Мутації стійкості до антибіотиків, які впливають на біосинтез ландоміцину е у streptomyces globisporus 1912-2 і ногаламіцину в streptomyces nogalater imet 43360

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

Інститут клітинної біології та генетичної інженерії

УДК 579.873.71

03.00.15 - генетика

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

МУТАЦІЇ СТІЙКОСТІ ДО АНТИБІОТИКІВ, ЯКІ ВПЛИВАЮТЬ НА БІОСИНТЕЗ ЛАНДОМІЦИНУ Е У STREPTOMYCES GLOBISPORUS 1912-2 І НОГАЛАМІЦИНУ В STREPTOMYCES NOGALATER IMET 43360

Громико Олександр Миколайович

Київ - 2008

Дисертацією є рукопис

Робота виконана на кафедрі генетики і біотехнології Львівського національного університету імені Івана Франка

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор Федоренко Віктор Олександрович, Львівський національний університет імені Івана Франка, завідувач кафедри генетики та біотехнології

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор Кучук Микола Вікторович, Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України, заст.. завідувача відділом генетичної інженерії

доктор біологічних наук, професор Позур Володимир Костянтинович Київський національний університет імені Тараса Шевченка завідувач кафедри мікробіології та загальної імунології

Захист дисертації відбудеться 28 лютого 2008 р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д.26.202.01. Інституту клітинної біології та генетичної інженерії НАН України за адресою: 03143, м. Київ, вул. акад. Заболотного, 148.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту клітинної біології та генетичної інженерії НАН України за адресою 03143, м. Київ, вул. акад. Заболотного, 148.

Електронна адреса здобувача: o_gromyko@franko.lviv.ua

Автореферат розісланий «26» січня 2008 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, кандидат біологічних наук О.А.Кравець

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Висока частота онкологічних захворювань та поширення явища множинної стійкості ракових клітин до лікарських препаратів становить одну з найбільших проблем сучасної медицини та біології. Найбільшим природним джерелом біологічно-активних речовин на даний час є бактерії роду Streptomyces. Вони синтезують понад 70% усіх відомих антибіотиків, значна частина яких володіє протипухлинними властивостями. Штами Streptomyces globisporus 1912 та Streptomyces nogalater IMET43360 продукують протипухлинні антибіотики ландоміцин Е [Поліщук Л.В. та ін., 1998] і ногаламіцин [Bhuyan B.K.et al, 1965], відповідно. Унікальною властивістю ландоміцинів, зокрема ландоміцину Е, є їхня активність проти пухлин, стійких до деяких антрациклінів [Korynevska A.V., 2007]. Якщо ландоміцини розглядають як перспективні для клінічного застосування у майбутньому, то похідні ногаламіцину (зокрема 7(R)-О-метилногарол) вже широко використовують у хіміотерапії онкологічних захворювань. Ці антибіотики виявляють також антибактерійну активність, особливо проти грам-позитивних бактерій.

Висока вартість протипухлинних антибіотиків зумовлена насамперед низьким рівнем їх біосинтезу штамами-продуцентами. Тому існує потреба в розробці методів конструювання і селекції стабільних високоактивних штамів, які б утворювали необхідні кінцеві метаболіти антибіотичної природи. Дослідження останніх років показали, що високий рівень біосинтезу антибіотика зумовлений не тільки експресією генів біосинтезу, але сильно залежить від генів резистентності як до власного, так і до інших антибіотиків. Особливо цікаві з точки зору їхнього механізму, а також використання у селекції мутації стійкості до антибіотиків, які впливають на процеси транскрипції, трансляції, транспорту метаболітів та морфогенез актиноміцетів. Розробка підходів до отримання високоактивних продуцентів ландоміцину Е і ногаламіцину з використанням цих мутацій дасть змогу скоротити тривалість та об'єми селекційних робіт, зробить пошук більш направленим і має велике значення для створення вітчизняного промислового виробництва протипухлинних препаратів.

Зв'язок роботи з науковими програмами організації, де виконувалась дисертація. Дисертаційна робота виконана у науково-дослідній лабораторії генетики, селекції та генетичної інженерії продуцентів антибіотиків (НДЛ-42) Львівського національного університету імені Івана Франка у межах держбюджетних науково-дослідних тем Бг-12б «Розробка методів генетичного та генно-інженерного конструювання штамів-продуцентів протиракових антибіотиків» (2000-2002, номер держреєстрації - 0197U018080), Бг-117б «Генетичний контроль біосинтезу протипухлинних антибіотиків ландоміцинової групи» (2003-2005, номер держреєстрації - 0197U011132), Бг-33П «Біотехнологічне вдосконалення продуцента протипухлинного антибіотика ногаламіцину Streptomyces nogalater IMET43360» (2005-2007, номер державної реєстрації - 0105U003401), Бг-201П «Конструювання і селекція штамів Streptomyces nogalater - продуцентів протипухлинного антибіотика ногаламіцину» (2003-2006, номер держреєстрації - 0103U006796). Ці дослідження також були підтримані міжнародним грантом INTAS-Україна 95-20 “Біотехнологічне вдосконалення продуцента нового потенційного протипухлинного антибіотика” (1997-2000), двома індивідуальними грантами Західно-Українського Біомедичного Центру (2002-2003), а також індивідуальним міжнародним грантом DAAD (2003-2004).

Мета та завдання дослідження. Метою роботи є розробка методів конструювання високоактивних продуцентів ландоміцину Е S. globisporus і ногаламіцину S. nogalater. Для досягнення цієї мети були поставлені такі завдання:

дослідити спонтанну мінливість культур S. globisporus і S. nogalater за антибіотичною активністю та стійкістю до антибіотиків;

вивчити вплив мутагенної обробки на виживання та антибіотичну активність досліджуваних штамів, визначити ефективні дози мутагенів для пошуку мутантів; антибіотичний штам globisporus nogalater

отримати та вивчити мутанти S. globisporus і S. nogalater, стійкі до еритроміцину, хлорамфеніколу та стрептоміцину;

дослідити вплив мутацій стійкості до антибіотиків на рівень синтезу ландоміцину Е і ногаламіцину у мутантів S. globisporus і S. nogalater;

відібрати та вивчити мутанти, резистентні до антибіотиків, з підвищеним рівнем біосинтезу кінцевих продуктів.

Об'єктом дослідження є спонтанна та індукована мінливість культур актиноміцетів S. globisporus і S. nogalater.

Предметом дослідження є мутації стійкості S. globisporus і S. nogalater до еритроміцину, хлорамфеніколу і стрептоміцину та їхній вплив на біосинтез ландоміцину Е і ногаламіцину.

Методи дослідження - мікробіологічні (культивування штамів актиноміцетів та аналіз їхніх ознак), біохімічні (очищення, кількісний та якісний аналіз антибіотиків), генетичні (отримання та вивчення мутацій, кон'югаційні схрещування між E. coli та актиноміцетами), генно-інженерні (виділення та рестрикційний аналіз сумарної та плазмідної ДНК, конструювання рекомбінантних молекул ДНК, гель-електрофорез ДНК, ДНК-ДНК гібридизація, полімеразна ланцюгова реакція, cеквенування ДНК).

