Показники вуглеводного обміну у кролів з експериментальним цукровим діабетом після трансплантації острівців підшлункової залози в різні тканини організму

Размещено на http://www.allbest.ru/

ХАРКІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ІМЕНІ В.Н. КАРАЗІНА

УДК 577.124:616.379-008.64-092.9:616.37.089.843

03.00.13 - фізіологія людини і тварин

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

ПОКАЗНИКИ ВУГЛЕВОДНОГО ОБМІНУ У КРОЛІВ З ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНИМ ЦУКРОВИМ ДІАБЕТОМ ПІСЛЯ ТРАНСПЛАНТАЦІЇ ОСТРІВЦІВ ПІДШЛУНКОВОЇ ЗАЛОЗИ В РІЗНІ ТКАНИНИ ОРГАНІЗМУ

Колот Наталя Володимирівна

Харків - 2009

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Харківському національному університеті імені В.Н. Каразіна Міністерства освіти і науки України і в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України.

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор Бондаренко Тетяна Петрівна, Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, завідувач відділу кріобіохімії і фармакології нейрогуморальних систем

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Клімова Олена Михайлівна, ДУ “Інститут загальної та невідкладної хірургії АМН України”, завідувач діагностичної лабораторії з імуноферментним аналізом

доктор медичних наук, професор Бобирьова Людмила Єгорівна, ВДНЗ “Українська медична стоматологічна академія” МОЗ України, завідувач кафедри ендокринології з лікувальною фізкультурою та спортивною медициною

Захист відбудеться «11» листопада 2009 р. о 15.15 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.051.17 Харківського національного університету імені В.Н. Каразіна Міністерства освіти і науки України за адресою: 61077, м. Харків, пл. Свободи, 4, ауд. ІІІ-15.

З дисертацією можна ознайомитись у Центральній науковій бібліотеці Харківського національного університету імені В.Н. Каразіна Міністерства освіти і науки України за адресою: 61077, м. Харків, пл. Свободи, 4.

Автореферат розісланий «28» вересня 2009 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради В.М. Дзюба

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. На даний час в Україні та в усьому світі спостерігається неухильне зростання захворюваності цукровим діабетом (ЦД). Прогресуючі та тяжкі діабетичні ускладнення призвели до того, що ЦД відносять до тріади найпоширеніших захворювань (Гринь В.К. та ін., 2003; Казьмин В.Д., 2000). Найбільш тяжкою формою діабету є інсулінозалежний ЦД (ІЗЦД) або ЦД 1 типу, при цьому частка захворювання ІЗЦД складає не більш 5-15% від загальної кількості хворих на ЦД. Даний тип захворювання відносять до найважливіших медико-соціальних проблем охорони здоров'я (Грищенко В.І. та ін., 2003; Davіdson J., 2003), тому що виникає внаслідок автоімунної деструкції інсулін-продукуючих в-клітин острівців Лангерганса на тлі спадкової схильності в основному в дитячому і юнацькому віці, призводить до ранньої інвалідизації, збільшення смертності у 2-3 рази і скорочення тривалості життя людей на 10-30% внаслідок розвитку багатокомпонентних порушень метаболізму та тяжких діабетичних ускладнень (Боднар П.М. та ін., 2002; Касаткина Э.П., 1996; Redondo M.J. et al., 2002).

Відомо, що при ІЗЦД необхідна постійна замісна інсулінотерапія. Однак інсулінотерапія під контролем глікемії не дозволяє повністю відновити складну регуляторну функцію загиблих острівців підшлункової залози (ОПЗ), а також не може замістити втрачену ендокринну функцію підшлункової залози (ПЗ) та здійснювати разом з іншими залозами внутрішньої секреції щосекундну регуляцію обміну речовин, гомеостазу, вегетативних процесів та інших фізіологічних функцій (Балаболкин М.И., 2000). Крім того, інсулінотерапія, особливо за умов лабільного перебігу ІЗЦД, може викликати гіпоглікемічний стан, що супроводжується комою та кетозом, а також призводить до парадоксального ефекту ? прискорює розвиток мікросудинних ускладнень (Боднар П. М. и др., 2002).

У зв'язку з цим необхідним є пошук ефективного способу компенсації ІЗЦД. Трансплантація ОПЗ або в-клітин розглядається як більш фізіологічний підхід компенсації гормональної недостатності в порівнянні з традиційною терапією, тому що дозволяє утворити в організмі реципієнта функціональне "депо" ендогенних гормонів і регулювати в організмі ряд нейроендокринних функцій на фізіологічному рівні (Турчин І.С. та ін., 2002; Korsgren O. et al., 2005). Трансплантовані ОПЗ фетального та неонатального походження, крім синтезу та секреції гормонів, здатні до продукції біологічно активних медіаторів, в основному пептидної природи, які виконують функції паракринних та аутокринних фізіологічних регуляторів, що мають вплив на функцію спеціалізованих клітин ендокринного органа, а також на стан інших органів і систем (Bliumkin V.N. et al., 2007; Lee M. et al., 2000).

Експериментальні та клінічні дані свідчать про те, що за своїм ефектом ксенотрансплантація (КсТц) ОПЗ або в-клітин, отриманих від неонатальних поросят (Турчин І.С. та ін., 2002; Rayat G.R. et al., 1999; Vіzzardellі C. et al., 2002) і кролів (Скалецкий Н.Н. и др., 2003), не уступає алотрансплантації (АлТц) та дозволяє уникнути етичних, моральних і правових проблем (McKewzie I.F.C. et al., 2002; Weiss R.A., 1998). Відомо, що ксеногенні фетальні та неонатальні в-клітини або ОПЗ, введені в організм реципієнта, здатні не тільки компенсувати дефіцит інсуліну, але і призводять до регенерації і/або часткового відновлення секреторної активності в-клітин власної ПЗ (Скалецкий Н.Н. и др., 2003).

Незважаючи на ефективність трансплантації, існує безліч невирішених питань, які пов'язані з механізмами розвитку гострого та хронічного відторгнення трансплантата в організмі реципієнта. Використання імуносупресивної терапії або тотального опромінення пригнічує імунну відповідь, направлену проти антигенів, що дозволяє продовжити строки виживаємості трансплантата в організмі реципієнта (Benhamou P.Y. et al., 1998), але при цьому в організмі утворюються ідеальні умови для розмноження мікроорганізмів (Турчин І.С. та ін., 2002), крім того деякі імуносупресанти (кортикостероїди, циклоспорин А, такролімус, азатіоприн, циклофосфамід) мають діабетогенний потенціал, виявляясь токсичними для ОПЗ (Desai N.M. et al., 2003; Sato T. еt al., 2003). Внаслідок цього актуальним є пошук способів продовження строків виживаємості трансплантата в організмі реципієнта. Гіпотетично, строки виживаємості та функціонування трансплантата в організмі реципієнта залежать від тканини, в яку здійснюють трансплантацію ОПЗ. Дане припущення аргументується результатами досліджень, в яких показано, що ауто-, ало- або ксеногенні ОПЗ, введені в пульпу селезінки (Bliumkin V.N. et al., 2007; Cheng Y. et al., 2005; van der Burg M.P. et al., 1996), сім'яник (Nasr S.W. et al., 2005), кістковий мозок (Salazar-Banuelos A. et al., 2008), портальну вену печінки (Shapіro A.M. et al., 2006) і під капсулу нирки (Matarazzo M. et al., 2002; Trіverdі N. et al., 2001), без і при використанні імуносупресантів сприяють тривалій нормалізації вмісту глюкози в крові реципієнтів.

