Партеноклонування шовковичного шовкопряда шляхом культивування яєчника донора у порожнині тіла самця

22

Размещено на http://www.allbest.ru/

Міністерство освіти і науки України

Харківський національний університет імені В.Н. Каразіна

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Партеноклонування шовковичного шовкопряда шляхом культивування яєчника донора у порожнині тіла самця

Забеліна В.Ю.

03.00.15 - генетика

Харків - 2009

Вступ

Актуальність теми. Саме на шовковичному шовкопрядові більше 70 років тому (1936) Б.Л. Астауровим вперше були клоновані жіночі генотипи і отримані перші штучні клони; для цього він використовував розроблений ним метод штучного амейотичного партеногенезу. Деякі із створених у той час клонів впродовж десятиліть зберігалися і зберігаються як сукупності ізогенних особин, які можна легко відтворити, постійно пропонуючи дослідникові проблему молекулярного механізму цього унікального явища і водночас надаючи йому благодатний матеріал для вивчення не лише клонування, але і безлічі інших проблем експериментальної генетики і біології розвитку.

Партеноклонування за Астауровим істотно обмежено рівнем гетерозиготності самиці-засновниці клону, унаслідок чого далеко не кожен жіночий генотип можна перевести в клон. Подолання обмежень спектру жіночих генотипів, що клонуються шляхом експериментального аналізу формування в онтогенезі здібності до термічного партеногенезу сформульоване В.В. Клименко (1989, 2001) на основі отриманих ним результатів збільшення цієї здатності при трансплантації яєчників дочірньої інбредной лінії в материнський клон, а також на основі класичної роботи О. Ямашити (1980), що показав можливість партеногенетичного розвитку з яєць, що дозріли в імплантованому в тіло самця яєчнику. Цей напрям отримав визнання на Міжнародному конгресі з шовківництва (2000) в Цукубі.

В межах названого підходу вивчення здатності до партеноклонування яєць, що розвинулися в яєчниках, узятих з личинок "хороших" партеноклонів і пересаджених в тіло самців, де синтез багатьох компонентів ооциту не має місця, представляє особливий інтерес і отримані на цій експериментальній моделі клонування результати надмірно виправдали наші очікування. Використовуючи й надалі експериментальний онтогенетичний підхід на унікальному генетичному матеріалі лабораторії шовковичного шовкопряда, ми сподіваємося ідентифікувати в майбутньому білки та інші компоненти молекулярного механізму партеногенетичного клонування.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконувалася в межах держбюджетної теми лабораторії зародкових і стовбурових клітин біологічного факультету Харківського національного університету імені В.Н. Каразіна "Механізми виникнення, підтримання та мобілізації зародкових і стовбурових клітин тваринного організму в нормальному розвитку та в експерименті" (№ державної реєстрації - 0108U007550).

Мета і завдання дослідження. Мета роботи - виявлення і фенотипова оцінка здатності до партеноклонування яєць шовковичного шовкопряда, що розвинулися в яєчниках, імплантованих в порожнину тіла личинок протилежної статі.

Для досягнення поставленої мети були визначені наступні завдання:

1. Оцінити ефективність методу трансплантації яєчників у шовковичного шовкопряда за показниками виживаності реципієнта і приживаності в ньому імплантованого яєчника.

2. Використовуючи як критерій здатність яєць до термічного партеногенезу, оцінити вплив тривалості культивування жіночої гонади в тілі самця на здатність до партеноклонування яєць, що розвинулися в імплантаті.

3. Порівняти здатність до партеноклонування яєць, що формуються в яєчниках різних клонів-донорів при пересадці їх в самців однієї породи (лінії).

4. Порівняти здатність до партеноклонування яєць, що сформувалися в імплантованому яєчнику, залежно від генотипу чоловічого реципієнта.

5. Визначити характер спадковості і мінливості фенотипа клонального партеногенетичного потомства, що отримується з яєць імплантата, які розвинулися в чоловічому реципієнтові.

Об'єкт дослідження. Оогенез і постембріональний розвиток шовковичного шовкопряда. Функціональність яєчника, імплантованого в організм самця. Цитологичні наслідки імплантації яєчника. Детерміація здібності до термопартеногенезу яєць, що розвинулися в імплантованому яєчнику. Білковий склад ооцитів імплантату. Спадковість і мінливість партеногенетичного потомства, що розвинулося з імплантованого яєчника. Гормональна регуляція діапаузи потомства імплантата.