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше отримано і охарактеризовано колекції мутантів продуцентів ландоміцину Е S. globisporus і ногаламіцину S. nogalater, стійких до еритроміцину, хлорамфеніколу і стрептоміцину. Досліджено вплив мутацій антибіотикорезистетності на рівень синтезу ландоміцину Е і ногаламіцину у вказаних штамів. Доведено перспективність селекції високоактивних штамів-продуцентів цих антибіотиків серед антибіотикорезистентних мутантів. Вперше клоновано та секвеновано ген rpsL з клітин S. globisporus 1912-2 та його мутанта Smy622. Встановлено, що високий рівень стрептоміцин-стійкості Smy622 зумовлений заміною нуклеотидів А на G у позиції 128. Доведено, що підвищений рівень біосинтезу ландоміцину Е в штаму Smy622 корелює з посиленою експресією гена шлях-специфічного активатора транскрипції lndI.

Практичне значення отриманих результатів. Розроблено ефективний шлях контруювання штамів з високим рівнем синтезу ландоміцину Е і ногаламіцину. Сконструйовано штами, які значно перевищують за рівнем синтезу ландоміцину Е і ногаламіцину вихідні штами S. globisporus 1912-2 і S. nogalater IMET43360, на однин з яких отримано патент України UA65866А «Штам актиноміцетів Streptomyces globisporus Smy622 - продуцент протипухлинного антибіотика ландоміцину Е». На основі штаму Smy622 спільно з фахівцями Національного університету «Львівська політехніка» створено модель виробництва ландоміцину Е, яка показала високу рентабельність цього виробництва та значно меншу вартість продукту порівняно з імпортними аналогами протипухлинних антибіотиків [Сидоров Ю.І. та ін., 2002]. Цей штам використано в експериментах з комбінаторного біосинтезу нових ангуциклінів [Biag et al., 2006]. Розроблені підходи можуть бути використані у конструюванні інших промислових продуцентів антибіотиків. Мутації стійкості до антибіотиків можуть слугувати як маркери під час картування в експериментах з комбінаторного біосинтезу у штамах S. globisporus і S. nogalater з метою одержання нових антибіотичних речовин або інших генетичних і генно-інженерних процедурах із вказаними штамами. Отримані в роботі штами і клоновний ген rpsL S. globisporus Smy622 використовують під час виконання великого практикуму з генетики і генетичної інженерії мікроорганізмів на кафедрі генетики і біотехнології ЛНУ ім. І. Франка.

Особистий внесок здобувача. Розробку програми виконання поставлених завдань, аналіз та обговорення отриманих результатів досліджень здійснено спільно з науковим керівником - професором Федоренком В. О. Автором самостійно підготовлено огляд літератури та виконано основний обсяг експериментальних досліджень. Спільно з канд. біол. наук Басілією Л.І. отримано мутанти S. globisporus і S. nogalater. У співпраці з канд. біол. наук. Осташом Б.О. здійснено кількісний аналіз рівня синтезу ландоміцину Е мутантами S. globisporus за допомогою ВЕРХ. Для введення репортерної плазміди pIJ8660 в S. globisporus Smy622, що містить безпромоторний ген зеленого флуоресцентного білка використано метод кон'югації E.coli-Streptomyces, модифікований канд. біол. наук. Лужецьким А.М. Спільно з канд. біол. наук. Ребцем Ю.В. досліджено рівень експресії генів lndI і lndE у штамах S. globisporus 1912 і Smy622.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень представлені на таких вітчизняних та міжнародних конференціях, симпозіумах та з'їздах: Міжнародній конференції з молекулярної біології та генетики для студентів, аспірантів та молодих вчених, присвяченій 100-річчю генетики (Львів, 2000); 36 Загальнопольському симпозіумі „Aktywnosc drobnoustrojуw w rуznych srodowiskach” (Краків, Польща, 2001); 6 та 7 Конференції молодих вчених “Биология - наука XXI столетия” (Пущино, Росія, 2002, 2003); II Міжнародній медичній конференції для студентів та молодих вчених (Гданськ, Польща, 2000); XII Міжнародному симпозіумі з біології актиноміцетів (Ванкувер, Канада, 5-9 серпня, 2001); І Всеукраїнській науково-практичній конференції „Біотехнологія. Наука. Освіта” (Київ, 2003); 69-й науковій конференції „Розроблення, дослідження і створення продуктів функціонального харчування та нових технологій для харчової та переробної промисловості” (Київ, 2003); ІІ Крайовому біотехнологічному конгресі (Лодзь, Польща, 2003), X З'їзді Товариства мікробіологів України (Одеса, 2004); Установчому з'їзді Українського товариства клітинної біології (Львів, 2004); Конференції, присвяченій 70-річчю кафедри генетики і цитології Харківського національного університету імені В.Н. Каразіна (Харків, 2004); ІІ Міжнародній науковій конференції студентів, аспірантів і молодих вчених, присвяченій 140-річчю Одеського національного університету імені І.І. Мечнікова (Одеса, 2005); ІІ Міжнародній науковій конференції студентів і аспірантів «Молодь та поступ біології» (Львів, 2006); Міжнародній науковій конференції «Мікробні біотехнології (Одеса, 2006); ІХ Українському біохімічному з'їзді (Харків, 2006); на звітних наукових конференціях ЛНУ ім. І. Франка (2001-2007).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 27 робіт, у тому числі 11 статей в фахових наукових журналах, 1 в збірнику наукових праць, 1 патент України та 14 тез доповідей на конгресах, конференціях та з'їздах.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, експериментальної частини (матеріалів та методів досліджень, результатів та їхнього обговорення), висновків, списку використаних джерел, що охоплює 193 найменувань. Роботу викладено на 180 сторінках машинописного тексту і проілюстровано 29 рисунками та 30 таблицями.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ

Штами бактерій та плазміди. У роботі використано штами S. globisporus 1912 та 3-1 (отримані від проф. Б.П. Мацелюха, Ін-т мікробіології та вірусології НАНУ, м. Київ), S. nogalater IMET43360 (д-р Г. Крюгель, Ін-т дослідження природних сполук, Йєна, ФРН) та їхні мутанти, виділені в цій роботі, E. coli DH5б (MBI Fermentas, Литва), E. coli ET12567 (pUB307) (проф. К.П. Сміт, Ін-т бімолекулярних досліджень, Манчестер, Великобританія). В експериментах з виявлення мутацій в гені rpsL використали плазміди pT7rpsL1 та pT7rpsL2, а для визначення активності гена-регулятора lndI - плазміди pIJ8660H і pIJ8660Е (к.б.н. Ю. Ребець, ЛНУ ім. І. Франка).

Середовища. Для вирощування штамів актиноміцетів та визначення їхньої антибіотичної активності використали повноцінні модифіковані кукурудзяні (КС), вівсяні (ВС), соєві середовища (СС) [Гаузе и др., 1983] та рідке середовище SG [Kieser et al., 2000]. Міцелій для виділення сумарної та плазмідної ДНК, вирощували у рідких середовищах YEME, TSB [Kieser et al., 2000]. Кон'югаційні суміші E. coli-Streptomyces висівали на ВС-1.

Методи. Стійкість штамів актиноміцетів до антибіотиків визначали, як описано в роботах [Настасяк и др., 1992; Демидчук и др., 1996]. Антибіотичну активність досліджуваних штамів визначали методом дифузії в агар із використанням тест-культур S. levoris S165 та Sarcina lutea. Обробку мутагенами виконували за модифікованими методиками [Kieser et al., 2000]. Кон'югацію Escherichia coli-Streptomyces виконували як описано [Лужецкий и др., 2001].

