Остеогенна індукція та імунні властивості мезенхімальних стовбурових клітин in vitro
Визначення спектру цитокінів, що продукуються культивованими некомітованими та комітованими за остеогенним шляхом лініями мезенхімальних стовбурових клітин. Рекомендації щодо експериментального використання клітинної остеоімунної моделі in vitro.
| Рубрика | Биология и естествознание |
| Вид | автореферат |
| Язык | украинский |
| Дата добавления | 28.08.2015 |
| Размер файла | 49,9 K |
Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже
Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.
Размещено на http://www.allbest.ru/
Размещено на http://www.allbest.ru/
Остеогенна індукція та імунні властивості мезенхімальних стовбурових клітин in vitro
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук
Загальна характеристика роботи
Актуальність теми. Відомо, що імунна система ретельно контролює процеси фізіологічної та репаративної регенерації в кістці. В результаті зберігається цілісність кістки як органа, а в разі остеорепарації настає реституція кісткової тканини [Aaron J., Choi Y., 2000]. Але існують порушення остеорепаративного процесу, що спричинені явищем «остеогенної недостатності», яке обумовлене руйнуванням камбію кісткової тканини, та, як наслідок, клітини не можуть реалізувати свої гістобластичні потенції, спрямовані на відновлення кістки, що призводить до її тривалого незростання чи субституції волокнистою сполучної тканиною [Гололобов В.Г. та ін., 2004].
Останнім часом в науці формується концепція про остеоімунітет, або існування остеоімунної системи. Функціонування цієї системи тісно пов'язане як з процесами активації Т-клітин та асоційованої втрати маси кістки при аутоімунних захворюваннях, так і з вірусною інфекцією та запаленням [Urban N. et al., 2008; Rauner M. et al., 2007; Rho J. et al., 2004; Takayanagi H., 2002]. В цих процесах не останнє місце займають імунорегуляторні гормони, що контролюють кісткоутворення на системному рівні: парат-гормон, статеві гормони, глюкокортикоїди [Urban N. et al., 2008]. Існує й чіткий контроль остеогенезу на місцевому рівні за рахунок таких факторів, як, наприклад, інсуліноподібний фактор росту, трансформуючий фактор росту в, кісткові морфогенетичні білки, фактор росту фібробластів, а також цитокіни (ЦК) [De Vernejoul M.C., Marie P.J., 1996]. Однак якщо роль більшості місцевих факторів в фізіології кістки є відомою, то щодо ЦК, неімунних клітинних джерел їхньої продукції та їхньої ролі в остеорепаративних процесах, - дані в літературі є суперечливими. Постає питання відносно функціонального статусу клітин-попередників, в тому числі мезенхімальних стовбурових, або стромальних, клітин (МСК) кісткового мозку, остеобластів та остеокластів при патологічних станах, зокрема, в кістковій рані, та яким чином гуморальні та клітинні фактори впливають на остеоімунні процеси, які задіяні в порушеннях остеорепарації та регенерації кісткової тканини.
Не дивлячись на те, що при репаративному остеогенезі є передумови для повного відновлення втраченої кісткової тканини, кількість ускладнень, пов'язаних з порушенням або сповільненням загоєння кісткової рани після травматичного пошкодження, залишається достатньо високою, і, за даними різних авторів, коливається від 2,5 - 18% [Claes L., Willie B., 2007; Романенко К.К., 2002; Горидова Л.Д., Романенко К.К., 2000] до 25% [Афаунов А.И., Афаунов А.А., 1999; Гайдуков В.М., 1995]. Окрім важливого теоретичного, ця проблема має особливе прикладне значення, що полягає в можливості оптимізувати процеси загоєння кісткових ран з використанням клітинних технологій. Разом з цим, залишається невирішеним питання, за рахунок яких механізмів культивовані МСК та клітини імунної системи, що привертаються до рани, сприяють остеогенезу та дозволяють відновити цілісність кісткової тканини при її дефектах у пацієнтів з переломами кісток кінцівок, що протягом тривалого часу не зростаються [Гринь В.К. та ін., 2007; Казаков В.Н. та ін., 2006].
Тобто існує загальна проблема сповільненої консолідації переломів кісток. Для її вирішення необхідно, зокрема, дослідити функціонально-фенотипові особливості та можливі механізми взаємодій остеогенних клітин та клітин імунної системи. Отже на визначення імунних властивостей некомітованих та комітованих за остеогенним шляхом МСК в аспекті клітинної моделі in vitro й спрямовано мету та завдання дисертаційної роботи.
Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана in vitro в лабораторії клітинного та тканинного культивування Інституту невідкладної і відновної хірургії ім. В.К. Гусака в межах науково-дослідної теми за програмою АМН України «Дослідити деякі механізми остеорепаративних процесів при сповільненій консолідації переломів та дефектів кісток кінцівок за умов використання клітинно-тканинних технологій» (шифр теми АМН 27; №ДР 0107U000282), в якій здобувач є співвиконавцем.
Мета і завдання дослідження. Мета роботи - визначити in vitro імунні властивості мезенхімальних стовбурових клітин кісткового мозку людини за умов їхнього культивування з індукторами остеогенезу.