Предмет дослідження. Ооцити, клітини строми яєчника, гемолімфа, підглоткові ганглії, генетичні маркери і фенотипові ознаки на різних стадіях онтогенезу шовковичного шовкопряда в нормі та експерименті.

Методи дослідження. У роботі використані генетичний аналіз, мікрохірургічні методи трансплантації гонад, метод термічного партеногенезу за Астауровим, цитогенетичний метод дослідження оогенезу і сперматогенезу, метод усунення діапаузи за допомогою соляної кислоти, електрофоретичне розділення білків в лінійному градієнті поліакриламіду, статистичний аналіз даних.

Наукова новизна отриманих результатів. У роботі вперше для аналізу формування в онтогенезі здатності жіночих зародкових клітин до партеноклонування використана пересадка яєчників в личинок чоловічої статі різного віку.

Визначено, що генетично обумовлена здатність донора до партеноклонування не зменшується істотно в результаті культивування імплантованого яєчника в чоловічому реципієнтові, навіть протягом декількох личинкових віків.

Виявлено, що в клоні, який отримано з яєчника після культивування його в чоловічому організмі, має місце виражена фенотипова мінливість (випадіння діапаузи, неповний прояв ознак забарвлення личинок I віку і коконів).

Встановлено значення фактору онтогенетичного віку ооцитів в ієрархії причин, що обумовлюють внутрішньоклональну і модифікаційну мінливість взагалі.

Показано, що виявлені відхилення фенотипових ознак трансплантаційного потомства від фенотипа донора і реципієнта мають характер тимчасових модифікацій і зникають в наступному поколінні за нормального партеноклонування.

Практична значущість отриманих результатів. Отримані результати мають пряме відношення до репродуктивної біології і генетики розвитку тварин, особливо феногенетики клонування. Вони можуть бути використані в експериментальній генетиці і селекції для клонування моновольтинних жіночих генотипів, коли необхідно тимчасово виключити діапаузу з життєвого циклу. Так, використання яєць партеноклонів для здобуття трансгенів виявилося неможливим внаслідок необхідності обробки для усунення діапаузи соляною кислотою яєць, в які за допомогою мікроін'єкцій була введена чужорідна ДНК (яйця гинуть). Випадання діапаузи у варіанті трансплантації яєчників в самців може бути використане для здобуття трансгенних клонів від наявних в колекції лабораторії моновольтинних партеноклонів, оскільки здобуття клонів від полівольтинних порід ні у Франції, ні в Японії до цього часу успішно не закінчилося. Результати даного дослідження можуть бути використані в курсах генетики і біології розвитку для демонстрації фенотипової мінливості в клонах тварин, що отримуються експериментально.

Особистий внесок здобувача. Винесені до захисту положення і експериментальні дані отримані при безпосередній участі дисертанта, яка полягає в самостійному плануванні досліджень, проведенні трансплантаційних експериментів, вивченні біохімічних і фізіологічних показників, проведенні цитогенетичних досліджень, інтерпретації і статистичному аналізі отриманих даних, формулюванні висновків.

Автор висловлює вдячність науковому керівникові д.б.н., проф. Клименко В.В., за запропоновану тему дослідження, конструктивну критику в ході досліджень і підготовці дисертації. Співробітникам лабораторії зародкових і стовбурових клітин, кафедрі генетики і цитології Харківського національного університету імені В.Н. Каразіна на чолі з Воробйовою Л.І. автор вдячний за увагу і допомогу в роботі.

Апробація результатів дисертації. Основні положення і результати роботи викладені і обговорені на наукових семінарах кафедри генетики і цитології біологічного факультету Харківського національного університету імені В.Н. Каразіна. Матеріали дисертації представлені на наукових форумах: VI Всеукраїнській науковій конференції студентів і аспірантів "Біологічні дослідження молодих учених в Україні" (Київ, 2006 р.); І-III конференціях молодих учених з міжнародною участю "Біологія: від молекули до біосфери" (Харків, 2006, 2007, 2008 р.р.); VIII З'їзді Українського суспільства генетиків і селекціонерів ім. Н.І. Вавілова (Алушта, 2007 р.); IV науковій конференції з міжнародною участю фактори експериментальної еволюції організмів" (Алушта, 2008 р.); ІV науковій конференції студентів і аспірантів з міжнародною участю "Молодь та поступ біології" (Львів, 2008 р.); I Міжнародна наукова конференція студентів, аспірантів і молодих учених "Фундаментальні і прикладні дослідження в біології" (Донецьк, 2009 р.).