Тонкошарову та високоефективну рідинну хроматографію метаболітів (ТШХ та ВЕРХ, відповідно), спектральний аналіз ландоміцинів виконували згідно [Мацелюх та ін., 1999; Henkel et al., 1990]. Спектральний аналіз ногаламіцину здійснювали за [Wiley et al., 1977].

Генно-інженерні маніпуляції з ДНК (виділення ДНК, секвенування, конструювання та аналіз рекомбінантних молекул ДНК, ПЛР, ДНК-ДНК гібридизація) виконували згідно методик [Kieser et al., 2000, Sambrook et al., 1989].

Аналіз нуклеотидних та імовірних амінокислотних послідовностей виконували за допомогою програм, BLAST 2.0, DNASIS, CLUSTAL W [Altschul et al., 1997]. Аналіз експресії репортерного гена зеленого флуоресцентного білка (EGFP) та отриманих на його основі генетичних конструкцій здійснювали за рівнем флуоресценції міцелію згідно [Sun еt al., 1999].

Статистичну обробку результатів здійснювали за допомогою cтатистичної програми STATGRAFIC та електронних таблиць Мicrosoft Excel 2000.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХНЄ ОБГОВОРЕННЯ

Мінливість штамів S. globisporus 1912 і S. nogalater IMET43360 за рівнем антибіотичної активності. Штам S. globisporus 1912 на ВС утворює повітряний міцелій білого кольору, титр спорових суспензій - (5,6±0,4)Ч108 на мл. Штам утворює два типи колоній: 16% білих спорулюючих (1912-1) і 84% сірих олігоспорових (1912-2). Далі використовували штам 1912-2, оскільки він мав вищу антибіотичну активність (середній індекс продуктивності (ІП) 2,0±0,3), ніж 1912-1 (середній ІП 1,2±0,1). Рівень синтезу ландоміцину Е у штаму 1912-2 становить 2,8±0,3 мкг/мл, а у його похідного 3-1 - 86±3 мкг/мл. Штам S. nogalater IMET43360 на ВС утворює повітряний міцелій світло-сірого кольору. Колонії однорідні, титр спор становить (2,1±0,3)Ч106 на мл, а середній ІП - 5,2±0,6. Штам 43360 синтезує 240±5 мкг/мл ногаламіцину.

Підібрано поживні середовища, оптимальні для росту і синтезу антибіотиків штамами S. globisporus 1912-2 і S. nogalater IMET43360. Досліджено мінливість окремих клонів штамів 1912-2 та 43360 за рівнем антибіотичної активності за умови їх вирощування у різних середовищах. Використано 10 середовищ на основі вівсяної (два середовища), кукурудзяної (шість середовищ) і соєвої круп (два середовища) [Гаузе и др., 1983]. Штам 1912-2 добре росте та утворює повітряний міцелій і спори на ВС і КС. Натомість на СС його ріст сповільнений, а повітряний міцелій не утворюється. Середній ІП штаму 1912-2 коливався від 1,3-1,5 на ВС до 2,9-4,2 на КС. Цей показник був найвищим за умови його вирощування на КС-7. За цих умов високою була частка «плюс»-варіантів (2,1%), ІП яких перевищував М+2у, та коефіцієнт варіації (CV%) - 21,4%. «Мінус»-варіантів, ІП яких менше від М-2у, на КС-7 не виявлено.

Штам S. nogalater IMET43360 добре росте на усіх використаних середовищах. Найвищу антибіотичну активність цього штаму виявлено на соєвих середовищах, зокрема на СС-14 ІП становив 5,6±0,7, а найнижчу на вівсяних - ІП від 3,3 до 3,9. За умови вирощування штаму 43360 на СС-14 CV% становив 26,8% та виявлено найбільше «плюс»-варіантів (4,5%). Частка «мінус»-варіантів сягала 2,3%. У наступних експериментах S. globisporus 1912-2 вирощували на КС-7, а S. nogalater IMET43360 на - СС-14.

Досліджено вплив різних доз ультрафіолетового випромінювання (УФ) та N-метил-N'-нітро-N-нітрозогуанідину (НГ) на виживання спор штамів S. globisporus 1912-2 і 3-1, а також S. nogalater IMET43360. Штами опромінювали УФ протягом різних проміжків часу (10-100 с) за незмінності усіх інших умов досліду. Для оброблення досліджуваних штамів використали НГ у концентраціях 3-10 мг/мл із часом дії мутагену 10-45 хв. Близько 1% спор штаму 1912-2 виживало після 30 с опромінення. У разі оброблення спор штаму 1912-2 НГ у концентрації 3 мг/мл та часу експозиції 25 хв їхнє виживання становило близько 10%. Високоактивний штам 3-1 дещо стійкіший до дії використаних мутагенів, ніж 1912-2. Натомість найбільшу стійкість до мутагенів виявив продуцент ногаламіцину S. nogalater IMET43360. Близько 1% його спор виживало після 90 с УФ-опромінення, а 10% виживання спостерігали після дії НГ у дозі 10 мг/мл протягом 20 хв.

Вивчено вплив різних доз УФ і НГ на антибіотичну активність S. globisporus 1912-2 і S. nogalater IMET43360. Використані дози мутагенів спричиняли зниження середніх значень ІП: на 30-45% штаму 1912-2 і на 10-30% штаму 43360. Натомість у разі використання деяких доз спостерігали підвищення варіабельності досліджуваних штамів за антибіотичною активністю і появу клонів з високими ІП. Зокрема, найбільшого значення CV% штаму 1912-2 досягали після 30 с опромінення УФ (виживання 1,2%), а також після обробки НГ у концентрації 3 мг/мл з часом експозиції 25 хв (виживання 10,0%). У штаму S. nogalater 43360 CV% зростав тільки після 90 с (виживання 1,2%) УФ-опромінення та після дії усіх доз НГ. Він був найвищим (39,2%) у клонів, отриманих після обробки 10 мг/мл мутагену протягом 20 хв (виживання 20,1%). Частка «плюс»-варіантів після дії мутагенів залишалася такою ж, як і серед клонів вихідних штамів, або незначно зростала. Однак серед «плюс»-варіантів, отриманих після обробки мутагенами, виникали штами із значно вищими ІП (від 8,5 до 12,3), ніж серед таких варіантів, виявлених серед клонів вихідних штамів (від 4,8 до 7,4 ).

Таким чином, дози УФ, які знижують виживання спор досліджуваних штамів до 1%, а НГ - до 10-20%, можна використати для виділення мутантів з високою антибіотичною активністю.

Характеристика штамів S. globisporus і S. nogalater IMET43360 за ознаками стійкості до антибіотиків. Визначено спектри та рівні стійкості штамів S. globisporus 1912-1, 1912-2, 3-1, LND901 (не синтезує ландоміцину Е) і S. nogalater IMET43360 до 16 антибіотиків різного механізму. Штами S. globisporus мають подібні спектри антибіотикорезистентності: вони стійкі до в-лактамних антибіотиків та поліміксину, а також помірно чутливі до макролідів та лінкоміцину. Найвищу чутливість вони виявляють до аміноглікозидних антибіотиків. Однак виявлено певні відміни між ними за рівнем стійкості до окремих антибіотиків. Наприклад, штам 3-1 стійкіший від 1912-2 до паромоміцину, стрептоміцину та гентаміцину, а LND901, навпаки чутливіший до них. На відміну від інших досліджених штамів LND901 стійкий до еритроміцину. Штам S. nogalater IMET43360 стійкіший від S. globisporus до рифампіцину і хлорамфеніколу, а також виявляє чутливість до деяких -лактамних антибіотиків, що вирізняє його поміж інших досліджених стрептоміцетів [Федоренко, 2004].

