Генетичний поліморфізм свиней породи велика біла за молекулярними і цитогенетичними маркерами

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Генетичний поліморфізм свиней породи велика біла за молекулярними і цитогенетичними маркерами

Автореферат

дисертації на здобуття вченого ступеня кандидата біологічних наук

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Однією з передумов високої економічної ефективності тваринництва є удосконалення генетичного потенціалу порід.

Генні мутації у сільськогосподарських тварин можуть бути як патологічними, так і господарсько-корисними, що зумовлюють, наприклад, стресостійкість у свиней, м'язову гіпертрофію у великої рогатої худоби, багатоплідність у свиней та овець, резистентність до колібактеріозів тощо (M.F. Rothschild et.al., 1995; В.И. Глазко та ін, 2001; R.D. Houston, N.D. Cameron, K.A. Rance, 2004). Володіння інформацією про спадковість тварини дає змогу вести селекцію для швидкого поліпшення конкретних економічно важливих якостей, а визначення генотипу за локусами кількісних ознак (Quantitative Trait Loci - QTL) - передбачати господарську цінність тварини, її генетичний потенціал у ранньому віці (В.Н. Балацкий, Е.Н. Метлицкая 2001; Г.Е. Сулимова, 2002; И.П. Шейко, Т.И. Епишко 2006; В.П. Буркат, С.І. Ковтун, К.В. Копилова, К.В. Копилов, 2008).

У 1994 році в США та розвинутих європейських країнах було запроваджено програму селекції за допомогою генетичних маркерів (Marker-assisted selection, MAS), тобто формування племінного ядра за результатами тестування племінних тварин. В Україні, згідно Закону «Про племінну справу в тваринництві» (2003 рік) генетична експертиза походження та аномалій племінних тварин виступає невід'ємним заходом. Проте, сьогодні в Україні відсутні цілісні підходи до оцінки та використання генофондів порід свиней із застосуванням молекулярно-генетичних та цитогенетичних маркерів. Оскільки, показники продуктивності тварин асоційовані з генами господарсько корисних ознак, актуальним є питання підбору оптимальних поліморфних маркерних систем для впровадження їх у практику селекційної роботи і оцінки генетичної структури порід свиней.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Роботу виконано відповідно до напрямку наукових досліджень відділу молекулярно-діагностичних досліджень Української лабораторії якості і безпеки продукції АПК Національного університету біоресурсів і природокористування України за темами «Вплив генів-кандидатів на господарсько-цінні якості свині свійської» (номер держреєстрації ДР 0107U007936), «Розробка та застосування ДНК-технологій в АПК та природоохоронній сфері для контролю якості і безпеки продукції біологічного походження» (ДР 110/22-л-пр) та за допомоги Чеського наукового фонду №523/03/H076 у молекулярно-діагностичній лабораторії в Аграрному університеті ім. Менделя в м. Брно (Чехія).

Мета і завдання дослідження. Метою досліджень є аналіз і оцінка внутрішньопородного поліморфізму свиней породи велика біла за генами, асоційованими з господарсько корисними ознаками і цитогенетичними показниками.

Для реалізації поставленої мети в роботі вирішувались наступні завдання:

- вивчити внутрішньопородні особливості поліморфізму свиней великої білої породи за генами репродуктивних якостей: ESR (ген рецептору естрогену), PRLR (ген рецептору пролактину), FSHB (ген фолікулостимулюючого гормону в);

- дослідити особливості поліморфізму структурних генів, асоційованих з показниками приросту живої маси: MYF4 (ген міогенін фактору), MYOD1 (ген фактору, що детермінує ріст міобластів), MC4R (ген меланокортин4-рецептору), CMyc (ген міогенез-, адипогенез-, фолікулогенезфактору);

- провести дослідження внутрішньопородних особливостей тварин за маркерами резистентності до колібактеріозів FUT1 (ген фукозилтрансферази 1), MUC4 (ген муцин 4), та стрес-чутливості RYR (ген рианодин рецептору);

- порівняти особливості розподілу алельних вapiaнтів генів і вплив генотипу на формування господарсько корисних ознак у тварин, які мають різне походження та відтворюються в господарствах з різними умовами утримання;

- оцінити залежність кількісних показників плідності і приросту живої маси від алельних варіантів генів на прикладі естроген- і меланокортин4-рецепторів;

- розробити експрес тест-систему для тестування племінних тварин за генами естроген- і меланокортин4-рецепторів;

- провести цитогенетичний аналіз свиней великої білої породи.

Об'єкт досліджень: поліморфізм генів, асоційованих з господарсько корисними ознаками та мінливість цитогенетичних показників у свиней великої білої породи.

