Молекулярно-біологічні властивості українських ізолятів латентних вірусів яблуні

Размещено на http://www.allbest.ru/

Київський національний університет імені Тараса Шевченка

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

03.00.06 - вірусологія

Молекулярно-біологічні властивості українських ізолятів латентних вірусів яблуні

Господарик Аліна Володимирівна

Київ-2009

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана на кафедрі вірусології біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор Поліщук Валерій Петрович, Київський національний університет імені Тараса Шевченка, завідувач кафедри вірусології

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Щербатенко Іван Степанович, Інститут мікробіології і вірусології імені Д.К. Заболотного НАН України, завідувач відділу фітопатогенних вірусів

доктор біологічних наук, професор, член-кореспондент УААН Мельничук Максим Дмитрович, Національний університет біоресурсів і природокористування України, проректор з наукової та інноваційної діяльності

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, кандидат біологічних наук О.В. Молчанець

Анотація

ізолят вірус капсидний білок

Господарик А.В. Молекулярно-біологічні властивості українських ізолятів латентних вірусів яблуні. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.06 - вірусологія. - Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Київ, 2009.

Дисертація присвячена вивченню молекулярно-біологічних властивостей латентних вірусів яблуні -ВХПЛЯ, ВБДЯ, ВЯДЯ та ВМЯ.

В результаті детекції вірусів методом ЗТ-ПЛР різними парами праймерів підібрано найбільш оптимальні праймери для детекції українських ізолятів.

Досліджено, що найбільш ефективною методикою виділення тотальної РНК з тканин плодових культур є методика заснована на використанні LiCl та протеїнкінази К, в екстрагуючому буфері, рН 7,8.

Визначено нуклеотидні послідовності фрагмента гена капсидного білка українських ізолятів ВХПЛЯ, ВЯДЯ, ВБДЯ, ВМЯ. Філогенетичний аналіз українських ізолятів ВБДЯ, ВЯДЯ, ВМЯ показав їх високу спорідненість з відомими ізолятами в Генбанку. Спорідненість українських ізолятів ВХПЛЯ з послідовностями Генбанку є порівняно низькою - 79-90%, що може свідчити про існування в Україні окремого штаму ВХПЛЯ.

Ключові слова: латентні віруси яблуні, полімеразна ланцюгова реакція, сиквенування, філогенетичний аналіз.

Аннотация

Господарик А.В. Молекулярно-биологические свойства украинских изолятов латентных вирусов яблони.- Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.06 - вирусология. - Киевский национальный университет имени Тараса Шевченка, Киев, 2009.

В диссертационной работе представлены результаты диагностики образцов яблони на присутствие латентных вирусов - вируса хлоротической пятнистости листья яблони (ВХПЛЯ, Trichovirus), вируса бороздчатости древесины яблони (ВБДЯ, Capillovirus), вируса ямчатости древесины яблони (ВЯДЯ, Foveavirus) и вируса мозаики яблони (ВМЯ, Ilarvirus) с помощью метода иммуноферментного анализа и полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР). Проведено сравнение полученных результатов при детекции обеими методами и показана более высокая специфичность ОТ-ПЦР в сравнении с ИФА применительно к диагностике вирусов яблони. При тестировании образцов яблони методом ОТ-ПЛР использовали разные пары праймеров, комплементарные фрагменту гену капсидного белка соответствующих вирусов: для ВХПЛЯ - две пары праймеров, ВЯДЯ - три пары праймеров, ВБДЯ - четыре пары праймеров, ВМЯ - две пары праймеров. В результате сравнительного анализа были подобраны наиболее оптимальные праймеры для диагностики украинских изолятов латентных вирусов яблони.

Показано, что наиболее эффективной методикой для выделения тотальной РНК с тканей плодовых культур является методика, основанная на использовании LiCl и протеинкиназы К, в экстрагирующем буфере, рН 7,8.

Было проведено секвенирование полученных в результате постановки ОТ-ПЦР ампликонов фрагмента гена капсидного белка ВХПЛЯ, ВБДЯ, ВЯДЯ та ВМЯ с целью определения нуклеотидных последовательностей украинских изолятов и сравнения их с известными последовательностями Генбанка, а также проведения филогенетического анализа. При сравнении нуклеотидных последовательностей фрагмента гена капсидного белка украинских изолятов вирусов яблони и известных изолятов с Генбанка, отмечалась высокая гомология исследуемых ампликонов ВБДЯ, ВЯДЯ та ВМЯ с известными последовательностями, что говорит о принадлежности этих изолятов к известным штаммам соответствующих вирусов. Так, изоляты ВМЯ являются близкородственными с чешскими изолятами (99%), ВЯДЯ - с чешскими и польскими изолятами (93%), ВБДЯ - с бразильским (98%). Родство украинских изолятов ВХПЛЯ является более низким в сравнении с известными нуклеотидными последовательностями (79-90%), что может говорить о наличии в Украине отдельного штамма ВХПЛЯ.

Ключевые слова: латентные вирусы яблони, полимеразная цепная реакция, секвенирование, филогенетический анализ.

Summary

Gospodaryk A.V. Molecular biological property of Ukraine isolates of apple latent viruses. -Manuscript.

The thesis for obtaining PhD degree in speciality 03.00.06 - virology. Taras Shevchenko' Kyiv National University, Kyiv, 2009.

Thesis work is dedicated to investigation of molecular-biological properties of apple latent viruses - Apple chlorotic leaf spot virus, Apple stem grooving virus, Apple stem pitting virus, and Apple mosaic virus.

The work describes the results of diagnostics of apple tree samples for occurence of latent viruses and apple mosaic virus using both enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR). Comparison of achieved outcomes by both techniques was carried out. Higher specificity and reliability of RT-PCR as comparing to ELISA for diagnostics of apple tree viruses was confirmed.

Optimal primers for detection of the Ukrainian isolates were selected for RT-PCR identification of apple latent viruses.

It was studied that the most effective method of total RNA extraction from fruit tree tissues is the one based on using LiCl and proteinkinase K, with extraction of buffer, pH 7.8. As a result of sequencing, nucleotide sequences of coat protein gene of Ukrainian isolates of ACLSV, ASPV, ASGV, ApMV were established. Phylogenetic analysis of Ukrainian isolates of ASPV, ASGV, ApMV showed their high homology with isolates deposited in Genbank. In particular, ApMV is closely related to Czech isolates (99%), ASPV - to Polish and Czech isolates (93%), ASGV - to Brazilian isolates (98%). Homology of Ukrainian isolates of ACLSV to sequences in Genbank has been comparatively low - 79-90%, that gives evidence about presence of a separate strain of ACLSV in Ukraine.

Key words: apple latent viruses, polymerase chain reaction, sequencing, phylogenetic analysis.

1. Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Віруси та вірусні хвороби яблуні традиційно привертають увагу фітопатологів та вірусологів усього світу, оскільки є причиною значних економічних втрат у галузі [Митрофанова, 2000; Kundu, 2008]. Так, втрати врожаю при змішаних інфекціях сягають 60% [Petzik, 2005]. На території України яблуню вирощують практично в усіх кліматичних зонах, при цьому вірусні хвороби діагностуються в більшості промислових господарств [Удовиченко, 2005]. Таким чином, в Україні дуже гостро стоїть питання експрес-діагностики вірусів яблуні та розробки превентивних заходів ефективної профілактики вірусних захворювань, і особливо латентних, які не виявляються візуально. Для українських промислових насаджень яблуні на сьогоднішній день актуальними є декілька вірусів - вірус хлоротичної плямистості листя яблуні (ВХПЛЯ, Trichovirus), вірус борознистості деревини яблуні (ВБДЯ, Capillovirus), вірус ямкуватості деревини яблуні (ВЯДЯ, Foveavirus) та вірус мозаїки яблуні (ВМЯ, Ilarvirus), які відрізняються за своїм таксономічним положенням та біологічними характеристиками. Однак спільною їх особливістю є відсутність векторів передачі та латентна форма інфекції для ВХПЛЯ, ВБДЯ та ВЯДЯ [Nemeth, 1986], що значно ускладнює вчасне виявлення цих вірусів за відсутності вірусних симптомів ураження. Слід також відмітити, що досі українських ізолятів перерахованих вірусів практично ніхто не досліджував в аспекті встановлення специфічності їх геномів та ряду фізико-хімічних та біологічних властивостей.

Для детекції фітовірусів, зокрема вірусів плодових культур, широко використовується імуноферментний аналіз (ІФА), оскільки цей класичний метод є високоспецифічним, швидким та порівняно недорогим [Гнутова, 1993]. Однак у випадку латентної вірусної інфекції концентрація вірусних білків у інфікованих рослинах може бути настільки низькою, що чутливість даного методу може бути недостатньою для їх ефективної діагностики [Kinard, 1996], тому необхідно застосовувати молекулярно-біологічні методи детекції, зокрема полімеразну ланцюгову реакцію зі зворотньою транскрипцією (ЗТ-ПЛР), яка базується на специфіці вірусних геномів й залежить від правильного підбору та синтезу праймерів для відповідного вірусу або його штаму [Мельничук, 2005].

Важливим загальнобіологічним аспектом вивчення вірусних геномів є їх молекулярно-біологічний порівняльний аналіз, в результаті якого отримується інформація про генетичні взаємозв'язки між ізолятами та штамами серед споріднених штамів вірусів з усього світу. Останнє дозволяє зробити аналіз походження та еволюції того чи іншого штаму. Крім того, визначення нуклеотидних послідовностей українських ізолятів вірусів дозволить створювати високочутливі тест-системи для виявлення специфічних для України ізолятів вірусів.

З огляду на вищесказане, саме вивчення молекулярно-біологічних характеристик українських ізолятів вірусів яблуні є актуальним як з точки зору фундаментальної науки по визначенню циркулюючих в Україні штамів вірусів яблуні, їх філогенетичних зв'язків, еволюції та походження, так і з практичної точки зору, від дизайну праймерів для ЗТ-ПЛР до визначення можливості походження того чи іншого штаму, оцінки толерантних та стійких сортів яблуні та створення молекулярно-біологічних ЗТ-ПЛР діагностикумів.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалась у межах науково-дослідної роботи кафедри вірусології біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка за темою “Вивчення екологічних особливостей та біоіндикаторних властивостей різних організмів та їх угруповань в умовах трансформованого середовища для розв'язання проблем біобезпеки України” (реєстраційний номер № 06БФ036-04) та в рамках міжнародного договору № М/257-2008 (08 ДП 036-09) від 15 травня 2008 р. між кафедрою вірусології Київського національного університету імені Тараса Шевченка та Університетом Анкари (Анкара, Туреччина) на виконання НДР “Визначення стійких сортів та молекулярно-біологічна характеристика українських та турецьких ізолятів вірусу мозаїки яблуні”.

Мета та завдання дослідження. Метою роботи було вивчення молекулярно-біологічних особливостей ізолятів ВХПЛЯ, ВЯДЯ, ВБДЯ, ВМЯ та проведення діагностики латентних вірусів яблуні на території України.

Для досягнення мети були поставлені наступні завдання:

Ш візуальне обстеження насаджень яблуні та проведення біологічного тестування;

Ш діагностика вірусів яблуні методом ІФА;

Ш порівняння ефективності різних методів виділення тотальної РНК;

Ш діагностика вірусів яблуні методом ЗТ-ПЛР;

Ш підбір оптимальних праймерів для детекції ВХПЛЯ, ВБДЯ, ВЯДЯ та ВМЯ;

Ш сиквенування фрагменту гену капсидного білка досліджуваних вірусів;

Ш вивчення молекулярно-біологічних характеристик українських ізолятів вірусів яблуні та порівняння їх з відомими ізолятами;

Ш дослідження філогенетичних взаємозв'язків українських ізолятів ВХПЛЯ, ВБДЯ, ВЯДЯ, ВМЯ

Об`єкт дослідження - латентні віруси яблуні - вірус хлоротичної плямистості листя яблуні, вірус борознистості деревини яблуні, вірус ямкуватості деревини яблуні та вірус мозаїки яблуні, а також зерняткові плодові культури Malus domestica Borkh.

Предмет дослідження - діагностика латентних вірусів яблуні, їх молекулярно-біологічна характеристика та філогенетичний аналіз.

Методи дослідження. Візуальне обстеження насаджень яблуні, біологічне тестування, твердофазний імуноферментний аналіз в модифікації „сендвіч”, екстракція тотальної РНК, полімеразна ланцюгова реакція зі зворотньою транскрипцією, електрофорез в агарозному гелі, визначення нуклеотидних послідовностей гену капсидного білка (сиквенування), філогенетичний аналіз.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше на території України проведено діагностику вірусів яблуні методом полімеразної ланцюгової реакції.

Вперше були визначені нуклеотидні послідовності фрагмента гену капсидного білка українських ізолятів ВХПЛЯ, ВБДЯ, ВЯДЯ та ВМЯ, що уражують яблуню та зареєстровано їх в світових генетичних банках даних (GenBank). Проведено філогенетичний аналіз українських ізолятів латентних вірусів яблуні та вірусу мозаїки яблуні за геном капсидного білка та показано високу гомологію українських ізолятів ВЯДЯ (93%) до ізолятів з Чехії та Польщі , ВБДЯ (98%) до ізоляту з Бразилії, ВМЯ (99%) до ізолятів з Чехії. Спорідненість українських ізолятів ВХПЛЯ порівняно з відомими нуклеотидними послідовностями є дещо нижчою (78-90%), що може свідчити про існування в Україні окремого штаму ВХПЛЯ.

Практичне значення одержаних результатів. Запропоновано ефективну методику виділення тотальної РНК з тканин яблуні. Підібрано оптимальні праймери для ідентифікації українських ізолятів ВХПЛЯ, ВБДЯ, ВЯДЯ та ВМЯ методом полімеразної ланцюгової реакції, які будуть використані для створення відповідних діагностичних тест-систем. Розроблено методичні рекомендації щодо діагностики та філогенетичного аналізу латентних вірусів яблуні, які використовуються в навчальному процесі кафедри вірусології Київського національного університету ім. Тараса Шевченка.

Особистий внесок здобувача. Дисертація є самостійною роботою автора. Всі етапи роботи включаючи: інформаційний пошук, опрацювання літературних джерел, розробка схем експерименту, отримання експериментальних даних, їх узагальнення та інтерпретацію автором дисертації здійснено особисто.

Формування основних положень і висновків дисертаційної роботи, а також підготовку публікацій за отриманими результатами проведено за участю наукового керівника д.б.н., проф. В.П. Поліщука.

