертації складає 160 сторінок, вона містить 47 рисунки (з них 8 на окремих сторінках), 15 таблиць, 2 з яких займають 1 окрему сторінку. Список використаних джерел (220 найменувань) займає 24 сторінки.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У вступі подана загальна характеристика роботи, обґрунтовано актуальність теми, сформульовані мета і задача дослідження, показано новизну і значимість одержаних результатів.

Розділ 1 присвячений огляду літератури. В ньому надано відомості про структуру РЦ виду Rb. Sphaeroides, про константи швидкостей між кофакторами даного центру і вплив на них різних чинників; аналізуються сучасні погляди на процес переносу заряду у фотосинтетичних РЦ.

Проведений огляд літературних даних показав, що структурні зміни впливають на процес електронного транспорту у РЦ, а ефекти конформаційного регулювання вважаються визначальним фактором зарядово-транспортних процесів, хоча відповідні фізичні механізми до кінця нез'ясовані. Досі нема однозначного теоретичного підходу до опису електрон-конформаційної динаміки макромолекули. Її точний кількісний опис стикається з серйозними труднощами як у теоретичних, так і експериментальних дослідженнях. У теорії виникає проблема вибору способу опису мезоскопічної системи, кількість змінних якої велика, а виключно статистичний опис її є неприйнятним. Експериментально можна спостерігати за параметрами, які характеризують кінетику фотозбудження та релаксації електрона фотодонора (основної координати реакції системи). При цьому розподіл досліджуваних об'єктів по структурних змінних дає інтегральний внесок у цю кінетику. Численні експериментальні дані свідчать, що модель кінетики розділення зарядів у РЦ має бути комплексною. Вважається, що існують дві фази рекомбінації електрону зі стану з розділеним зарядом: швидка і повільна. У зв'язку з цим при обробці експериментальних даних, в основному, користуються двоекспоненційною апроксимацією досліджуваних кривих. Однак, вибір числа експонент є суб'єктивним чинником і може впливати на аналіз та трактовку результатів. У даній роботі запропоновано метод більш інформаційного представлення кривих релаксації, який не обмежений числом експонент.

У розділі 2 дано основні положення нелінійної теорії електронного переносу у РЦ. Вважається, що ансамбль РЦ складається з ідентичних макромолекул. У даній моделі не розглядаються коливання електрона всередині потенціальної ями, пружні коливання атомів у молекулі і коливання самих білкових макромолекул. Весь процес можна розбити на кілька простих стадій: 1) тунелювання електрона з однієї молекули-кофактору на інший--протягом цієї стадії конформаційний стан макромолекули можна вважати незмінним; 2) конформаційний перехід самої макромолекули, викликаний зміною розподілу електронної густини--протягом цієї стадії розподіл електронної густини адіабатично прямує за зміною конформаційних перетворень; при цьому електронний стан завжди знаходиться у рівновазі з конформацією макромолекули.

Для теоретичного моделювання процесів функціонування біологічної макромолекули необхідно ввести, як мінімум, дві змінні: змінну основного процесу і структурну змінну системи. У випадку електронного транспорту у РЦ змінну основного процесу можна розглядати як електронні переходи між редокс-кофакторами. В якості структурної змінноївибрана різниця вільних енергій системи у розрахунку на 1 електрон на первинному і вторинному хінонних акцепторах: (де ДGBA ? різниця вільних енергій електрону на первинному QA і вторинному QB хінонних акцепторах, kБ ? стала Больцмана, T ? температура). У найпростішому випадку, коли макромолекула має два просторово розділені редокс-кофактори (фотодонор--димер бактеріохлорофілу і фінальний акцептор--вторинний хінон QB), а також у випадку наявності проміжних акцепторів, стани яких мають заселеність, якою можна знехтувати, базова система рівнянь еволюції конкретизується у вигляді:

(1)

де шд(t), шa(t) - імовірності знаходження системи в момент часу у станах з електроном на донорі д чи акцепторі а відповідно. Перехід електрона здійснюється з константами швидкостей прямого переносу (розділення заряду) ke(x) і зворотного (рекомбінації) kr(x), у вигляді яких враховані усі швидкі ядерні рухи коливального характеру. З появою фотоактивації чи зміною інтенсивності у системі починається перерозподіл електронної заселеності кофакторів. В реальному випадку переходи між станами д>а пов'язані із зовнішнім параметром, а саме, інтенсивністю збуджуючого світла I та константою рекомбінації kr, і можуть змінюватись. Це означає, що система ніколи не знаходиться у рівновазі, а її нерівноважний стан підтримується за рахунок зовнішнього джерела (світла), що ініціює основний процес фоторозділення зарядів, який виконується макромолекулою РЦ в процесі її функціонування. У цьому випадку при неперервному освітленні потік забезпечується циркуляцією одного й того ж електрона внаслідок багаторазових послідовних актів фотоіндукованого електронного переносу та його рекомбінації. Швидкість прямого переходу пропорційна інтенсивності збуджуючого світла: ke=б·I, де б- імовірність фотозбудження при I=1. Константа рекомбінації kr=kr0·e-x вважається експоненційною функцією структурної змінної x. Така залежність розглядається як найбільш реалістична.