Предмет досліджень: генетична структура великої білої породи свиней за генами ESR, PRLR, FSHB, MYF4, MYOD1, MC4R, CMyc, FUT1, MUC4, RYR та її цитогенетична характеристика за кількістю лімфоцитів з мікроядром, двоядерних лімфоцитів, апоптозних клітин і клітин, що діляться.

Методи досліджень: молекулярно-генетичні - екстракція нуклеїнової кислоти, визначення чистоти та концентрації ДНК, ампліфікація фрагментів ДНК методом сайт-специфічної полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) з наступним рестриктним аналізом (метод ПЛР-ПДРФ, (поліморфізм довжин рестриктних фрагментів)), метод горизонтального електрофорезу ДНК в агарозному гелі; цитогенетичні - культивування лімфоцитів крові, отримання цитогенетичних препаратів, цитогенетичний аналіз, ветеринарні методи - відбір крові шляхом пункції ретробульбарного синусу ока та вени вуха, відбір волосяних фолікулів; статистичні - обробка експериментальних даних із застосуванням сучасних комп'ютерних програм, розробка діагностичних наборів для генотипування свиней за генами, які детермінують господарсько корисні ознаки.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведено генетичний аналіз популяцій свиней великої білої породи в Україні одночасно за 10 генами, які детермінують господарсько корисні ознаки та за цитогенетичними показниками. Визначено генетичну структуру великої білої породи свиней за генами, асоційованими з репродуктивними показниками, показниками приросту живої маси, резистентністю до колібактеріозів та стрес-стійкістю. Встановлено доповнюючу дію обох генів естроген- і пролактин-рецепторів на репродуктивні якості свиноматок. Розроблено експрес тест-систему ДНК-діагностики племінних свиней за комплексом двох генів господарсько корисних ознак, які контролюють показники приросту живої маси та репродуктивну функцію.

Практичне значення одержаних результатів. Використання результатів генетичного аналізу свиней великої білої породи дає можливість підвищити ефективність селекційного процесу шляхом добору, який спрямовано на відтворення тварин бажаних генотипів.

Отримані результати досліджень, пропозиції і висновки було використано для написання методичних рекомендацій «ДНК-ідентифікація свині свійської» та збірника задач з генетики з дисципліни «Генетика тварин з основами біометрії». Результати популяційного аналізу використовують в Національному університеті біоресурсів і природокористування України при викладанні навчальних дисциплін: «Ветеринарна генетика», «Генетика тварин з основами біометрії».

Особистий внесок здобувача. Разом з науковим керівником визначені напрям досліджень, методологічні підходи та схема досліджень. Викладені у дисертаційній роботі результати експериментальних досліджень отримані особисто автором або за його безпосередньої участі. Дисертантом особисто опрацьовані першоджерела літератури, проведено аналіз та інтерпретацію одержаних результатів, статистичну обробку результатів досліджень, сформульовано висновки та практичні пропозиції. Із загальних наукових експериментів та публікацій дисертант використав тільки свою частину результатів.

Автор виражає щиру подяку науковому керівнику С.О. Костенко, завідувачу відділом МДД УЛЯБП АПК В.Г. Спиридонову за методичну допомогу у молекулярно-генетичному аналізі, плануванні дослідницької роботи та створенні тест-системи, завідуючій відділом генетики Інституту Розведення і генетики тварин К.В. Копиловій за можливість приготування та аналізу цитогенетичних препаратів, головним зоотехнікам ВАТ агрокомбінату «Калита» В.О. Донцю, ВАТ «Маки» О.П. Щербині та головному зоотехніку-селекціонеру СП ТОВ «Нива Переяславщини» С.Г. Маскевич, рецензентам В.І. Шереметі, Н.В. Тряпіциній, В.А. Малієнко, І.О. Супрун.

Апробація роботи. Результати дисертаційної роботи доповідались автором на науково-практичних конференціях та наукових семінарах Національного університету біоресурсів і природокористування України (2005-2009 рр., м. Київ), конференціях молодих вчених та аспірантів Інституту розведення та генетики тварин УААН (2006-2008 рр., с. Чубинське Київської обл.), Міжнародній конференції «Золоте порося 2006» (с. Майське Дніпропетровської обл., Агро-союз), ІІ Міжнародній науково-практичній конференції «Екотрофологія-міст у майбутнє харчування людини» (2007 р., 2009 р., м. Біла Церква), VIII та ІХ З'їздах українського товариства генетиків і селекціонерів ім. Вавилова (2007, 2008 рр., м. Алушта), V міжнародному конгресі спеціалістів ветеринарної медицини (2007 р., м. Київ), Міжнародній літній школі в університеті ім. Гумбольда (2007 р., м. Берлін, Німеччина), науковому семінарі Аграрного університету (2008 р., м. Ханчжоу, Китай).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 15 наукових праць (з них 4 одноосібних), у тому числі 7 статей у фахових виданнях, 5 тез доповідей на конференціях та 2 методичні рекомендації.