Частину досліджень виконано на базі лабораторії вірусології Інституту садівництва УААН (зав. лабораторії В.М. Удовиченко, к.б.н., ст.н.с. Н.В. Тряпіцина), тестування зразків яблуні методом ЗТ-ПЛР та визначення нуклеотидних послідовностей гена капсидного білка ВХПЛЯ, ВБДЯ, ВЯДЯ, ВМЯ було здійснено спільно з д.б.н. Джибаном Кумаром Кундю на базі Інституту захисту рослин (Прага, Чеська Республіка). Автор висловлює щиру подяку за корисні поради і допомогу в плануванні, проведенні експериментів та обговоренні результатів.

Апробація результатів дисертації. Матеріали роботи доповідались на Днях науки у Національному Університеті Києво-Могилянська Академія (Київ, Україна, січень 2005 р.); V Всеукраїнській науковій конференції студентів та аспірантів (Київ, Україна, вересень 2005); «BIOTECHNOLOGY 2006» (Ceske Budejovice, Czech Republic, February 2006); Міжнародній науковій конференції «Мікробні біотехнології» (Одеса, Україна, вересень 2006 р.); V Міжнародній конференції "Біоресурси та віруси" (Київ, Україна, вересень 2007 р).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 10 робіт, з них 4 статті у фахових виданнях, 5 - тези в матеріалах конференцій, 1 - методичні рекомендації. Права співавторів не порушено.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається із вступу, чотирьох розділів, висновків, списку використаних джерел, що охоплює 176 найменувань та додатків. Робота викладена на 142 сторінках машинописного тексту. Фактичний матеріал дисертації подано у вигляді 23 рисунків і 7 таблиць.

2. Основний зміст

Розділ 1. Огляд літератури

Огляд літератури складається з п'яти підрозділів, в яких наведені сучасні відомості про віруси та вірусні хвороби яблуні, висвітлені питання діагностики вірусів плодових культур. Огляд літератури обґрунтовує доцільність виконання роботи.

Розділ 2. Матеріали та методи досліджень

Матеріалом при дослідженні були зразки яблуні (листки, пелюстки), відібрані в травні-липні з промислових насаджень Київської області та з дослідних ділянок Інституту садівництва УААН.

Для виявлення вірусів застосовували візуальне обстеження плодових насаджень яблуні. Обстеження проводили по двох діагоналях і чотирьох сторонах обстежуваної ділянки. Насадження оглядали весною при повному розвитку перших трьох-чотирьох листків, та наприкінці вегетативного сезону при дозріванні плодів з метою виявлення можливих симптомів вірусних захворювань. Проби відбирали рівномірно з чотирьох боків дерева з гілок, розміщених у внутрішній частині крони ближче до штамба на висоті не більше 2-х метрів. Відбирали верхню частину пагона з молодими листками.

Дослідження біологічних властивостей вірусів яблуні проводили на рослинах-індикаторах Cucumis sativus L., Phaseolus vulgaris L., Nicotiana tabacum cv. Samsun, Chenopodium quinoa Willd., N.occidentalis 37B.

Ідентифікацію вірусів за допомогою імуноферментного аналізу проводили з комерційними тест-системами LOEWE згідно з рекомендаціями виробника. Результати реєстрували на автоматичному ІФА-аналізаторі Stat Fax 2100 (Awarennes Technology, США) при довжині хвилі 405 нм (для АТ, мічених лужною фосфатазою). За позитивний приймався показник Е₄₀₅, що втричі перевищував показник негативного контролю. Досліди по кожному зразку проводили в трьохкратній повторності. Для порівняння результатів використовували середній показник (середньоарифметичне) [Лакин, 1980].

Для виділення тотальної РНК зі зразків яблуні (листки, пелюстки) використовували три методики - загальноприйняту методику виділення тотальної РНК [Джейпер, 1991], методику основану на використанні LiCl та протеїнази К, в екстрагуючому буфері, рН 7,8 [Kundu, 2002; Kundu, 2003] та методику з використанням LiCl, 5 M NaCl, CTAB [Boonham, 2001].

Для детекції ВМЯ, ВБДЯ, ВЯДЯ, ВХПЛЯ методом ЗТ-ПЛР використовували кіт one-step-RT-PCR (Qiagen, Великобританія). Постановка реакції проводилася за рекомендацією виробника. Для детекції кожного з вірусів використовували по декілька різних пар праймерів, з метою підбору найбільш оптимальних. Для ВМЯ було використано дві пари праймерів [Menzel, 2002; особисте повідомлення Kundu], ВХПЛЯ - дві пари [Menzel, 2002; особисте повідомлення Kundu], ВБДЯ - чотири пари [Menzel, 2002; James, 1999; Kundu, 2008], ВЯДЯ - три пари [Menzel, 2002; Jelkman, 1994; Kundu, 2008].

Аналіз продуктів ампліфікації здійснювали за допомогою електрофорезу в 1% агарозному гелі з використанням стандартних маркерів Gene Ruller 100 bp DNA Ladder plus (Fermentas, США).

Сиквенування очищених ампліфікованих фрагментів проводили на Applied Biosystems 3730x1 DNA Analyzer з використанням Big Dye terminators, version 3.1 (Applied Biosystems, США). Ідентифікацію та порівняння отриманих послідовностей проводили за допомогою BLAST-аналізу (http://www.ncbi.nlm.him.gov). Вирівнювання фрагментів визначали за допомогою програмного пакету GENEDOC. Філогенетичний аналіз - за допомогою програмного пакету PHYLIP [Felsenstein, 1993]. Топологію дерев - за допомогою програми DNAPARS та DNADIST. Для перевірки достовірності побудованих дерев застосовували бутстреп тест (bootstrep) з 100 бутстреп реплікаціями [Felsenstein, 1985]. Філогенетичні дерева конструювали методом зв'язування найближчих сусідів (neighbour-joining, NJ) [Saitou, Nei, 1987] та максимуму парсимонії (maximum parsimony, MP). Філогенетичні дерева були візуалізовані за допомогою TREEVIEW [Page, 1996]. Статистичну обробку результатів досліджень здійснювали комп'ютерною програмою Microsoft Excel з врахуванням t критерію Ст'юдента.

Розділ 3. Результати та їх обговорення

3.1 Візуальне обстеження плодових культур на вірусну інфекцію

Першим етапом наших досліджень було проведення обстеження промислових насаджень сортів яблуні на наявність візуальних симптомів вірусних інфекцій в дослідних установах Інституту садівництва УААН та в промислових насадженнях Київської області. При обстеженні (квітень-травень) на досліджуваних рослинах виявили симптоми ураження вірусом мозаїки яблуні (рис. 1).

Рис. 1. Симптоми, викликані вірусом мозаїки яблуні на листках Malus domestica Borkh, сорт Голден Делішес

Симптоми проявлялися весною (травень) на перших молодих листках яблуні у вигляді яскраво-жовтих, а пізніше - блідо-жовтих плям та кілець, які в подальшому некротизувалися і сильно уражене листя опадало. З підвищенням температури симптоми маскувалися. Симптомів ВХПЛЯ, ВБДЯ, ВЯДЯ виявлено не було.