У розділі 3 розглянуто методологічні аспекти щодо аналізу експериментальних даних. Показано, що для опису кінетики фотозбудження і релаксації макромолекул РЦ можна скористатись спрощеною дворівневою кінетичною схемою (1). В ході експерименту вимірюється зміна поглинання ДA(I,t) розчину РЦ при різних умовах фотоактивації зразка, яка визначається різницею поглинання зразка, що знаходиться у темряві, і поглинання у кожен момент часу після фотозбудження, і, фактично, пропорційна заселеності збуджуючого стану ДA(I,t)=A(0,0)-A(I,t)~шa(t) .

Розв'язком системи рівнянь (1) для опису процесу фотозбудження при початкових умовах шд(0)=1, шa(0)=1 , які визначають, що усі молекули знаходяться в основному стані, є вираз:

(2)

Для опису процесу релаксації () після досягнення стаціонарного стану (початкові умови: ) використовується вираз:

(3)

Апроксимація експериментальних даних виразами типу (2,3) дозволяє визначити кінетичні і стаціонарні характеристики даної молекулярної системи.

Відомо, що у випадку біологічних молекул вплив складної структурної релаксації призводить до необхідності описувати релаксаційні криві набором експонент. У випадку дискретної зміни інтенсивності збуджуючого світла (до 3 мВт/см2) при сталому часі фотоактивації (до 5 секунд) був розроблений алгоритм, що дозволяє встановити усі кінетичні параметри системи:

1. Виконується апроксимація кривих релаксації набором експонент згідно виразу:

(4)

В результаті апроксимації встановлюється набір параметрів kr(i), однаковий для усієї експериментальної серії (при різних інтенсивностях, але сталому часі фотоактивації), і залежні від інтенсивності світла величини .

2. На другому етапі величина представляється у вигляді:

(5)

За цією формулою визначаються параметри б(i) і для встановленого раніше kr(i). ДAmax=ДA(I=?,t=?) ? максимальна абсорбційна зміна.

3. На третьому етапі знайдені кінетичні параметри підставляються в розрахункову формулу для опису стадії фотозбудження:

(6)

і відбувається порівняння експериментальної і побудованої теоретично кривих для стадії фотозбудження. Знайдені в результаті співставлення параметри б(i), kr(i) та визначають кінетику фотозбудження та релаксації молекул.

При цьому важливим залишається проблема вибору числа експонент, необхідних для правильного встановлення кінетичних параметрів системи. Щоб виключити суб'єктивний чинник, яким є кількість експонент, було використано алгоритм, в якому однозначно встановлюється розподіл констант швидкостей, що характеризує досліджуваний перехід. Фактично, ми представляємо релаксаційну криву, яка має бути монотонно спадаючою, не сумою експонент (де qi ? вага експоненціальної складової, ki - константа швидкості розпаду в стан і, n -кількість складових), а у вигляді (де ? розподіл констант швидкостей, що характеризує досліджуваний перехід, а межі інтегрування визначаються властивостями системи). В реальних експериментах сигнал вимірюється в дискретні моменти часу ti і має величини gi, які апроксимуються значеннями fi, а спектр обчислюється як дискретний набір значень , причому крок дискретного розбиття по часу і константам швидкостей обирається достатньо малим. При цьому використовується метод максимальної ентропії (МЕМ).

Оптимальний спектр, що задається дискретним набором, визначається при максимізації функціоналу, де ? ентропійний член (ентропія Шенона-Дженса), Fj? деяке фіксоване початкове наближення; L - невідомий множник Лагранжа; ч2 ? значення критерію при апроксимації експериментальної залежності gi набором fi. Ентропійний член забезпечує однозначність розв'язку, вибираючи з усіх можливих спектрів , які дають апроксимацію з даною точністю, той, який найбільш імовірно продукує одержані в експерименті значення gi. Параметр L визначає баланс між ентропією та середньоквадратичним критерієм. Роль ентропійного члена полягає у виборі форми спектра на початкових ітераціях, коли L мале. Подальша “тонка підгонка” спектра забезпечується мінімізацією середньоквадратичного відхилення при великих L, коли роль ентропійного члена стає малою. Ітеративна процедура збігається до заданого значення чcr2 при певному значення параметра L. Процедура максимізації функціоналу дозволяє встановити розподіл характерних часів релаксації системи внаслідок співставлення з теоретичним виразом не експериментальної релаксаційної кривої, а її логарифмічної гістограми.