Публікації. За матеріалами дисертаційної роботи опубліковано 11 наукових праць, у тому числі 5 статей у виданнях, що рекомендовані ВАК України як фахові з біологічних наук, та 6 тез доповідей у матеріалах наукових конференцій і з'їздів.

Структура дисертації. Матеріали дисертаційної роботи викладені на 142 сторінках друкарського тексту, у тому числі на 23 сторінках цитована література. Дисертація складається з наступних розділів: введення, основної частини (огляд літератури, матеріал і методи досліджень, отримані результати та їх обговорення), висновків, списку використаної літератури, який налічує 216 джерел, з них 44 кирилицею і 172 латиницею. Дисертаційна робота проілюстрована двома малюнками і 41 фотографією, в тому числі в додатку, містить 9 таблиць.

1. Основний зміст роботи

Як матеріал використовували партеноклони (P29, P50, Pos, P178, P4n17, Pwr1, PwrB2, PwrB13), породу (С-5) і лінії (mow2, repoiax, reLps, reZe) шовковичного шовкопряду, які підтримуються в колекції лабораторії зародкових і стовбурових клітин ХНУ імені В.Н. Каразіна. Матеріал колекції створювався починаючи з 60-х років впродовж довгого часу в лабораторії цитогенетики розвитку (Астауров, Струнников, ІБР, Москва), лабораторії онтогенетичного контролю рекомбіногенезу (Клименко, Інститут екологічної генетики, Кишинів), Токійському університеті (Клименко, 1999-2001) і в ХНУ імені В.Н. Каразіна (Клименко, 2001-2008). Матеріал містить ряд генетичних маркерів і ознак, відібраних для вивчення на шовковичному шовкопрядові партеноклонування, відкритого Астауровим у 1936 році.

Вигодівлю експериментального матеріалу даної роботи проводили в 2005-2009 роках на експериментальній базі ХНУ імені В.Н. Каразіна відповідно до прийнятих зоотехнічних вимог (Поярков, 1929; Михайлов, 1936, 1950; Астауров та ін., 1962; Ayuzawa et al., 1972; Krishnaswami et al., 1973, Tazima, 1978).

Метод трансплантації яєчників в шовковичного шовкопряда (Спірідонова, Щегельська, Клименко, 1987) полягає в екстирпації гонад донора і введенні їх в тіло реципієнта. Розвинуті в імплантаті незапліднені яйця термоактивували для індукції партеногенетичного розвитку, прогріваючи їх при 46?С протягом 18 хвилин у водному ультратермостаті (Астауров, 1940). Оскільки весь використаний в роботі матеріал моновольтинный, звичайна запліднена грена й така, яку було термоактивовано, для усунення діапаузи проходила "зимівлю" (зберігання в холодильнику при температурі +5?С протягом 100-120 днів). Після цього грену інкубували при 24-25°С і через 10-12 днів з неї виходили личинки першого віку ("мураші"), яких переносили на свіжий аркуш і вигодовували до завивання кокону (25-30 днів). При необхідності бездіапаузний розвиток моновольтинного матеріалу отримували, обробляючи грену, що розвивається, на стадії початкового порозовіння соляною кислотою (питома вага 1,120 при 30°С) при 30-35°С протягом 12-15 хвилин.

Оцінку здатності генотипу до партеноклонування проводили за відносною кількостю яєць, що почали розвиток (підрахунок пігментованих яєць), й за відсотком виходу личинок з яєць, що розвиваються . У першому випадку оцінюється здатність яйця до термоактивації, в другому - здатність до повного партеногенезу, тобто партеноклонування.

Розвиток імплантату в чужорідному середовищі контролювали цитологічно. Матеріал фіксували в суміші спирт-оцтова кислота (3:1) і фарбували ацетогематоксиліном (Смирнов, 1968); для набрякання і диференціювання матеріал переносили в ацетохлоралгідрат, спостерігаючи за процесом під стереомікроскопом; з гонади, що збільшилася в розмірах, видаляли оболонку, а з вмісту, що залишився, вибирали необхідну для аналізу частину, яку переносили на предметне скло і роздавлювали в краплі свіжого ацетохлоралгідрату (Клименко, 1972). Тим самим способом оцінювали стан підглоткових гангліїв на стадіях личинки і ляльки, коли в ході роботи нам потрібно було знайти непряму оцінку їх функціональної активності, тобто продукції ними гормону діапаузи.