Отже, підсумовуючи дані візуального обстеження слід відмітити, що серед досліджуваних нами вірусів, тільки ВМЯ проявлявся у вигляді характерних симптомів, що добре узгоджується з даними літератури [Пересыпкин, 1989]. Щодо можливості виявлення латентних вірусів - ВХПЛЯ, ВБДЯ, ВЯДЯ слід застосовувати високочутливі методи детекції.

3.2 Діагностика вірусів яблуні методом біологічного тестування

Для біологічного тестування в роботі були використані наступні рослини-індикатори - для ВМЯ - Cucumis sativus та Phaseolus vulgaris, для вірусу ВЯДЯ - Nicotiana occidentalis 37B, для ВБДЯ та ВХПЛЯ - Chenopodium quinoa та N.tabacum cv.Samsun. Рослини-індикатори уражували методом механічної інокуляції в листову пластинку. У результаті механічної інокуляції симптоми відмічались лише на рослинах Cucumis sativus у вигляді мозаїчної крапчатості та хлорозів. На деяких рослинах відмічалась недорозвиненість першого справжнього листка, що є типовим при розвитку вірусної інфекції, викликаної ВМЯ. На інших рослинах-індикаторах жодних проявів вірусної інфекції не спостерігалось.

Таким чином, в результаті біологічного тестування відібраних зразків з дослідних ділянок Інституту садівництва та промислових насаджень Київської області на рослинах-індикаторах виявилося неможливим надати оцінку поширенню латентних вірусних інфекцій. Передача вірусу при механічній інокуляції з деревних рослин на рослини-індикатори відбувається з дуже низькою ефективністю, особливо це характерно саме для вірусів плодових рослин, оскільки в їх соці міститься велика кількість поліфенолів та полісахаридів, які мають інгібуючу дію на вірус [Salzman, 1999].

3.3 Діагностика латентних вірусних інфекцій методом імуноферментного аналізу

Для ідентифікації вірусів у відібраних зразках яблуні за допомогою ІФА використовували стандартні тест-системи LOEWE. За результатами ІФА серед 60 протестованих зразків, найбільше виявлялися антигени ВХПЛЯ в 68,4%. Антигени ВЯДЯ в 23,3%, ВБДЯ в 18,3 %, ВМЯ виявлявся в 1,7 % досліджуваних зразків (рис. 2). Детектувалась і змішана інфекція - ВЯДЯ+ВБДЯ - 5 %, ВБДЯ+ВХПЛЯ - 16,7%, ВХПЛЯ+ВЯДЯ - 1,7%.



Рис. 2. Розповсюдження вірусів яблуні в промислових насадженнях Київської області

Результати тестування зразків з дослідних ділянок Інституту садівництва УААН наведено в таблиці 1. У дослідження було включено зразки 4-х сортів яблуні вітчизняної селекції з різним терміном промислового використання, а саме: сорт Слава Переможцям - виведений в 1928 році, сорт Мавка - в 1978 р., сорт Внучка - в 1979 р. на Мліївській дослідній станції ім. Л.П. Симиренка, сорт Рубінове Дуки - в 1934 р. в Інституті садівництва УААН; та інтродуковані сорти - Джонаголд, виведений в 1968 році в США, сорт Чемпіон, виведений в 1970 році в Чехії та сорт Пінова, виведений в 1986 р. в Німеччині. Таким чином, ми намагалися виявити рівень неоднорідності вірусів в різних сортах яблуні, що може бути пов'язано з походженням сорту та віком промислової експлуатації.

Як продемонстровано в таблиці, ВХПЛЯ відмічався в семи зразках, ВБДЯ - в п'яти зразках, ВЯДЯ - в одному зразку, а ВМЯ - в чотирьох зразках.

Таблиця 1. Результати тестування зразків з дослідних ділянок Інституту садівництва УААН методом ІФА

№	Зразок	ВХПЛЯ	ВЯДЯ	ВБДЯ	ВМЯ
1	Слава переможцям	-	-	-	-
2	Пінова р*. 5, д**.49	+	-	-	+
3	Внучка р. 6, д. 7	+	-	+	-
4	Внучка р. 6, д. 9	+	-	+	-
5	Мавка р. 5, д. 4	+	-	-	-
6	Джонаголд р. 3, д. 76	+	-	+	+
7	Джонаголд р. 3, д. 77	+	-	+	+
8	Чемпіон р. 3, д. 62	+	-	-	-
9	Рубінове Дуки р. 1, д. 9	-	+	+	+

* - ряд, ** - дерево

Окрім того, наведені результати свідчать, що мала місце змішана вірусна інфекція. Так, зразки № 9 та № 6 інфіковані одночасно трьома вірусами. Зразок № 9 - ВБДЯ, ВЯДЯ, ВМЯ, зразок № 6 - ВХПЛЯ, ВЯДЯ та ВМЯ. Моноінфекція ВХПЛЯ відмічалась в зразках № 5 та № 8. В усіх інших зразках була присутня змішана інфекція з 2-х патогенів. Результати тестування зразка № 1 на наявність вірусних інфекцій показали відсутність ВХПЛЯ, ВЯДЯ, ВБДЯ та ВМЯ.

Таким чином, результати тестування зразків яблуні методом ІФА виявили широке розповсюдження вірусних інфекцій серед протестованих зразків. Закономірності розподілу вірусної інфекції серед сортів різного походження виявлено не було. Однак, слід мати на увазі, що віруси про які йде мова є латентними - це значить, що застосування ІФА може бути неефективним при малій кількості білка в матеріалі. Можна припустити, що метод ЗТ-ПЛР має бути більш ефективним. В свою чергу, якість ПЛР дуже залежить від якісного виділення первинного матеріалу для аналізу - тотальної РНК з рослинних тканин.

3.3 Порівняння ефективності виділення тотальної РНК з рослинного матеріалу різними методиками

При проведенні досліджень з рослинами, які мають високий рівень вмісту фенольних речовин, вуглеводів та інших сумішей досить часто постають проблеми з виділенням тотальної РНК. Фенольні сполуки окислюють форми ковалентно-зв'язаних хінонів та авідно-зв'язаних нуклеїнових кислот. Це призводить до складнощів при постановці полімеразної ланцюгової реакції зі зворотньою транскрипцією, оскільки основою для постановки цього методу слугує тотальна РНК [Salzman, 1999].

У нашій роботі порівняння екстракції тотальної РНК ми проводили за допомогою трьох методів. Це було зроблено для того, щоб порівняти ефективність та підібрати найбільш оптимальну, якісну та швидку методику виділення тотальної РНК серед багатьох методик, що відомі на сьогоднішній день. Ми намагалися підібрати таку методику, яка була б зручна у використанні впродовж року та могла б бути використана для виділення тотальної РНК з будь-якого матеріалу плодових дерев.

У результаті порівняння ефективності виділення тотальної РНК з рослинного матеріалу виявили, що найбільш оптимальною є методика, основана на використанні LiCL та протеїнкінази К, з рН екстрагуючого буферу 7, 8. При її використанні відмічався найвищий вихід тотальної РНК.