На основі МЕМ було створено програму, яка знаходить розподіл характерних часів релаксації, апроксимуючи при цьому гістограму функції f(t). Було проведено детальне тестування та апробацію даної програми. Дана методика була використана як основна для обробки експериментальних даних і встановлення як кількості експонент, так і значень констант швидкостей релаксації і їх ваг.

Розділ 4 присвячений питанню взаємодії світла з фоточутливим середовищем. Теоретично обґрунтовано, що у випадках, коли біологічні макромолекули перебувають у стані з фоторозділеним зарядом аномально великий час (набагато більший від типових часів розпаду ~10-8c), класичний закон Бугера-Ламберта-Бера I(z)=I0e-еcz (де I0--інтенсивність падаючого на зразок світла, е--коефіцієнт молярної екстинкції, c--молярна концентрація поглинаючих молекул, z--довжина оптичного шляху світла) порушується, оскільки концентрація молекул в основному стані cд змінюється вздовж оптичного шляху збуджуючого світла. Разом з цим змінюється і інтенсивність збуджуючого світла вздовж зразка, що призводить до того, що у зразку різні макромолекули перебувають в різних експериментальних умовах фотозбудження. Зрозуміло, що такі зміни як інтенсивності світла, так і кількості макромолекул, здатних поглинати світло, можуть суттєво вплинути на знаходження величин важливих стаціонарних і кінетичних параметрів реакцій біомакромолекул, які визначаються методами оптичної спектроскопії.

Проведено теоретичні розрахунки, які показують, що за умови, коли на кювету деякої довжини L з двох протилежних сторін падає світло однакової інтенсивності I0, може відбуватись просвітлення зразка, суть якого полягає у тому, що світло вздовж оптичного шляху розподіляється рівномірно. Цей ефект нетривіальний і може спостерігатись у випадку, коли співвідношення констант швидкостей фотозбудження і релаксації має вигляд бI>>kr. Величина , що відповідає максимальному відносному зменшенню інтенсивності у зразку в середній точці зразка L/2, у такому разі з<<1, а розміри кювети при цьому мають бути меншими від деякого параметру . Основуючись на теоретичних розрахунках, можна оцінити умови для забезпечення рівномірного розподілу світла у середовищі молекул з аномально великим часом життя у стані з фоторозділеним зарядом.

У випадку збільшення оптичного шляху збуджуюче світло розподіляється нерівномірно вздовж кювети.

Направлене перпендикулярно до збуджуючого, тестуюче світло поглинається вздовж усієї довжини зразка (вздовж осі z), і вимірюється середнє по цій довжині значення поглинання

,(7)

де шд(z,t) визначається з рівняння

(8)

При цьому інтенсивність світла визначатиметься як:

(9)

Рівняння (8),(9) являють собою нелінійну систему відносно шд(z,t) та I(z,t). Вона розв'язувалась чисельно з використанням для розв'язку (8) методу Рунге-Кутта 4-го порядку з початковою умовою: шд(z,0)=1, I(z,0)=I0(e-еcz+e-еc(L-z)), а інтегрування в (9) проводилось методом Гауса. На основі розробленого алгоритму, що спирається на вирази (7?9), було створено спеціальну комп'ютерну програму для визначення кінетичних параметрів фотозбудження і б(i) з врахуванням нелінійних ефектів, пов'язаних з нерівномірним проходженням збуджуючого світла крізь фотоактивне середовище.

Для опису кінетики фотозбудження РЦ, розчин яких містився у кюветі довжиною 1 см, було використано алгоритм (7-9). Результати представлені у першому рядку Таблиці 1 і на рис. 1 (суцільна крива). У другому рядку містяться результати, одержані згідно алгоритму (4-6), на рис. 1 представлені чорними квадратами. Експериментальні дані представлені прозорими точками.

Таблиця 1.