Вивчено залежність між виживанням спор штамів S. globisporus і S. nogalater від вмісту антибіотиків у поживному середовищі. Виявлено, що 100% спор штаму 1912-2 виживало на КС-7, яке містило менше від 0,1 мкг/мл стрептоміцину чи рифапіцину або ж 1,0 мкг/мл хлорамфеніколу чи еритроміцину. На середовищах з 2,0-2,5 мкг/мл стрептоміцину, 7-9 мкг/мл еритроміцину та 12-15 мкг/мл хлорамфеніколу виживання падало спор до 10-5-10-6%. За таких умов виживало приблизно у 10 разів більше спор штаму 3-1. 100% спор штаму S. nogalater 43360 виживало на СС-14 з 0,2 мкг/мл стрептоміцину, 0,5 хлорамфеніколу чи 0,1 мкг/мл еритроміцину. За наявності у середовищі СС-14 15-20 мкг/мл стрептоміцину, 3-5 мкг/мл еритроміцину або 50 мкг/мл хлорамфеніколу виживало 10-5-10-6% спор штаму 43360.

Отримані дані використано для селекції мутантів S. nogalater IMET43360 та S. globisporus стійких до антибіотиків.

Мутації стійкості S. globisporus 1912-2 і S. nogalater IMET43360 до антибіотиків та біосинтез ландоміцину Е і ногаламіцину. Ми зосередилися на отриманні і вивченні мутантів досліджуваних штамів, стійких до еритроміцину (Eryr), хлорамфеніколу (Cmlr) та стрептоміцину (Strr). Визначено частоти утворення таких мутантів (спонтанних та індукованих УФ і НГ), рівні їхньої стійкості до вказаних та інших антибіотиків, а також їхню здатність до синтезу ландоміцину Е та ногаламіцинув.

Отримання і характеристика мутантів S. globisporus 1912-2 і S. nogalater IMET43360, стійких до еритроміцину. Спонтанні Eryr-мутанти штаму S. globisporus 1912-2 відбирали на середовищі КС-7, яке містило 5-10 мкг/мл еритроміцину, з частотою від 5,2Ч10-5 до 1,9Ч10-7, а штаму S. nogalater IMET43360 - з частотою від 1,2Ч10-5 до 0,6 Ч10-6 на середовищі СС-14 з 1-3 мкг/мл антибіотика, відповідно. Оброблення спор УФ і НГ підвищувало частоту виникнення стійких мутантів на один-два порядки. Створено колекцію Eryr-мутантів, яка складається з 1416 похідних штаму S. globisporus 1912-2 і 1383 похідних штаму S. nogalater IMET43360. Виділені мутанти мали різні рівні стійкості. За цією ознакою їх розділено на три групи: стійкі до 5-10 мкг/мл еритроміцину (І група), до 20-30 мкг/мл (ІІ група) та 45-50 мкг/мл (ІІІ група). Більшість Eryr-мутантів обох штамів входили до І і ІІ груп. Менше 1% спонтанних мутантів цих штамів належали до ІІІ групи. У цю ж групу увійшло 2,0% мутантів штаму 1912-2 і 8,6% мутантів штаму 43360, індукованих УФ.

Досліджено зміни антибіотичної активності спонтанних та індукованих УФ Eryr-мутантів S. globisporus 1912-2. Середній ІП спонтанних мутантів, отриманих на КС-7 з 5 і 10 мкг/мл еритроміцину, коливався від 70,3 до 78,4 % щодо середнього значення ІП окремих клонів штаму 1912-2. В Eryr-мутантів, індукованих УФ, цей показник був нижчим лише на 2-4%. Для УФ-індукованих мутантів, відібраних на середовищі з 10 мкг/мл еритроміцину, характерний найвищий коефіцієнт варіації (36,1%). Серед них було й найбільше «плюс»-варіантів (0,5%). Якщо серед спонтанних мутантів лише 8,3% представників ІІ групи синтезували більше ландоміцину Е, ніж вихідний штам (максимум на 20%), то серед УФ-індукованих вже 15,8% мутантів І групи, 38,9% ІІ і 66,6% ІІІ мали такий рівень синтезу (рис.1, А). Вивчення антибіотичної активності спонтанних Eryr-мутантів штаму S. nogalater 43360, виділених на середовищах з 1,0-5,0 мкг/мл антибіотика, виявило, що їхній середній ІП коливався в межах (60,4±0,5)-(65,5±1,0)%, відповідно, відносно вихідного штаму. Середній ІП УФ-індукованих Eryr-мутантів був вищий приблизно на 20% порівняно із спонтанними. Найбільш варіабельними за антибіотичною активністю (CV=31,1%) були мутанти, відібрані на середовищі з 3 мкг/мл еритроміцину. У цій же вибірці було найбільше «плюс»-варіантів (1,3% спонтанних і 0,7% УФ-індукованих).

Лише 16,0% низько- резистентних Eryr-мутантів штаму 43360 синтезували більше ногаламіцину (максимум на 20%), ніж вихідний штам. У ІІ групі виявили мутанти, які синтезували на 25-40% більше антибіотика, ніж штам 43360. Частка таких штамів серед високорезистентних мутантів була вищою утричі. З отриманих результатів випливає, що штами з підвищеним рівнем синтезу ногаламіцину частіше виникають серед УФ-індукованих Eryr-мутантів штаму S. nogalater IMET43360, стійких до 45-50 мкг/мл еритроміцину.

Отримання і характеристика мутантів S. globisporus 1912-2 і S. nogalater IMET43360, стійких до хлорамфеніколу. Спонтанні Cmlr-мутанти штаму 1912-2 виникали з частотою (2,1±0,4)Ч10-6 на середовищі КС-7 з 15 мкг/мл хлорамфеніколу. З частотою близько 10-6-10-7 утворювалися спонтанні мутанти S. nogalater IMET43360, стійкі до вищих концентрацій антибіотика (30 -50 мкг/мл). Оброблення спор УФ дозволило підвищити частоту Cmlr-мутантів на два-три, а НГ - на один порядок.

Створено колекцію спонтанних та індукованих УФ і НГ Cmlr-мутантів S. globisporus 1912-2 (1752 штамів) та S. nogalater IMET43360 (3917 штамів). Коливання за рівнями резистентності до хлорамфеніколу серед досліджених мутантів S. globisporus відносно невеликі - від 10 до 40 мкг/мл антибіотика. Лише близько 10% спонтанних і індукованих мутантів мали найвищу стійкість, натомість абсолютна більшість мутантів була стійкою до 10-20 мкг/мл хлорамфеніколу.