Завдання дослідження:
1) дослідити динаміку секреції лужної фосфатази лініями мезенхімальних стовбурових клітин за умови їхньої спрямованої остеогенної індукції;
2) визначити поверхневі маркери культивованих некомітованих та комітованих за остеогенним шляхом ліній мезенхімальних стовбурових клітин: молекули міжклітинної адгезії - CD44, CD62L; активації та костимуляції - CD54, CD56, CD58, CD166; інтегринових ланцюгів - CD29, CD49a, CD49b, CD49c; HLA-молекули - HLA-A, B, C, HLA-DR;
3) вивчити спектр цитокінів, що продукуються культивованими некомітованими та комітованими за остеогенним шляхом лініями мезенхімальних стовбурових клітин: ФНП-б, ІЛ-1в, ІЛ-2, ІЛ-4, ІЛ-6, ІЛ-8;
4) розробити клітинну модель in vitro для вивчення остеоімунних процесів, що задіяні в репаративному остеогенезі, котра базується на дослідженні функціонально-фенотипових властивостей культивованих некомітованих мезенхімальних стовбурових клітин, як попередників остеобластів, та остеоіндукованих мезенхімальних стовбурових клітин, як аналогів остеоцитів;
5) розробити практичні рекомендації щодо експериментального використання клітинної остеоімунної моделі «остеоіндукована культура мезенхімальних стовбурових клітин людини» in vitro.
Об'єкт дослідження - комплекс мембранних антигенів міжклітинної адгезії - CD44, CD62L; активації та костимуляції - CD54, CD56, CD58, CD166; інтегринових ланцюгів - CD29, CD49a, CD49b, CD49c; HLA-молекул - HLA-A, B, C, HLA-DR; а також спектр цитокінів - ФНП-б, ІЛ-1в, ІЛ-2, ІЛ-4, ІЛ-6, ІЛ-8 та маркер остеогенних ліній - лужна фосфатаза, котрі секретуються in vitro некомітованими та комутованими за остеогенним шляхом мезенхімальними стовбуровими клітинами 1-4 пасажів, що ізолюються зі строми кісткового мозку людини.
Предмет дослідження - функціонально-фенотипова модифікація комітованих за остеогенним шляхом ліній мезенхімальних стовбурових клітин 1-4 пасажів кісткового мозку людини.
Методи дослідження: метод культури клітин; метод імунофлуоресцентного фенотипування; імуноферментний метод BD OptEIA Human ELISA; цитохімічний метод з використанням субстрату BCIP/NBT Liquid Substrate System; МТТ-аналіз; методи інвертованої мікроскопії в світлі, що проходить, флуоресцентної та фазово-контрастної мікроскопії; методи статистичного аналізу.
Наукова новизна одержаних результатів. Вперше визначено розбіжності в експресії поверхневих антигенів досліджуваними мезенхімальними стовбуровими клітинами (МСК) in vitro: фенотип комітованих за остеогенним шляхом МСК відрізняється від фенотипу некомітованих експресією HLA-DR на рівні поодиноких клітин та припиненням експресії CD56; вперше визначено особливості та розбіжності в секреції спектру цитокінів некомітованими та остеоіндукованими МСК in vitro: культивовані некомітовані та комітовані МСК продукують ІЛ-1в та ІЛ-2, а комітовані за остеогенним шляхом МСК виявляють гіперпродукцію ІЛ-6 та ІЛ-8 до 276,5 пг/мл і 106,6 нг/мл відповідно; вперше досліджено взаємозв'язок змін фенотипу і функціональної активності некомітованих та остеоіндукованих МСК; вперше розроблено клітинну остеоімунну модель, яка дала змогу науково обґрунтувати імунні властивості МСК в культурі за рахунок поверхневої експресії функціональних молекул і секреції остеоактивних цитокінів досліджуваними клітинами, та розглядати культивовані МСК як ефективні активатори кісткової резорбції, запалення і остеоімунних реакцій в процесі порушеної остеорепарації, особливо в тих випадках, коли останній має тенденцію до хронізації та «завмирає» в проліферативній фазі запалення.
Практичне значення одержаних результатів. За матеріалами дисертації одержано 5 патентів України та здійснено 1 галузеве впровадження в практику охорони здоров'я: КПКВ - 6561030. Матеріали патенту №8551 Україна, МПК 7 А61В 5/00 та розроблена in vitro клітинна остеоімунна модель прийнято до практичного використання в лабораторії імунології ДУ «Інститут генетичної та регенеративної медицини АМН України». Матеріали дисертаційної роботи та 5-х патентів: №15677 Україна, МПК А61В 17/56, А61В 17/88, №15680 Україна, МПК C12N 5/08, C12N 5/00, A61K 35/28, №15689 Україна, МПК А61F 2/28, C12N 5/00, А61К 35/28, А61Р 19/00, №70589 А Україна, МПК 7 А61В 17/322 та №8551 Україна, МПК 7 А61В 5/00, включено до програми навчання на кафедрі травматології, ортопедії та воєнно-польової хірургії, та прийнято до практичного використання в лабораторії імунології та біохімії Донецького науково-дослідного інституту травматології та ортопедії Донецького національного медичного університету ім. М. Горького МОЗ України.
Особистий внесок здобувача. Разом з науковим керівником проф. О.А. Труновою розроблено концепцію роботи, сформульовано мету та завдання дослідження. Дисертантом особисто створено методологічну основу роботи, адекватну меті та завданням дослідження. Здобувачем із співавторами проведено вдосконалення методу маркування структур клітинної поверхні в культурі адгерентних клітин. Власне, здобувачем виконано всі дослідження з культивування, остеогенної індукції, виявлення продукції цитокінів та лужної фосфатази, фенотипування клітин, МТТ-аналізу, а також розробка експериментальної клітинної остеоімунної in vitro моделі, математична та статистична обробка матеріалу, його аналіз і узагальнення, підготовка та впровадження методичних документів.