Розрахункові значення кінетичних параметрів системи РЦ при їх фотоактивації протягом 5 секунд

1	8.597	0.751	0.699	1.071	0.300	0.699	0.205	0.060	0.699
2	8.597	1.153	0.498	1.071	0.239	0.347	0.205	0.089	0.333

Експериментальні криві фотозбудження РЦ при різних інтенсивностях фотозбуджуючого світла досить добре співпадають з теоретично побудованими кривими з встановленими за цим методом параметрами. Ще більш суттєвий, якісний висновок витікає з приведених у Таблиці 1 значень для молекулярного коефіцієнта поглинання б(i). Так, стандартний метод призводить до висновку про існування трьох типів РЦ з помітно різними значеннями цього коефіцієнту, тоді як розрахунки, проведені за допомогою програми, яка враховує нелінійний характер поглинання вздовж зразка, навпаки, свідчить про однорідність РЦ відносно фотозбудження, оскільки для усіх компонент релаксації значення б(i) співпадають з високою точністю. Такий результат видається більш логічним, оскільки величина б визначається властивостями первинного фотодонора, що міститься у білковому комплексі РЦ на значному віддаленні від хінонних акцепторів, які визначають характер релаксації. Оцінка розмірів кювет (менше 5 мм), при яких ще можна застосувати стандартний метод, також свідчить на користь більшої адекватності розробленого методу. У цьому випадку інтенсивність світла у зразку практично постійна і умови фотозбудження для усіх молекул однакові.

Розділ 5 містить експериментальну частину роботи. Тут описано методику виділення РЦ, програмно-апаратний комплекс для дослідження молекулярних систем з фотопереносом заряду, представлено експериментальні дані, їх обробку і аналіз при різних режимах фотоактивації зразків.

Досліджувався вплив збуджуючого світла різної інтенсивності при невеликій тривалості (3 та 5 секунд) фотоактивації на розчини РЦ, що знаходяться у кюветі довжиною 1 міліметр. Інтенсивність світла змінювалась дискретно--від 0.16 мВт/см2 до 5 мВт/см2. На рис. 2 представлено експериментальні кінетичні криві при трьохсекундній фотоактивації в залежності від інтенсивності фотозбуджуючого світла. Було застосовано усі вищеописані методики для знаходження кінетичних параметрів і проведено аналіз результатів обробки. Релаксаційні криві оброблялись двома способами: 1) знаходження розподілу характерних часів релаксації (результати представлені на рис.3) і 2) апроксимація набором експонент.

Для опису кінетики стадії фотозбудження РЦ використовувся алгоритм (4?6). Було встановлено кінетичні параметри фотозбудження і релаксації системи РЦ при трьохсекундній і п'ятисекундній фотоактивації розчину (Таблиця 2). Показано, що при малих часах експозиції РЦ, кінетичні параметри практично не змінюються, тому можна припустити, що система не зазнає суттєвих структурних перебудов.

Таблиця 2.

Розрахункові значення кінетичних параметрів системи РЦ при їх фотоактивації протягом 3 і 5 секунд

	texp=3 c	texp=5 c
	i=1	i=2	i=3	i=4	i=1	i=2	i=3	i=4
	10.23	1.48	0.560	0.016	10.04	1.534	0.601	0.016
	0.292	0.297	0.293	0.292	0.296	0.299	0.305	0.305
	0.002	0.051	0.049	0.003	0.002	0.057	0.049	0.002

Вплив збільшення тривалості фотоактивації на кінетику релаксації системи досліджувався у трьох випадках: 1) при сталих інтенсивностях світла ( І=0.375 мВт/см2,, І=1.125 мВт/см2); 2) при різних температурах (T=2 oC, , T=5 oC, T=10 oC) при інтенсивності збуджуючого світла І=3 мВт/см2; 3) для РЦ з різними детергентами (холат натрію, LDAO, Tr-X-100) при температурі T=2 oC при інтенсивності збуджуючого світла І=1.5 мВт/см2.

На рис.4 показано зміну оптичного поглинання розчину РЦ при І=0.375 мВт/см2 в залежності від тривалості фотоактивації розчину. З рисунку видно, що процес релаксації має дві фази--швидку і повільну, що узгоджується з літературними даними. При збільшенні тривалості фотоактивації процес релаксації змінюється, а саме, вклад повільної фази стає більший. Розподіл характерних часів релаксації (рис.5) при цьому змінюється суттєво.