Оцінку наявності гормону діапаузи в підглоткових гангліях (10 залоз в пробі) ляльок-самців і ляльок-самиць різних порід і ліній проводили за результатами розділення білків у низькомолекулярної області за допомогою вертикального електрофорезу в лінійному градієнті акриламіду (Laemmli, 1970). Цим методом також вивчали білковий склад гемолімфи личинок, яєць порід і клонів, що досліджувалися, а також яєць, які розвинулися в імплантаті. Відсоткове співвідношення фракцій розраховували за допомогою комп'ютерних програм Density та Gel exe.

Статистичний аналіз даних проводили з використанням t-критерія Стьюдента для оцінки різниці між долями. Також визначали середню зважену і статистичну помилку вибіркової долі, вираженої у відсотках. Перевірку статистичних гіпотез проводили на рівні значущості p< 0,05 (Лакін, 1990).

Результати досліджень та їх обговорення

Ефективність методу трансплантації.

Виживаність реципієнтів і приживаність в них імплантату за результатами поставлених дослідів представлені в табл. 1, з якої виходить, що в умовах проведеного експерименту виживає в середньому 72% реципієнтів, в яких приживається близько 64% імплантованих яєчників. При імплантації яєчників в реципієнтів одного походження, але різної статі, відмінностей у виживаності реципієнтів не виявлено. Максимальна виживаність реципієнтів і приживаність в них імплантатів виявилася при внутрішньопорідних пересадках (С-5, лінія mo і repoiax). Найменша ефективність методу виявлена при трансплантаціях, в яких донором служив клон Р29, а реципієнт - самці ліній reLps (45%) і reZe (48%). Але навіть і на такому рівні метод трансплантації гонад виявляється досить ефективним для вирішення цілого ряду завдань експериментальної генетики. У даній роботі за допомогою цього методу вивчений вплив чоловічого організму на розвиток ооцитів в імплантованому яєчнику, в першу чергу, вплив на їх здатність до термічного партеногенезу.

Для визначення віку личинок, в якому пересадка гонад найбільш ефективна, в кожному з варіантів P29>C-5>, P29>repoiax>, P29>mo>, P29>reLps>, P29>reZe>, P178>C-5>, Pos>C-5>, P50>C-5>, Pwr1>C-5>, PwrB2>C-5>, PwrB13>C-5>, P4n17>C-5> трансплантували яєчники послідовно в II, III, IV і V личинкових віках. Показано, що максимальний рівень термопартеногенезу досягається частіше, пересаджуючи в III личинковому віці. У цьому віці при порівнянні донорів з однаковим реципієнтом (самці породи С-5) найвищий показник партеногенезу отриманий для клона Р29 (70%), найменший - для клону PwrB2 (48%, р<0,001); при порівнянні реципієнтів з імплантатами від одного донора (клон P29) максимальний вихід личинок виявлений при пересадках яєчників в самців породи С-5 (70%), мінімальний, - в самців породи reZe (52%) (р<0,001). Слід зазначити, що навіть гірші варіанти пересадок сповна прийнятні для постановки досліджень, а відмінності результатів за віками не заважають стверджувати, що, починаючи з II личинкового віку, яєчник здатний забезпечити проходження оогенезу в чужорідному середовищі: у яєчниках, імплантованих в чоловічий організм, формуються ооцити, здатні до термічного партеногенезу.

Таблиця 1 Ефективність трансплантації яєчників в самців шовковичного шовкопряда в личинковому періоді

Здатність до термопартеногенезу яєць партеноклону, що розвинулися в імплантованому в тіло самця яєчнику.

Для порівняльного аналізу здатності яєць імплантату до термопартеногенезу імплантували в II-V личинкових віках яєчники клонів Р29, P178, Pos, Р50, Pwr1, PwrB2, PwrB13, P4n17 в личинок-самців породи С-5, ліній repoiax і mo. Контролем служили яйця, що розвинулися в яєчниках донора, імплантованих в личинок-самиць тих самих ліній, а також незапліднені яйця клонів-донорів і використаного реципієнтного матеріалу, активовані за Астауровим (табл. 2).