Апробація результатів дисертації. Основні положення та результати дисертації було оприлюднене на наукових з'їздах, конференціях та конгресах: науково-практична конференція з міжнародною участю «Нові технології у травматології та ортопедії» (Донецьк, 2006); XIV з'їзд ортопедів-травматологів України (Одеса, 2006); науково-практична конференція з міжнародною участю «Реконструктивно-відновні методи в травматології та ортопедії» (Донецьк, 2007); III національний конгрес з біоетики (Київ, 2007); IV з'їзд трансплантологів України (Київ, 2007); X Українська науково-практична конференція з актуальних питань клінічної і лабораторної імунології, алергології та імунореабілітації (Київ, 2008); науково-практична конференція з міжнародною участю «Актуальні проблеми сучасної артрології» (Київ, 2008); науково-практична конференція з міжнародною участю «Сучасні теоретичні та практичні аспекти остеосинтезу» (Донецьк, 2008).
Публікації. Основні положення дисертації викладено у 11-ти публікаціях, з них 4 опубліковано у фахових виданнях, рекомендованих ВАК України, в 6-х тезах конференцій, в 1-му патенті України на винахід, 4-х патентах України на корисну модель та в 1-му галузевому впровадженні в практику охорони здоров'я.
Обсяг і структура дисертації. Дисертаційна робота викладена на 141-й сторінці машинописного тексту і складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів дослідження, 3-х розділів власних спостережень, узагальнень, висновків, практичних рекомендацій, списку використаних джерел та 1-го додатку. Дисертацію ілюстровано 10-ма таблицями та 20-ма рисунками. У бібліографічному покажчику міститься 231 джерело (з них 37 кирилицею та 194 латиницею).
Основний зміст роботи
остеогенний стовбуровий клітина цитокін
Матеріали та методи досліджень. Первинно ізольовані некомітовані культури МСК з кісткового мозку добровольців одержували відповідно до положень про біоетику за загальноприйнятими методиками [Minguell J.J. et al., 2001; Фриденштейн А.Я., 1986], та культивували в CO2-інкубаторі (Jouan, Франція) при 37ос і 5% атмосфері CO2. Зміна ростового середовища (DMEM/F12 та 15% ембріональної телячої сироватки, Sigma, США) проводилася кожну 3-тю добу культивування.
Первинного моношару культури досягали на 8-11-ту добу культивування. Отримані таким чином активно проліферуючі клітини складали контрольну групу некомітованих МСК.
Після досягнення культурами некомітованих МСК конфлуентного моношару, їх інкубували в остеогенному ростовому середовищі з додаванням 50 мкг/мл L-аскорбінової кислоти, 10 мМ в-гліцерофосфату, 0,1 мкМ дексаметазону (Sigma, США) [Marie P.J., 1999]. Зміна ростового середовища проводилася кожну 3-тю добу культивування. Інкубовані таким чином культури складали експериментальну групу остеоіндукованих, або комітованих за остеогенним шляхом, МСК. Взагалі було отримано 56 проліферуючих культур МСК від 14-ти первинних клітинних ліній. З них 51-у культуру булу доведено до утворення остеогенних ліній, що активно продукували лужну фосфатазу (ЛФ).
Для порівняння динаміки росту та проліферації конфлуентних культур некомітованих та комітованих МСК, був проведений МТТ-аналіз клітинної проліферації (Methylthіazoletetrazolіum-Cell Proliferation Assay). Це кількісний колориметричний аналіз для виміру клітинної проліферації, життєздатності й цитотоксичності [Celis J.E., 1998]. Оптична густина конвертованого клітинами барвника вимірялася з використанням фотометру для багатофункціонального аналізу Synergy HT Bio-Tek® Instruments (США) за допомогою програми КС4 System (США).
Для детекції ЛФ, або остази, використовувався реактив BCIP/NBT Liquid Substrate System (Sigma, США), що визначає активність мембранного ектозиму в імуноблотінгових і імуногістохімічних дослідженнях. Рідка субстратна система на основі 5-бромо-4-хлоро-3-індоліл фосфату (BCIP)/нітросинього тетразолію (NBT) є ефективним преципітуючим субстратом, що надійно визначає ЛФ. Продуктом реакції є темно-фіолетове забарвлення ЛФ-позитивних клітин [Valerio P. et al., 2005; Cox W.G, Singer V.L., 1999].
Детекцію ЛФ в комітованих за остеогенним шляхом МСК проводили в 24-лункових планшетах за схемою: визначення ферменту на четверту (n=42), сьому (n=42), десяту (n=42), тринадцяту (n=42), шістнадцяту (n=42) і дев'ятнадцяту (n=42) добу. Результати виражалися кількістю ЛФ-позитивних культур на кожну лінію протягом всього періоду остеогенної індукції МСК, починаючи з четвертої доби.
Мембранні поверхневі рецептори МСК визначалися моноклональними антитілами (МКА). В роботі використовувалися МКА, рекомендовані для специфічного маркування поверхневих антигенів 8-ю Міжнародною робочою нарадою з питань лейкоцитарних антигенів диференціювання людини (The 8th International HLDA Workshop and Conference, Adelaide, Australia, 2004). Всі МКА та ізотип-контролі виробництва BD Biosciences (США).