Виявлено, що при збільшенні тривалості фотоактивації РЦ відбуваються зміни у розподілі характерних часів релаксації: 1) при фотоактивації РЦ протягом 10 та 30 секунд у розподілі з'являються нові піки шляхом відокремлення від існуючих (Рис.5), що свідчить про утворення нових конформаційних підстанів; 2) із збільшенням тривалості фотоактивації відбуваються зсуви в область більших значень часів релаксації, що стосуються повільної фази (так, найбільш повільна компонента ф4 збільшується у 8 разів, компонента ф5? у 4 рази, а компонента ф6? у 3 рази), з перерозподілом їх вагових вкладів; 3) в області швидкої фази спостерігається поява (при малих часах фотоактивації розчину РЦ) і зникнення (при великих тривалостях фотоактивації) сателітного піку ф3; 4) значення часів релаксації швидкої фази ф1 і ф2 залишаються практично незмінними, причому компонента ф1?0.1 c відповідає характерному часу релаксації електрону у РЦ без вторинного хінонного акцептора, а компонента ф2?1 c відповідає характерному часу швидкої рекомбінації електрона з вторинного хінону РЦ. Вага компоненти ф1 є практично сталою і становить ~6-8%. Вага швидкої фази релаксації (компоненти ф2 і її сателіт ф3) Aшв зменшується на користь ваги повільної фази (компоненти ф4, ф5, ф6) Aпов. На рис.6 представлено динаміку змін констант релаксації і вагових вкладів для швидкої і повільної фаз релаксації для усієї експериментальної серії.

В роботі було показано, що виникнення нових конформаційних підстанів і динаміка збільшення характерного часу рекомбінації при тривалому часі фотоактивації РЦ (більше 10 секунд) відбувається у РЦ при різних температурах, РЦ з різними детергентами і різній інтенсивності збуджуючого світла.

Показано, що більш висока інтенсивність збуджуючого світла (І=1.125 мВт/см2) уповільнює процес релаксації системи. Значення характерного часу компоненти ф4 збільшується у 33 рази, компонент ф5 і ф6, що з'являється при фотоактивації протягом 30 та 50 секунд, Ї у 19 і 5 раз, відповідно. Сателітна компонента у швидкій фазі релаксації існує при фотоактивації розчину протягом 90 секунд і зникає при більш тривалих засвітках. Природа сателіту пов'язана зі зміною розподілу РЦ в основному стані при їх фотозбудженні. Очевидно, що сильніше світло спричинятиме більші зміни їх розподілів, і як наслідокЇ триваліше існування сателітного піку в розподілах характерних часів релаксації РЦ.

Температурні залежності електронного транспорту--найважливіші залежності, що дозволяють охарактеризувати еволюцію системи і встановити роль повільної конформаційної динаміки у формуванні стійких станів макромолекули. В роботі показано, що при вищій температурі значення характерних часів релаксації конформаційних під станів, що відповідають повільній фазі, зі зростанням тривалості фотоактивації швидше збільшуються, ніж при нижчих температурах (рис.7). Нові конформаційні підстани при вищій температурі утворюються при меншій тривалості фотоактивації розчину.

З ростом тривалості фотоактивації вагове співвідношення між швидкою і повільною фазами релаксації змінюється на користь останньої (рис.8). Причому, при вищій температурі вага повільної фази релаксації досягає більшого значення (Апов=60% при T=2 oC, Апов=65% при T=5 oC, Апов=74% при T=10 oC). Виявлено, що при низьких температурах (T=2 oC, T=5 oC) спостерігається зменшення вкладу компоненти ф1 (А1) і збільшення вкладу компонент швидкої фази (ф2 і ф3) Ашв при тривалостях фотоактивації до 10 секунд. Ми припускаємо, що цей ефект пов'язаний з впливом температури на електронний перехід між хінонами QA і QB. Так, при низьких температурах (T=2oC, T=5 oC) зв'язок між хінонами є порушеним і як наслідок--вклад компоненти ф1 становить A1=30% (рис.8а).

При збільшенні тривалості фотоактивації РЦ (7 секунд при T=2 oC і 5 секунд при T=5 oC) спостерігається відновлення зв'язку між хінонами, що проявляється досягненням стаціонарного значення ваги компоненти ф1, яке становить A1?10%. При T=10 oC перерозподіл між вкладами спостерігається лише при односекундній фотоактивації зразка (рис.8б). Тобто, вища температура сприяє швидшому відновленню електронного переходу між первинним і вторинним хінонами.

Подібний ефект спостерігається і для РЦ з різними детергентами. При texp=1 c співвідношення між вкладами різних компонент становить: для РЦ у LDAO A1=36%, Aшв=58%, Апов=5%, для РЦ у Tr-X-100 A1=30%, Aшв=57%, Апов=8%, а для РЦ з детергентом холат натрію вага компоненти ф1 є сталою і становить A1=6%, а Aшв?84%, Апов?5%. При збільшенні тривалості фотоактивації вага повільної фази релаксації збільшується. Це свідчить, що детергент впливає на жорсткість системи у місцях зв'язування кофакторів, зокрема, хінону QB, може впливати на електронний перехід і на швидкість електронного транспорту.