Структура та обсяг роботи. Дисертація складається зі вступу, трьох розділів, висновків, списку використаної літератури, 5 додатків та 2 рекомендацій виробництву. Робота містить 133 сторінки основного тексту, список літератури складається з 162 найменувань, з них 105 зарубіжних авторів, 5 додатків. Загальний обсяг дисертації - 160 сторінок комп'ютерного тексту і включає 54 таблиці, 29 рисунків.

Основний зміст роботи

поліморфізм свиня ген

Матеріали і методи досліджень

Основні дослідження за ДНК - та цитогенетичними маркерами виконувалися на генетичному матеріалі Sus scrofa, L. (свині свійської) великої білої породи. Загальну схему досліджень представлено на рисунку 1. Проведено аналіз генетичного поліморфізму свиней великої білої породи в Україні за допомогою молекулярно-генетичних та цитогенетичних маркерів (табл. 1-3). З метою виявлення особливостей генетичної структури свиней української популяції породи велика біла, за генами асоційованими з репродуктивними якостями, показниками приросту живої маси, резистентністю до колібактеріозів та стрес-стійкістю, проведено аналіз генетичної структури різних груп (популяцій) за 10 локусами господарсько корисних ознак. Досліджувані групи свиней великої білої породи відрізнялись за походженням та умовами утримання: 1) тварини місцевої селекції: група І - господарство ВАТ «Маки»*; с. Макіївка, Білоцерківського р-ну Київської обл.; група ІV - ДСПГ «Христинівське» УААН*, Христинівський р-н Черкаської обл.; група V - господарство с. Яблунівка*, Фастівського р-ну Київської обл. (матеріал відібрано при плановому забої тварин на «Київському птахокомбінаті»); 2) данської селекції: група ІІ - СП ТОВ «Нива Переяславщини», Переяслав-Хмельницького району Київської обл.; 3) англійської селекції: група ІІІ - ВАТ агрокомбінат «Калита», Броварського району Київської області.

За геном ESR досліджено 123 тварини, 60 тварин за генами PRLR, FSHB, MYF4 і RYR, 59 - за генами CMyc, MUC4 і FUT1, та 115 і 105 за генами MYOD1 і MC4R відповідно (табл. 1).

Обсяг досліджень за маркерами господарсько корисних якостей свиней

Визначали показники живої маси, довжину тіла, висоту в холці, товщину шпика та генотипи племінних свиноматок і кнурів, з якими їх спаровували. У піддослідних свиноматок визначалась кількість опоросів за рік, кількість поросят за опорос і за рік, серед них живих та мертвих, жива маса новонароджених поросят.

Проведені цитогенетичні дослідження 38 тварин (табл. 2). Всього проаналізовано 114 тисяч клітин тимчасових культур лімфоцитів (три тис. клітин від кожної тварини).

Досліджені групи свиней за цитогенетичними показниками

Відбір біоптату проводився з використанням стерильного (одноразового) інструменту; в якості антикоагулянту крові використовувався 3%-й розчин ЕДТА (для ДНК-досліджень) або 1%-й розчин гепарину чи цитрату натрію (для цитогенетичних досліджень). Геномну ДНК виділяли із крові та волосяних фолікулів за допомогою сорбенту діоксиду кремнію у присутності хаотропних агентів за модифікованою методикою R. Boom et al. (1990).

Визначення генотипів тварин проводили методом ПЛР-ПДРФ за стандартними методиками (M.F. Rothschild et al., 1997; T. Short et al., 1997; K.S. Kim et al., 2004; M. Kmieс, A. Terman, 2006; E. Meijerink et al., 1997; Q.-L. Peng, 2007) та із власними модифікаціями. ПЛР здійснювали в об'ємі 25 мкл реакційної суміші, яка містила деіонізовану воду, 5хПЛР-буфер з 15 мМ Mg++, суміш дезоксинуклеотид-трифосфатів по 2 мМ кожного, прямий та зворотній праймери, специфічні для кожного гену, в концентрації 5 пкМ/мкл, 0,8-1,0 од. Taq-полімерази та ДНК зразку (50-100 нг). Ампліфікацію проводили в термоциклері Applied Biosystems 2720. Рестрикцію продуктів ПЛР проводили згідно рекомендацій виробника у реакційній суміші, яка містила 10х рестрикційний буфер, рестриктазу 10 од./мкл. Зразки інкубували протягом 12-16 годин при 37єС. Електрофоретичне розділення продуктів рестрикції проводили у 2-4%-му агарозному гелі з 1% розчином бромового етидію за використання 1ЧТВЕ-буферу протягом 40-60 хв. при напрузі 10 В/см. Візуалізацію здійснювали на транселюмінаторі в УФ світлі. Розміри продуктів ампліфікації визначали за допомогою маркера молекулярної маси GeneRulerTM 100bp DNA Ladder Plus, «Fermentas».