Маркування поверхневих антигенів некомітованих та остеоіндукованих МСК здійснювали в культурах 1-4 пасажів від 14-ти ліній за модифікованою здобувачем та співавторами методикою прямого та непрямого імунофлуоресцентного фарбування для флуоресцентної мікроскопії, захищеною патентом України на корисну модель [Пат. 8551 Україна, 2005]. При вивченні і порівнянні антигенів клітинної поверхні використовувалася бальна система і W-критерій Уілкоксона. Так, 1 бал відповідав поодиноким позитивним клітинам в полі зору; 2 бали - кількість позитивних клітин складала до 25%; 3 бали - до 50%; 4 бали - до 75% і 5 балів - до 100%.
Для вивчення складу мембранних антигенів, експресованих на поверхні досліджуваних культур, взагалі було проведено фенотипування 14-ти ліній МСК, що складаються з 23-х культур некомітованих МСК 1-4 пасажів та 21-ї культури остеоіндукованих МСК 1-4 пасажів.
Визначення кількості цитокінів у супернатанті проводили за допомогою імуноферментного методу та наборів BD OptEIA™ Human ELISA (BD Biosciences, США). Набори є строго специфічними відносно цитокінів людини і не виявляють перехресного реагування з іншими рекомбінантними протеїнами людини або тварин. Вимірювання здійснювали за оптичною густиною отриманого розчину з використанням фотометра для багатофункціонального аналізу Synergy HT Bio-Tek® Instruments (США) за допомогою програми КС4 System (США). Кондиційоване середовище, або супернатант, збирали виключно з моношарових конфлуентних культур МСК на першу, третю та п'яту добу в групі культивованих некомітованих МСК, та на десяту, тринадцяту, шістнадцяту та дев'ятнадцяту добу в групі комітованих за остеогенним шляхом МСК.
Візуалізацію і фотодокументування культур проводили за допомогою інвертованого мікроскопа Leica DMIL, робочої станції з обробки зображень Leica QWin500 Standard і відеокамери Sanyo TK-C1380 (Німеччина). Клітинні препарати і культури мікроскопувалися за 40-, 100-, 200- і 400-разового збільшення. Детекцію результатів імунофенотипування клітин здійснювали за допомогою системи флуоресцентної мікроскопії та обробки зображення LEICA DMLS/DC-IM-50 з використанням програм IM50 та Leica QWin Standard (Німеччина). Клітинні препарати мікроскопувалися за допомогою імерсійного об'єктиву за 1000-разового збільшення.
Статистична обробка отриманих результатів проводилась із застосуванням статистичних пакетів «Stadia 6.0» [Куланчев А.П., 1998], «MedStat» [Лях Ю.Е. та ін., 2006] з використанням адекватних методів біостатистики (рангового однофакторного аналізу Краскела-Уоліса та дисперсійного аналізу). Кількісні характеристики випадкових величин представлено в матеріалах дисертації у вигляді середніх значень та стандартних помилок середніх значень ( ± m). Значимість розбіжностей показників оцінювалася за t-критерієм Стьюдента (у разі нормального розподілу) або за W-критерієм Уілкоксона (у разі відмінності закону розподілу від нормального) та методами множинних порівнянь за допомогою непараметричного Q-критерію Данна (для порівняння вибірок різного об'єму), а також дисперсійним аналізом і методом множинних порівнянь за допомогою параметричного S-критерію Шеффе (для залежних вибірок) [Гланц С., 1999].
Отримані результати та їх обговорення. За результатами дисертаційних досліджень доведено імунні властивості культур кістковомозкових мезенхімальних стовбурових клітин людини за рахунок цитокінів, що cекретуються, та поверхневих мембранних антигенів, що експресуються, досліджуваними культивованими лініями.
Ефективність остеогенної індукції МСК вивчали шляхом дослідження ЛФ - маркерного ферменту остеогенних ліній. Продукція ЛФ остеогенними лініями достовірно зростала, починаючи з 7-ї доби культивування, та статистично значимо відрізнялась на 7, 10, 13, 16 і 19-ту добу індукції в порівнянні з 4-ю добою на рівні значимості p<0,01. Також продукція ЛФ статистично помітно збільшувалася на 10, 13, 16 і 19 добу у порівнянні з 7-ю добою індукції на рівні значимості p<0,01. Ключовий період інкубації спостерігали між 7-ю і 10-ю добою, коли практично всі досліджувані лінії МСК активно продукували ЛФ. Відзначимо, що йдеться про середні показники на одну остеоіндуковану лінію МСК з 14-ти.
В процесі остеогенної індукції кістковомозкових ліній МСК секреція ЛФ клітинами починається між 7-ю та 10-ю добою, максимально збільшується до 13-ї доби та її рівень стабільно детектується в культурах комітованих за остеогенним шляхом МСК на 13, 16 і 19-ту добу остеоіндукції. На 13, 16 і 19-ту добу ЛФ-позитивними ставали в середньому 3,6 з 4-х остеоіндукованих культур МСК, або 90%. При цьому МСК змінюють морфологію з активно проліферуючих веретеноподібних клітин в некомітованій групі до розпластаних і не проліферуючих клітин з активною продукцією ЛФ в комітованій групі.
Представлені в табл. 1 результати фенотипування розташовані за групами антигенів, яким притаманні подібні функції: адгезивні молекули міжклітинної взаємодії; молекули адгезії до ендотеліальних клітин; молекули, що забезпечують адгезію до позаклітинного матриксу; молекули, відповідальні за активацію та костимуляцію імунокомпетентних клітин; HLA-молекули.