ВИСНОВКИ

1. Досліджено особливості взаємодії світла з фотоактивними біологічними макромолекулами, що перебувають у стані з фоторозділеним зарядом аномально великий час. Вперше показано суттєву відмінність поглинання світла, що проходить крізь таке середовище від класичного закону поглинання Бугера-Ламберта-Бера, зокрема, показано за яких умов можливий рівномірний розподіл збуджуючого світла вздовж його оптичного шляху. Розроблено нову методику обробки експериментальних результатів для дослідження процесів фотозбудження та релаксації електрона в РЦ, що враховує нелінійний характер поглинання молекул.

2. Розроблено нову методику обробки кривих релаксації на основі алгоритму з максимізацією ентропії Шенона-Дженса. Проаналізовано можливості створеної на її основі комп'ютерної програми та визначено ступінь впливу її

внутрішніх параметрів на точність апроксимації кривих релаксації.

3. Встановлено, що дія світла інтенсивністю до 2мВт/см2 тривалістю до 5 секунд не спричиняє суттєвих конформаційних перебудов у РЦ. Визначено основні кінетичні параметри фотозбудження і релаксації системи, що не зазнала суттєвих структурних перебудов внаслідок фотоактивації.

4. Показано, що при збільшенні тривалості фотоактивації (до сотень секунд) відбувається уповільнення швидкості розпаду фотозбудженого стану на кілька порядків з одночасним перерозподілом вкладів між швидкою і повільною фазами релаксації.

5. Відкрито явище утворення нових фотоіндукованих конформаційних підстанів РЦ. Показано, що їх поява залежить від режиму фотоактивації зразка, а саме, від інтенсивності та тривалості збуджуючого світла.

6. Аналіз експериментальних результатів з кінетики релаксації фотозбудженого електрона при різних температурах показує, що при вищій температурі ефекти конформаційних перебудов є сильнішими і відбуваються при менших тривалостях фотоактивації РЦ.

7. Експериментально показано, що в температурному діапазоні 2-10 °С при фотоактивації до 10 с відбувається відновлення електронного переходу між первинним і вторинним хінонними акцепторами , але при використанні найбільш «м'якого» детергенту ? холату натрію ? ефект відсутній, що можна пояснити сповільненням структурних перебудов при відновленні нативної структури РЦ в умовах фотозбудження.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Дослідження кінетики накопичення фотоіндукованих структурних перебудов фотоактивного жовтого протеїну / М.В. Оленчук, Ю.М. Барабаш, Н.М. Березецька, С.О. Єсилевський, В.М. Харкянен // Вісник Харківського університету. Біофізичний вісник. - 2002. - №568, Випуск 2. - C.62-73.

2. Медленная конформационная динамика фотовозбужденных реакционных центров Rb.sphaeroides при различных температурах / Ю.М. Барабаш, А.О. Гуща, М.Т. Капустина, М.В. Оленчук, В.Н. Харкянен // Біополімери та клітина. - 2002. - T.18, №3. - C.196-205.

3. Оленчук М.В. Дослідження кінетики фотозбудження та релаксації біологічних макромолекул у просторово розподілених системах / М.В. Оленчук // Наукові записки НаУКМА. Фізико-математичні науки. - 2005. -T.39. - C. 48-57.

4. Оленчук М.В. Визначення кінетичних параметрів реакційних центрів пурпурових бактерій виду Rb.sphaeroides / М.В. Оленчук, М.А. Заболотний // Вісник Київського ун-ту. Серія: фізико-математичні науки. - 2006. - №3. - C. 531-537.

5. Оленчук М.В. Дослідження кінетики рекомбінації електронів у бактеріальних реакційних центрах виду Rb.Sphaeroides після фотозбудження світлом різної експозиції / М.В. Оленчук // Фізика живого. - 2006. - T. 14, № 3. - C. 55-62.

6. Peculiarities of light propagation through the media of molecules with long-lived photoexcited states / M.V. Olenchuk, Yu.M. Barabash, L.N. Christophorov, V.N. Kharkyanen // Chem.Phys.Letters. - 2007. - Vol. 447. - P. 358-363.

7. Olenchuk M.V. Study of the Recombination Process of Light-Induced Charge Separation in Reaction Centers of Purple Bacteria Under Long-Term Exposition / M.V. Olenchuk, N.M. Berezetska // Mol. Cryst. Liq. Cryst.. - 2008. - Vol. 497. - P. 453-460.