Більшість спонтанних та індукованих УФ і НГ Cmlr-мутантів штаму S. nogalater віднесли до І групи (стійкі до 50 мкг/мл антибіотика). ІІ групу склали мутанти, стійкі до 100-130 мкг/мл (6,1% спонтанних, 27,2% індукованих УФ та НГ). У ІІІ групу (стійкі до 150-160 мкг/мл) увійшло лише 8,6% УФ- і 0,4% НГ-індукованих мутантів.

Середні рівні антибіотичної активності спонтанних та УФ-індукованих Cmlr-мутантів S.globisporus на 2-4% нижчі від цього показника вихідного штаму. Частка «плюс»-варіантів була найвищою серед спонтанних мутантів (3,5%). Ці мутанти на 10,2% перевищували за коефіцієнтом варіації CV% клони штаму 1912-2. Зниження середніх ІП на 20-25% порівняно з вихідним штамом спостерігали також і серед спонтанних та індукованих НГ Cmlr-мутантів S. nogalater IMET43360. Натомість середнє значення ІП його УФ-індукованих мутантів, відібраних на середовищі з 30 мкг/мл хлорамфеніколу, було на рівні вихідного штаму (100,8±3,5%). Серед цих мутантів було найбільше «плюс»-варіантів (5,1%) та найвища варіабельність антибіотичної активності (CV = 29,3%).

Дослідили залежність між рівнями хлорамфенікол-стійкості мутантів S. globisporus і S. nogalater та синтезом антибіотиків (рис.2). Усі мутанти S. globisporus, стійкі до 30 мкг/мл хлорамфеніколу, мали вищий рівень синтезу антибіотика, ніж вихідний штам, що свідчить про доцільність пошуку серед них активних продуцентів ландоміцину Е. Серед мутантів з нижчими рівнями стійкості частка таких, що перевищували вихідний штам за синтезом ландоміцину Е, коливалася від 30 до 57,2%. Подібну картину спостерігали й серед Cmlr-мутантів S. nogalater 4336. 73,3% найбільш резистентних мутантів (до 150 мкг/мл хлорамфеніколу) перевищували за рівнем синтезу вихідний штам. Отже, існує кореляція між частотою появи штамів з підвищеним рівнем синтезу ландоміцину Е і ногаламіцину та рівнем їхньої стійкості до хлорамфеніколу.

Отримання і характеристика мутантів S. globisporus 1912-2 і S. nogalater IMET43360, стійких до стрептоміцину. На середовищі КС-7 з 1,0 мкг/мл стрептоміцину спонтанні Strr-мутанти S. globisporus 1912-2 відбирали з частотою 2,1Ч10-5. Якщо ж концентрацію антибіотика в КС-7 збільшити у 2,5 рази, то такі мутанти можна відібрати лише з дуже низькою частотою - 4,0Ч10-9. Натомість у S. nogalater IMET43360 спонтанні Strr-мутанти виникають на середовищі з вищими концентраціями стрептоміцину (5 - 15 мкг/мл, частота (0,8±0,1)Ч10-5 - (0,4±0,02)Ч10-7, відповідно). Після оброблення спор досліджуваних штамів УФ і НГ частота виникнення резистентних мутантів зростала на один-три порядки.

Колекція вивчених Strr-мутантів налічувала 4846 похідних S. globisporus 1912-2 (2382 спонтанних і 2463 УФ-індукованих) і 2202 - S. nogalater IMET43360 (570 спонтанних, 888 УФ- і 744 НГ-індукованих). На відміну від описаних вище Eryr- i Cmlr-мутантів, ці мутанти мали більшу варіабельність за рівнем стійкості до стрептоміцину. Отримані мутанти розділено на групи за рівнями резистентності. До І групи Strr-мутантів S. globisporus 1912-2 увійшли низькорезистенті мутанти, стійкі до 2,5-5,0 мкг/мл стрептоміцину (95,9% спонтанних і 76,9% УФ-індукованих). ІІ групу склали мутанти, стійкі до 10-50 мкг/мл стрептоміцину (2,4% спонтанних і 15,3% УФ-індукованих). Решта (1,7% спонтанних і 7,8% УФ-індукованих) були стійкими до 100-500 мкг/мл стрептоміцину (ІІІ група). Подібний розподіл за рівнями резистентності спостерігали і серед Strr-мутантів S.nogalater IMET43360.

Середнє значення антибіотичної активності спонтанних Strr-мутантів S. glosisporus коливалося в межах 75,3-86,1% порівняно з клонами штаму 1912-2, тоді як в УФ-індукованих воно було вище майже на 10%. Найбільше «плюс»-варіантів виявили серед штамів, відібраних на середовищі з 2,5 мкг/мл стрептоміцину (5,6%). Для цієї вибірки властивий і найвищий коефіцієнт варіації за рівнем синтезу антибіотика (CV=36,8%). Лише 16,7% спонтанних і 9,3% УФ-індукованих мутантів І групи синтезували більше ландоміцину Е, ніж вихідний штам (максимум на 20%) (рис.3). Натомість це характерно для майже половини спонтанних та УФ-індукованих мутантів ІІ групи. 4% УФ-індукованих Strr-мутантів цієї групи продукували у 2-3 рази більше ландоміцину Е. Усі високорезистентні Strr-мутанти S. globisporus перевищували за цим показником вихідний штам. Рівень синтезу 22,2% спонтанних і 58,7% УФ-індукованих мутантів досягав 200-300%. Серед цієї групи виділено штам Smy622, який продукував у 200 разів більше ландоміцину Е, ніж штам 1912-2 (див. 3.4) Отже Strr-мутанти штаму S.globisporus 1912-2 з високим рівнем стійкості перспективні для пошуку активних продуцентів ландоміцину Е.

Визначили антибіотичну активність Strr-мутантів S. nogalater, що відібрані на середовищах з 5, 10 і 15 мкг/мл стрептоміцину. Середні значення антибіотичної активності усіх груп мутантів нижчі, ніж у клонів штаму 43360 (від 1 до 30%). Лише УФ-індуковані мутанти, відібрані на середовищі з 10 мкг/мл стрептоміцину, близькі за цим показником до вихідного штаму (ІП=99,3±3,2). Серед них було й найбільше «плюс»-варіантів - 5,8%. Про доцільність використання УФ-індукованих свідчить зростання коефіцієнтау варіації до 35,1%. Як і у випадку S. globisporus, ми виявили найвищу частку штамів з високим рівнем продукції ногаламіцину у високорезистентних Strr-мутантів S. nogalater. У 2-3 рази більше нагаламіцину синтезували 14,3 % спонтанних і 75% УФ-індукованих мутантів

Серед отриманих резистентних мутантів кожного класу виявлено значну частку таких, що перевищують вихідні штами за антибіотичною активністю. Це свідчить про те, що виділення і аналіз Eryr-, Cmlr- і Strr-мутантів може бути одним з етапів селекції S. globisporus і S. nogalater. Правильність цього висновку підтверджена отриманням стрептоміцин-резистентного високоактивного надпродуцента ландоміцину Е, який був основою для розробки моделі виробництва ландоміцину Е [Cидоров Ю.І. та ін., 2002, Gromyko O. et al, 2004]. Ми визначили набільш перспективні групи Eryr-, Cmlr- і Strr-мутантів, які можна використовувати в селекції, а саме УФ-індуковані мутанти S. globisporus і S. nogalater стійкі до 45-50 мкг/мл еритроміцину, Cmlr-мутанти S. globisporus, стійкі до 30 мкг/мл і S. nogalater - до 150 мкг/мл антибіотика, а також УФ-індуковані мутанти досліджуваних штамів, стійкі до 100-500 мкг/мл стрептоміцину.