Таблиця 1. Результати бальної оцінки імунофенотипування некомітованих та комітованих за остеогенним шляхом мезенхімальних стовбурових клітин людини 1-4 пасажів, ± m
|
CD |
Антиген |
Некомітовані МСК |
Комітовані МСК |
|||
|
1-2 (n=5) |
3-4 (n=17) |
1-2 (n=12) |
3-4 (n=13) |
|||
|
Рівень експресії молекул активації та костимуляції |
||||||
|
58 |
LFA-3 |
1,6±0,2 |
1,6±0,2 |
1,4±0,2 |
1,5±0,1 |
|
|
166 |
ALCAM |
3,8±0,2 |
3,9±0,1 |
4,8±0,1 |
4,9±0,1 |
|
|
56 |
NCAM |
3,8±0,2 |
3,9±0,1 |
0,3±0,1* |
0,2±0,1* |
|
|
54 |
ICAM-1 |
1,2±0,2 |
2,5±0,2 |
2,7±0,1* |
2,8±0,1 |
|
|
Рівень експресії молекул ендотелій-опосередкованої адгезії |
||||||
|
62L |
L-селектин, LECAM-1 |
1,8±0,4 |
1,9±0,2 |
1,7±0,1 |
2,1±0,2 |
|
|
Рівень експресії молекул міжклітинної адгезії |
||||||
|
44 |
HCAM |
4,8±0,2 |
4,9±0,1 |
4,9±0,1 |
5,0 |
|
|
Рівень експресії інтегринових субодиниць |
||||||
|
29 |
інтегрин в1 |
2,8±0,2 |
2,7±0,1 |
3,1±0,2 |
3,5±0,2* |
|
|
49а |
інтегрин б1 |
0 |
0 |
0,2±0,1 |
0 |
|
|
49b |
інтегрин б2 |
3,6±0,2 |
3,9±0,1 |
3,5±0,2 |
3,8±0,1 |
|
|
49c |
інтегрин б3 |
3,2±0,2 |
3,3±0,1 |
2,7±0,1 |
3,0±0,2 |
|
|
Рівень експресії молекул HLA |
||||||
|
- |
HLA A, B, C |
0 |
0 |
0 |
0 |
|
|
- |
HLA-DR |
0 |
0 |
0,3±0,1 |
0,5±0,1* |
Фенотип культивованих некомітованих МСК відповідно до використаної панелі маркерів та проведеного статистичного аналізу, можна подати в такий спосіб:
СD44hi/СD166hi/СD58+/CD62L+/CD29+/CD49b+/CD49c+/CD56+/CD54+
В той же час, фенотип культивованих комітованих за остеогенним шляхом МСК відповідно до використаної панелі маркерів і з урахуванням продукції ЛФ та проведеного статистичного аналізу, можна подати в такий спосіб:
СD44hi/СD166hi/СD58+/CD62L+/CD29+/CD49b+/CD49c+/CD54+/CD56-/lo/HLA-DR-/lo/ лужна фосфатазаhi
При вивченні кількісної продукції ІЛ-1в, ІЛ-2, ІЛ-4, ІЛ-6, ІЛ-8 і ФНП-б, що секретуються некомітованими і комітованими за остеогенним шляхом лініями МСК в умовах клітинної культури, з'ясувалося, що в середньому, концентрація клітин на одиницю площі культурального флакону для обох досліджуваних груп була практично однаковою та складала в групі некомітованих МСК 4,6-5 х 104/см2, в групі комітованих МСК - 4,5-5,1 х 104/см2.
Некомітовані культури МСК. З табл. 2 видно, що максимальна концентрація ЦК виявлялася в супернатантах некомітованих культур, зібраних після трьох діб культивування: ІЛ-1в - 56,2 пг/мл, ІЛ-2 - 14,9 пг/мл, ІЛ-4 - 32,6 пг/мл, ІЛ-6 - 112,5 пг/мл, ІЛ-8 - 386,1 пг/мл і ФНП-б - 17,7 пг/мл.
Таблиця 2. Концентрація цитокінів в супернатантах культур некомітованих мезенхімальних стовбурових клітин залежно від доби культивування, пг/мл, ± m
|
Цитокін |
1 доба (n=30) |
3 доба (n=30) |
5 доба (n=30) |
|
|
ІЛ-1в |
16,6±2,0 |
56,2±3,6* |
25,4±3,7# |
|
|
ІЛ-2 |
3,5±0,6 |
14,9±1,5* |
12,6±0,4* |
|
|
ІЛ-4 |
13,1±1,1 |
32,6±1,7* |
5,0±0,8*# |
|
|
ІЛ-6 |
86,5±4,4 |
112,5±4,7* |
105,1±2,5* |
|
|
ІЛ-8 |
202,2±5,7 |
386,1±30,2* |
196,5±19,2# |
|
|
ФНП-б |
3,9±1,2 |
17,7±1,7* |
10,8±2,6 |
При проведенні аналізу виявлено статистично значиму зміну концентрацій ІЛ-1в (p=0,002 за критерієм Краскела-Уоліса), ІЛ-2 (p<0,001 дисперсійний аналіз), ІЛ-4 (p<0,001 дисперсійний аналіз), ІЛ-6 (p=0,001 дисперсійний аналіз), ІЛ-8 (p=0,003 дисперсійний аналіз) і ФНП-б (p<0,001 дисперсійний аналіз) залежно від доби культивування. Таким чином, тридобовий рівень секреції ЦК некомітованими культурами МСК був прийнятий за базовий за даних умов культивування.