8. Experimental and theoretical investigations of the RC from Rb.Sphaeroides under prolonged excitation and different temperature conditions/ M.T. Kapustina, Yu.M. Barabash, M.V. Olenchuk, N.M. Berezetskaya // Spectroscopy of molecules and crystals: the XV International School-Seminar, 23-30 June 2001.: book of abstr. - Chernihiv (Ukraine), 2001. - P.147.

9. Olenchuk M.V. Study of kinetics in distributed biological macromolecule systems/ M.V. Olenchuk // Problems of optics and high technology material science: the V International young scientists conf., 28-31 Oct. 2004.: Conf. Proc. - Kyiv, 2004. - P.202.

10. Оленчук М.В. Дослідження кінетичних характеристик біологічних макромолекул / М.В. Оленчук // Актуальные вопросы теоретической и прикладной биофизики, физики и химии “БФФХ-2005”: первая всеукраинская научн.-техн. конф., 4-9 апр. 2005 р.: тезиcы докл. - Севастополь: CевНТУ, 2005. - C.65-66.

11. Sample size effects in photoexcitation of biological molecules / Olenchuk M., Barabash Yu., Kharkyanen V., Christophorov L. // Evolution from Cellular to Social Scales: NATO ASI, 10-20 Apr. 2007.: book of abstr. - Geilo (Norway), 2007. - P.11.

12. Оленчук М.В. Дослідження кінетики рекомбінації електронного збудження в РЦ фотосинтетичних бактерій на основі уявлень про розподіл констант релаксації / М.В. Оленчук // Актуальные вопросы теоретической и прикладной физики и биофизики “Физика. Биофизика-2006”: вторая всеукраинская научн.-техн. конф., 17-22 апр. 2006 г.: тезисы докл. - С.: CевНТУ, 2006. - С.115-117.

13. Olenchuk M.V. Study of recombination processes of light-induced charge separation in bacterial reaction centers under the different photoactivation conditions / M.V. Olenchuk // Spectroskopy of molecules and crystals: the XVIII International School-Seminar, 20-28 Sept. 2007.: book of abstr. - Beregove (Ukraine), 2007. - Р.213-214.

14. Оленчук М.В. Дослідження кінетики рекомбінації електронного збудження в бактеріальних РЦ при різних часах їх фотоактивації / М.В. Оленчук // Актуальные вопросы теоретической и прикладной биофизики, физики и химии “БФФХ-2008”: IV Всеукраинская научно-техн. конф., 21-26 апр. 2008 г.: тезисы докл. - С.: CевНТУ, 2008. - С. 122-124.

15. Olenchuk M.V. Study of recombination process of light-induced charge separation in reaction centers of purple bacterim under long exposition time / M.V. Olenchuk, N.M. Berezetskaya // Electronic Processes in Organic Materials: 7-th international conference, 26-30 May 2008.: book of abstr. - Lviv: Institute of Physics of NAS of Ukraine, 2008. - Р. 39-40.

16. Light propagation through solutions of molecules with long-lived photoexcited states / M.V. Olenchuk, Yu.M. Barabash, L.N. Christophorov, V.N. Kharkyanen //

Physics of Liquid Matter Modern Problems: the 4 International Conf., 23-26 May 2008.: book of abstr. - Kiev, 2008. Ї Р.191.

АНОТАЦІЯ

Оленчук М.В. Дослідження фотоіндукованого переносу електрона в фотосинтетичних реакційних центрах бактерій. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата фізико-математичних наук за спеціальністю 03.00.02 -- біофізика. --Севастопольський національний технічний університет, м. Севастополь, 2009.

Вперше проведено систематичне дослідження взаємодії світла з фотоактивними біологічними макромолекулами, що перебувають у стані з фоторозділеним зарядом аномально великий час (секунди і більше). Визначено умови, за яких можливий рівномірний розподіл збуджуючого світла вздовж його оптичного шляху. Розроблено нову методику обробки експериментальних результатів, що враховує нелінійний характер поглинання молекул.

Дослідження кінетики відновлення донору при різних режимах фотоактивації РЦ показало, що нетривале (до 5 секунд) збудження світлом інтенсивністю до 2мВт/см2 не викликає суттєвих конформаційних перебудов у макромолекулі РЦ, а при збільшенні тривалості фотоактивації (до сотень секунд) відбувається уповільнення швидкості розпаду стану з фоторозділеним зарядом на кілька порядків, величина якої залежить від інтенсивності збуджуючого світла, температури зразка і детергенту. Відкрито явище утворення нових фотоіндукованих конформаційних підстанів РЦ. Показано, що їх поява залежить від режиму фотоактивації зразка, а саме, інтенсивності та тривалості збуджуючого світла. Проаналізовано динаміку змін констант швидкості рекомбінації електрона зі стану з розділеними зарядами для зразків різних РЦ.