Однак в літературі відсутні дані про вплив ОПЗ неонатальних поросят за умов їх трансплантації в різні тканини організму на вуглеводний обмін і тканину ПЗ реципієнта, а також на тканину органів, в які здійснювали введення ксенотрансплантата. У зв'язку з цим було актуальним провести дослідження по вивченню впливу ОПЗ неонатальних поросят і кролів залежно вiд тканини, в яку здійснювали їх трансплантацію, на показники вуглеводного обмiну при експериментальному ЦД та оцiнити функціональні показники, що вiдображають стан органів тварин-реципієнтів у різні строки після трансплантації ОПЗ неонатальних поросят.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота була виконана в рамках держбюджетної теми Харківського національного університету імені В.Н. Каразіна “Механізми впливу фізичних факторів і біологічно активних речовин на ДНК, білки та біомембрани” (№ державної реєстрації 019U016741) і наукової тематики Інституту проблем кріобіології і кріомедицини (ІПКіК) НАН України “Дослідження механізмів функціонування кріоконсервованих органних культур ендокринних тканин” (№ державної реєстрації 0101U003478).

Мета і завдання дослідження. Мета роботи ? вивчити тканиноспецифічний вплив ало- та ксенотрансплантації острівців підшлункової залози неонатальних тварин на показники вуглеводного обміну у кролів з експериментальним цукровим діабетом, а також оцінити функціональний стан органів тварин-реципієнтів в посттрансплантаційний період. ксенотрансплантація підшлунковий залоза діабет

Відповідно до встановленої мети передбачалося вирішити наступні задачі:

1. Вивчити в порівняльному аспекті функціональні властивості ОПЗ неонатальних поросят і кролів іn vіtro.

2. Дослідити показники вуглеводного обміну (вміст глюкози в крові та сечі, фракції глікозильованого гемоглобіну (HbA1c) в крові, тест толерантності до глюкози) у кролів з експериментальним ЦД після трансплантації ОПЗ неонатальних тварин в різні тканини організму.

3. Оцінити виживаємость ОПЗ неонатальних поросят в організмі тварин-реципієнтів при використанні неспецифічного флуоресцентного барвника DіОС18 і гістохімічного аналізу.

4. Для оцінки тяжкості та відновлення метаболічних порушень у тварин-реципієнтів після КсТц ОПЗ неонатального походження вивчити динаміку вмісту загального та вільного білірубіну, креатиніну, альбуміну, гемоглобіну, активності лужної фосфатази (ЛФ), аланінамінотрансферази (АлАт), аспартатамінотрансферази (АсАт) в крові, кількості форменних елементів крові, швидкості осідання еритроцитів (ШОЕ), часу згортання крові.

5. На основі структурно-функціональних змін (гістологічний аналіз) оцінити вплив ОПЗ неонатальних тварин при трансплантації в різні тканини організму на підшлункову залозу кролів з експериментальним ЦД.

Об'єкт дослідження: ОПЗ неонатальних поросят і кролів іn vіtro та при трансплантації в різні тканини організму кролів з експериментальним ЦД.

Предмет дослідження: тканиноспецифічний вплив АлТц і КсТц ОПЗ неонатальних тварин на показники вуглеводного обміну (вміст глюкози в крові та сечі, фракції HbA1c в крові, тест толерантності до глюкози) у кролів з експериментальним ЦД.

Методи дослідження. У роботі використовувались метод ферментативного отримання та культивування ОПЗ, метод трансплантації ОПЗ в різні тканини організму, світлова та флуоресцентна мікроскопія, цитофлуориметричний аналіз, методи визначення форменних елементів крові, ШОЕ, часу згортання крові, імуноферментний, радіоімунологічний, спектрофотометричний методи, гістохімічний і гістологічний аналіз, статистичний аналіз результатів.

Наукова новизна одержаних результатів. У дисертаційній роботі проведена порівняльна характеристика структурно-функціональних властивостей ОПЗ неонатальних донорів віддаленої філогенетичної спорідненості (поросят і кролів) іn vіtro і при трансплантації тваринам з експериментальним ЦД. Встановлено, що ОПЗ неонатальних кролів мають більшу інсулін-продукуючу здатність іn vіtro в порівнянні з ОПЗ неонатальних поросят.

Вперше проведено вивчення впливу КсТц ОПЗ неонатального походження в різні тканини організму на показники вуглеводного метаболізму (вміст глюкози в крові та сечі, фракції HbA1c в крові, тест толерантності до глюкози) у кролів з експериментальним ЦД без використання імуносупресантів. Встановлено, що тривалість метаболічного впливу ОПЗ неонатальних поросят і кролів на показники вуглеводного обміну у тварин-реципієнтів залежить від тканини, в яку здійснювали їх трансплантацію. При цьому максимальна по тривалості нормалізація показників вуглеводного обміну в організмі тварин-реципієнтів спостерігалася після трансплантації ОПЗ неонатальних поросят і кролів в селезінку, далі в портальну вену печінки, кістковий мозок, сім'яник і під капсулу нирки, а мінімальна ? в паренхіму печінки. Нормалізації показників вуглеводного обміну не спостерігалось у тварин-реципієнтів після введення ОПЗ неонатальних поросят і кролів у загальний кровоток (через вушну вену). Показано тривале фізіологічне зниження вмісту глюкози в крові кролів після АлТц і КсТц ОПЗ неонатальних тварин в селезінку та портальну вену печінки. Короткочасне зниження вмісту глюкози в крові було виявлено у кролів після трансплантації ало- та ксеногенних ОПЗ неонатального походження в паренхіму печінки, кістковий мозок, сім'яник і під капсулу нирки.

За умов проведення структурно-функціонального дослідження (гістологічний аналіз) тканини ПЗ встановлено, що трансплантація ОПЗ неонатальних тварин в селезінку та портальну вену печінки стимулює на тлі сенсибілізації процеси ауторегенерації у ПЗ тварин-реципієнтів, що призводить до часткового відновлення власної ендокринної тканини.

Вперше проведено комплексне визначення динаміки функціональних показників (вміст загального та вільного білірубіну, креатиніну, альбуміну, гемоглобіну, активність ЛФ, АлАт, АсАт в крові, кількість форменних елементів крові, ШОЕ, час згортання крові), які відображають стан печінки та селезінки, а також наявність відновлення метаболічних порушень у тварин-реципієнтів після трансплантації ОПЗ неонатальних поросят. Показано, що трансплантація ОПЗ неонатальних поросят сприяла відновленню супутніх метаболічних порушень і не викликала посттрансплантаційних ускладнень функції печінки (з 7 по 70 добу) та селезінки (з 7 по 91 добу) тварин-реципієнтів. Встановлено нормалізацію вмісту загального та вільного білірубіну, креатиніну, альбуміну, активності ЛФ, АлАт, АсАт в сироватці крові кролів з 7 по 70 добу після трансплантації ОПЗ неонатальних поросят в портальну вену печінки. Показано зниження та підтримання в межах нормальних значень вмісту загального білірубіну в сироватці крові та ШОЕ у кролів з 7 по 91 добу після трансплантації ОПЗ неонатальних поросят в селезінку.

