Епідеміологія вірусу шарки сливи (Plum pox virus) в Закарпатському регіоні

20

Размещено на http://www.allbest.ru/

20

КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

ІМЕНІ ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

03.00.06 - вірусологія

УДК 578.85/86

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

ЕПІДЕМІОЛОГІЯ ВІРУСУ ШАРКИ СЛИВИ

(PLUM POX VIRUS) В ЗАКАРПАТСЬКОМУ РЕГІОНІ

ЮСЬКО ЛЕСЯ

СЕРГІЇВНА

КИЇВ-2009

Дисертація є рукописом.

Робота виконана на кафедрі вірусології біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка.

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор Поліщук Валерій Петрович, Київський національний університет імені Тараса Шевченка, завідувач кафедри вірусології

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор Коваленко Олексій Григорович, Інститут мікробіології і вірусології імені Д.К. Заболотного НАН України, завідувач відділу фітопатогенних вірусів

Кандидат сільськогосподарських наук Юхименко Анатолій Іванович,

Миронівський інститут пшениці ім. В.М. Ремесла, Українська академія аграрних наук, науковий співробітник

Захист дисертації відбудеться « 19 » травня 2009 р. о 14 00 год. на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.001.14 при Київському національному університеті імені Тараса Шевченка за адресою: 03127, м. Київ, просп. акад. Глушкова 2, корпус 12, біологічний факультет, ауд. 433.

Поштова адреса: 01033, м. Київ, вул. Володимирська 64.

З дисертацією можна ознайомитись у науковій бібліотеці ім. М. Максимовича Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою: 01033, м. Київ, вул. Володимирська 58.

Автореферат розісланий « 13 » квітня 2009 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, кандидат біологічних наук О.В. Молчанець

1. ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Віруси кісточкових плодових культур привертають увагу вірусологів та фітопатологів усього світу, оскільки завдають значних економічних втрат садівництву. Захворювання вірусної етіології відрізняються великою шкодочинністю і значно знижують продуктивність садів: втрати врожаю можуть сягати 30-40%, а в окремі роки на чутливих сортах - 70-90 % [Vasilakakis M., 1999; Garcia J.A., 2007]. Крім того, уражені вірусом рослини сильніше піддаються несприятливій дії умов навколишнього середовища, стають більш чутливими до збудників грибкових та бактеріальних хвороб.

На сьогодні одним із найбільш небезпечних вірусів кісточкових плодових культур вважають вірус шарки сливи (ВШС). Він уражує фактично всі види кісточкових і є найбільш шкодочинним вірусом на сливі, абрикосі та персику в Європі [Llacer G., 2006]. ВШС має статус карантинного вірусу у всьому світі, а в Україні віднесений до національного “Переліку регульованих шкідливих організмів”, обмежно поширених на території країни.

Оскільки єдиним дієвим заходом протистояння експансії ВШС є вчасна діагностика та проведення упереджувальних профілактичних заходів по усуненню резерваторів та переносників інфекції, запровадження стійких сортів та отримання безвірусного посадкового матеріалу, то Україна, як і кожна країна, яка займається вирощуванням кісточкових культур, повинна мати власну стратегію з контролю шарки сливи. Для розробки такої стратегії необхідно перш за все визначити ареал розповсюдженості вірусу та дослідити властивості ізолятів (штамове різноманіття, шлях передачі, коло рослин-господарів, резерватори, біологічні та молекулярні властивості), а також реакції на зміни довкілля. Відповідь на всі ці питання дозволить розробити дієві заходи попередження поширення та розвитку шарки в насадженнях кісточкових культур.

В Україні вивчення вірусу шарки сливи розпочалось порівняно недавно [Ратушняк Л.К., 2004; Kondratenko P., 2006]. Дуже гостро стоїть питання дослідження українських ізолятів вірусу шарки сливи в аспекті встановлення специфічності їх геномів та ряду фізико-хімічних та біологічних властивостей.