Штам S. globisporus Smy622 - стрептоміцин-резистентний мутант з підвищеним рівнем синтезу ландоміцину Е. Під час культивування в рідкому КС-7 штам Smy622 синтезує 560±5 мкг/мл ландоміцину Е, що у 200 разів перевищує рівень синтезу вихідним штамом 1912-2 (рис.4). Штам отримано в результаті одного етапу УФ-мутагенезу. Він є резистентним до високих концентрацій стрептоміцину - 100% спор Smy622 виживає на повноцінних середовищах, які містять 500 мкг/мл стрептоміцину. Він стабільно зберігає ознаку стійкості до стрептоміцину і підвищений рівень синтезу ландоміцину Е за умов вирощування на повноцінних середовищах без додавання стрептоміцину. Штам зберігається в Дипозитарії Інституту мікробіології і вірусології НАН України ім. Д.К.Заболотного, на нього отримано патент України UA65866А.

З літератури відомо, що резистентність актиноміцетів до стрептоміцину може бути зумовлена мутаціями гена rpsL, який кодує білок S12 30S-субодиниці рибосоми. Для частини rpsL-мутантів властива підвищена продукція антибіотиків [Shima et al., 1996]. Гени rpsL S. globisporus 1912-2 і Smy622 було клоновано за допомогою ПЛР з використанням праймерів, специфічних до 5'- та 3'-послідовності гена rpsL S. lividans TK24. У результаті ми ампліфікували фрагменти хромосомної ДНК штамів S. globisporus 1912 та Smy622, розміром 318 п.н., що містили ген rpsL. Визначено нуклеодидні послідовності клонованих генів та виявлено, що в гені rpsL штаму S. globisporus Smy622 відбулась транзиція А(128) на G(128), яка призводить до заміни залишку лізину на аргінін у положенні 43 амінокислотній послідовності білка, порівняно із штамом дикого типу. Подібна мутація описана в S. lividans 66 і S. coelicolor A3(2). Однак в них вона не зумовлює підвищеного синтезу актинородину [Shima J. et al, 1996].

Ми припустили, що зростання рівня синтезу ландоміцину Е у Smy622 пов'язане з підвищеною експесією гена-регулятора lndI, продукт якого активує експресію генів біосинтезу ландоміцину Е [Rebets Y. et al, 2005]. Досліджено рівень експресії гена lndI, а також структурного гена оксигенази lndE у штамах S. globisporus 1912 і Smy622. Для вивчення активності промоторів lnd-генів у S. globisporus ми використали репортерну плазміду pIJ8660, що містить безпромоторний ген зеленого флуоресцентного білка (EGFP), ген стійкості до апраміцину, oriT-ділянку плазміди RK2, ген інтегрази та attP-сайт актинофага цС31 [Sun J. et al, 1999]. Сконструйовано рекомбінантні плазміди pIJ8660Н і pIJ8660Е, які містять, відповідно, промотори генів lndI і lndЕ в орієнтації, при якій забезпечувалась транскрипція гена EGFP. За допомогою кон'югативних схрещувань з E. coli їх перенесено у штами S. globisporus 1912-2 і Smy622. Отримані рекомбінантні штами виростили у середовищі SG, відібрали зразки кожні 12 годин та визначили рівень продукції EGFP-білка за інтенсивністю флуоресценції міцелію. Флуоресценція міцелію у штамів Smy622 pIJ8660Н+ і Smy622 pIJ8660Е+ була, відповідно, в 1,5-1,8 і 2,0-2,2 рази інтенсивнішою, ніж у штаму 1912 pIJ8660Е+. Це свідчить про зростання активності промоторів генів lndI та lndE у штамі Smu622 порівняно із штамом дикого типу (рис.5). Активування транскрипції цих генів може бути однією з причин надпродукції ландоміцину Е.

ВИСНОВКИ

У результаті виконаної роботи доведено перспективність застосування мутацій стійкості до еритроміцину, хлорамфеніколу і стрептоміцину у селекції штамів S. globisporus та S. nogalater з підвищеною здатністю до біосинтезу ландоміцину Е та ногаламіцину.

Головні наукові та практичні результати викладені у таких висновках:

Досліджено спонтанну мінливість штамів S. globisporus та S. nogalater IMET43360 за антибіотичною активністю за умов їх вирощування на різних поживних середовищах. Найвище середнє значення антибіотичної активності, високі частка «плюс»-варіантів та варіабельність за рівнем антибіотичної активності досягалися за умов вирощування штаму 1912-2 на кукурудзяному середовищі №7, а штаму 43360 - на соєвому середовищі №14.

Вивчено вплив різних доз УФ та НГ на виживання та антибіотичну активність штамів S. globisporus та S. nogalater IMET43360. Штам S. nogalater IMET43360 є стійкішим до дії мутагенів (УФ і НГ) порівняно з S. globisporus 1912-2. Оброблення УФ і НГ призводить до зниження середнього значення антибіотичної активності досліджених штамів. Дози УФ, які знижують виживання спор цих штамів до 1% та НГ - до 10-20% є ефективними для виділення мутантів з підвищеним синтезом ландоміцину та ногаламіцину. Це дає змогу виділити серед «плюс»-варіантів штами із значно вищими ІП (8,5-12,3), ніж серед спонтанних «плюс»-варіантів вихідних штамів (4,8-7,4).

Визначено спектри та рівні стійкості штамів S. globisporus 1912-1, 1912-2, 3-1, LND901 і S. nogalater IMET43360 до антибіотиків. Для штамів S. globisporus, які різняться за рівнем синтезу ландоміцину Е, характерні подібні спектри резистентності до антибіотиків та відміни за рівнем стійкості до паромоміцину, стрептоміцину, гентаміцину та еритроміцину. Штам S. nogalater IMET43360 стійкіший від S. globisporus до рифампіцину і хлорамфеніколу, а також виявляє чутливість до деяких -лактамних антибіотиків.

Опрацьовано підходи до селекції мутантів S. globisporus 1912-2 та S. nogalater IMET43360, стійких до еритроміцину, хлорамфеніколу і стрептоміцину. Визначено групи резистентних мутантів, серед яких доцільно здійснювати пошук високоактивних продуцентів антибіотиків. Це УФ-індуковані мутанти досліджених штамів, стійкі до 50 мкг/мл еритроміцину та до 100-500 мкг/мл стрептоміцину, мутанти S. globisporus, стійкі до 30 мкг/мл і S. nogalater - до 150 мкг/мл хлорамфеніколу. Найперспективнішими є Strr-мутанти, серед яких найчастіше відбираються штами, які значно перевищують вихідні культури за рівнем синтезу антибіотиків.

Отримано колекцію Eryr-, Cmlr- і Strr-мутантів S. globisporus 1912-2 і S. nogalater IMET43360, що володіють підвищеною здатністю до синтезу ландоміцину Е і ногаламіцину. Виділено та запатентовано стрептоміцин-стійкий мутант S. globisporus Smy622, який у 200 разів більше синтезує ландоміцину Е, ніж вихідна культура.