Встановлено, що здатність до термопартеногенезу яєць імплантата, що сформувалися в чоловічому реципієнтові, знижується не більше ніж на 2-3% в порівнянні з відповідним жіночим реципієнтом, а в комбінаціях P29>C-5 та P29>repoiax показник партеногенезу яєць, що розвинулися в реципієнтах-самцях навіть вище на 2-5%, ніж в реципієнтах-самицях. Порівняння з рівнем термопартеногенезу клонів-донорів показує, що в обох серіях пересадок цей загальний контрольний рівень значимо перевищує дослідний на 10-40%.

Таблиця 2 Здатність до термопартеногенезу яєць партеноклону, що розвинулися в імплантованому в тіло самця яєчнику

Примітка: ***- різниця із контролем значима на рівні р< 0,001; (к.)- інтактний контроль, нормальний оогенез.

Таким чином, яєчник партеноклону може продукувати здатні до повного партеногенезу яйця, навіть після культивування його в організмі протилежної статі з початку II віку. Близькість результатів, які отримані на реципієнтах чоловічої і жіночої статі, узятих з лінії з нульовим рівнем партеногенезу, свідчить про те, що механізм повного партеногенезу детермінований генотипом клону-донора і не залежить від статі реципієнта. Оскільки частота спрацьовування цього механізму різна в різних реципієнтних лініях, слід допустити вплив на нього генотипу реципієнта, який здійснюється через оточення імплантату.

Вплив чоловічого організму на фенотип партеногенетичного потомства, що отримується з яєць імплантата.

Випадіння діапаузи в партеногенетичному потомстві імплантату.

Трансплантація яєчника партеноклону в личинку-самця незмінно призводить до бездіапаузному розвитку яєць, що сформувалися в імплантаті й активованих за Астауровим. Контрольний імплантат в жіночому реципієнтові давав при цьому звичайне потомство з діапаузою, характерною для використаного в роботі моновольтинного матеріалу. Ми виявили, що у всіх варіантах з чоловічим реципієнтом (P29>C-5>, P29>repoiax>, P29>mo>, P29>reLps>, P29>reZe>, P178>C-5>, Pos>C-5>, P50>C-5>, Pwr1>C-5>, PwrB2>C-5>, PwrB13>C-5>, P4n17>C-5>) пересадка яєчників партеноклона в самців моновольтинних порід призводить до одного результату: яйця, що сформувалися в імплантаті, почавши партеногенетичний розвиток, не вступають потім в діапаузу і розвиваються до імаго, здібних до нормального й партеногенетичного розмноження. Порівняння показників бездіапаузного виходу личинок з яєць, що розвинулися в самцях С-5, виявило максимальний вихід личинок для клона Р29 (69%), найменший (46%), - при трансплантації яєчника клона PwrB2 (табл. 3).

Таблиця 3 Діапауза в потомстві імплантатів, що розвинулися в реципієнтах різної статі

Найбільш простим поясненням бездіапаузного розвитку в потомстві імплантата була б передбачувана відсутність гормону діапаузи у самців. Проте статевий диморфізм у такому вигляді в шовковичного шовкопряду не має місця: у самців показана наявність гормону діапаузи, що синтезується підглотковим ганглієм. Диморфізм полягає в тому, що вивільнення синтезованого гормону з підглоткового ганглія в гемолімфу відбувається у самиць в перші дві третини лялечного періоду, а у самців - в останній третині, коли у самиць рецепторна система для цього гормону вже не функціонує; тому, коли у самиць гормон надходить в гемолімфу за чоловічим розкладом, вони відкладають бездіапаузну грену, як це має місце в бівольтинних породах за "холодового" варіанту інкубації грени батьківського покоління (Sonobe et al., 1977; Ichikawa, 1995; Ichikawa, Suenobu, 2003; Kitagawa et al., 2005).

У нашій роботі стан підглоткових гангліїв самиць і самців вивчали цитологічно на личинковій і ляльковій стадіях. Помітних морфологічних відмінностей між статями на одній стадії розвитку виявлено не було. Розділення білків підглоткових гангліїв проводили в низькомолекулярної області за допомогою вертикального електрофорезу. Відомо, що гормон діапаузи має молекулярну масу 4500 Да. Вміст білків з молекулярною масою 4500 Да у самців лінії repoiax було в 2,7 разу нижче, ніж у самиць цієї лінії; у самців лінії mo - нижче в 3,5 разу; у самців породи С-5 - нижче в 11 разів. У припущенні однакової долі гормону в названій фракції ми можемо вивести, відповідно даним Sonobe (1977), що в нашому матеріалі аналіз ляльок припав на той період, коли в самцях мав місце активний викид гормону діапаузи в гемолімфу, проте його дія залишилася без відповіді з боку ооцитів імплантату: розвиток яєць, що сформувалися в імплантаті в реципієнтах-самцях, проходив без діапаузи після термоактивації.