З огляду на вищесказане, вивчення молекулярно-біологічних характеристик вірусу шарки сливи та хвороби шарки на території України, зокрема в Закарпатському регіоні, що зумовлено геоекономічним розташуванням області та кліматичними умовами, які сприяють вирощуванню кісточкових плодових культур, є актуальним. На даному етапі такі дослідження необхідні для запобігання поширення вірусу шарки сливи на території нашої країни, а в подальшому - і для виробництва високоякісного посадкового матеріалу, який задовольняв би потреби садівництва України.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконувалась у межах науково-дослідної роботи Закарпатського територіального центру карантину рослин ІЗР УААН за темою 14.06/024 "Розробити систему моніторингу, прогнозування появи і розвитку карантинних організмів, основи раціонального захисту від них, удосконалити методи їх виявлення, ідентифікації та локалізації" (реєстраційний номер № 0106U002794), у межах науково-дослідної роботи кафедри вірусології біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка за темою “Вивчення екологічних особливостей та біоіндикаторних властивостей різних організмів та їх угруповань в умовах трансформованого середовища для розв'язання проблем біобезпеки України” (реєстраційний номер № 06БФ036-04) та в рамках договору № М/170-2007 від 14.05.2007 р. між кафедрою вірусології Київського національного університету імені Тараса Шевченка та Інститутом ботаніки (Вільнюс, Литва) на виконання (передачу) науково-технічних робіт НДР “Вивчення розвитку штамів вірусу шарки сливи у Литві та Україні та розробка біотехнологічних методів для отримання безвірусного посадкового матеріалу”.

Мета та завдання дослідження. Метою роботи було визначити ареал розповсюдження вірусу шарки сливи в Закарпатській області та дослідити молекулярно-біологічні властивості Закарпатських ізолятів вірусу шарки сливи.

Для досягнення мети були поставлені такі завдання:

Ш візуальне обстеження насаджень кісточкових плодових культур Закарпатського регіону на наявність шарки сливи;

Ш порівняння поширення шарки сливи на кісточкових у різних агро-кліматичних районах Закарпатської області;

Ш ідентифікація вірусу шарки сливи;

Ш вивчення молекулярно-біологічних характеристик закарпатських ізолятів вірусу шарки сливи та порівняння їх із стандартними штамами;

Ш ідентифікація попелиць - переносників вірусу шарки сливи.

Об`єкти дослідження - вірус шарки сливи, а також кісточкові плодові культури.

Предмет дослідження - поширеність шарки сливи в насадженнях кісточкових плодових культур Закарпатського регіону та біологічні і молекулярні характеристики Закарпатських ізолятів вірусу шарки сливи.

Методи дослідження. Візуальне обстеження насаджень кісточкових культур, біологічне тестування, твердофазний імуноферментний аналіз в модифікації „сендвіч”, імунно-сорбентна електронна мікроскопія, полімеразна ланцюгова реакція.

Наукова новизна одержаних результатів. Отримано детальну карту по розповсюдженню вірусу шарки сливи на території Закарпатського регіону та показано відмінність в інфікуванні різних сортів і видів кісточкових культур.

Встановлено видову приналежність попелиць - потенційних векторів вірусу шарки сливи в Закарпатському регіоні.

Вперше було отримано сіквенс гена білка оболонки закарпатських ізолятів ВШС, показано їх належність до штаму D.

Практичне значення роботи. Отримані результати по поширенню вірусу шарки сливи в Закарпатській області можуть бути використані для запобігання розповсюдження вірусу, оздоровлення посадкового матеріалу та пошуку стійких до нього сортів.

Показано, що динаміка накопичення ВШС в рослині протягом вегетаційного періоду значно варіює, що необхідно враховувати при відборі зразків для подальшого лабораторного тестування методом ІФА.

Підібрана пара праймерів, яка може бути використана для створення українського високочутливого діагностичного тесту на основі ПЛР.

Особистий внесок здобувача. Дисертація є самостійною роботою автора. Інформаційних пошук, опрацювання літературних джерел, розробка схем експерименту, отримання експериментальних даних, їх узагальнення та інтерпретацію автором дисертації здійснено особисто. Підготовку публікацій за отриманими результатами та представлення результатів на наукових конференціях здійснено за участю наукового керівника д. б. н., проф. В.П. Поліщука.