Комітовані культури МСК. Визначення концентрації ЦК (рис. 2) в комітованих остеоіндукованих культурах МСК проводили в тридобових супернатантах на 10, 13, 16 і 19 добу індукції.
Як видно з рис. 2, чіткої лінійної залежності в зменшенні чи збільшенні секреції ЦК МСК залежно від доби культивування не спостерігалося. Тому процес продукції ЦК досліджували за методом побудови апроксимуючої функції - лінійної регресії. За умов побудови лінійних регресій можна виявити тенденцію в цитокіновій продукції з певним рівнем достовірності (R2 > 1). Так, для ІЛ-1в, ІЛ-2 і ІЛ-4 (див. рис. 2 а-в) спостерігалася тенденція до збільшення секреції з 10-ї по 19-ту добу індукції, а для ІЛ-6, ІЛ-8 і ФНП-б - до зниження (див. рис. 2 г-є).
При проведенні аналізу виявлено статистично значиму зміну концентрації ІЛ-1в (p<0,001 дисперсійний аналіз), ІЛ-2 (p=0,007 дисперсійний аналіз), ІЛ-4 (p=0,02 дисперсійний аналіз), ІЛ-6 (p=0,003 дисперсійний аналіз), ІЛ-8 (p=0,003 за критерієм Краскела-Уоліса) і ФНП-б (p<0,001 дисперсійний аналіз) залежно від доби культивування (див. рис. 2).
На рис. 3 наведено порівняльну діаграму середнього рівня ЦК в тридобових супернатантах некомітованих і комітованих ліній МСК. Для порівняння представлено також референтні аналітичні значення концентрацій ЦК, що вимірювалися в нестимульованих клітинних культурах мононуклеарних клітин периферичної крові (МКПК) здорових донорів [Human IL ELISA Instruction Manuals BD OptEIA, США, 2005].
Фактор некрозу пухлин - альфа. Як видно з рис. 2 є, концентрація ФНП-б в супернатантах комітованих культур достовірно збільшувалася з 10-ї по 13-ту добу до 18,5 пг/мл (p<0,05), а потім поступово зменшувалася до мінімального значення 5,4 пг/мл з 13-ї по 19-ту добу остеогенної індукції МСК (p<0,05).
Інтерлейкін 1в. Середній рівень прозапального ІЛ-1в, як видно з рис. 3, був достовірно вищим в комітованій групі - 47,8 пг/мл (p<0,05). Його рівень в супернатантах некомітованих МСК, як видно з табл. 2, достовірно підвищувався на 3-ю добу культивування до максимального значення - 56,2 пг/мл (p<0,05) і знижувався на 5-ту добу до 25,4 пг/мл (p<0,05). Продукція ІЛ-1в комітованими остеоіндукованими лініями, як видно з табл. 2, була в 1,5 рази вищою, ніж некомітованими (32,7 пг/мл), і майже в 5 разів вищою, ніж в культурах МКПК здорових донорів. Секреція ІЛ-1в некомітованими культурами МСК є також вищою, ніж в групі МКПК в 3 рази. Взагалі, рівень секреції цього ЦК остеоіндукованими лініями МСК, як видно з рис. 2 а, достовірно збільшувався з 10-ї по 16-ту добу індукції з максимальним значенням 67,1 пг/мл (p<0,05). Більш того, в наших дослідженнях вперше показана секреція ІЛ-1в культивованими МСК (на відміну від ІЛ-1б).
Висновки
В дисертаційній роботі здійснено теоретичне узагальнення та наведено нове вирішення наукового завдання відносно визначення імунних властивостей та ефективності спрямованої індукції мезенхімальних стовбурових клітин кісткового мозку людини за остеогенним шляхом, що призводить до змін рецепторного апарату та динаміки цитокінової продукції досліджуваними клітинами з можливістю стимуляції остеорепаративного процесу за рахунок остеоімунних гуморальних та клітинних взаємодій.
1. Комітовані за остеогенним шляхом імунорегуляторні культури мезенхімальних стовбурових клітин людини з 10-ї доби індукції починають продукувати лужну фосфатазу - 78% культур (p<0,05). Максимальна кількість позитивних по лужній фосфатазі культур спостерігається з 13-ї по 19-ту добу остеоіндукції - 90% культур (p<0,05). Впродовж тритижневого процесу остеогенної індукції мезенхімальні стовбурові клітини змінюють морфологію з фібробластоїдних недиференційованих активно проліферуючих та не продукуючих лужну фосфатазу клітин на непроліферуючі розпластані відросчаті округло-багатокутні клітини, що активно продукують лужну фосфатазу.
2. Загальними мембранними антигенами, згідно досліджуваної панелі, для некомітованих та комітованих за остеогенним шляхом мезенхімальних стовбурових клітин кісткового мозку людини за умов їхнього культивування є: СD44, СD166, СD58, CD62L, CD29, CD49b, CD49c і CD54. Не ідентифікуються СD49a і HLA A, B, C. Після спрямованої остеогенної індукції комітовані мезенхімальні стовбурові клітини, на відміну від некомітованих, починають експресувати HLA-DR на рівні поодиноких клітин (p<0,05), та припиняють експресувати CD56 (p<0,05).