Не можна виключити, що в "мускулінізованих" умовах рецепторна система ооцитів, що розвиваються в імплантаті, може взагалі не утворитися, що неминуче призведе до випадіння діапаузи з життєвого циклу.

Фенотип трансплантаційного потомства.

Вплив організму самця на розвиток потомства імплантата відбивається також і на забарвленні личинок першого віку, "мурашів". Мураші реципієнта і донора мають чорний колір і не відрізняються; відмінності виникають після першого линяння, коли личинки P29 набувають коричневого відтінку, а личинки породи С-5 стають попелясто-сірими. У личинок, що вилуплюються з яєць імплантата P29, якщо він розвивався в самцеві C-5, замість характерної чорної з'являється цілий спектр забарвлень від темно-коричневої через руду до бежевої; у цьому спектрі можна виділити приблизно 70% "коричневих" і 30% "рудих" мурашів. До кінця I віку 85% рудих мурашів гине; коричневі і ті 15% рудих, що залишилися, починаючи з II віку мають вже характерне для клона-донору Р29 забарвлення. У забарвленні коконів спостерігається послаблення жовтого кольору, з'являються блідіші відтінки. Ми показали, що у наступних партеногенетичних поколіннях термоактивовані яйця входять в діапаузу і дають після зимівлі чорних мурашів і інтенсивно жовті кокони, як і належить клону P29.

Наше припущення про вплив положення ооцитів в оваріолі імплантата на формування з них здатних до партеноклонування, але нерівноцінних зрілих яєць підтвердилося в дослідженні з розподіленням на стадії імаго оваріол імплантованого яєчника (42 самця-реципієнти) на апікальну і базальні половини; було встановлено, що руді мураші виникають з термоактивованих яєць базальної частини оваріоли. Оскільки в нашому матеріалі типове руде і типове чорне забарвлення мурашів обумовлені гомо- і, відповідно, гетерозиготністю за рецесивним алелем ch, ми передбачаємо, що відмінності забарвлення мурашів, отриманих з імплантата, від чорного забарвлення їх матері, клона P29 (ch|/ch+), обумовлені неповним проявом дикого алеля ch+, яке, у свою чергу, викликане дією чоловічого організму на процеси оогенезу в імплантованому яєчнику. Відмітимо, що при імплантації яєчника P29 у самиць С-5, партеногенетичне потомство імплантата цілком повторює фенотип донора (яйця пігментуються і вступають в діапаузу, після інкубації з них виходять чорні мураші й кокони отримують донорського кольору). Оскільки орієнтація імплантата по відношенню до передньозадньої осі реципієнта випадкова, ми можемо передбачити, що виявлений убуваючий градієнт пігментації в забарвленні мурашів імплантата від апікальної до базальної частини оваріоли закладений в яєчниковій онтогенетичній програмі дозрівання ооцитів уподовж оваріоли; ця програма, хоча і порушена чужорідним оточенням імплантованого яєчника і відсутністю його зв'язків з іншими компонентами жіночої статевої системи, зберігає в модифікованому вигляді тимчасову послідовність дозрівання яєць, починаючи з базального кінця, і умов, які створюються в них для майбутньої експресії гена ch+ в ході розвитку після термоактивації. У експериментальній ситуації, яку створено імплантацією яєчника в організм самця, виявляються біохімічні відмінності між ооцитами однієї оваріоли, які можна пов'язувати з показаною раніше на шовковичному шовкопряді внутрішньоклональною мінливістю морфологічних ознак. Ця фенотипова мінливість, як передбачалося, корениться в стохастичності молекулярних процесів в гомологічних закладках ознаки, має модифікаційний характер і не успадковується при клонуванні окремого фенотипового варіанту (особини клона), проте параметри характеризують її на рівні безлічі особин клона, наприклад, пенетрантність і експресивність, детерміновані генотипом клону, при тому, що вони є різними в різних партеноклонах (Клименко, Воробйова, Шахбазов, 1980; Клименко, 1989).

Взаємодія імплантата і гонад реципієнта.