Цитогенетичні препарати готували за стандартною методикою (А.Ф. Яковлев и др., 1984; Б.Є. Подоба, В.С. Качура, М.В.Дідик, 1991). Біометричну обробку результатів досліджень виконували загальноприйнятими методами (Н.А. Плохинский, 1969; Л.А. Животовский, 1999), та за допомогою комп`ютерної програми PopGene 32.

Результати досліджень

В результаті дослідження особливостей генетичної структури української популяції свиней породи велика біла за локусами господарсько корисних ознак, асоційованими з репродуктивними якостями, показниками приросту живої маси, резистентністю до колібактеріозів та стрес-стійкістю, було виявлено поліморфізм за всіма генами, окрім MyoD1.

Вплив бажаних генотипів на господарсько корисні ознаки S. scrofa наведено у таблиці 3. За усіма дослідженими генами були виявлені тварини-носії господарсько корисних алелів. Частоти генотипів і алелів генів, пов'язаних з господарсько корисними ознаками у свиней великої білої породи із урахуванням статистичної помилки для частоти генотипу (Sp) та частоти алелів (Sq) (Л.А. Животовский, 1999) наведено у таблиці 4.

Вплив генотипів за дослідженими генами на господарсько корисні ознаки S. scrofa

Встановлено, що за геном ESR досліджена популяція свиней великої білої породи на 28% (±3,25%) складається з тварин-носіїв бажаного домінантного алелю D, а 17% (±3,39%) з них - гомозиготи DD.

Бажаний алель А гену PRLR виявлено у 57,5% (±2,74%) тварин, 30% (±5,92%) є гомозиготами АА. У досліджених тварин виявлено високу частоту алелю В гену FSHВ - 76,7% (±1,50%), а частота бажаного генотипу ВВ за цим геном становить 56,7% (±6,40%).

Порівняльний аналіз частот генотипів за генами ESR, PRLR і FSHВ зарубіжних дослідників і дані, отримані в наших дослідженнях, свідчить про те, що популяція великої білої породи в Україні характеризується значним генетичним потенціалом за генами-детермінантами репродуктивної функції.

За генами MYF4, MC4R і CMyc, асоційованими з показниками приросту живої маси свиней було знайдено поліморфізм. На рисунку 3 представлено розподіл частот генотипів S. scrofa породи велика біла за досліджуваними генами.

Тварини з бажаним генотипом за геном MYF4 зустрічаються з невисокою частотою 3,4%, за геном MC4R - близько 49%, а за геном C-Myc - 67% (рис. 3). За геном MYOD1 усі досліджені тварини були з бажаним генотипом АА. Отже, відбір носіїв бажаного генотипу за генами MYF4, MC4R та C-Myc у племінному ядрі може значно поліпшити показники продуктивності товарного поголів'я.

Частоти генотипів і алелей генів, пов'язаних з господарсько корисними ознаками у свиней великої білої породи в Україні

В результаті проведених досліджень трьох груп свиней, був виявлений низький рівень поліморфізму за геном RYR. Встановлено, що тварини з генотипом NN, які є стрес-стійкими, становлять переважну більшість серед досліджених і складають 0,975 ± 0,0281. Гетерозиготи Nn у досліджених тварин зустрічались з частою лише 0,025 ± 0,0091, причому, тварини з цим генотипом були виявлені лише в одному господарстві (ВАТ «Маки»). Гомозиготи за мутантним алелем nn, чутливі до стресу, не були виявлені в жодному господарстві. Рецесивний мутантний алель цього гену за даними О.М. Метлицької (2001) був характерний лише для свиней м`ясних порід України. За результатами наших досліджень частота небажаного алелю n гену RYR у популяції великої білої породи в Україні склала близько 2,5%. Таким чином, бажано проводити генотипування плідників за геном RYR з метою запобігання поширення мутантного алелю в популяції.