Клоновано та секвеновано ген rpsL з клітин S. globisporus 1912-2 та його мутанта Smy622. Високий рівень стрептоміцин-стійкості Smy622 зумовлений заміною нуклеотидів А на G у позиції 128. Підвищений рівень біосинтезу ландоміцину Е в штаму Smy622 корелює з посиленою експресією гена lndІ, який кодує шлях-специфічний активатор транскрипції структурних генів біосинтезу ландоміцину Е.

ПЕРЕЛІК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА МАТЕРІАЛАМИ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Дубицька Л., Заворотна С., Осташ Б., Громико О., Басілія Л., Федоренко В. Характеристика ознак стійкості до антибіотиків у продуцентів протипухлинних антибіотиків Streptomyces globisporus 1912, Streptomyces peucetius ATCC29050 та Streptomyces peucetius subsp.caesius ATCC27952 // Вісник Львів.ун-ту.Сер.біол.-2000.-Вип.25.-С.49-60. Здобувач виконав 30% експериментальних досліджень (визначення спектру стійкості та залежності виживання штамів від концентрації антибіотика в середовищі), брав участь в опрацюванні та аналізі експериментальних даних, написанні та оформленні статті.

2. Громико О., Басілія Л., Кириченко Н., Федоренко В. Отримання і характеристика стрептоміцин-резистентних мутантів продуцента протипухлинного антибіотика ландоміцину Е Streptomyces globisporus // Вісник Львів.ун-ту.Сер.біол.-2000.-Вип.26.-С.46-53. Здобувач виконав 80% експериментальних досліджень (підбір умов мутагенної обробки, отримання мутантів, визначення рівня синтезу ландоміцину Е), брав участь в опрацюванні та аналізі експериментальних даних, написанні та оформленні статті.

3. Федоренко В.О., Басілія Л.І., Панькевич К.О., Дубицька Л.П., Осташ Б.О., Лужецький А.М., Громико О.М., Крюгель Г. Генетичний контроль біосинтезу актиноміцетами протиракових антибіотиків-полікетидів // Бюлетень ін-ту сільськогосп. мікробіології.-2000.-№8.-С.27-31. Здобувач виконав 25% експериментальних досліджень (отримання мутантів з порушеним синтезом ландоміцину Е, хроматографічний аналіз метаболітів), брав участь в опрацюванні та аналізі експериментальних даних, написанні та оформленні статті.

4. Ostash B., Basiliya L., Gromyko O., Rebets Yu., Fedorenko V. Streptomyces globisporus 1912 mutants with altered landomycin biosynthesis // Вісник Львів. ун-ту. Сер.біол.-2001.-Вип.27.-C.106-112. Здобувач виконав 30% експериментальних досліджень (отримання мутантів з порушеним синтезом ландоміцину Е, тести на косинтез), брав участь в опрацюванні та аналізі експериментальних даних, написанні та оформленні статті.

5. Ostash B., Luzhetskyy A.,Gromyko O., Fedorenko V. Transfer of plasmid from Escherichia coli to mutant strain Streptomyces globisporus LND900 with altered biosynthesis of antitumor antibiotic landomycin E // Наук. вісник Ужгородського ун-ту. Сер.біол.-2001.-№10.-С.147-149. Здобувач виконав 30% експериментальних досліджень (отримання мутантного штаму, хроматографічний аналіз метаболітів), брав участь в опрацюванні та аналізі експериментальних даних, написанні та оформленні статті.

6. Cидоров Ю.І., Федоренко В.О., Громико О.М., Новіков В.П., Влязло Р.Й., Верес.Р.М. Розрахункова модель виробництва протипухлинного антибіотика “Ландоміцин Е” // Вісник Національного ун-ту “Львівська політехніка”. Хімія, технологія речовин та їх застосування.-2002.-№461.-С.204-208. Здобувач виконав 50% експериментальних досліджень (отримання штаму, визначення рівня стійкості, кількісний аналіз рівня синтезу), брав участь в опрацюванні та аналізі експериментальних даних, написанні та оформленні статті.

7. Громико О., Басілія Л., Федоренко В. Вплив мутагенів на антибіотичну активність Streptomyces globisporus 1912 - продуцента протипухлинного антибіотика ландоміцину Е // Наук.вісн. Львів. держ. акад. вет. мед.-2003.-Т.5, (№2).-Ч.3.- С.45-52. Здобувач виконав 80% експериментальних досліджень (мутагенна обробка, відбір мутантів, визначення антибіотичної активності), брав участь в опрацюванні та аналізі експериментальних даних, написанні та оформленні статті.

8. Громико О.М., Кириченко Н.В., Федоренко В.О. Мутанти Streptomyces nogalater IMET43360 з підвищеним рівнем синтезу протипухлинного антибіотика ногаламіцину // Вісник Львів ун-ту. Сер. біол.-2004.-Вип.35.-С.121-127. Здобувач виконав 80% експериментальних досліджень (здійснення титрування, визначення спектру стійкості мутантів до антибіотиків, визначення рівня стійкості, кількісний аналіз рівня синтезу ногаламіцину), брав участь в опрацюванні та аналізі експериментальних даних, написанні та оформленні статті.

9. Ostash B., Rix U., Rix L.L., Liu T., Lombo F., Luzhetskyy A., Gromyko O., Wang C., Brana A.F., Mendez C., Salas J.A., Fedorenko V., Rohr J. Generation of new landomycins by combinatorial biosynthetic manipulation of the LndGT4 gene of the landomycin E cluster in S. globisporus // Chem. Biol.- 2004.- Vol.4.- P.547-455. Здобувач виконав 30% експериментальних досліджень (проведення схрещувань, хроматографічний аналіз метаболітів), брав участь в опрацюванні та аналізі експериментальних даних, написанні та оформленні статті.

10. Gromyko O., Rebets Yu., Ostash B., Luzhetskyy A., Fukuhara M., Bechthold A., Nakamura T., Fedorenko V. Generation of Streptomyces globisporus SMY622 strain with increased landomycin E production and it's initial characterization// J. Antibiot., 2004.-Vol.57, N6.- P.383-389. Здобувач виконав 60% експериментальних досліджень (отримання штаму, спектрофотометричний аналіз рівня синтезу, здійснення схрещувань), брав участь в опрацюванні та аналізі експериментальних даних, написанні та оформленні статті.

11. Штам актиноміцетів Streptomyces globisporus Smy622 - продуцент протипухлинного антибіотика ландоміцину Е. Патент UA65866А, МПК7С12N15/01 / Громико О.М., Федоренко В.О., Басілія Л.І.- Заявл. 13.06.2003; опубл. 15.04.2004.- Бюл.№4. Здобувач виконав 90% експериментальних досліджень (підбір оптимальних умов культивування, визначення рівня стійкості, встановлення рівня синтезу ландоміцину Е, проведення схрещувань, хроматографічний аналіз метаболітів), брав участь в опрацюванні та аналізі експериментальних даних, написанні та оформленні патенту.

12. Громико О.М., Аравіцька О.В., Грубський Я.П., Федоренко В.О. Отримання і характеристика еритроміцин- і хлорамфенікол-резистентних мутантів продуцента протипухлинного антибіотика ногаламіцину Streptomyces nogalater IMET43360. // Науковий вісник ЛДАВМ ім. С.З. Гжицького.-2005.-Т.7, №3 (26),Ч1.- С.18-27. Здобувач виконав 80% експериментальних досліджень (визначення рівня стійкості до антибіотиків, підбір умов мутагенної обробки, спектральний аналіз рівня синтезу), брав участь в опрацюванні та аналізі експериментальних даних, написанні та оформленні статті.