3. Загальний спектр цитокінів, які продукуються некомітованими та комітованими за остеогенним шляхом культурами мезенхімальних стовбурових клітин кісткового мозку людини в умовах культивування, представлений ІЛ-1в, ІЛ-2, ІЛ-4, ІЛ-6, ІЛ-8 і ФНП-б. Вперше показано секрецію ІЛ-1в та ІЛ-2 культивованими некомітованими мезенхімальними стовбуровими клітинами (ІЛ-1в - 32,7±4,9 пг/мл, ІЛ-2 - 10,4±1,4 пг/мл) та виявлено збільшення рівня секреції ІЛ-1в та ІЛ-2 комітованими за остеогенним шляхом мезенхімальними стовбуровими клітинами (ІЛ-1в - до 47,8±3,2 пг/мл та ІЛ-2 - до 14,4±0,5 пг/мл (p<0,05)).
4. Вперше показано гіперпродукцію ІЛ-6 та ІЛ-8 культивованими комітованими за остеогенним шляхом мезенхімальними стовбуровими клітинами (ІЛ-6 - до 276,5±5,6 пг/мл, ІЛ-8 - до 106,6±4,3 нг/мл, (p<0,05)) у порівнянні з некомітованими мезенхімальними стовбуровими клітинами (ІЛ-6 - до 101,4±3,2 пг/мл, ІЛ-8 - до 262,0±25,0 пг/мл, (p<0,05)).
5. На основі розробленої in vitro клітинної моделі остеогенної індукції доведено імунні властивості культур кістковомозкових мезенхімальних стовбурових клітин людини за рахунок остеоактивних цитокінів, що cекретуються, та поверхневих мембранних антигенів, що експресуються, досліджуваними культивованими лініями.
Список наукових праць, опублікованих за темою дисертації
1. Зубов Д.А. Функционально-фенотипическая характеристика мезенхимальных стволовых клеток человека / Д.А. Зубов // Імунологія та алергологія. - 2008. - №2. - С. 67-72.
2. Зубов Д.О. Імунорегуляторна роль мезенхімальних стовбурових клітин в остеорепаративному процесі / Д.О. Зубов // Фізіол. журн. - 2008. - Т. 54, №4. - С. 30-36.
3. К вопросу об обосновании применения культивированных фетальных фибробластов человека в комплексном лечении хронических мезенхимальных дефектов / А.Г. Попандопуло, О.М. Корчак, О.А. Трунова, Д.А. Зубов, И.А. Разенкова // Архив клинической и экспериментальной медицины. - 2004. - Т. 13, №1-2. - С. 55-61. (Здобувачем була виконана робота по культивуванню клітин та проведенню серії експериментів, а також аналізу отриманих результатів та узагальненню зібраного матеріалу).
4. Дія синтетичних полісахаридів на проліферативну активність дермальних фібробластів щурів / Д.О. Зубов, І. О. Сліпченко, Р.Г. Васильєв, О.М. Корчак, О. Є. Чуприна, А.Г. Попандопуло, В.К. Гусак // Експериментальна та клінічна фізіологія і біохімія. - 2003. - Т. 2, №22. - С. 18-23. (Здобувачем була виконана робота по культивуванню клітин та проведенню серії експериментів, а також аналізу отриманих результатів та узагальненню зібраного матеріалу).
5. Возможности применения культивированных мезенхимальных стволовых клеток в травматологии и ортопедии / В.К. Гринь, Д.А. Зубов, А.Г. Попандопуло, В.М. Оксимец // Трансплантологія. - 2007. - Т. 9, №1. - С. 55-59. (Здобувачем була виконана робота по культивуванню, фарбуванню клітин на лужну фосфатазу, фенотипуванню клітинних ліній, аналізу отриманих результатів та класифікації зібраного матеріалу).
6. Зубов Д.А. Функционально-фенотипическая характеристика культивированных некоммитированных и коммитированных по остеогенному пути мезенхимальных стволовых клеток / Д.А. Зубов // Травма. - 2008. - Т. 9, №3. - С. 297-303.
7. Зубов Д.А. Цитокиновая иммунорегуляция репаративной регенерации костной ткани культивированными мезенхимальными стволовыми клетками / Д.А. Зубов, В.М. Оксимец // Травма. - 2008. - Т. 9, №2. - С. 145-153. (Здобувачем була виконана робота по культивуванню клітин та проведенню серії експериментів з визначенню вмісту цитокінів в клітинному супернатанті, а також аналізу отриманих результатів та узагальненню зібраного матеріалу).
8. Индуктивные свойства носителей мезенхимальных стволовых клеток / В.Г. Климовицкий, В.К. Гринь, И.В. Василенко, В.М. Оксимец, Д.А. Зубов, В.М. Пастернак, А.Г. Попандопуло, А.А. Антонов // Травма. - 2007. - Т. 8, №3. - С. 243-247.
Размещено на Allbest.ru
...Подобные документы
Типи клітинної організації. Структурно-функціональна організація еукаріотичної клітини. Вплив антропогенних чинників на довкілля. Будова типових клітин багатоклітинного організму. Ракція клітин на зовнішні впливи. Подразливість та збудливість клітин.
курсовая работа [4,0 M], добавлен 02.12.2012Основні процеси, за допомогою якого окремі клітини прокаріотів і еукаріотів штучно вирощуються в контрольованих умовах. Здатність перещеплених клітин до нескінченного розмноженню. Культивування клітин поза організмом. Основні види культур клітин.
презентация [1,3 M], добавлен 16.10.2015Особливості та основні способи іммобілізації. Характеристика носіїв іммобілізованих ферментів та клітин мікроорганізмів, сфери їх застосування. Принципи роботи ферментних і клітинних біосенсорів, їх використання для визначення концентрації різних сполук.