Генетична структура популяції свиней великої білої породи за ДНК-маркерами стійкості до колібактеріозів

Мутація у нуклеотидній послідовності гену MUC4 проявляється як шкідлива, в той час, як мутація гену FUT1 проявляється як господарсько корисна. Стійкість свиней до колібактеріозів успадковується як рецесивна ознака, отже, мутація за геном MUC4 є домінантною, а мутація за геном FUT - рецесивною. Наявність обох алелей АА у генотипі за кожним геном асоційована з резистентністю до колібактеріозів. Встановлено, що популяція великої білої породи в Україні має 13-17% тварин із резистентним генотипом до колібактеріозів за геном MUC4 та 7% тварин із резистентним генотипом за геном FUT1. Здійснено розподіл тварин за алелями генів, пов'язаних резистентністю до колібактеріозів в різних господарствах України. Тварини за генотипами були розподілені на три групи. До першої включено тварин з бажаним генотипом за двома генами. До другої - з бажаним генотипом за одним з генів. Третя група містила небажані генотипи за обома генами. Частка тварин резистентних до колібактеріозів (гомозиготні за диким типом гену MUC4 і гомозиготні за мутантним алелем гену FUT1) коливалась в межах від 0 до 6%, а умовно резистентних (гомозиготні за диким типом гену MUC4 і гетерозиготні за мутантним алелем гену FUT1 та/або гомозиготні за мутантним алелем гену FUT1 і гетерозиготні за диким типом гену MUC4) коливалась в межах від 6 до 20%. Розподіл частот генотипів свиней великої білої породи в Україні по кожному дослідженому гену відповідає закону Харді-Вайнберга. Таким чином, більшість свиней породи велика біла в Україні (від 80 до 91%) є чутливими до інфекцій, викликаних E. coli.

Особливості розподілу алельних вapiaнтів генів і вплив генотипу на формування господарсько корисних ознак в господарствах з різними технологіями утримання тварин

На основі даних, отриманих в результаті генотипування тварин різних груп, визначались частоти алелів генів, генотипів, статистична помилка для кожного показника, а також теоретично очікувані частоти генотипів за законом Харді-Вайнберга. Порівняння теоретично очікуваних та отриманих частот генотипів за генами ESR, PRLR, FSHB, MYF4, MC4R, CMyc, FUT1, MUC4 за допомогою критерію відповідності чІ у кожній групі свідчить, що відмінності між теоретично очікуваними і отриманими частотами невірогідні. Це свідчить про те, що досліджені популяції є генетично стабільними за дослідженими молекулярно-генетичними маркерами. Це є суттєвим резервом для інтенсифікації генетичного прогресу популяцій свиней.

В ІV групі (ДПДГ «Христинівське» УААН) за геном ожиріння, MC4R, та в групах ІІ і ІІІ (СП ТОВ «Нива Переяславщини» та ВАТ агрокомбінат «Калита») за геном стрес-чутливості (RYR) не знайдено поліморфізму. Так, досліджені тварини з групи ІV мали тільки господарсько корисні генотипи (гомозиготи за мутантним рецесивним алелем), за геном MC4R, а досліджені тварини груп ІІ і ІІІ не мали мутантного алелю n гену RYR, який в гомозиготному стані зумовлює чутливість до стресу (синдром MHS).

В усіх досліджених групах, за геном MYOD1 усі тварини виявились гомозиготними носіями господарсько корисних домінантних алелів. Дані свідчать про те, що для племінного розведення у досліджених господарствах, були відібрані тварини з гомозиготними господарсько корисними генотипами.

На основі проведених ДНК-досліджень, можна зробити висновок, що велика біла порода в Україні характеризується високим рівнем поліморфності і гетерозиготності досліджених локусів і, відповідно, має великий резерв генетичної мінливості, а також хороший генетичний потенціал.

Визначення реалізації генотипу за генами репродуктивної функції на показники продуктивності свиней

Враховуючи різні технології виробництва, нами вивчався вплив генів господарсько цінних ознак на репродуктивні показники свиноматок за допомогою дисперсійного аналізу однофакторного комплексу для малої вибірки (Н.А. Плохинский, 1996). В залежності від технології утримання тварин, вплив генотипу коливався від 1% до 38%, а вплив інших факторів - відповідно від 62% до 99%. В усіх досліджених групах генотип за геном ESR найменше впливав на кількість поросят, народжених живими і коливався від 1 до 8%. PRLR впливав на кількість поросят, народжених живими - від 3 до 38%. З результатів дисперсійного аналізу виявилось, що в СП ТОВ «Нива Переяславщини» ген ESR впливає найбільше на кількість опоросів у рік (22%), а у ВАТ агрокомбінат «Калита» ген PRLR - на живу масу новонароджених поросят (38%). Найвищий вплив генотипу за всіма показниками продуктивності спостерігався в господарстві «Калита», а найнижчий - у господарстві ВАТ «Маки». Великі розбіжності у впливі певних генів свідчить про значну залежність реалізації генетичного потенціалу від взаємодії неалельних генів та умов відтворення тварин.