Підготовка проб та тестування зразків кісточкових культур методом ЗТ-ПЛР проводились автором спільно із доцентом кафедри вірусології КНУ ім. Тараса Шевченка, к. б. н. Будзанівською І.Г.; лабораторні дослідження з ідентифікації попелиць - спільно із доцентом кафедри зоології УжНУ, к. б. н. Чумаком В.О.

Апробація результатів дисертації. Матеріали роботи доповідались на Міжнародній науковій конференції «Мікробні біотехнології» (Одеса, Україна, вересень 2006 р.); Міжнародній науково-практичній конференції «Інтегрований захист рослин. Проблеми та перспективи» (Київ, Україна, листопад 2006 р.); V Міжнародній науково-практичній конференції студентів, аспірантів та молодих вчених "Шевченківська весна" (Київ, Україна, березень 2007 р.); ІІІ Міжнародній науковій конференції студентів і аспірантів "Молодь та поступ біології" (Львів, Україна, квітень 2007 р.); V Міжнародній конференції "Біоресурси та віруси" (Київ, Україна, вересень 2007 р.); European meeting on Plum pox 2007 (Pula, Croatia, September 2007); 10-th International Plant Virus Epidemiology Symposium (ICRISAT, Hyderabad, India, October 2007); International Plant Protection Conference "Advances in Plant Protection Strategies" (Druskininkai, Lithuania, September 2008).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 14 робіт, з них статей в наукових виданнях - 5, тез в матеріалах конференцій - 9. Права співавторів не порушено.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається із вступу, огляду літератури, матеріалів та методів, результатів та їх обговорення, підсумків, висновків та переліку використаних джерел. Повний обсяг роботи складає 119 сторінок друкованого тексту, що включає 29 рисунків, 5 таблиць та перелік використаних джерел (225, з них 199 - іноземні).

Подяка. Особлива подяка висловлюється спеціалістам Державної інспекції з карантину рослин по Закарпатській області за надання допомоги при моніторингу насаджень кісточкових культур Закарпатської області на наявність шарки сливи, доценту Будзанівській І.Г. за допомогу в філогенетичному аналізі, професору Ю. Станіолісу - за допомогу в електронно-мікроскопічних дослідженнях.

2. ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

Розділ 1. ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

Огляд літератури складається з чотирьох підрозділів, в яких наведені сучасні відомості про вірус шарки сливи - ареал розповсюдження вірусу в світі, морфологічні, фізико-хімічні, біологічні та молекулярні властивості, висвітлені питання діагностики вірусу шарки сливи, наведено методи запобігання інфікування та оздоровлення уражених цим вірусом кісточкових культур. Огляд літератури обґрунтовує доцільність виконання роботи.

Розділ 2. МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Дослідження проводили в Берегівському, Велико-Березнянському, Виноградівському, Воловецькому, Іршавському, Міжгірському, Мукачівському, Перечинському, Рахівському, Свалявському, Тячівському, Ужгородському та Хустському районах Закарпатської області. Матеріалом при дослідженні були зразки сливи, аличі, абрикоси та персика (листки, бруньки, пелюстки, кора одно-дворічних пагонів, плоди), відібрані в квітні-жовтні в насадженнях кісточкових плодових культур Закарпатської області.

Візуальну діагностику насаджень кісточкових культур проводили за зовнішніми симптомами ураження листкових пластинок та плодів вегетуючих рослин в період з квітня по жовтень.

Біологічне тестування вірусу шарки сливи проводили на рослинах-індикаторах, загальноприйнятих для цього вірусу: лободи (Chenopodium foetidum), тютюну (Nicotiana benthamiana, N. clevelandii, N. tabacum cv. Samsun), петунії (Petunia spp.) та гороху (Pisum sativum) сорту “Альфа” [Oosten van H.J., 2005]. Рослини інокулювали механічно та уколом в жилку листка у віці трьох-чотирьох справжніх листків. Для кожного досліду використовували не менше трьох рослин.

Ідентифікацію вірусу проводили із застосовуванням твердофазного імуноферментного аналізу (ІФА) (“сендвіч”-метод) із використанням стандартної комерційної тест-системи (фірма „Loewe”, Німеччина) до вірусу шарки сливи.