3.4 Діагностика вірусів яблуні методом полімеразної ланцюгової реакції

Вірусні інфекції яблуні носять латентний характер, що ускладнює їх виявлення при візуальних обстеженнях, оскільки симптоми або зовсім не проявляються, або маскуються з підвищенням температури, що характерно для ВМЯ. Метод ІФА, не дивлячись на його високоспецифічність та надійність порівняно з методом біологічного тестування, має ряд недоліків. Впродовж літа, особливо з підвищенням температури зовнішнього середовища, відбувається зниження концентрації вірусів в рослині, а кількість інгібуючих речовин (поліфенолів та полісахаридів) збільшується. Тому в результаті діагностики вірусів плодових культур методом ІФА збільшується ймовірність появи псевдонегативних результатів. Альтернативою є молекулярні методи детекції, такі як ЗТ-ПЛР, які мають більший потенціал порівняно з біологічними та серологічними методами діагностики вірусів яблуні впродовж цілого року, навіть коли концентрація вірусів в рослинних тканинах є досить низькою.

Підбір праймерів є ключовою ланкою ПЛР, оскільки ними визначається можливість ампліфікації та виявлення необхідної послідовності. Для детекції вірусів застосовували декілька пар праймерів, підібраних різними авторами. Послідовність кожної з пар праймерів до ВХПЛЯ, ВБДЯ, ВЯДЯ, ВМЯ була комплементарною різним консервативним ділянкам гена капсидного білка відповідних вірусів, оскільки саме дані ділянки вважаються найбільш оптимальними для її ідентифікації, з огляду на те, що транскрипти гена капсидного білка кількісно переважають у цитоплазмі інфікованих клітин. Використання різних праймерів було зумовлено тим, що в генах капсидного білка різних ізолятів вірусів можливі незначні генетичні зміни, спричинені мутаціями під впливом різних факторів. Ці зміни можуть призводити до проблем, пов'язаних з детекцією вірусних послідовностей. І тому, з метою перекрити більшу частину гену капсидного білка досліджуваних вірусів було вирішено використати різні пари праймерів. Для тестування методом ПЛР були відібрані зразки з дослідних ділянок Інституту садівництва УААН, які попередньо були перевірені ІФА (див. табл. 1).

У результаті детекції першою парою праймерів, запропонованою Kundu, інфікованими ВХПЛЯ виявилися лише п'ять зразків - №2, 3, 6, 8, 9 (рис. 3).

Рис. 3 Електрофорез продуктів ЗТ-ПЛР ВХПЛЯ в агарозному гелі з праймерами, запропонованими Kundu: 1-9 - зразки яблуні, М - маркери, К - негативний контроль

Це суперечить даним ІФА, оскільки інфекція відмічалась в семи відібраних зразках - № 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8. Такі результати, можливо, пов'язані з відмінностями в нуклеотидних послідовностях гена капсидного білка деяких зразків. І з цієї причини, праймери ймовірно виявилися некомплементарними до послідовностей гена капсидного білка. У подальшому, зразки детектували другою парою праймерів, запропонованою Menzel. Інфікованими виявилися усі дев'ять зразків (рис. 4).

Рис. 4. Електрофорез продуктів ЗТ-ПЛР ВХПЛЯ в агарозному гелі з праймерами, запропонованими Menzel: 1-9 - зразки яблуні, М - маркери, К - негативний контроль

На нашу думку, ці результати, вірогідно, є більш реалістичними, так як інфікованість більшості зразків підтверджується і результатами ІФА, і результатами детекції з праймерами, запропонованими Kundu. Зразок № 9, який показав негативний результат в ІФА, ймовірніше є інфікованим ВХПЛЯ, так як тестування за допомогою праймерів двох авторів показало наявність нуклеотидної послідовності гену капсидного білку ВХПЛЯ. Результати зразка № 1 є дещо суперечливими, оскільки результати ІФА та тестування за допомогою першої пари праймерів показали негативний результат.

Таким чином, при використанні двох пар праймерів для детекції ВХПЛЯ на нашу думку, праймери, запропоновані Menzel є найбільш оптимальними.

Для детекції інфекції, викликаної ВЯДЯ методом ЗТ-ПЛР були використані три пари праймерів. Результати тестування зразків кожною з пар праймерів були ідентичними і показали наявність вірусної інфекції в 8 зразках - № 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9. Відмінним при тестуванні зразків різними парами праймерів було те, що відмічалась різна яскравість смуг при УФ-опроміненні гелю. Продукти ампліфікації розміром 264 та 277 bp (праймери, запропоновані Kundu та Jelkman) були менш помітні, ніж продукт розміром 370 bp (праймери, запропоновані Menzel) в УФ. Це може бути пов'язано з розміром продукту та, відповідно, кількістю інтеркальованого бромистого етидію і довжиною пробігу продукту у гелі. Відомо, що менший продукт містить менше бромистого етидію і більш інтенсивно знебарвлюється при проходженні гелю. Тому, на нашу думку, запропоновані Menzel праймери є найбільш оптимальними для детекції ВЯДЯ, а серологічна діагностика методом ІФА не є ефективною та достовірною.

Для детекції вірусної інфекції, викликаної ВБДЯ методом ЗТ-ПЛР були використані чотири пари праймерів. Вірусна інфекція спостерігалась в восьми зразках (№ 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9) при детекції праймерами, запропонованими James (рис. 5).

Рис. 5. Електрофорез продуктів ЗТ-ПЛР ВБДЯ в агарозному гелі з праймерами, запропонованими James: 1-9 - зразки яблуні, М - маркери, К - негативний контроль

У шести зразках (№ 2, 3, 4, 6, 7, 9) - праймерами, запропонованими Kundu (продукт ампліфікації 657 п.о.) (рис. 6а), в дев'яти зразках (№ 1-9) - праймерами запропонованими Menzel (рис.6б) та в дев'яти зразках (№ 1-9) - праймерами запропонованими Kundu (продукт ампліфікації 449 п.о.) (рис. 7).

З огляду на такі суперечливі результати, досить важко говорити про достовірність інфікування тих зразків, які показали відмінні результати в ІФА та при детекції різними парами праймерів. Під сумнівами, на нашу думку, є зразки № 1, 2, 5 та 8. Дані тестування зразка № 1 методом ІФА та парою праймерів, запропонованою Kundu (продукт ампліфікації 657 п.о.) не підтверджують вірусну інфекцію. Однак детекція іншими 3-ма різними парами праймерів, говорить про наявність нуклеотидної послідовності гена капсидного білка ВБДЯ. Зразок № 2 показав негативний результат лише при тестуванні методом ІФА, що не можна вважати достовірним, оскільки чутливість ЗТ-ПЛР є набагато вищою порівняно з ІФА. Результати зразка №5 показують наявність ВБДЯ при тестуванні з праймерами, запропонованими Kundu (продукт ампліфікації 449 п.о.) та Menzel. В інших випадках результат виявився негативним.

а б

Рис. 6. Електрофорез продуктів ЗТ-ПЛР ВБДЯ в агарозному гелі: 1-9 - зразки яблуні, М - маркери, К - негативний контроль: а) - з праймерами, запропонованими Kundu б) - з праймерами, запропонованими Menzel

Рис. 7. Електрофорез продуктів ЗТ-ПЛР ВБДЯ в агарозному гелі з праймерами, запропонованими Kundu: 1-9 - зразки яблуні, М - маркери, К - негативний контроль

Як видно з рис. 6б та 7, в результаті тестування зразків методом ЗТ-ПЛР спостерігається утворення чітких смуг продуктів ампліфікації розмірами, характерними для відповідних праймерів. Тому ми вважаємо, що праймери запропоновані Kundu (продукт ампліфікації 449 п.о.) та Menzel є оптимальними для детекції ВБДЯ, а результати тестування ними можна вважати достовірними.