Практичне значення одержаних результатів. Встановлено, що ОПЗ неонатальних тварин зберігають функціональні властивості при культивуванні протягом 6 діб, а тривале культивування (більш 6 діб) призводить до зниження функціональної активності ОПЗ неонатальних поросят і кролів. Показано, що умови отримання ОПЗ у двох видів неонатальних донорів відрізняються: ОПЗ неонатальних поросят при градієнтному розподіленні та проведенні забарвлювання розчином дитизону концентруються в інтерфазі фіколу з щільністю 1,070-1,074 г/см3, а ОПЗ неонатальних кролів ? з щільністю 1,060-1,070 г/см3.

На основі вивчення показників вуглеводного обміну та структурно-функціонального дослідження (гістологічний аналіз) тканини ПЗ тварин-реципієнтів встановлено метаболічний вплив для тканин печінки та селезінки, після АлТц і КсТц ОПЗ неонатальних тварин в які спостерігалося тривале зниження та підтримання в межах нормальних значень вмісту глюкози в крові.

Отримано нові дані щодо тканиноспецифічного впливу АлТц і КсТц ОПЗ неонатального походження на показники вуглеводного обміну у тварин-реципієнтів, які мають практичне значення та можуть бути використані для практичних розробок в галузі тканинної та клітинної трансплантології, а також експериментальної ендокринології та хірургії.

Отримано деклараційний патент України № 32227 “Спосіб корекції гіперглікемії при інсулінозалежному цукровому діабеті”, згідно з яким інтрапортальна трансплантація ОПЗ неонатальних поросят сприяє зниженню та дозволяє протягом 1,5-2 місяців підтримувати в межах нормальних значень вміст глюкози в крові тварин-реципієнтів.

Результати досліджень використовуються при викладанні дисциплін “Ендокринологія” та “Фізіологія людини і тварин” Харківського національного університету імені В.Н. Каразіна та можуть бути використані при викладанні курсів нормальної, патологічної фізіології і ендокринології на біологічних факультетах університетів і у вищих медичних учбових закладах, а також у роботі науково-дослідних установ ендокринологічного профілю.

Особистий внесок здобувача. Представлені на захист положення і експериментальні дані отримані при безпосередній участі дисертанта, яка полягає в самостійному плануванні досліджень, виконанні серії експериментів іn vіtro та іn vіvo, інтерпретації і статистичному аналізі отриманих результатів, формулюванні висновків.

Автор висловлює подяку співробітникам відділу кріобіохімії і фармакології нейрогуморальних систем ІПКіК НАН України.

Апробація результатів дисертації. Основні положення та результати роботи викладені та обговорені на засіданнях відділу кріобіохімії і фармакології нейрогуморальних систем ІПКіК НАН України та на засіданнях вченої ради біологічного факультету Харківського національного університету імені В.Н. Каразіна. Матеріали дисертації представлені на наукових форумах: І конференції молодих вчених із міжнародною участю “Біологія: від молекули до біосфери” (Харків, 2006 р.); науково-практичній конференції “Профілактика, діагностика та лікування ? основні складові терапії” (Харків, 2006 р.); ІІІ і ІV наукових конференціях студентів і аспірантів з міжнародною участю “Молодь та поступ біології” (Львів, 2007, 2008 р.р.); Всеросійському симпозіумі з міжнародною участю “Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии” (Москва, 2007 р.); ІV з'їзді трансплантологів України з міжнародною участю (Київ, 2007 р.); VІІ Данилевських читаннях (Харків, 2008 р.); V медико-фармацевтичній конференції студентів і молодих вчених з міжнародною участю (Чернівці, 2008 р.); конференції молодих вчених “Холод у біології та медицині” (Харків, 2008 р.).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 13 наукових робіт, у тому числі 4 статті, 3 з яких ? у фахових виданнях, 8 тез доповідей, 1 деклараційний патент.

Обсяг і структура дисертації. Матеріал дисертаційної роботи викладено на 179 сторінках друкованого тексту, в тому числі на 29 сторінках ? цитована література. Дисертаційна робота містить вступ, огляд літератури, розділи “Матеріали і методи дослідження”, “Результати досліджень та їх обговорення”, узагальнення, висновки і список використаної літератури, який включає 300 джерел, з них 97 кирилицею та 203 латиницею. Робота ілюстрована 52 рисунками, з них 24 мікрофотографії, та 7 таблицями.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи дослідження. Робота виконана на 130 безпорідних кролях-самцях, масою 2,5-3,0 кг, віком 5-6 місяців, з них 80 кролям здійснювали трансплантацію ОПЗ неонатальних тварин. Експерименти на лабораторних тваринах проводились відповідно до вимог “Загальних принципів експериментів на тваринах”, які схвалені І Національним конгресом з біоетики (20.09.01 р., м. Київ, Україна) і погоджені з положеннями “Європейської Конвенції про захист хребетних тварин, що використовуються в експериментальних та інших наукових цілях” (м. Страсбург, 1985 р.).

Трансплантаційний матеріал представлено ОПЗ неонатальних поросят (n=160) і кролів (n=130), з них для трансплантації використовували ОПЗ 110 неонатальних кролів і 129 неонатальних поросят. ОПЗ неонатальних тварин отримували з хвостової частини ПЗ в асептичних умовах за методом (Korbutt G.S. et al., 1996). Отримана суспензія, після ферментативної обробки тканини ПЗ неонатальних тварин, містила поодинокі клітини (2-4 х 106 клітин/мл) та ОПЗ (2-6 х 105 ОПЗ/мл). Розподілення суспензії панкреатичних клітин та ОПЗ здійснювали в ступінчастому градієнті щільності фіколу (1,060; 1,070; 1,074; 1,076; 1,080 г/см3).

Верифікацію наявності інсуліну в культурах ОПЗ неонатальних тварин проводили при культивуванні, яке здійснювали протягом 8 діб за методом (Korbutt G.S. et al., 1996). Культури ОПЗ неонатальних тварин були переживаючими, тому що культивування проводили без факторів росту та антиоксидантів, які необхідні для проліферації клітин.