Для визначення наявності вірусу у сокові уражених рослин сливи використовували метод імуносорбентної електронної мікроскопії (ICEM). Для сенсибілізації використовували антитіла IgG до литовського ізоляту ВШС (титр в реакції мікро преципітації 1:1024). Перед нанесенням антигену антитіла розводили 1:50. Препарати соку з ураженого листя сливи аналізували у трансмісивному електронному мікроскопі JEM-100B при збільшенні 10000-25000.

В роботі був використаний метод ПЛР із зворотною транскрипцією (RT-PCR).

Ампліфікацію маркерних генів проводили з використанням OneStep RT-PCR Kit (25) (QIAGEN). Для ампліфікації використовували пару праймерів, яка фланкує ген, що кодує структурний білок ВШС, описані Wetzel et al. (1991). Послідовність праймерів наступна:

P1: 5' ACC GAG ACC ACT ACA CTC CC -3'

P2: 5' CAG ACT ACA GCC TCG CCA GA -3'

Очікуваний розмір продукту ампліфікації ? 243 пар нуклеотидів.

Встановлення нуклеотидної послідовності РНК вірусу шарки сливи, виділеної з уражених рослин сливи, проводили після ампліфікації маркерного гену. Продукти ампліфікації очищали за допомогою Gel Using Mini Elute Columns (Qiagen, UK).

Сіквенування очищених ампліфікованих фрагментів проводили на Applied Biosystems 3730x1 DNA Analyzer з використанням Big Dye terminators, version 3.1 (Applied Biosystems, USA).

Ідентифікацію отриманих сіквенсів проводили за допомогою пошукової системи ALIGN засобами програми ALIGN (http://xylian.igh.cnrs.fr/bin/align-guess.cgi).

Статистичний аналіз експериментальних даних проводили за параметричними критеріями нормального розподілу варіант, стандартне відхилення середніх значень - за загальноприйнятою методикою з допомогою комп'ютерної системи управління базами даних MS EXCEL 2000.

Розділ 3. РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

3.1. Візуальне обстеження насаджень кісточкових культур Закарпатського регіону на наявність шарки сливи

За період з 2004 по 2008 роки нами спільно з Державною інспекцією з карантину рослин по Закарпатській області були проведені обстеження насаджень кісточкових плодових культур у всіх районах Закарпатської області на наявність симптомів шарки сливи. Симптоми вірусного ураження на кісточкових культурах спостерігали у 11 районах із 13 досліджуваних, крім Воловецького та Міжгірського районів. На сливі (Prunus domestica) симптоми з'являлись на листкових пластинках весною (квітень-травень) і не зникали до листопада місяця в роки із помірною температурою повітря влітку. Лише в 2007 році із підвищенням денної температури в ІІ декаді липня до +32,2 єС симптоми на листкових пластинках маскувались і з'являлись при пониженні температури до +24,3 єС (ІІІ декада серпня). Найбільш чіткі симптоми на листкових пластинках спостерігали через 3-4 тижні після цвітіння (рис. 1). Це були розмиті прижилкові плями або кільця по всій поверхні листкової пластинки, що мали світло-зелене або жовто-зелене забарвлення. Плями розташовувались уздовж жилок і по краях листкової пластинки, їх добре було видно на світлі, в центрі плям тканини листка зберігали нормальний зелений колір, що є характерним для шарки сливи. Однак, у двох районах, крім вищезазначеної плямистості вздовж жилок і по краях листкової пластинки, спостерігали нетипові для шарки симптоми. Так, у Брегівському районі у дерев сливи сорту “Угорка звичайна” на листі спостерігали чіткі плями жовтого кольору по всій поверхні листкових пластинок, що більше нагадувало бактеріальний некроз, а у Виноградівському районі у декількох випадках спостерігали дрібну світло-зелену крапчастість.

Рис. 1 Симптоми прижилкових плям та кілець на листкових пластинках сливи сорту “Угорка звичайна” (Ужгородський р-н)

Щодо інтенсивності, тобто ступеня ураження крони сливових дерев, то вона значно відрізнялась у різних районах області (табл. 1).

Таблиця 1 Ураження кісточкових вірусом шарки сливи в деяких районах Закарпаття за результатами візуального обстеження.