Для детекції ВМЯ методом ЗТ-ПЛР були використані дві пари праймерів. При тестуванні зразків як парою праймерів запропонованою Menzel, так і парою запропонованою Kundu, інфекція ВМЯ відмічалась в усіх дев'яти зразках. Тому, на нашу думку, обидві пари праймерів можуть бути використані для діагностики ВМЯ.

Підсумовуючи отримані результати тестування зразків яблуні методами ПЛР та ІФА слід зазначити, що кількість інфікованих зразків методом ЗТ-ПЛР є набагато вищою порівняно з даними ІФА. Це ще раз підтверджує більш високу чутливість та специфічність методів на основі ПЛР, які дозволяють детектувати необхідну послідовність навіть за її незначної концентрації в матеріалі. З іншого боку, результати ЗТ-ПЛР при використанні пар праймерів, запропонованих різними авторами, є теж дещо відмінними. Так, підібрані праймери до одного і того ж вірусу можуть давати різні результати. Наприклад, праймери до ВБДЯ, запропоновані Kundu (продукт ампліфікації 657 п.о.) дозволяють детектувати вірус лише в 5 зразках, тоді як праймери, запропоновані Menzel для діагностики того ж вірусу - в 9 зразках, що вірогідно пов'язано з більш високою специфічністю при ідентифікації українських ізолятів ВБДЯ.

Отже, можна зробити висновок, що не зважаючи на окремі суперечливі результати полімеразної ланцюгової реакції, методи на основі ПЛР є набагато більш достовірними та чутливими у діагностиці латентних вірусів плодових культур. Основною перевагою цих методів є те, що навіть за незначної концентрації вірусів у тканинах рослин є можливим виявити патоген на відміну від імуноферментного аналізу, достовірність результатів якого залежить від пори року проведення досліджень та від рівня поліфінолів та полісахаридів в тканинах. Тому, метод ПЛР є надійним у використанні протягом року.

Таким чином, узагальнюючи результати проведення порівняльної детекції латентних вірусів яблуні методом ПЛР для широкої та рутинної ідентифікації ВХПЛЯ, ВБДЯ, ВЯДЯ та ВМЯ можна рекомендувати наступні праймери, наведені в таблиці 3.

Таблиця 3. Праймери, рекомендовані для ідентифікації ВХПЛЯ, ВБДЯ, ВЯДЯ та ВМЯ

Вірус	Праймери	Продукт ампліфікації
ВХПЛЯ	5'-TTCATGGAAAGACAGGGGCAA-3 5'-AAGTCTACAGGCTATTTATTATAAGTCTAA-3'	677 п.о.
ВБДЯ	5'-CCAGGCAGAACTCTTTGAACG-3' 5'-GAGTGGACAAACTCTAGACTC-3'	449 п.о.
	5'-GCCACTTCTAGGCAGAACTCTTTGAA-3' 5'-AACCCCTTTTTGTCCTTCAGTACGAA-3'	273 п.о
ВЯДЯ	5'-ATGTCTGGAACCTCATGCTGCAA-3' 5'-TTGGGATCAACTTTACTAAAAAGCATAA-3'	370 п.о.
ВМЯ	5'-ATCCGAGTGAACAGTCTATCCTCTAA-3' 5'-GTAACTCACTCGTTATCACGTACAA-3'	262 п.о.
	5'-CGTAGAGGAGGACAGCTTGC-3' 5'-CCGGTGGTAACTCACTCGTT-3'	436 п.о.

3.5 Порівняння нуклеотидних послідовностей фрагмента гену капсидного білка вірусів та їх філогенетичний аналіз

У результаті постановки ЗТ-ПЛР були отримані амплікони фрагмента гена капсидного білка ВХПЛЯ, ВБДЯ, ВЯДЯ та ВМЯ, які надалі були сиквеновані з метою визначення нуклеотидних послідовностей гена капсидного білка українських ізолятів, порівняння їх з відомими ізолятами Генбанку та проведення філогенетичного аналізу.

Було визначено нуклеотидні послідовності фрагмента гену капсидного білка трьох українських ізолятів ВЯДЯ, чотирьох українських ізолятів ВБДЯ, ВХПЛЯ та ВМЯ. Визначені фрагменти гена капсидного білка українських ізолятів ВХПЛЯ, ВБДЯ, ВЯДЯ, ВМЯ були депоновані в GenBank під номерами, FJ752494, FJ752496, FJ752495, FJ752493, відповідно. У таблиці 4 представлені нуклеотидні послідовності ампліконів-1 фрагментів гену капсидного білка досліджуваних вірусів.

Таблиця 4. Нуклеотидні послідовності фрагмента гену капсидного білка ВЯДЯ, ВБДЯ, ВХПЛЯ, ВМЯ

Амплікон-1 фрагмента гена капсидного білка віруса ямкуватості деревини яблуні
1	CCCAGCAGAG	AGAGTGGCTA	ACGCCACAAG	CAAGGAAATA
41	CAGATGTACC	GTATCCGCTC	TATGGAGGGT	ACTCAAGCTG
81	TGAACTTTGG	CGAGGTCACT	GGGGGAAAGA	TTGGACCCAA
121	GCCAGTTCTA	TCCATTAGGA	AGTGA
Амплікон-1 фрагмента гена капсидного білка віруса борознистості деревини яблуні
1	ATTTGCTGAT	TTGGCTCGGG	AATTTCTTCA	TGAAAGATGG
41	TCAAGGGGAC	TTGCCACCAA	CATTTATAAG	AAATGGCCCA
81	AAGCTTTTGA	AAAAAGCCCT	TGGGTGGCTT	TTGATTTTGC
121	CACTGGTCTT	AAAATGAACC	GTCTAACGCC	TGATGAAAAA
161	CAGGTAATAG	ACAGAATGAC	TAAGAGGCTT	TTTCGTACTG
201	AAGGACAAAA	GGGGGTTTTC	GAGGCGGGTT	CGGAGAGCAA
241	TCTGGAACTG	GAGGGTTAGA	AGTCGTGTGA	AATTCCGCAA
281	ACTTGGTCGC	GGTCTTACAG	GTTGACATGC	CTGCCTTTAT
321	ACTTAAATAA	AGGGTTCCCT	CGGTTTTCTG	TGCATTTCCG
361	GGTTAGTGTG	GTTTTTTCTA	G
Амплікон-1 фрагмента гена капсидного білка віруса хлоротичної плямистості листя яблуні
1	ACTGGAGCAT	CTTCGCGACA	TAGCGATCAC	AGGGGACCTC
41	GGAGCAGACG	GAGTTCCTGG	ACGTGACTGT	GGAGGTGAAA
81	TCCATGGAGG	ACCAGAAGGT	GATAGGGTCC	TTCAATCTGA
121	AGGAGGTGGT	CAATTTGATA	AAGACATTCA	AGACTACACT
161	CTTCGGATCC	GAATATCAGC	AACATGACCT	TTCCGCCAGG
201	TGTGTGAGGC	TTTTGCACCT	GAGGCAAGAA	ATGGGCTGGT
241	TAAACTGAAG	TATAAAGGGG	TTTTCACTAA	CCTCTTTTCT
281	ACCATGCCAG	AAGTGGGAAG	AAAATACCCG	GAGCTGATGT
321	TCGATTTCAA	TAAGGGGCTG	AACATGTTCA	TCATGAACAA
361	GGCCCAGCAG	AAAGTCATAA	CTAATATGAA	CCGGCGTCTT
401	TTACAGACTG	AATTTGCAAA	GAGTGAGAAA	TGAGGGCGAA
441	ATGTCAGCTG	TTAACACTGA	ACTTTGGCTT	TAGGTCGGAT
81	AAGAAGCTTG	GTTTCATTAA	TTAGATAAAT	TAAT
Амплікон-1 фрагмента гена капсидного білка віруса мозаїки яблуні
1	GGTCACAGGG	TCCTGAGCAG	TCGAGAAGTG	ACTGCCATGG
41	TTGAAGGCAA	GTTCGTCAAT	ATTGACTTTG	CCGATGTCTT
81	TCGTGATCTT	CTGGAGAAGG	ATCTGAAGGT	GTATACCTTC
121	ATAATCCGAG	TGAACAGTCT	GTCCTCTAAT	GGATGGATTG
161	GGTTAGTGGA	GGATTACGAT	GAGAGTAATC	CGAAAGGTCC
201	GAATCCGATG	GACCGAAAGG	GTTTCAAAAA	GGACCAACCG
241	AGAGGTTGGC	AGTGGGAAGC	CCCTCCAAAC	ACAACTTTTG
281	ATGACTTCGT	GAGGAAGTTT	AGGTTGGTAT	TGGAGTTTAA
321	GACGAATTTC	GCCGCTGGCG	CGAAAGTCTT	TATGAGGGAT
361	TTGTACGTGA	TAACGAGTGA	GTTACCACC