Імплантат і гонади реципієнта, знаходячись в порожнині тіла одного організму, можуть вступати у взаємодію через загальне середовище, гемолімфу. Яєчники клона-донору Р29, що мають жовту гемолімфу, в організмі самців і самиць породи С-5 з безбарвною гемолімфою змінюють своє жовте забарвлення на біле, тоді як сім'яники або ж яєчники реципієнта набувають жовтого кольору. Те ж саме відбувається зі зрілими ооцитами донора: розвиваючись в імплантаті вони втрачають жовтизну і стають зовсім білими, а жовтий відтінок яєць реципієнта (якщо це самиця С-5) помітно посилюється порівняно з контролем, який не оперували. Жовтий колір ооцитів визначається каротиноїдами, які поступають в ооцити з гемолімфи; він втрачається після трансплантації яєчника в тіло самиці з безбарвною гемолімфою і вони стають білими; навпаки, при пересадці яєчника від донора з безбарвною гемолімфою в організм самиці з жовтою гемолімфою ооцити набувають жовтого забарвлення; таким чином, жовток яєць імплантованого яєчника завжди набуває колір гемолімфи реципієнта (Umeya, 1926). Наші спостереження, підтверджуючи дані японського дослідника, доповнюють їх ефектом зміни забарвлення гонад реципієнта, нез'ясовним в припущенні пасивної дифузії каротиноїдів між гонадами, коли вони, у противагу нашим спостереженням, мали б однаковий колір. Можливу зміну кольору ооцитів у зародковій лінії донора в період культивування імплантату in vivo в організмі реципієнта ми відносимо до фенотипових змін, які не успадковуються і визначаються підбором донора і реципієнта. Біохімічний аналіз руху каротиноїдів між імплантатом і органами реципієнта становить експериментальний підхід для вивчення цих процесів і їх генетичного контролю в нормі (Doira, 1978; Chino, 1985; Tsuchida et al., 1998; Sakudoh et al., 2007).

За допомогою електрофорезу за Леммлі вивчали зміну спектру білків гемолімфи личинок С-5 після імплантації в них яєчника P29. Виявлено появу нових білкових фракцій на рівні 70 і 12 кДа у реципієнтів-самців; ці фракції відсутні в гемолімфі реципієнта до трансплантації, але вони присутні в гемолімфі організму донора і у самиць породи С-5; на рівні 29 кДа з'являється фракція, яка присутня в гемолімфі донора і у самиць породи С-5, проте в гемолімфі самиць Р29 вона виражена майже в 7 разів слабкіше, ніж в гемолімфі чоловічого реципієнта С-5 (рис.1, табл. 4). Можна передбачити, що поява цих фракцій викликана виходом відповідних білків з імплантованого яєчника або під його дією - із будь-якого органу реципієнта, наприклад, жирового тіла. Якщо ж цей вихід є результат дії на яєчник тих самих сигналів, що і у донора, то ми повинні зробити висновок, що ці сигнали працюють і у самців, але не ефективні у відсутності яєчника.

Таблиця 4 Відсоткове співвідношення білкових фракцій

Основними білками яєць шовковичного шовкопряда є вітеллін, що складається з чотирьох субодиниць (2 з молекулярною масою 180 кДа і дві з молекулярною масою 43 кДа), специфічний білок яєць, що складається з двох субодиниць з молекулярною масою 72 кДа і 64 кДа (Irie, Yamashita, 1983), і 30 кДа білки, що є також основними білками гемолімфи (Zhu et al, 1986). Сім'я 30 кДа білків складається принаймні з трьох білків з молекулярними масами 32.0, 31.0 і 29.5 кДа. Попередник вітелліну вітеллогенін і білки 30 кДа синтезується в жировому тілі й транспортується в оваріоли гемолімфою (Izumi, 1980); він синтезується в жировому тілі самиць і самців, але в останньому випадку в значно меншій кількості; він не надходить до ооцитів імплантованих яєчників (Miwa, Yamashita, 1985; Engelman, 1979). Білки 30 кДа фракції синтезуються в жировому тілі самиць і самців на однаковому рівні, секретуються в гемолімфу і поглинаються ооцитами (Irie, Yamashita, 1980; Izumi et al., 1980; Izumi et al., 1981).

Пересаджуючи яєчники партеноклонів у самиць й самців різних порід, що не мають здатності до партеногенезу, загальним результатом є зникнення вітелліну і зміна розподілення білків у фракції 30 кДа і збагачення цієї фракції. В організмі самців вітеллогенін не надходить до ооцитів, можливо, внаслідок його слідового вмісту в гемолімфі. У реципієнтах-самицях, відсутність вітелліну в ооцитах імплантата може бути наслідком порушення транспорту вітеллогеніна гемолімфи в імплантовані яєчники.