Залежність репродуктивних якостей свиней великої білої породи від алельних варіантів естроген- і пролактин-рецепторів

В усіх дослідних групах (господарствах) свині відрізнялись за співвідношенням генотипів пролактин - та естроген-рецепторів. У ВАТ агрокомбінат «Калита» не виявили тварин небажаного генотипу, бажаний генотип AADD складав 35,7%, а маса новонароджених поросят була вищою, ніж в інших господарствах (p<0,001). У ВАТ «Маки» не було виявлено тварин з небажаним генотипом, тут переважали генотипи ААСD (33,3%) та АВСD (33,3%). У СП ТОВ «Нива Переяславщини» було 11,1% тварин з небажаним генотипом ВВСС, відсутні - з генотипом AADD та ААСD. Тут переважав генотип АВСС (55,5%).

Отримані дані свідчать про те, що найвищою жива маса новонароджених поросят була у свиноматок генотипу AADD.

У досліджуваних тварин кількість опоросів за рік коливалась від 1,45 (генотип ABCD) до 2,8 (генотип ААDD). Мінімальна жива маса новонароджених поросят становила 700 г. (генотип АВСС), максимальна - 1500 г. (генотип ААDD), мінімальна кількість поросят за опорос - 5 (у свиноматок ААСС і ААСD), максимальна - 19 поросят (у свиноматки ABCD).

Найбільша кількість мертвонароджених поросят була у тварин АВСС.

Серед вибракуваних через нездатність до запліднення, народжування мертвих поросят, аборти свиноматок, переважали тварини з генотипом ВВСС, а також ВВDD, АВСС. Найменша кількість мертвих поросят характерна для тварин з генотипом AADD та AВDD.

Оскільки тварини генотипу ВВСС і ВВDС були виявлені лише в одному господарстві (СП ТОВ «Нива Переяславщини»), їх не включено до рисунку.

Тварини генотипу AАDС були виявлені також лише в одному господарстві ВАТ «Маки». Вищі показники репродуктивної функції спостерігались у свиноматок, у генотипі яких зустрічались алелі A і D естроген- і пролактин-рецепторів.

Дослідження свиней великої білої породи за генетичним маркером приросту живої маси MC4R

У досліджених тварин за геном MC4R спостерігається високий рівень генотипу РР, частоти якого коливаються від 0,16 до 1. У господарстві ДСПГ «Христинівське» УААН усі досліджені тварини мали генотип РР. У тварин ВАТ «Маки» переважав генотип РР (0,8), не було знайдено тварин гомозиготних за дикою алеллю М, частоти алелей М і Р були 0,47 і 0,53 відповідно. Це свідчить про селекційну роботу в господарстві, спрямовану на відбір тварин, що характеризуються інтенсивним приростом живої маси. Морфометричні показники на прикладі живої маси свиней з різними генотипами за геном MC4R ілюструють вірогідні відмінності між тваринами з різними генотипами (табл. 7).

Жива маса свиней (кг) з різними генотипами за геном MC4R, M±m

Порівняння результатів сумарного аналізу генотипів породи велика біла у чотирьох господарствах України з результатами інших дослідників (R.D. Houston, N.D. Cameron, K.A. Rance, 2004; J. Chen et al., 2004) свідчать про те, що розподіл генотипів за геном МС4R співпадає з таким розподілом в Англії і Китаї. Оскільки порода велика біла належить до універсальної породи, відмінності у частотах мутантної алелі в різних популяціях можуть свідчити про різні напрямки їх селекції.

Методика ПЛР-експрес аналізу свиней за генами естроген - та меланокортин-4-рецепторів

У результаті проведеної роботи була розроблена експрес тест-система для генотипування свиней за генами ESR та MC4R одночасно, методом ПЛР-ПДРФ, за рахунок оптимізації режиму ампліфікації для обох генів, знижуючи витрати реактивів та час проведення реакцій. При цьому використовували наступний режим ампліфікацій для двох генів:

Параметри ампліфікації

Послідовності праймерів

Для рестриктазного гідролізу ампліфікованих фрагментів використовують ферменти рестрикції PVu II, для гену ESR та Taq I для гену MC4R.