13. Громико О., Федоренко В. Вплив мутагенів на антибіотичну активність Streptomyces nogalater IMET43360 - продуцента протипухлинного антибіотика ногаламіцину. Вісник Львів. ун-ту. Сер. біол.-2005.-Вип.40.-С.16-22. Здобувач виконав 90% експериментальних досліджень (підбір умов мутагенної обробки, отримання мутантів, визначення антибіотичної активності), брав участь в опрацюванні та аналізі експериментальних даних, написанні та оформленні статті.

14.Gromyko O. Obtaining and studying of Streptomyces globisporus mutants with altered landomycin E biosynthesis // Conference on genetic and molecular biology, Lviv, 20-22 April, 2000.- P.68. Здобувач брав участь у проведенні досліджень, опрацюванні та аналізі експериментальних даних, представляв доповідь.

15.Sambir M.V., Gromyko O.M., Ostash B.O. Molecular analysis of Streptomyces globisporus mutants deficient in production of putative anticancer polyketide landomycin E // 2nd International Medical Conference, Lublin, 28-30 April, 2000.- P.134. Здобувач брав участь у проведенні досліджень, опрацюванні та аналізі експериментальних даних.

16.Fedorenko V.O., Ostash B.O., Luzhetskiy A.M., Basiliya L.I., Pankevich K.O., Gromyko O.M., Rebets Yu.V., Kruegel H. Genetic control of antitumor antibiotic landomycin E biosynthesis in Streptomyces globisporus // Materialy ogњlnopolskiego sympozjum mikrobiologicznego “Aktywnoњж drobnoustrojуw w rуznych њrodoviskach”, Krakуw, 6-8 wrzesieс, 2001.- P.17-18. Здобувач брав участь у проведенні досліджень, опрацюванні та аналізі експериментальних даних.

17.Ostash B.O., Pankevych K.O., Luzhetskiy A.M., Basiliya L.I., Gromyko O.M., Kruegel H., Fedorenko V.O. Studing of genes involved in landomycin E biosynthesis by Streptomyces globisporus 1912 // Abs. of 12th International Symposium on the Biology of Actinomycetes. Vancouver, August 5-9, 2001.- P.133. Здобувач брав участь у проведенні досліджень, опрацюванні та аналізі експериментальних даних.

18.Громыко А.Н., Аравицкая А.В. Мутанты Streptomyces nogalater IMET43360, устойчивые к стрептомицину // Тез. 6-й Пущинской школы-конференции молодых ученых.- Пущино, 2002.- Т.3.- С.17. Здобувач брав участь у проведенні досліджень, опрацюванні та аналізі експериментальних даних, представляв доповідь.

19.Аравіцька О.В., Громико О.М., Федоренко В.О. Розробка селекційних та генно-інженерних методів з метою конструювання штамів Streptomyces nogalater - продуцентів протипухлинного антибіотика ногаламіцину // Тези доп. І Всеукр.наук-практ.конф. „Біотехнологія, освіта, наука”, Київ, 10-11 лютого 2003.-Р.124-125. Здобувач брав участь у проведенні досліджень, опрацюванні та аналізі експериментальних даних, написанні тез доповіді.

20.Громико О., Аравіцька О., Федоренко В. Отримання високоактивних продуцентів протипухлинних антибіотиків ландоміцину Е та ногаломіцину // Тези доп. 69-ї наук. конф. „Розроблення, дослідження і створення продуктів функціонального харчування та нових технологій для харчової та переробної промисловості”.- Київ, 2003.- С.70-71. Здобувач брав участь у проведенні досліджень, опрацюванні та аналізі експериментальних даних, представляв доповідь.

21.Ребець Ю.В., Осташ Б.О., Лужицький А.М., Козаревська І.С., Громико О.М., Кобилянський А.М., Дутко Л.О., Мік У.Я., Федоренко В.О. Регуляція біосинтезу ландоміцинів та гени стійкості до них у Streptomyces globisporus 1912 // Тези доп. Х з'їзду Товариства мікробіологів України, Одеса, 2004.- С. 320. Здобувач брав участь у проведенні досліджень, опрацюванні та аналізі експериментальних даних, написанні тез доповіді.

22.Громико О.М., Ребець Ю.В., Осташ Б.О., Федоренко В.О. Підходи до конструювання штамів з підвищеним синтезом протипухлинних антибіотиків // Тези доп. Х з'їзд Товариства мікробіологів України, Одеса, 2004.- С. 329. Здобувач брав участь у проведенні досліджень, опрацюванні та аналізі експериментальних даних, представляв доповідь.

23.Федоренко В.О., Осташ Б.О., Ребець Ю.В., Громико О.М., Лужицький А.М., Кириченко Н.В., Козаревська І.С., Самбір М.В. Генетичні та генно-інженерні підходи до конструювання актиноміцетів - продуцентів антибіотиків // Тезисы докл. Конференции, посвященной 70-летию кафедры генетики и цитологии Харьковского национального университета имени В.Н.Каразина, Харьков.- 2004.- С.46. Здобувач брав участь у проведенні досліджень, опрацюванні та аналізі експериментальних даних, написанні тез доповіді.

24.Громико О.М., Грубський Я.П., Федоренко В.О. Мінливість антибіотичної активності продуцента протипухлинного антибіотика ногаламіцину Streptomyces nogalater IMET43360 під дією мутагенів // Тезисі докл ІІ Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых усеных, посвященной 140-летию Одесского национального университета им.И.И.Мечникова, Одеса, 2005.- С.117. Здобувач брав участь у проведенні досліджень, опрацюванні та аналізі експериментальних даних, представляв доповідь.

25.Аравіцька О.В., Громико О.М., Грубський Я.П., Климишин Д.О., Федоренко В.О. Отримання і вивчення мутантів Streptomyces nogalater IMET43360, стійких до канаміцину і гентаміцину // Тези доп. ІІ Міжнародної наукової конференції студентів і аспірантів «Молодь та поступ біології», Львів.-2006.- С.134. Здобувач брав участь у проведенні досліджень, опрацюванні та аналізі експериментальних даних, написанні тез доповіді.

26.Федоренко В.О., Осташ Б.О., Лужицький А.М., Громико О.М., Ребець Ю.В., Осташ І.С., Климишин Д.О., Дутко Л.О., Кобилянський А.М., Макітринський Р.П., Мироновський М.Л. Підходи до комбінаторного біосинтезу полікетидних антибіотиків // Тези доп. міжнародної наукової конференції «Мікробні біотехнології, Одеса.-2006.- С.31. Здобувач брав участь у проведенні досліджень, опрацюванні та аналізі експериментальних даних, написанні тез доповіді.

27.Федоренко В.О., Осташ Б.О., Лужецький А.М., Ребець Ю.В., Громико О.М., Осташ І.С., Климишин Д.О., Дутко Л.О., Кобилянський А.М. Створення штамів актиноміцетів - продуцентів антибіотиків за допомогою методів генетичної інженерії // Тези доп. ІХ Українського біохімічного з'їзду, Харків.-2006.- С.16. Здобувач брав участь у проведенні досліджень, опрацюванні та аналізі експериментальних даних.