Найбільш варіабельним є розподіл білків 30 кДа фракції. Дійсно, на всіх електрофореграмах спостерігалися варіації кількості та/або складу білків цієї фракції. Зміни складу білків цієї сім'ї, які спостерігалися в різних варіантах трансплантацій, є наслідком відмінностей в додатковому надходженні білків до ооцитів із гемолімфи організму реципієнта; спектр білків в цій області, можливо, відіграє роль як у формуванні здатності яєць імплантата до термічного партеногенезу, так і її залежності від генотипу реципієнта.

Імплантовані в самців С-5 в II віці яєчники P29 виймали в кінці V віку для їх цитологічного та цитогенетичного вивчення. Використано чотири яєчники з досліду і два інтактні яєчники як контроль. З кожного яєчника приготували по 40 давлених препаратів, на яких було вивчено по 100 клітин. Розвиток імплантата в чужорідному оточенні відповідав розвитку яєчника в контрольній серії. Відмінності між яєчниками в досліді і в контролі виявлялися в долі пікнотичних ядер. У контролі відсоток пікнотичних ядер склав 6±0,2%, в досліді цей показник вищий - 17±0,3%. Розвиток сім'яників реципієнта відповідав розвитку контрольних сім'яників. Цитологічних відмінностей між дослідом і контролем виявлено не було. Кількість пікнотичних ядер склала 5-6% як в досліді, так і в контролі. Пікнотичні ядра в ході оогенезу і сперматогенезу є нормою. Не виключено, що збільшення числа пікнотичних ядер в імплантованому яєчнику пов'язане з трансплантаційним стресом, який включає можливі механічні пошкодження, заподіяні імплантату під час проведення операції, а також процес онтогенетичної адаптації імплантата до нового середовища.

Фенотипова мінливість при партеноклонуванні.

У роботі використовували і вивчали партеноклонування на матеріалі унікальної лабораторної колекції клонів шовковичного шовкопряда. Збереження ознак самиці-засновниці у особин партеноклона забезпечується методом термоактивації, який зводить мейоз до митозу (Астауров, 1940). У дослідженнях зі штучного партеногенезу завжди підкреслювалася фенотипова однорідність виведених в лабораторії Астаурова клонів з майже 100%-вим термопартеногенезом (Астауров, 1973); ці клони практично позбавлені аномалій розвитку і відрізняються підвищеною постійністю кількісних і якісних ознак (Астауров, 1977).

Незабаром, проте, була показана навіть генотипічна мінливість в партеноклонах, обумовлена неминучим процесом поліплоїдизації, який компенсує на самому початку розвитку відсутність запліднення; наявність тетраплоїдних яєць в грені всіх вивчених диплоїдних клонів, само по собі вже представляє внутрішньоклональну генетичну мінливість, яка через спонтанну активацію і мейоз може призвести до комбінативної генетичної мінливості усередині клона (Клименко, 1978). Пізніше були виведені клони з неповним проявом морфологічних ознак й на них була продемонстрована внутрішньоклональна мінливість навіть при синхронному розвитку особин клона в однакових умовах. Кількісні параметри цієї мінливості зумовлюються генотипом клона ще в ембріогенезі, оскільки зміна температури інкубації грени змінює ці параметри (Кліменко, Воробйова, Шахбазов, 1980). Показана мінливість була віднесена до онтогенетичних шумів, тобто самостійної мінливості, що не зводиться до впливу спадкового і середовищного компонентів і яка обумовлюється випадковою локальною флуктуацією морфогенетичних процесів (Астауров, 1971).

Про значущість морфогенетичних флуктуацій в зачатках органів і ознак можна говорити лише за інших рівних умов, які, проте, у внутрішньому середовищі організму, що розвивається, а тим більше, в різних організмах взагалі не мають місця. На певному рівні онтогенетичного аналізу ми абстрагуємося від відмінностей в оточенні зачатків, що порівнюються, від неминучої асинхронності їх виникнення. Так, ми вважаємо, що ооцити, які виймають із метелика для партеноклонування, завершили процес дозрівання, що метафаза I мейозу заблокована в них однаковою мірою, що складний мікропілярний апарат і вся архітектоніка ооплазми однакові в основній масі яєць. Насправді це не так, хоч би тому, що яйця знаходяться в двох яєчниках у восьми оваріолах, а в межа...