Під час ДНК-ідентифікації свиней за геном ESR після обробки рестриктазою Pvu II генотип АА дає фрагмент розміром 120 п.н, АВ-120 п.н. і 55 п.н., а генотип ВВ - 55 п.н. відповідно (Рис. 8).Під час ДНК-ідентифікації свиней за геном MC4R після обробки рестриктазою Taq I генотип ММ характеризується наявністю продуктів розмірами 156 п.н. і 70 п.н., РМ - 226, 156 і 70, РР - 226 п.н. відповідно.

Дослідження свиней за цитогенетичними показниками

Для проведення цитогенетичних досліджень нами було оптимізовано методику приготування препаратів. У тварин забір крові здійснювали як з синуса ока, так із вушної і хвостових вен. Аналіз цитогенетичних препаратів виявив, що більш успішним для культивування лімфоцитів є взяття у свиней крові з синуса ока. Це можна пояснити більшою стерильністю процедури взяття крові з синусу, яка виключає контакт зі шкірою тварин. До недоліків цього методу можна віднести необхідність високого рівня професіоналізму ветеринара, який відбирає зразки крові. Каріотипування не виявило тварин-носіїв геномних та хромосомних мутацій.

Мікроядрений аналіз при цитогенетичних дослідженнях свиней до цього часу не набув широкого застосування, тому параметри умовного контролю за кількістю клітин з мікроядрами для S. scrofa досі невідомі. Для інших ссавців цей показник варіює - 2,7-5,6 ‰ (С.О. Костенко, 2001). Для порівняння отриманих цитогенетичних показників свиней, були взяті цитогенетичні показники м'ясного типу великої білої породи, які належать ДДАУ ТОВ «Луговське» Дніпропетровського області Солонянського району, с. Александропіль (С.О. Костенко, О.М. Коновал, О.В. Сидоренко, Д.Т. Сметанін, 2009) (табл. 10). Встановлено, що для свиней, які відтворюються в с. Александропіль Солонянського району Дніпропетровської області характерна вірогідно нижча (***Р>0,999) кількість клітин з мікроядрами в порівнянні з тваринами, яких утримують в Київській і Черкаській областях.

Цитогенетичні показники S. scrofa великої білої породи

Менша кількість хромосомних аберацій і анеуплоїдій, наслідком яких є збільшення кількості лімфоцитів з мікроядром, може бути особливістю генотипів тварин дослідженої популяції, обумовленою високими антиоксидантними властивостями організмів. Подібні відмінності відомі для інших видів тварин, зокрема лінійно специфічний рівень хромосомних аберацій та мікроядер у Mus musculus domesticus (О.А. Ковалева та ін., 2007). Не можна виключати впливу в Київській області іонізуючого опромінення, яке збільшує темпи клітинного поділу.

Отримані нами дані свідчать про те, що розмах середніх величин числа лімфоцитів з мікроядрами у свиней, які утримуються в різних господарствах, відповідає показникам умовного контролю (середнім значенням для ссавців).

Висновки

1. Розроблено систему оцінки генофондів порід свині свійської (Sus scrofa) за використання молекулярно-генетичних та цитогенетичних маркерів на прикладі великої білої породи.

2. Встановлено особливості внутрішньопородного поліморфізму свиней українського поголів'я великої білої породи за 10 генами господарсько корисних ознак і цитогенетичних параметрів.

3. Досліджені внутрішньопородні особливості поліморфізму свиней великої білої породи за маркерами репродуктивних якостей. Виявлено, що частота алелю D гена ESR коливалась від 0,153 до 0,360, частота алелю А гена PRLR - 0,267-0,533, частота господарсько корисного рецесивного алелю А гена FSHB - 0,650-0,900.

4. Виявлено, що вплив генів ESR і PRLR взаємопов'язаний, і репродуктивні якості тварин залежать від поєднання генотипів за двома генами. Вищі показники репродуктивної функції спостерігались у свиноматок, у генотипі яких зустрічались алелі А і D естроген- і пролактин-рецепторів.

5. Вивчені особливості поліморфізму структурних генів, асоційованих з показниками приросту живої маси. Встановлено, що господарсько цінні рецесивні алелі А генів MYF4 та C-Myc зустрічаються з частотою - 0,167-0,333, та 0,633-0,966 відповідно, за бажаним алелем гена MyoD1 усі досліджені тварини - гомозиготні. Частота бажаного алелю Р гена приросту живої маси MC4R коливається в межах 0,417-0,825.