Вміст ОПЗ неонатальних тварин у середовищі культивування підраховували щодоби за допомогою камери Горяєва. Життєздатність ОПЗ неонатальних тварин визначали методом суправітального забарвлювання 0,1% трипановим синім (Меньшиков В.В., 1987). Для візуалізації інсулін-продукуючих в-клітин суспензію, отриману з ПЗ неонатальних тварин, забарвлювали розчином дитизону (100 мкг/мл) (Sorіa B., 2001). Морфологічні дослідження культур ОПЗ неонатальних тварин проводили під світловим мікроскопом при збільшенні х 20, х 40, х 60. Для визначення функціональної активності в-клітин ОПЗ неонатальних тварин in vitro оцінювали вміст інсуліну в середовищі культивування ОПЗ неонатальних тварин протягом 8 діб та при додаванні розчину глюкози 1,67 і 10 мМ концентрації за допомогою імуноферментного методу та стандартного набору ІNSULІN ELІSA KІТ (DRG Dіagnostіc, США).

Експериментальний ЦД викликали у кролів шляхом однократної внутрішньовенної ін'єкції розчину алоксану тетрагідрату з розрахунку 100 мг/кг маси тіла тварини. Алоксановий діабет є моделлю ІЗЦД, тому що алоксан призводить до надлишкової сенсибілізації по гуморальному шляху, сприяє активації перекисного окиснення ліпідів і продукції високореактивних метаболітів малонового альдегіду, вільних радикалів, що викликає оксидативну деструкцію клітинних мембран і прогресуючу загибель в-клітин ПЗ (Єльський В.М. та ін., 2007; West I., 2000). Для трансплантації були відібрані тварини, у яких вміст глюкози в крові був не нижче 19-20 ммоль/л (n=80). Трансплантацію ОПЗ неонатальних тварин проводили в стерильних умовах під комбінованою кетамін-ксилазиновою анастезією (1 мг кетаміну та 0,5 мг ксилазину на 1 кг маси тіла тварини). Перед трансплантацією суспензію ОПЗ неонатальних тварин відмивали та ресуспендували в середовищі 199, поміщали у шприц із розрахунку 1-2 х 106 ОПЗ/мл на одну тварину-реципієнта. Трансплантацію здійснювали: ін'єкція в портальну вену печінки ? 3 мл, паренхіму печінки ? 3 мл, селезінку ? 2 мл, сім'яник ? 3 мл, кістковий мозок ? 2 мл, під капсулу нирки ? 3 мл, в загальний кровоток (через вушну вену) ? 2 мл. Тварин спостерігали протягом 100 діб із моменту трансплантації. Контролем були групи тварин без і з експериментальним ЦД після псевдотрансплантації (ПТ), яким уводили середовище 199 в кожне з вищезазначених місць, при цьому об'єм уведеного розчину відповідав об'єму трансплантаційного матеріалу.

Вміст інсуліну в сироватці крові тварин визначали радіоімунологічним методом при використанні стандартного набору РІА-ІНС-ПГ-125І (Білорусь). Вміст глюкози в крові тварин контролювали при використанні індикаторних пластинок “Гемоглан” і глюкометра Глюкофот-ІІ. Концентрацію глюкози в сечі визначали за допомогою індикаторних пластинок “Глюкотест”. Тест толерантності до глюкози проводили шляхом внутрішньовенного введення розчину глюкози (0,5 г глюкози на 1 кг маси тіла тварини) (Фелиг Ф. и др., 1985).

Для візуалізації ОПЗ неонатальних поросят в організмі тварин-реципієнтів використовували неспецифічний флуоресцентний поліметиновий барвник DіOC18 в концентрації 5х10-6 моль. Досліджували DіOC18-мічені зразки за допомогою проточного цитофлуориметра BD Biosience FACS Calibrur та люмінесцентного мікроскопа Olympus IX-71.

Вміст загального та вільного білірубіну, креатиніну, альбуміну, активності ЛФ, АлАт, АсАт в сироватці крові тварин, а також активність б-амілази в середовищі культивування ОПЗ неонатальних тварин досліджували спектрофотометричним методом за допомогою тест-наборів (Філісіт-Діагностика, Україна) і ФЕК (КФК 2 - УХЛ 42), вміст гемоглобіну та фракції HbА1c в крові ? за допомогою стандартних наборів GHB 100 і HB 400 S (PLIVA Lachema, Чехія). Підрахунок кількості еритроцитів, лейкоцитів, тромбоцитів здійснювали в камері Горяєва, ретикулоцитів і сидероцитів - в мазках крові за стандартними методами, ШОЕ ? мікрометодом Панченкова, час згортання крові ? за методом Моравіца (Терентьева Э.И. и др., 1978).

Гістологічному та гістохімічному аналізу піддавали ПЗ тварин-реципієнтів і органи, в які здійснювали трансплантацію. Органи фіксували в 10%-му розчині нейтрального формаліну, за стандартною методикою заливали в парафін. Виготовлені на мікротомі зрізи тканини (5-7 мкм) забарвлювали гематоксиліном і еозином та досліджували під світловим мікроскопом. Гістохімічне дослідження зрізів тканини ПЗ та органів, в які здійснювали трансплантацію, для виявлення в-клітин ОПЗ проводили за методом Магера, використовуючи дитизон-вміщуючий розчин (Пирс Э., 1962). Мікрофотозйомку здійснювали на мікроскопі Olympus IX-71.

Статистичний аналіз результатів проводили з використанням t-критерію Стьюдента ? для кількісних нормально розподілених ознак та однофакторного дисперсійного аналізу (ANOVA) ? для непараметричних даних за допомогою пакета програм “Excel” з використанням функції описової статистики. Обробку микрофотографій здійснювали за допомогою програми “Fotoshop CS”.

Результати досліджень та їх обговорення

Вивчення структурно-функціональних властивостей острівців підшлункової залози неонатальних поросят і кролів іn vіtro. Дослідження структурно-функціональних властивостей ОПЗ, отриманих від неонатальних донорів віддаленої філогенетичної спорідненості (поросят і кролів), у різні строки культивування є актуальним і недостатньо вивченим питанням.

Щодоби протягом усього періоду культивування здійснювали підрахунок вмісту ОПЗ обох видів неонатальних тварин у культуральному середовищі, при цьому вміст ОПЗ неонатальних поросят (n=20) був вірогідно вище вмісту ОПЗ неонатальних кролів (n=20, p<0,05). Морфометричний аналіз культур ОПЗ неонатальних тварин показав, що ОПЗ неонатальних кролів прикріплювалися до дна культуральної чашки, а ОПЗ неонатальних поросят залишалися вільно флотуючими в живильному середовищі. Функціональним параметром життєздатної культури прийнято вважати здатність виключати з клітин суправітальний барвник (трипановий синій). Життєздатність ОПЗ неонатальних тварин на момент отримання суспензії становила 77-79% від загальної кількості ОПЗ (прийнятої за 100%). Однак з 6 доби в переживаючих культурах ОПЗ неонатальних тварин відмічалося зниження їх життєздатності, і на 8 добу даний показник складав 63-64%.

Одним з основних показників функціонального стану клітин-продуцентів є здатність до секреції гормонів (Дроздович І.І. та ін., 2003; ArRajab А. et al., 1991). Вміст інсуліну в переживаючих культурах ОПЗ неонатальних тварин був на досить високому рівні протягом 6 діб культивування (рис. 1, а).