Назва району	Кількість оглянутих дерев	Кількість дерев з відповідним ступенем ураження, бали	Відсоток уражених дерев (Р), %
		0	1	2	3	4
Берегівський	670	401	111	55	103	-	40,1
Виноградівський	320	240	17	63	-	-	25,0
Мукачівський	520	367	52	34	44	23	29,4
Ужгородський	560	414	62	42	24	18	26,1
Іршавський	760	365	184	125	86	-	52,0
Хустський	800	416	164	96	69	55	48,0
Воловецький	210	210	-	-	-	-	0,0
Між гірський	150	150	-	-	-	-	0,0
Всього	3990	2563	590	415	326	96

Примітка: "-" - симптоми відсутні

За даними візуальної діагностики найбільш ураженими були дерева сливи в Іршавському та Хустському районах - 52 та 48 %, відповідно. Однак, в Іршавському районі дерева сливи з ураженням крони в 4 бали були відсутні, а в Хустському районі у 55 дерев симптоми ураження становили більше 50 % від поверхні рослини. Таким чином, незважаючи на те, що в Іршавському районі кількість дерев з симптомами ураження більша, інтенсивність ураження дерев сливи в Закарпатській області найвища в Хустському районі. Середню інтенсивність ураження крони відмічали у Виноградівському районі - у 17 та 63 дерев ураження крони становило менше 10 % та від 11 до 25 %, відповідно. Вищого ступеня прояву хвороби в цьому районі не відмічали.

На деревах абрикоси та персика на листкових пластинках симптомів, які були б подібні до шарки, не відмічали до 2008 року. І лише в травні 2008 року при обстеженні насаджень кісточкових культур Мукачівського та Ужгородського районів на листі абрикоси (P. armeniaca) були виявлені чіткі симптоми у вигляді блідо-зелених або жовто-зелених кілець та смуг. На персику (P. persicae) відмічали деформацію листкових пластинок та дрібну хлоротичну плямистість листкових пластинок. В інших районах Закарпатського регіону при обстеженні насаджень кісточкових культур у весняний період симптоми, характерні для шарки, на абрикосі та персику не відмічали.

Таким чином, з 2004 по 2008 роки нами було проведено візуальне обстеження насаджень кісточкових плодових культур 13 районів Закарпатської області на наявність шарки сливи. У 11 районах в промислових насадженнях та на присадибних ділянках кісточкових культур спостерігали симптоми вірусного ураження на листкових пластинках, які були подібними, проте відрізнялись за ступенем прояву, мали дерева аличі та сливи; на плодах - дерева аличі, абрикоси, персика та сливи. Найчастіше це були розмиті прижилкові плями або кільця по всій поверхні листкової пластинки, що мали світло-зелене або жовто-зелене забарвлення.

3.2. Порівняння поширення шарки сливи на кісточкових у різних агро-кліматичних районах Закарпатської області

За відмінностями кліматичних показників на території Закарпатської області можна умовно виділити три агро-кліматичні райони - низовинний, передгірний, гірський. З метою порівняння фітосанітарного стану насаджень кісточкових культур в цих агро-кліматичних районах (АКР) ми протягом 2004-2008 років здійснювали візуальну діагностику хвороби за симптомами, типовими для ВШС. В результаті обстеження насаджень кісточкових культур в Закарпатській області симптоми вірусного ураження виявлено на деревах в 11 районах із 13 досліджених, крім Міжгірського та Воловецького районів, що належать до гірського АКР. Найбільша загальна площа уражених шаркою дерев знаходиться в Іршавському районі (1143,68 га) - передгірний АКР та Мукачівському (907,10 га) і Ужгородському (769,10 га) районах - низовинний АКР. Найменші площі уражених дерев в Перечинському районі (21,20 га) -та Рахівському районі (30,90 га) - передгірний та гірський АКР відповідно (рис. 2).

Порівнюючи з даними карантинної служби за 2001 рік, загальна площа уражених шаркою дерев збільшилась на 95,68 га в Іршавському та на 1,2 га в Перечинському районах, в більшості районів, наприклад, в Мукачівському, Ужгородському та інших площа залишилась без змін, а в Тячівському та Рахівському районах зменшилась на 164,3 га та 20,02 га, відповідно, що є результатом викорчовування інфікованих дерев. Більша площа насаджень сливи, уражених шаркою, в Закарпатській області припадає на присадибні ділянки, крім Мукачівського та Ужгородського районів.