6. Проведені дослідження внутрішньопородних особливостей тварин за маркерами резистентності до колібактеріозів FUT1 (фукозилтрансфераза 1), MUC4 (муцин 4). В досліджених популяціях свиней не ведеться спрямована селекційна робота по відбору тварин-носіїв господарсько корисних алелів генів стійкості до інфекцій викликаних E.coli (алелі А генів FUT1 та MUC4 - відповідно 0,212 та 0,483).

7. Досліджено внутрішньопородні особливості тварин за геном стрес-чутливості RYR (рианодин рецептор). Виявлено, що усі досліджені тварини стійкі до стресу, бажаний алель N гена RYR зустрічається з частотою 0,975.

8. Встановлені особливості розподілу алельних вapiaнтів генів і вплив генотипу на формування господарсько корисних ознак у тварин, які мають різне походження та відтворюються в господарствах з різними умовами утримання. Виявлено, що в залежності від технології утримання тварин вплив генотипу коливався від 1% до 38%.

9. Виявлена залежність кількісних показників від алельних варіантів генів на прикладі естроген- і меланокортин4-рецепторів.

10. В результаті проведеної роботи встановлено, що параметри умовного контролю свиней за кількістю клітин з мікроядрами коливаються від 0,58 до 4,1 ‰.

11. Розроблено експрес-метод генотипування свині свійської за двома генами кількісних ознак, ESR та MC4R, із використанням дуплексної полімеразної ланцюгової реакції.

Публікації

1. Костенко С.О. Залежність репродуктивних якостей свиней великої білої породи від алельних варіантів естроген- і пролактин-рецепторів / Науковий вісник Національного аграрного університету // С.О. Костенко, О.М. Коновал, К.Білек, Ж.Філкукова - К., 2007. - Вип. 109. - С. 49-56. (Дисертант брала участь у проведенні експерименту, провела обробку та аналіз матеріалу, написала статтю).

2. Коновал О.М. Дослідження поліморфізму свиней великої білої породи за генами господарсько корисних ознак / О.М. Коновал, С.О. Костенко, К.Білек, Ж.Філкукова. Наукові доповіді НАУ [електронний ресурс] // - К., 2008 - №1 (9) - 15 с. - режим доступу до журн.: http://www.nbuv.gov.ua/e-Journals/nd/2008-1/08komevt.pdf 11 (Дисертант брала участь у проведенні експерименту, провела обробку та аналіз матеріалу, написала статтю).

3. Коновал О.М. Поліморфізм гену естроген-рецептора у свиней великої білої породи в Україні / О.М. Коновал, С.О. Костенко, В.Г. Спиридонов // Тваринництво України. - К. - 2008. - №1. - С. 22-23. (Дисертант провела дослідження, обробку та аналіз матеріалу, написала статтю).

4. Коновал О.М. Генетична структура української популяції свиней породи велика біла за геном естроген-рецептора / О.М. Коновал, С.О. Костенко, В.Г. Спиридонов, С.Д. Мельничук, І.П. Григорюк // Доповіді Національної академії наук України України. - К. - 2008 - №3, с. 149-151. (Дисертант провела дослідження, обробку та аналіз матеріалу, написала статтю).

5. Коновал О.М. Ген MC4R як генетичний маркер приросту живої маси у свиней // Коновал О.М., Костенко С.О., Спиридонов В.Г., Мельничук С.Д., Григорюк І.П. Науковий вісник Ужгородського Університету. -2008. - Вип. 22. - С. 110-113. (Дисертант провела дослідження, обробку та аналіз матеріалу, написала статтю).

6. Коновал О.М. Генетична структура популяції свиней великої білої породи за маркерами стійкості проти колібактеріозів / О.М. Коновал // Вісник аграрної науки - 2008. - №8. - С. 79-81.

7. Коновал О.М. молекулярно-генетичний аналіз господарсько-корисних генів свині свійської (Sus scrofa) / О.М. Коновал, С.О. Костенко, В.Г. Спиридонов, С.Д. Мельничук // Вісн. Укр. тов-ва генетиків і селекціонерів. - 2008, том 6, №2. - С. 240-245. (Дисертант провела дослідження, обробку та аналіз матеріалу, написала статтю).

8. Костенко С.О. Показники цитогенетичної мінливості Sus scrofa. - Зб. наук. НАН України УААН, АМН України, укр. т-во генетиків і селекціонерів ім. М.І. Вавилова; редкол.: В.А. Кунах (голов. ред.) [та ін.]. - С.О. Костенко, О.М. Коновал, О.В. Сидоренко, В.Т. Сметанін // К.: Логос. - т. 6.: - 2009. - С. 149-154. (Дисертант брала участь у проведенні експерименту, проведенні обробки та аналізу матеріалу, написані статті).

Размещено на Allbest.ru