При порівнянні отриманих ампліконів фрагмента гену капсидного білка українських ізолятів ВХПЛЯ, ВБДЯ, ВЯДЯ, ВМЯ між собою за допомогою BLAST - аналізу (www.ncbi.nlm.gov) виявилося, що ізоляти ВБДЯ, ВЯДЯ, ВМЯ мають високу спорідненість між собою: ізоляти ВЯДЯ - 94-97%, ізоляти ВБДЯ - 99-100%, ВМЯ - 96-99%. Українські ізоляти ВХПЛЯ мають значно нижчій відсоток гомології - 86-89%, що говорить про високу варіабельність генома віруса. Варіабельність генома ВХПЛЯ відмічалась і серед ізолятів Італії, Франції, Польщі, Германії та Угорщини, відсоток варіабельності серед ізолятів становив 10-20% [Candresse, 1995; Krizbai, 2001].

Надалі був проведений пошук аналогічних послідовностей у Генбанку (GenBank, www.ncbi.nlm.gov). Так, результати показали, що амплікони фрагмента гена капсидного білка ВЯДЯ найбільш подібні до відомих послідовностей гена, який кодує капсидний білок ВЯДЯ ізолятів з Чехії (номер доступу DQ003336.1) та Польщі (AF491930.1). Відсоток гомології складає 93%. Тому, з огляду на близьке межування даних країн з Україною, вірогідно, що український ізолят та ізоляти Чехії та Польщі належать до одного штаму. Найменший відсоток гомології відмічався до ізоляту (номер доступу AY572458.1), який походить з Бразилії - 86%. Такий порівняно низький відсоток спорідненості українського ізоляту з бразильським, може бути пов'язаний з відсутністю прямого обміну посадковим матеріалом, ураженим ВЯДЯ. Результати порівняння ампліконів-2 та 3 з відомими послідовностями є подібними до результатів амплікона-1.

До ампліконів фрагмента гена капсидного білка українських ізолятів ВБДЯ, навпаки, найбільш гомологічним виявився ізолят, що походить з Бразилії - 98% (код доступу AF438409.1), і досить важко пояснити причину високої гомології українського ізоляту з ним, оскільки у випадку ізолятів ВЯДЯ, з ізолятом з Бразилії спостерігалась найменша гомологія. Вірогідно, причиною може бути недостатність інформації щодо відомих послідовностей ВБДЯ з територіально ближчих країн, таких як Польща, Угорщина, Чехія, Болгарія, Туреччина та ін. Найменша спорідненість досліджуваного амплікону фрагмента гена капсидного білка ВБДЯ - 87%, спостерігалась з ізолятом з Китаю (номер доступу АУ886760), що може свідчити про відмінність даних ізолятів аж до існування окремих штамів. Результати порівняння ампліконів-2, 3 та 4 з відомими послідовностями є подібними до результатів амплікона-1.

При порівнянні ампліконів фрагмента гена капсидного білка ВМЯ, найвищий відсоток гомології - 99% відмічався до ізоляту з Чехії (номер доступу AY542543.1). Така висока гомологія досліджуваного амплікону може пояснюватися близьким розташуванням наших країн та інтенсивним обміном посадкового матеріалу і свідчити про поширення одних і тих самих ізолятів ВМЯ. Найменша спорідненість - 91%, відмічалась з австралійським ізолятом (номер доступу AF473582.1). З цього виходить, що українські ізоляти ВМЯ не можна вважати окремим штамом даного вірусу, оскільки відсоток гомології з іншими відомими послідовностями досить високий, що може бути пояснено низькою варіабельністю геному даного вірусу і відсутності його штамового різноманіття.

При дослідженні послідовностей амплікона-1 гена капсидного білка ВХПЛЯ найвищий відсоток гомології - 88% відмічався до ізолятів з Албанії (номер доступу AJ586637.1), Японії (номер доступу AB326228.1) та ізоляту з Греції (номер доступу AM292923.1). Найнижчий відсоток гомології - 81% (код доступу AB060961.1 Японія). При порівнянні амплікона-2 з нуклеотидними послідовностями гена капсидного білка ВХПЛЯ з Генбанку, відсоток гомології подібний до амплікона-1, для амплікона-3 - найвищий відсоток гомології 90% відмічається до ізолятів з Італії (номер доступу AJ586642.1) та до ізолятів з Японії (номер доступу AB326223.1), та найнижчий відсоток гомології - 78% до ізолятів з Японії (номер доступу AB060953.1), для амплікона-4 - найвищий відсоток гомології 90% відмічається для ізоляту з Японії (номер доступу AB326228.1) та до ізоляту АТ-49 з Венгрії (номер доступу AY677104.1). Найменший - до ізолятів з Японії - 79% (номер доступу AB060957.1). Такий, порівняно низький у порівнянні з іншими вірусами відсоток гомології досліджуваних ампліконів ВХПЛЯ, ймовірно, свідчить про циркуляцію на Україні окремого штаму ВХПЛЯ.

З метою наглядного графічного відображення наведених вище результатів еволюційних взаємовідносин українських ізолятів досліджуваних вірусів з їх ізолятами, депозитованими в Генбанку, нами були сконструйовані філогенетичні дерева за методом зв'язування найближчих сусідів (NJ), модель Кімура з 100 бутстреп реплікацій (рис. 8 а-г).

Таким чином, аналізуючи нуклеотидні послідовності ампліконів фрагмента гену капсидного білка українських ізолятів ВХПЛЯ, ВБДЯ, ВЯДЯ та ВМЯ можна говорити про високу спорідненість ізолятів ВБДЯ, ВЯДЯ та ВМЯ, що циркулюють на території України з відомими ізолятами (штамами) цих вірусів. В той же час, ізоляти ВХПЛЯ з України продемонстрували порівняно незначну спорідненість їх при порівнянні як між собою так і з відомими послідовностями ВХПЛЯ, що може свідчити про окремий український штам вірусу хлоротичної плямистості листя яблуні.