На 1 добу культивування ОПЗ неонатальних поросят і кролів вміст інсуліну в живильному середовищі складав 13,27±1,18 і 20,30±1,68 мкМО/мл х 104 ОПЗ, відповідно (p<0,01), але з 7 доби було виявлено зниження даного показника на 20-25%, при цьому абсолютні значення вмісту інсуліну були вище в культурах ОПЗ неонатальних кролів у порівнянні з культурами ОПЗ неонатальних поросят (рис. 1, а).

При інкубації ОПЗ неонатальних тварин у живильному середовищі, що містить глюкозу 1,67 мМ концентрації, продукція інсуліну ОПЗ неонатальних поросят і кролів складала 9,93±2,73 і 16,60±3,06 мкМО/мл х 104 ОПЗ, відповідно (рис. 1, б). Отримані дані були контролем при оцінюванні здатності ОПЗ неонатальних тварин відповідати секрецією інсуліну на додавання розчину глюкози 10 мМ концентрації in vitro. Слід зазначити, що при додаванні в живильне середовище розчину глюкози 10 мМ концентрації вміст інсуліну в переживаючих культурах ОПЗ неонатальних поросят і кролів збільшувався та складав 98,78±6,99 і 119,08±11,74 мкМО/мл х 104 ОПЗ, відповідно (p<0,05) (рис. 1, б). Отже, використання розчину глюкози 10 мМ концентрації in vitro викликало адекватну секреторну відповідь ОПЗ обох видів неонатальних тварин.

У переживаючих культурах, отриманих із ПЗ неонатальних тварин, крім ОПЗ також були присутні поодинокі клітини, тому необхідно було провести дослідження активності панкреатичної б-амілази ? маркера ацинарних клітин (Nomura Y. et al., 1994). На 1 добу культивування ОПЗ неонатальних поросят і кролів у живильному середовищі активність б-амілази складала 155,69±14,88 і 151,06±15,64 мг/с·л, відповідно. Однак на 2 добу в культурах ОПЗ неонатальних поросят і кролів відзначалося підвищення активності б-амілази в 1,9 і 1,3 рази (p<0,05), що було зумовлено лізисом ацинарних клітин і виходом ферменту в живильне середовище, оскільки з 3 доби спостерігалося зниження активності б-амілази в переживаючих культурах ОПЗ неонатальних тварин. На 7-8 добу культивування ОПЗ неонатальних поросят і кролів даний показник знижувався до 4,75±1,50 і 4,36±1,67 мг/с·л, відповідно.

Наявність високої активності б-амілази в культурах ОПЗ неонатальних тварин на 1-4 добу культивування свідчить про присутність у культурах ацинарних клітин. У зв'язку з цим наступним етапом роботи стало розподілення у ступінчастому градієнті щільності фіколу суспензії панкреатичних клітин і ОПЗ. При градієнтному розподіленні ОПЗ неонатальних поросят були виявлені в інтерфазі фіколу з щільністю 1,070-1,074 г/см3, а ОПЗ неонатальних кролів ? 1,060-1,070 г/см3. Відомо, що дитизон дозволяє ідентифікувати інсулін-продукуючі клітини, оскільки здатен селективно зв'язувати цинк, забарвлюючи гранулярний апарат в-клітин ОПЗ в пурпурно-червоний колір (Chіng C.D. et al., 2001; Shіroі A. et al., 2002). Забарвлювання розчином дитизону клітинних фракцій, отриманих в інтерфазі фіколу 1,070-1,074 г/см3 (для неонатальних поросят) та 1,060-1,070 г/см3 (для неонатальних кролів), на момент одержання та на 4 добу культивування виявило велику кількість дитизон-забарвлених клітин та ОПЗ, що свідчило про наявність інсуліну в в-клітинах.

Таким чином, ОПЗ неонатальних поросят і кролів можуть бути використані при трансплантації з метою заміщення втраченої ендокринної функції ПЗ в організмі тварин з експериментальним ЦД.

Ало- і ксенотрансплантація острівців підшлункової залози неонатальних тварин у різні тканини організму кролів з експериментальним цукровим діабетом. АлТц і КсТц ОПЗ неонатальних тварин в різні тканини організму здійснювали на 21 добу після введення кролям діабетогенної дози розчину алоксану. Близько 30% кролів загинуло в результаті гіпо- або гіперглікемічної коми у посталоксановий період. Слід зазначити, що 10% загибель кролів відмічалася на 1 добу після трансплантації ОПЗ неонатальних тварин у портальну вену печінки та кістковий мозок і була пов'язана з внутрішньою кровотечею.

З метою оцінки нормалізації показників вуглеводного обміну у кролів з експериментальним ЦД після АлТц і КсТц ОПЗ неонатальних тварин досліджували вміст глюкози в крові та сечі, фракції HbА1c в крові та проводили тест толерантності до глюкози, а також визначали вміст інсуліну в сироватці крові.

Вміст глюкози в крові інтактних тварин складав 5,95±0,50 ммоль/л (рис. 2). У тварин незалежно від місця ПТ протягом усього періоду спостереження вміст глюкози складав 5,71±0,70 ммоль/л (n=15), а у кролів з експериментальним ЦД після ПТ ? 23,65±2,24 ммоль/л (n=15, р<0,01). Прискорену динаміку зниження вмісту глюкози в крові кролів реєстрували на 7 добу після АлТц і КсТц ОПЗ неонатальних тварин у селезінку (рис. 2). Після АлТц і КсТц ОПЗ неонатальних тварин інтрапортально (n=14), у паренхіму печінки (n=14), кістковий мозок (n=10) і під капсулу нирки (n=10) зниження вмісту глюкози в крові тварин-реципієнтів до нормальних значень спостерігалося на 14 добу, а у сім'яник (n=10) ? на 20 добу. У випадку внутрішньовенного введення ало- та ксеногенних ОПЗ неонатальних тварин вміст глюкози в крові кролів не нормалізувався протягом усього періоду спостереження (98 діб) (n=8, p<0,01). Слід зазначити, що вірогідних відмінностей між вмістом глюкози в крові кролів після АлТц і КсТц ОПЗ неонатальних тварин не було виявлено, тому на рис. 2 представлені значення вмісту глюкози в крові кролів після інтрапортальної і внутрішньоселезінкової КсТц ОПЗ неонатальних тварин, оскільки тільки після введення ОПЗ в ці тканини організму спостерігалося тривале зниження даного показника до нормальних значень. Після КсТц і АлТц ОПЗ неонатальних тварин у паренхіму печінки на 28-35 добу, сім'яник і під капсулу нирки на 35-42 добу, кістковий мозок на 56 добу було виявлено повторне підвищення вмісту глюкози в крові (р<0,01), і на 98 добу цей показник складав 15-19 ммоль/л у даних груп тварин (р<0,01). Після інтрапортальної АлТц і КсТц ОПЗ неонатальних тварин протягом 49 діб вміст глюкози в крові тварин-реципієнтів вірогідно не відрізнявся від значень інтактного контролю, після чого відзначалося підвищення даного показника до 9,58±0,68 і 9,88±0,50 ммоль/л, а на 98 добу ? 11,83±0,18 і 11,73±0,38 ммоль/л, відповідно (р<0,01). У кролів після АлТц і КсТц ОПЗ неонатальних тварин у селезінку підтримання вмісту глюкози в крові в межах нормальних значень зберігалося протягом 70 діб, після чого даний показник підвищувався, але не перевищував 9 ммоль/л протягом наступного періоду спостереження (р<0,01) (рис. 2). Динаміка вмісту глюкози в сечі кролів з експериментальним ЦД після АлТц і КсТц ОПЗ неонатальних тварин в різні тканини організму була схожа зміненню вмісту глюкози в крові. Слід зазначити, що тільки після АлТц і КсТц ОПЗ неонатального походження у селезінку глюкоза в сечі тварин-реципієнтів не виявлялася протягом усього періоду спостереження (98 діб).