Рис. 2 Загальна площа уражених шаркою насаджень кісточкових культур в районах Закарпатської області при візуальному обстеженні.Як видно з отриманих результатів, найбільша загальна площа уражених вірусом дерев знаходиться в районах, що відносяться до низовинного АКР, саме тому в подальших дослідженнях ми звернули на них увагу. Також обстежували два райони передгір`я - Іршавський і Хустський, де спостерігалось значне поширення ВШС, та два райони гірського агро-кліматичного району - Воловецький і Міжгірський, в насадженнях яких симптоми вірусу шарки сливи не було виявлено.

У низинному та передгірному АКР найбільш чіткі симптоми вірусного ураження на листкових пластинках спостерігали через 3-4 тижні після цвітіння. Однак, у залежності від агро-кліматичного району та погодних умов року цей період припадав на різні місяці: від ІІІ декади квітня до І декади червня. В низинному агро-кліматичному районі прояв симптомів завжди був на 7-9 днів раніше, ніж у передгірному. Це зумовлено особливостями клімату цього агро-кліматичного району, який є найтеплішим, відповідно вегетаційний період в ньому найдовший до 250 днів, в той час як у передгір'ї він становить 210-230 днів.

Враховуючи дані візуальної діагностики, можна сказати, що найгірший фітосанітарний стан насаджень кісточкових виявився в передгірному АКР. На нашу думку, це зумовлено тим, що в цьому районі знаходяться значні площі насаджень сливи. Крім того, більшість сортів сливи, що вирощують у передгірному АКР, є дуже чутливими до даного вірусу.

Таким чином, при порівнянні поширення ВШС на кісточкових культурах в насадженнях різних агро-кліматичних районів, можна сказати, що вірус шарки найбільш поширений у передгірному АКР - і поширення, і розвиток хвороби вищий саме в цьому районі. Як наслідок - насадження кісточкових культур цього агро-кліматичного району Закарпатської області мають найгірший фітосанітарний стан.

3.3. Ідентифікація вірусу шарки сливи

Ідентифікація ВШС методом ІФА. Під час обстежень насаджень кісточкових культур на наявність симптомів шарки шляхом рендомізованого відбору в 8 районах Закарпатської області було відібрано та протестовано 668 зразків листя кісточкових культур (абрикоса, алича, слива та персик) - з них 490 з симптомами та 178 без симптомів. Тестування відібраних зразків показало, що найбільший відсоток уражених рослин знаходиться в Хустському та Іршавському районах області (рис. 3). ВШС не був виявлений за допомогою імуноферментного аналізу в зразках, відібраних у Воловецькому та Міжгірському районах.

При проведенні ІФА було встановлено, що найвищий вміст антигенів вірусу шарки знаходився в зразках відібраних у Хустському районі, а найменший - в зразках із Виноградівського району, що збігається з даними візуальної діагностики при оцінюванні ступеню ураженості рослин.

При перевірці зразків листя кісточкових культур з симптомами, характерними для шарки, та без видимих симптомів ураження, відібраних при візуальному обстеженні, було визначено, що в насадженнях Закарпатської області найбільш ураженими із представників роду Prunus є дерева сливи (P. domestica), найменш ураженими - дерева персика (P. persicae) (рис. 4). Так, зразки сливи при тестуванні ІФА у 85,8 % давали позитивну реакцію. Зразки, відібрані від аличі, абрикоси та персика, давали позитивну реакцію в ІФА у 63,3 %, 16,2 та 9,3 %, відповідно.

Рис. 3 Відсоток уражених зразків кісточкових культур
при тестуванні методом ІФА

Рис. 4 Відсоток уражених кісточкових культур, відібраних в насадженнях Закарпатської області, при тестуванні методом ІФА на наявність вірусу шарки сливи (2004-2008 рр.)

У ході обстеження було проведено ІФА з матеріалом від різних сортів сливи з метою визначення їх ураженості вірусом шарки сливи. Тестування зразків листя сливи сортів “Угорка звичайна”, “Угорка італьянська” та “Угорка молдавська” показало, що рослини майже однаковою мірою були уражені вірусом шарки сливи.