Ключові слова: фотоактивні біологічні макромолекули, реакційний центр (РЦ), рекомбінація електрона, конформаційні зміни.

АННОТАЦИЯ

Оленчук М.В. Исследование фотоиндуцированного переноса электрона в фотосинтетических реакционных центрах бактерий. ? Рукопись.

Диссертация на соискание учёной степени кандидата физико-математических наук по специальности 03.00.02. ? биофизика. ? Севастопольский национальный технический университет, г. Севастополь, 2009.

Диссертационная работа посвящена исследованию кинетических механизмов фотоиндуцированного электронного транспорта и связанных с ним структурных перестроек в реакционных центрах фотосинтетических бактерий при различных режимах их фотоактивации.

Впервые было проведено систематическое исследование взаимодействия света с фотоактивными биологическими макромолекулами, способными пребывать в состоянии с фоторазделённым зарядом длительное время (секунды и более). Показано, что для такого случая интенсивность возбуждающего света меняется вдоль оптического пути, а значит, возникает необходимость учитывать это обстоятельство при расчёте кинетических параметров фотовозбуждения системы, поскольку, интенсивность света связана с переходами между состояниями электрона на доноре (основным) и акцепторе (возбуждённым). Разработана новая методика обработки экспериментальных данных с учётом нелинейного изменения интенсивности возбуждающего света вдоль оптического пути. Условия, при которых возможно равномерное распределение возбуждающего света вдоль оптического пути, были определены и учтены при постановке и проведении эксперимента. При этом реальную интенсивность возбуждающего света в образце, которая отличается от интенсивности падающего на образец света, можно рассчитать.

Исследование кинетики фотоокисления донора светом интенсивностью до 2мВт/см2 менее пяти секунд показало, что в системе не возникает существенных конформационных перестроек при её фотоактивации. Рассчитаны основные кинетические параметры фотовозбуждения и релаксации такой системы.

В работе показано, что при увеличении продолжительности световой активации (до сотен секунд) происходит нарастание конформационных изменений в РЦ, сопровождаемое прогрессивным замедлением характерного времени возврата электрона от вторичного акцептора к донору. Это время зависит от интенсивности возбуждающего света, температуры образца и детергента, с помощью которого проводилось выделение макромолекул РЦ. Изменения конформационного состояния РЦ связаны с появлением новых конформационных подсостояний РЦ. При этом количество этих состояний фиксировано и определяется детальным характером микроскопического окружения места связывания , реализацией различных вариантов электростатической стабилизации электрона, локализуемого на вторичном хиноне. Перераспределение весов подсостояний позволяет регулировать эффективность временной стабилизации электрона на акцепторе в зависимости от условий световой активации. Для детального анализа кинетики рекомбинации электрона с применен новый, разработанный метод получения распределения времён релаксации для экспериментальных кинетических кривых рекомбинации фоторазделенных зарядов в структуре РЦ, основанный на алгоритме с максимизацией энтропии Шенона-Дженса. Проанализированы возможности созданной программы и определена степень влияния её внутренних параметров на точность аппроксимации релаксационных кривых.

Ключевые слова: фотоактивные биологические макромолекулы, реакционный центр (РЦ), рекомбинация электрона, конформационные изменения.

SUMMARY

Olenchuk M.V. Investigation of photoinduced electron transfer in photosynthetic bacterial reaction centers. ? Manuscript.

A thesis for a candidate degree in physics and mathematics, speciality 03.00.02- Biophysics. - Sevastopol National Technical University, Sevastopol, 2009.

The interaction between light and photoactive biological macromolecules, photosynthetic bacterial reaction centers (RC), which are capable to stay in charge separated states for a long time (second and more) has been investigated and systemized. The conditions for uniform distribution of exciting light along its optical way were defined. To analyze the experimental data the new computational technique which taking into account the nonlinearity of molecular absorptions was developed.

Experimental results of photodonor oxidation kinetic revealed that short light excitation (< 5s, intensity < 2mW/cm2 ) does not lead to any substantial conformational changes but increase of photoactivation time (up to hundreds seconds) decreases the decay rate of charge separated states in order of several magnitudes. The decay rate also depends on light intensity, temperature and type of detergent. The research data confirmed the appearance of new conformational sub-states in RC macromolecules. These new sub-states depends on condition of photoactivation, namely, intensity and duration of light excitation. The rate constant of electron recombination from charge separated states were analyzed for different type of RC.

Keywords: photoactive biological macromolecules, reaction centers (RC), electron recombination, conformational changes.

Размещено на Allbest.ru

...