Одним із показових методів виявлення прихованих порушень вуглеводного обміну, а також способів функціональної оцінки ОПЗ в посттрансплантаційний період є тест толерантності до глюкози (ТТГ) (Bernard C. et al., 1998). У тварин інтактних і після ПТ при проведенні ТТГ була отримана класична глікемічна крива з піком на 30 хвилині та зниженням вмісту глюкози в крові до початкового рівня на 90 хвилині після внутрішньовенного введення розчину глюкози. Кролям після внутрішньовенного введення ало- та ксеногенних АлТц і КсТц ОПЗ неонатальних тварин та з експериментальним ЦД після ПТ ТТГ не проводили, тому що у даних груп тварин вміст глюкози в крові перевищував нормальні значення в 4-5 рази (р<0,01). ТТГ проводили на 90 добу посттрансплантаційного періоду, при цьому глікемічні криві після АлТц і КсТц ОПЗ неонатальних тварин у селезінку і портальну вену печінки змінювалися подібно інтактним тваринам, хоча вміст глюкози в крові був підвищений (р<0,01). Після АлТц і КсТц ОПЗ неонатальних тварин у паренхіму печінки, кістковий мозок, сім'яник і під капсулу нирки глікемічні криві мали згладжений вигляд з розтягнутою в часі постглікемічною фазою, що підтверджувало наявність порушень у вуглеводному обміні тварин-реципієнтів.

На теперішній час при діагностиці та лікуванні ІЗЦД велика увага приділяється оцінці вмісту фракції HbА1c, що має пряму кореляцію з концентрацією глюкози в крові та тривалістю ?стикання? глюкози з еритроцитами, а також відображає ступінь контроля за глікемією та станом вуглеводного обміну протягом останніх 3-4 місяців (Krіshamurtі U. et al., 2001). У тварин інтактних і після ПТ (n=15) вміст фракції HbA1c в крові складав 1,62±0,23 і 1,45±0,45% від загального гемоглобіну. На 91 добу після введення діабетогенної дози розчину алоксану у кролів з експериментальним ЦД без і після ПТ вміст фракції HbA1c в крові складав 11,25±0,55 і 11,05±1,53% (n=15, р<0,05), що свідчило про розвиток метаболічних порушень. Слід зазначити, що на момент АлТц і КсТц ОПЗ неонатальних тварин у кролів з експериментальним ЦД вміст фракції HbA1c в крові складав 3,17±0,24% (р<0,05). На 91 добу тільки у кролів після АлТц і КсТц ОПЗ неонатальних тварин у селезінку вміст фракції HbA1c в крові вірогідно не відрізнявся від інтактних тварин і складав 1,44±0,35 і 1,82±0,71%, відповідно, що свідчило про нормалізацію вуглеводного обміну. Після АлТц і КсТц ОПЗ неонатальних тварин інтрапортально вміст фракції HbA1c в крові кролів був вище відносно контрольних тварин в 2,1 і 2,4 (р<0,05), у паренхіму печінки - в 3,4 і 4,4 (р<0,05), кістковий мозок - в 2,6 і 3,4 (р<0,05), сім'яник - в 3,5 і 4,1 (р<0,05), під капсулу нирки - в 3,4 і 3,6 (р<0,05), внутрішньовенно - в 6,1 і 7,2 рази (р<0,05), відповідно (рис. 3).

Протягом 98 діб у тварин інтактних і після ПТ вміст інсуліну в сироватці крові складав 18,19±1,81 і 17,96±1,48 мкМО/мл, а у тварин з експериментальним ЦД без і після ПТ ? 2,06±0,45 і 2,08±0,57 мкМО/мл (р<0,05), відповідно. На 7 добу після КсТц ОПЗ неонатальних тварин у селезінку вміст інсуліну в сироватці крові кролів складав 44,64±3,41 мкМО/мл (р<0,05), а на 98 добу ? вірогідно не відрізнявся від контрольних значень (17,69±0,83 мкМО/мл). У кролів на 7 добу після інтрапортальної КсТц ОПЗ неонатальних тварин вміст інсуліну в сироватці крові складав 17,70±1,21 мкМО/мл, а з 14 по 49 добу підвищувався до 24,81±1,46 мкМО/мл, після чого повторно знижувався до контрольних значень. На 14-21 добу у кролів після КсТц ОПЗ неонатальних тварин у паренхіму печінки, кістковий мозок, сім'яник і під капсулу нирки відзначалося підвищення вмісту інсуліну в сироватці крові, але з 35-42 доби даний показник поступово знижувався. Внутрішньовенне введення ксеногенних ОПЗ неонатального походження протягом 98 діб не дозволяло нормалізувати вміст інсуліну в сироватці крові тварин-реципієнтів.

Проведення структурно-функціонального дослідження (гістологічний аналіз) тканини органів, в які здійснювали АлТц і КсТц ОПЗ неонатальних тварин, на 100 добу показало тільки в селезінці присутність острівцевоподібних структур, а також структур, які утримували волокна сполучної тканини та поодинокі клітини. Гістохімічний аналіз (забарвлювання дитизон-вміщуючим розчином) тканини селезінки також дозволив ідентифікувати острівцевоподібні структури, клітини яких вміщували дитизонат цинку у вигляді пурпурно-червоної зернистості. В якості негативного контролю було використано тканину селезінки інтактного кроля, при цьому забарвлювання даного препарату дитизон-вміщуючим розчином не виявило пурпурно-червоної зернистості. Позитивний контроль гістохімічної реакції на виявлення інсуліну в клітинах показав наявність дитизон-забарвлених ОПЗ у зрізах тканини ПЗ інтактного кроля. Структурно-функціональне дослідження (гістологічний аналіз) показало наявність дегенеративно-дистрофічних змін в тканині ПЗ кролів з експериментальним ЦД та після АлТц і КсТц ОПЗ неонатальних тварин у паренхіму печінки, кістковий мозок, сім'яник, під капсулу нирки та в загальний кровоток (через вушну вену). Але, слід зазначити, що після АлТц і КсТц ОПЗ неонатальних тварин у портальну вену печінки та селезінку в ендокринній тканині ПЗ тварин-реципієнтів були відсутні дегенеративно-дистрофічні зміни. Отже, тривале зниження вмісту глюкози в крові кролів після інтрапортальної і внутрішньоселезінкової АлТц і КсТц ОПЗ неонатальних тварин, можливо, було пов'язано з частковим відновленням ендокринної тканини власної ПЗ тварин-реципієнтів, а також з функцією трансплантата.