а - Угорка звичайна; б - Угорка молдавська;

в - Угорка італьянська; г - Ренклод фіолетовий

Лише 4,3 % зразків листя сливи сорту “Ренклод” давали позитивну реакцію на ВШС, а зразки листя сливи сорту “Анна Шпет” та “Стенлі” в жодній із повторностей не давали позитивний результат.

Отже, результати, отримані за допомогою імуноферментного аналізу, збігаються з даними оцінки фітосанітарного стану при візуальному обстеженні насаджень кісточкових культур Закарпатської області і показують, що найбільш уражені вірусом шарки сливи кісточкові культури Хустського та Іршавського районів. Крім того встановлено, що найбільш інфікованими ВШС є рослини сливи, а значне поширення хвороби в насадженнях Закарпатської області пояснюється вирощуванням сортів цієї культури, які сильно уражуються ВШС, а саме - „Угорки звичайної”, „Угорки італійської” та „Угорки молдавської”.

Реакція рослин-індикаторів на інфікування ВШС. При біологічному тестуванні ізоляти ВШС виділені з Берегівського, Виноградівського, Ужгородського та Хустського районів Закарпатської області були перенесені на трав'янисті рослини-індикатори Chenopodium foetidum, N. benthamiana, N. clevelandii, N. tabacum cv. Samsun, Pisum sativum сорту “Альфа”, Petunia spp.

На листі лободи (Ch. foetidum), яку інокулювали соком рослин P. domestica з симптомами, характерними для шарки, методом механічної інокуляції через 8-10 діб спостерігали дрібні хлорози здебільшого по периферії листкової пластинки. На тютюні N. benthamiana, який був інфікований соком рослин P. domestica та P. cerasifera з симптомами прижилкової плямистості, типовими для вірусу шарки, методом механічної інокуляції, через 14-18 діб після інокуляції спостерігали симптоми мозаїки. На листі P. sativum, який інокулювали методом уколу в жилку при основі листка та соком вищезазначених рослин через 10-12 діб після зараження спостерігали знебарвлення жилок та слабку системну мозаїку, що характерно для вірусу шарки сливи.

Наявність вірусу шарки сливи в рослинах-індикаторах була підтверджена за допомогою імуноферментного аналізу (табл. 2).

Таблиця 2 Реакція експериментально інокульованих рослин-індикаторів екстрактом листя P. domestica, позитивних при ІФА тестуванні

Вид рослини	Симптоми	Результат тестування методом ІФА
Chenopodium foetidum	хлороз	+
N. benthamiana	системна мозаїка	+
N. clevelandii	-	-
N. tabacum cv. Samsun	-	-
Pisum sativum, сорт “Альфа”	Знебарвлення жилок, системна мозаїка	+
Petunia spp.	-	+

Таким чином, результати біологічного тестування співпадають з результатами імуноферментного аналізу і дають підставу стверджувати про ураження кісточкових культур Закарпатської області вірусом шарки сливи.

Локалізація ВШС в рослині-хазяїні протягом вегетаційного періоду Шарка сливи, як переважна більшість вірусних хвороб рослин, є системною хворобою. Вірус шарки сливи знаходиться у всіх органах рослини-хазяїна: бруньках, листі, коренях, квітах, плодах, корі та молодих пагонах. Нами були проведені дослідження з визначення локалізації вірусу шарки сливи в деревах сливи протягом вегетаційного періоду в умовах Закарпатської області.

Тестування зразків різних органів рослини (генеративні та вегетативні бруньки, квіти, молоді та зрілі плоди, однорічні пагони) показало, що вірус був наявний у всіх досліджуваних органах (рис. 6), однак його локалізація та кількість значно варіювала в залежності від пори року.