реферат [398,4 K], добавлен 02.10.2013Основна структурно-функціональна одиниця всіх живих організмів. Основні типи клітин. Будова, розмноження клітин та утворення білка. Колоніальні та багатоклітинні організми. Заміщення відмерлих та пошкоджених тканин організму. Способи поділу клітин.
презентация [5,6 M], добавлен 18.12.2011Уявлення про клітину. Загальний план її будови. Основний білок мікрофіламентів. Швидкість росту мікрофіламентів при різних концентраціях вільного актину. Рух клітин і адгезійна взаємодія. Схема будови центріолі. Прогрес в розумінні механізму руху клітин.
реферат [3,4 M], добавлен 19.12.2014Стовбурові клітини як прародительки всіх без винятку типів клітин в організмі, знайомство з функціями. Загальна характеристика методу виділення клітин, вирощування органів на поживних середовищах. Аналіз найвідоміших прикладів наукових досягнень.
презентация [871,2 K], добавлен 02.02.2014Коннекторный и рестриктазно-лигазный методы конструирования рекомбинантных молекул ДНК in vitro, их применение в генной инженерии. Реакция лигирования; рестриктазные операции. Использование метода амплификации сегментов ДНК в полимеразной цепной реакции.
презентация [985,3 K], добавлен 17.08.2015Вивчення механізмів зміни, розмноження та реплікації генетичної інформації. Особливості організації, будови та функції клітин. Забезпечення редуплікації ДНК, синтезу РНК і білка. Характеристика еукаріотів та прокаріотів. Кінцеві продукти обміну речовин.
реферат [1,0 M], добавлен 19.10.2017Ультраструктура та механізм регенерації клітин. Просвічуюча та скануюча електронна мікроскопія. Об'ємне зображення клітин. Електронограма інтерфазного ядра. Проведення складних морфометричних вимірювань у клітини завдяки використанню цитоаналізаторів.
презентация [13,3 M], добавлен 24.02.2013Характеристика біотехнології отримання ембріонів in vitro, напрямки та перспективи її вдосконалення. Умови середовища культивування ооцит-кумулюсних комплексів. Впровадження біоритмічно осцилюючих параметрів культивування біологічних мікрооб’єктів.
статья [150,5 K], добавлен 21.09.2017Цитопатичні зміни інфікованих вірусом клітин. Неспецифічні ушкождення, причини цитопатичного ефекту і подальшої загибелі клітин. Характеристика та особливості цитолітичного ефекту. Виявлення біохімічних і цитохімічних змін при вірусних інфекціях.
презентация [694,3 K], добавлен 27.05.2019Об'єкти і методи онтогенетики. Загальні закономірності і стадії індивідуального розвитку. Генетична детермінація і диференціація клітин. Диференційна активність генів і її регуляція в процесі розвитку. Летальна диференціація клітин за розвитку еукаріотів.
презентация [631,0 K], добавлен 04.10.2013Відкриття та характеристика генетичного коду, його загальні властивості й практичне застосування. Будова ланцюгів РНК і ДНК. Вирощування культури клітин E. Coli на протязі багатьох поколінь в середовищі, що містить як джерело азоту хлористий амоній.
реферат [855,7 K], добавлен 14.11.2015Предмет, історія розвитку і завдання мікробіології. Основні типи та склад бактеріальних клітин. Класифікація, морфологія, будова та розмноження клітин грибів та дріжджів. Відмінні ознаки і морфологія вірусів та інфекцій. Поняття та сутність імунітету.
курс лекций [975,8 K], добавлен 22.02.2010Перстач прямостоячий: біологічний опис, різновиди, фармакологічні властивості, використання, способи розмноження та рекомендації щодо вживання. Практичне використання, антирадіаційні властивості, техніка вирощування материнки звичайної. Відвар материнки.
реферат [35,2 K], добавлен 27.11.2013Розгляд загальних положень механізму трансформації бактерій, рослин та тварин. Дослідження трансформації листових дисків тютюну шляхом мікроін’єкцій. Методика отримання трансформованих пагонів, їх підтримання і розмноження за допомогою брунькових пазух.
курсовая работа [349,3 K], добавлен 15.10.2014Культура ткани в размножении пшеницы. Гормональная регуляция в культуре ткани, схема контроля органогенеза. Роль гуминовых кислот в процессе стимуляции роста растений, их влияние на характер белкового и углеводного обмена растений пшеницы in vitro.
курсовая работа [1,9 M], добавлен 05.11.2011Способи вегетативного розмноження рослин. Розмноження поділом куща, нащадками, горизонтальними, вертикальними та повітряними відводками, окуліруванням, живцями та щепленням. Метод культури клітин. Регенерація органів у рослин шляхом репродукції.
курсовая работа [1,8 M], добавлен 09.09.2014Механізми дії та функції цитокінів у нервовій системі, їх взаємодії на рівні головного мозку. Рецептори цитокінів в межах центральної нервової системи (ЦНС). Стимуляція гіпоталамо-гіпофізарно-адреналової системи як доказ прямого впливу цитокінів на ЦНС.
реферат [5,7 M], добавлен 13.11.2013Історія розвитку та застосування біотехнології - комплексу наук, технічних засобів, спрямованих на одержання і використання клітин мікроорганізмів, тварин і рослин, а також продуктів їх життєдіяльності: ферментів, амінокислот, вітамінів, антибіотиків.
реферат [27,9 K], добавлен 07.12.2010