Таким чином, вибір тканини в організмі реципієнта для трансплантації ОПЗ неонатальних тварин є важливим. При проведенні трансплантації ОПЗ неонатальних тварин необхідно враховувати специфічні особливості регуляції і метаболізму трансплантаційного матеріалу, а також імунобіологічні властивості органа, в який буде здійснена трансплантація. Найкращі результати щодо тривалості підтримання в межах нормальних значень вмісту глюкози та інсуліну в крові, стимулювання на тлі сенсибілізації процесів часткового відновлення пула в-клітин в ендокринній тканині ПЗ тварин-реципієнтів були отримані після АлТц і КсТц ОПЗ неонатального походження в селезінку і печінку (через портальну вену).

Використання флуоресцентного барвника DіОС18 для ідентифікації трансплантата в організмі тварин-реципієнтів. Використання флуоресцентних барвників є простим і надійним способом ідентифікації клітинних трансплантатів в організмі реципієнта шляхом флуоресцентної мікроскопії або проточної цитофлуориметрії (Mellody C. et al., 2007). Для візуалізації та спостереження за функцією транплантата ми маркерували ОПЗ неонатальних поросят неспецифічним флуоресцентним поліметиновим барвником DіОС18. DіОС18-мічені ОПЗ неонатальних поросят на 21 добу були введені в праву долю печінки та селезінку кролів з експериментальним ЦД, після чого спостерігалося поступове зниження вмісту глюкози в крові до нормальних значень. На 21 добу після КсТц DіОС18-мічених ОПЗ неонатальних тварин кролям була виконана часткова гепатектомія та тотальна спленектомія (С/е), що призводило до підвищення вмісту глюкози в крові тварин-реципієнтів. Контрольним тваринам також була виконана часткова гепатектомія та тотальна С/е, але подібного ефекту не спостерігалось.

Вилучену тканину печінки і селезінки обробляли колагеназою і розділяли в градієнті щільності фіколу. Цитофлуориметричний аналіз суспензій, отриманих із фрагмента печінки та селезінки, показав наявність в інтерфазі фіколу з щільністю 1,070-1,074 г/см3 2,3% (рис. 4, а) та 0,6% (рис. 4, б), відповідно, об'єктів, які мають зелену флуоресценцію, при цьому флуоресцентна мікроскопія показала наявність острівцевоподібних структур.

Отже, наявність острівцевоподібних структур в печінці та селезінці кролів на 21 добу після КсТц свідчила про те, що зниження вмісту глюкози в крові тварин-реципієнтів на даному етапі відбувається внаслідок функції трансплантованих ОПЗ неонатальних поросят.

Вивчення впливу ксенотрансплантації острівців підшлункової залози на функції печінки та селезінки тварин-реципієнтів. Згідно отриманим нами даним КсТц ОПЗ неонатальних тварин в портальну вену печінки та селезінку дозволяє протягом тривалого часу підтримувати в межах нормальних значень вміст глюкози та інсуліну в крові, а також сприяє частковому відновленню ендокринної тканини ПЗ тварин-реципієнтів, але при цьому нез'ясованим залишилося питання про вплив уведення ОПЗ неонатальних поросят шляхом ін'єкції на стан органів. У зв'язку з цим були вивчені функціональні показники, які відображають стан печінки та селезінки, у кролів після інтрапортальної та внутрішньоселезінкової КсТц ОПЗ неонатальних тварин.

Вплив інтрапортальної ксенотрансплантації острівців підшлункової залози на функціональний стан печінки. Для ідентифікації дисфункції печінки після інтрапортальної КсТц ОПЗ неонатальних тварин протягом 91 доби було проведено дослідження динаміки вмісту загального та вільного білірубіну, креатиніну, альбуміну, активності ЛФ, АлАт, АсАт в сироватці крові тварин-реципієнтів, які відображають функціональний стан печінки та дозволяють оцінити ступінь тяжкості та відновлення супутніх метаболічних порушень (Маршалл В.Дж., 2000; Barshes N.R. et al., 2005; Hyon S.H. et al., 2004). У інтактних тварин вміст загального та вільного білірубіну складав 9,70±0,37 мкмоль/л і 11,95±1,35%, креатиніну ? 8,17±0,36 мг/мл, альбуміну ? 46,39±1,26 мг/мл, активність ЛФ ? 2468,11±56,75 нмоль/с•л, АлАт ? 0,54±0,04 мкмоль/год•мл і АсАт ? 0,49±0,03 мкмоль/год•мл. У тварин після ПТ (n=6) всі досліджувані показники вірогідно не відрізнялися від інтактних тварин, а у кролів з експериментальним ЦД після ПТ вміст загального та вільного білірубіну в 1,8 і 2,5, креатиніну в 2,2, активності ЛФ в 2,2, АлАт в 2,6, АсАт в 3,4 рази були вище відносно значень інтактного контролю (n=6, р<0,01).

До інтрапортальної КсТц ОПЗ неонатальних тварин вміст загального та вільного білірубіну в сироватці крові тварин-реципієнтів в 1,7 та 2,2, креатиніну в 1,6, активності ЛФ в 2,2, АлАт в 2,6 та АсАт в 3,3 рази були вище відносно контрольних значень (n=8, р<0,01). На 7 добу посттрансплантаційного періоду вищезазначені показники функції печінки вірогідно не відрізнялися від значень інтактного контролю, залишаясь в межах нормальних значень протягом 70 діб, але з 77 доби після КсТц ОПЗ неонатальних тварин спостерігалося повторне підвищення в сироватці крові тварин-реципієнтів вмісту загального та вільного білірубіну в 1,2 і 1,3, креатиніну в 1,2 (рис. 5, а), активності ЛФ в 1,2 (рис. 5, а), АлАт в 1,2 (рис. 5, б) та АсАт в 1,4 рази (рис. 5, б) відносно контрольних значень (n=8, р<0,01).

Вміст альбуміну в сироватці крові кролів до інтрапортальної КсТц ОПЗ неонатальних тварин був в 1,4 рази (n=8, р<0,01) нижче значень, встановлених для інтактного контролю. На 7 добу після КсТц ОПЗ неонатальних тварин у портальну вену печінки відзначалося підвищення даного показника до значень інтактних тварин, залишаючись в межах контрольних значень протягом 70 діб, що свідчило про відновлення білоксинтезуючої функції печінки, але з 77 доби посттрансплантаційного періоду спостерігалося повторне зниження вмісту альбуміну в сироватці крові тварин-реципієнтів, і на 91 добу даний показник складав 39,50±0,75 мг/мл. У кролів після ПТ вміст альбуміну в сироватці крові складав 45,71±0,82 мг/мл, а у тварин з експериментальним ЦД після ПТ був нижче в 1,5 рази відносно контрольних значень (n=6, р<0,01).