а) б)

в) г)

Рис. 8. Філогенетичні дендрограми побудовані за методом NJ: а) для ВХПЛЯ, б) для ВМЯ, в) ВБДЯ, г) ВЯДЯ

Висновки

У результаті виконання дисертаційної роботи було проведено візуальну, серологічну та молекулярно-біологічну діагностику латентних вірусів яблуні, визначено нуклеотидні послідовності та здійснений філогенетичний аналіз фрагментів генів капсидного білка 15 українських ізолятів латентних вірусів яблуні - ВХПЛЯ, ВБДЯ, ВЯДЯ та ВМЯ, проведено порівняльний аналіз чутливості методів ІФА та ПЛР для діагностики латентних вірусів, запропоновано модифіковані методи виділення тотальної РНК та розроблено методики ПЛР-діагностики латентних вірусів яблуні. Головні наукові та практичні результати роботи сформульовано у наступних висновках:

1. Порівняльний аналіз методів детекції латентних вірусів яблуні - візуальної діагностики, імуноферментного аналізу та полімеразної ланцюгової реакції показав, що для надійної діагностики найбільш чутливим методом є ЗТ-ПЛР.

2. За результатами ІФА виявлено антигени вірусу мозаїки яблуні в 1,7 % зразків, вірусу борознистості деревини яблуні в - 18,3%, вірусу ямкуватості деревини яблуні - в 23,3%, вірусу хлоротичної плямистості листя яблуні в - 68,4% серед протестованих дерев промислових насаджень Київської області.

3. Встановлена змішана інфекція ВЯДЯ та ВХПЛЯ в 1,7%, ВЯДЯ та ВБДЯ - в 5%, ВБДЯ та ВХПЛЯ в - 16,7%.

4. Показано, що для екстракції тотальної РНК з зразків яблуні оптимальною є методика заснована на використанні LiCl та протеїнкінази К в екстрагуючому буфері з рН 7,8.

5. Підібрано оптимальні праймери для специфічної детекції українських ізолятів ізолятів ВХПЛЯ, ВБДЯ, ВЯДЯ та ВМЯ методом полімеразної ланцюгової реакції.

6. У результаті порівняння нуклеотидних послідовностей фрагмента гена капсидного білка українських ізолятів латентних вірусів яблуні показано високу гомологію досліджених ампліконів ВБДЯ, ВЯДЯ та ВМЯ як між собою, так і з відомими послідовностями, що свідчить про належність даних ізолятів до відомих штамів відповідних вірусів.

7. Спорідненість українських ізолятів ВХПЛЯ порівняно з відомими нуклеотидними послідовностями є дещо низькою (79-90%), що свідчить про існування в Україні окремого штаму ВХПЛЯ.

8. Проведено філогенетичний аналіз українських ізолятів латентних вірусів яблуні та вірусу мозаїки яблуні за геном капсидного білка та показано високу гомологію українських ізолятів ВЯДЯ до ізолятів з Чехії та Польщі (93%), ВБДЯ до ізоляту з Бразилії (98%), ВМЯ до ізолятів з Чехії (99%).

Перелік наукових праць, опублікованих за темою дисертації

1. Господарик А.В. Діагностика вірусів плодових культур в умовах України / А.В. Господарик, К.М. Удовиченко, В.П. Поліщук // Наукові записки НАУКМА. - 2005 - т. 43. - С. 50-54. (Дисертантом проаналізовано літературу, проведено пошук та узагальнено літературні дані, крім того дисертантом підготовлено статтю до друку. Відбір зразків та їх тестування проводили спільно з співробітниками Інститутом садівництва. Висновки зроблено особисто автором).

2. Господарик А.В. Перспективи створення діагностикумів до вірусів рослин / А.В. Господарик, Г.О. Снігур, І.Г. Будзанівська, В.П. Поліщук // Вісник аграрної науки. - 2007. - № 10. - С.23-25. (Дисертантом проведена обробка одержаних результатів. Підготовлено статтю до друку. Висновки зроблено автором при участі наукового керівника).

3. Gospodaryk A. Distribution of apple latent viruses in Kiev region / A. Gospodaryk, I. Budzanivska, F. Demyanenko, V. Polischuk // Visnik of Taras Shevchenko Kiev National University. Series Biology. - 2008. -№ 51. - P. 25-27. (Дисертантом проаналізовано літературу, визначено ідею роботи, виконано експериментальну частину, здійснено статистичну обробку та інтерпретацію отриманих результатів та підготовлено статтю до друку. Висновки зроблено особисто автором).

4. Господарик А.В. Діагностика українських ізолятів вірусів яблуні методом ЗТ-ПЛР / А.В. Господарик, І.Г. Будзанівська, В.П. Поліщук, Д.К. Кундю // Науковий вісник НАУ. - 2008. - № 129. - С. 147-163. (Дисертантом проаналізовано літературу, здійснено інтерпретацію отриманих результатів та підготовлено статтю до друку. Висновки зроблено особисто автором).

5. Методичні рекомендації «Використання ПЛР для діагностики латентних вірусів яблуні та їх філогенетичний аналіз» / Київс. нац. ун-т ім. Т. Шевченка; уклад.: А.В. Господарик, І.Г. Будзанівська, В.П. Поліщук. - 2008. - 32 с.

6. Удовиченко В.М. Вірусні хвороби плодових порід в Україні / В.М. Удовиченко, Н.В. Тряпіцина, С.О. Васюта, В.А. Малієнко, Н.П. Таранухо, К.М. Удовиченко, А.В. Господарик, І.Г. Будзанівська В.П. Поліщук // Біоресурси та віруси: IV міжнар .конф., 27-30 вересня 2004 р.: зб. тез. - К.: Видавничо-поліграфічний центр «Київський університет», 2004. - С. 98-99.

7. Господарик А.В. Розповсюдження вірусів плодових культур на території України / А.В. Господарик // Біологічні дослідження молодих вчених на Україні: матеріали V Всеукраїнської наукової конференції студентів та аспірантів, 15-16 вересня, 2005. - К., 2005. - С. 24-25.

8. Gospodarik A.V. Diagnostic of apple latent viruses in Ukraine and development express-methods of diagnostic for Apple mosaic virus on the base of PCR / A.V. Gospodarik, V.M. Udovichenko, V.P. Polischuk, I.G. Budzanivska // BIOTECHNOLOGY 2006: Abstracts of conference, 15^th-16^th February, Ceske Budejovice, Czech Republic, 2006. - P. - 510-511.

9. Поліщук В.П. Перспективи створення діагностикумів до вірусів рослин / В.П. Поліщук, І.Г. Будзанівська, Т.П. Шевченко, Г.В. Коротєєва, А.В. Господарик // Мікробні біотехнології: зб. тез міжнар. наук. конф., 11-15 вересня 2006 р. - О. - С. 146-147.

10. Господарик А.В. Поширення латентних вірусів яблуні в Київському регіоні / А.В., Господарик І.Г. Будзанівська, В.М. Удовиченко, В.П. Поліщук // Біоресурси та віруси: V міжнар. конф., 10-13 вересня 2007 р.: зб. тез. - К.: Фітосоціоцентр, 2007. - С. 170-171.

Размещено на Allbest.ru

...