Таким чином, нормалізація вмісту загального та вільного білірубіну, креатиніну, альбуміну, активності ЛФ, АлАт і АсАт в сироватці крові тварин-реципієнтів з 7 по 70 добу посттрансплантаційного періоду свідчила про те, що інтрапортальна КсТц ОПЗ неонатальних тварин на даному строці не викликала ускладнень функції печінки та сприяла відновленню супутніх метаболічних порушень.

Вплив внутрішньоселезінкової ксенотрансплантації острівців підшлункової залози на функціональний стан селезінки. Відомо, що атрофія та некроз селезінки, а також С/е супроводжуються розвитком еритроцитозу, лейкоцитозу, тромбоцитозу, ретикулоцитозу, появою патологічних форм еритроцитів і порушенням білкового обміну (Смирнова Т.С. и др., 1993), тому для вивчення впливу КсТц ОПЗ неонатальних тварин на функціональний стан селезінки тварин-реципієнтів протягом 91 доби посттрансплантаційного періоду було проведено дослідження кількості форменних елементів крові, ШОЕ, часу згортання крові, наявності сидероцитів, вмісту білірубіну та гемоглобіну в крові. Тварин з експериментальним ЦД, яким здійснювали тотальну С/е, використовували як модель патології функції селезінки.

При дослідженні кількості еритроцитів, лейкоцитів, тромбоцитів, ретикулоцитів у кролів на 3 добу після внутрішньоселезінкової КсТц ОПЗ неонатальних тварин було встановлено незначне її збільшення, пов'язане з оперативним втручанням, тому що з 7 доби вищезазначені показники відновлювалися до нормальних значень, вірогідно не відрізняясь від значень інтактного контролю протягом усього наступного періоду спостереження. У кролів інтактних і після внутрішньоселезінкової КсТц ОПЗ неонатальних тварин сидероцити не були виявлені. Слід зазначити, що у кролів після тотальної С/е спостерігалося вірогідне збільшення кількості еритроцитів ? в 1,4, лейкоцитів ? в 1,4, тромбоцитів ? в 1,9, ретикулоцитів ? в 9,5 рази відносно контрольних тварин (n=5, р<0,05), і на 35 добу в мазках крові виявлялися сидероцити.

Вміст загального білірубіну в сироватці крові кролів з експериментальним ЦД був в 1,5 рази вище (n=8, р<0,01) відносно контрольних значень (9,29±0,61 мкмоль/л), але з 7 доби після КсТц ОПЗ неонатальних тварин у селезінку та весь наступний період даний показник у тварин-реципієнтів вірогідно не відрізнявся від значень інтактного контролю (рис. 6). У С/е кролів вміст білірубіну в сироватці крові в 1,6 рази перевищував значення інтактного контролю протягом 91 доби (n=5, р<0,01).

Після КсТц ОПЗ неонатальних тварин у селезінку вміст гемоглобіну в крові кролів вірогідно не відрізнявся відносно контрольних значень (128,29±1,85 г/л ) протягом 91 доби (рис. 6). На 3 добу після тотальної С/е у кролів спостерігалося зниження вмісту гемоглобіну в крові в 1,7 рази (р<0,01) відносно контрольних значень, і на 91 добу даний показник складав 95,28±1,96 г/л (n=5, р<0,01)

У кролів з експериментальним ЦД ШОЕ перевищувала в 1,5 рази (р<0,01) значення інтактних тварин (1,7±0,2 мм/год). На 3 добу після КсТц ОПЗ неонатальних тварин у селезінку відзначалося збільшення ШОЕ у тварин-реципієнтів до 3,3±0,3 мм/год (n=8, р<0,01), але з 7 доби спостерігалося зниження даного показника до контрольних значень (рис. 7). У кролів з експериментальним ЦД на 3 добу після тотальної С/е відзначалося збільшення в 3,5 рази ШОЕ (6,5±0,5 мм/год) відносно значень інтактного контролю (р<0,01), але з 7 по 91 добу спостереження ШОЕ поступово знижувалася до 3,4±0,5 мм/год (n=5, р<0,01).

Час згортання крові на 3 добу у кролів після КсТц ОПЗ неонатальних тварин у селезінку скорочувався в 2,5 рази (n=8, р<0,01) відносно інтактного контролю, що було пов'язано з оперативним втручанням, оскільки з 7 доби даний показник збільшувався та протягом наступного періоду складав 3,9±0,2 хв. (рис. 7). У С/е тварин на 3 добу після оперативного втручання час згортання крові скорочувався в 2,9 рази (р<0,01) відносно значень інтактних тварин (4,0±0,2 хв.), і на 91 добу складав 3,3±0,2 хв. (n=5, р<0,01).

Отже, внутрішньоселезінкова КсТц ОПЗ неонатальних тварин з 7 по 91 добу не викликала посттрансплантаційних ускладнень функції селезінки та сприяла зниженню та підтриманню в межах нормальних значень вмісту загального білірубіну в сироватці крові та ШОЕ у тварин-реципієнтів.

ВИСНОВКИ

У дисертаційній роботі представлено дані щодо тканиноспецифічного впливу трансплантації ОПЗ неонатальних поросят і кролів на показники вуглеводного обміну (вміст глюкози в крові та сечі, фракції HbA1c в крові, тест толерантності до глюкози) та тканину ПЗ кролів з експериментальним ЦД. Виявлено зміни функціональних показників (вміст білірубіну, креатиніну, альбуміну, активність ЛФ, АлАт, АсАт в крові, кількість форменних елементів крові, ШОЕ, час згортання крові), які відображають стан органів і наявність відновлення метаболічних порушень в організмі кролів з експериментальним ЦД після трансплантації ОПЗ неонатальних поросят.

1. В переживаючих культурах ОПЗ неонатальних поросят і кролів зберігалися функціональні властивості, які виявлялись у здатності до секреції інсуліну в середовище культивування, при цьому абсолютні значення вмісту інсуліну були вище в культурі ОПЗ неонатальних кролів. Тривале культивування (більше 6 діб) сприяло зниженню вмісту інсуліну в переживаючих культурах ОПЗ неонатальних поросят і кролів.

2. Період підтримання вмісту глюкози в крові тварин-реципієнтів в межах нормальних значень залежить від тканини, в яку здійснювали трансплантацію ОПЗ неонатальних поросят і кролів, при цьому видових відмінностей не було виявлено. Тривалість нормалізації вмісту глюкози в крові кролів після трансплантації ОПЗ неонатальних поросят і кролів у паренхіму печінки була нижче на 35-42%, у сім'яник та під капсулу нирки на 28-35%, у портальну вену печінки на 21%, у кістковий мозок на 14% відносно максимального строку нормалізації даного показника (70 діб) у кролів після трансплантації ОПЗ неонатальних поросят і кролів у селезінку. Нормалізації вмісту глюкози в крові не було виявлено у кролів після введення ОПЗ неонатальних поросят і кролів у загальний кровоток (через вушну вену).

3. Зниження вмісту фракції HbA1c в крові (на 91 добу) та глюкози в сечі (з 7 по 98 добу) до нормальних значень спостерігалося тільки у тварин-реципієнтів після трансплантації ало- та ксеногенних ОПЗ неонатального походження в селезінку.