В березні та квітні, за даними ІФА, вміст вірусу шарки сливи був найвищим у генеративних бруньках та квітках відповідно, а в вегетативних бруньках вірусу в ці місяці було найменше. Однак, із підвищенням вмісту вірусу в молодому листі, його концентрація значно зменшувалась в молодих плодах та однорічних пагонах. У плодах та пагонах вірус слабо виявлявся до вересня та серпня місяця, відповідно. Із вересня вміст ВШС в однорічних пагонах почав зростати, а в листі зменшуватись. Максимальний вміст вірусу шарки відмічали в квітках, молодому листі та стиглих плодах. Вміст вірусу слабо зростав в однорічних пагонах з травня по серпень, а також у молодих та нестиглих плодах. Показники температури повітря в період з максимальною концентрацією вірусу в тканинах квіток та листя становили 18-22 єС. Із підвищенням денної температури до 30-32 єС концентрація вірусу в тканинах листя значно зменшувалась, і дещо зростала при пониженні температури до 24 єС. кісточковий вірус слива штам

Таким чином, було показано, що локалізація ВШС та його вміст в органах ураженої рослини значно варіює протягом вегетаційного періоду. Максимальну концентрацію ВШС відмічали в квітках, молодому листі та стиглих плодах. З травня по серпень місяці ВШС не виявлявся в молодих плодах та однорічних пагонах.

Електронномікроскопічне дослідження ВШС. Електронномікроскопічні дослідження показали в сокові хворих рослин, що давали позитивний результат в ІФА з тест-системою до ВШС, наявність ниткоподібних вірусних часток довжиною біля 700-720±0,5 нм та 20±0,5 нм в діаметрі (рис. 7), що за літературними даними характерні для ВШС.

3.4. Вивчення молекулярно-біологічних характеристик закарпатських ізолятів вірусу шарки сливи та порівняння їх із стандартними штамами

Для детекції ВШС застосовували пару праймерів P1 та P2, запропоновані Wetzel et al. [Wetzel et al, 1991]. Зазначена пара праймерів ампліфікує послідовність гена, яка кодує синтез структурного білка вірусу. Очікуваний продукт ампліфікації повинен мати розмір 243 пар основ (по).

Ампліфікація з даною парою праймерів до послідовності геному ВШС призвела до появи чітких смуг ампліконів саме такої довжини (243 по) (рис. 8).

Для перевірки відповідності продукту ампліфікації нуклеотидній послідовності гена, який кодує капсидний білок ВШС, амплікони з P. domestica були сіквеновані, і за результатами сіквенсу проведений пошук відповідних послідовностей у банку генетичної інформації NCBI з використанням пошукової програми ALIGN.

Пошук аналогічних послідовностей у Генбанку показав, що продукти ампліфікації найбільш схожі з відомими послідовностями гена, який кодує капсидний білок ВШС штаму D, виділеного Teycheney P.Y. та ін. (код сіквенсу X16415.1) [Teycheney P.Y., 1989]. Порівняння даних, отриманих нами, з послідовностями показало до 99 % гомологій для фрагментів, отриманих з P. domestica, уражених ВШС. Відповідність ампліфікованих продуктів генів капсидного білка ВШС, отриманих нами при сіквенуванні, з послідовностями гена капсидного білка ВШС штаму D шляхом вирівнювання послідовностей представлена.

Отже, в результаті постановки полімеразної ланцюгової реакції було отримано продукти ампліфікації, які при порівнянні з даними Генбанку показали 99 % гомологій із послідовностями гену капсидного білка ВШС штаму D, виділеного Teycheney P.Y. та ін. (код сіквенсу X16415.1). Виходячи з цього, можна зробити висновок, що кісточкові культури в насадженнях Закарпатської області уражені D штамом вірусу шарки сливи.

3.5. Ідентифікація попелиць - переносників вірусу шарки сливи

При обстеженні насаджень кісточкових культур на рослинах аличі (Prunus cerasifera) та сливи (P. domestica) в багатьох випадках спостерігали шкідників, зокрема попелиць, які є переносниками вірусу шарки сливи. Як відомо з літератури, найбільш ефективними комахами-переносниками ВШС є Aphis craccivora, A. cardui, Brachycaudus helichrysi, B. сardui, Hyalopterus pruni, Phorodon humuli та ін. [Gildow F., 2004; Labbone G., 2001].

Колонії попелиць відмічали в І-ІІ декадах травня на деревах аличі та сливи з характерними симптоми шарки сливи. При серологічному тестуванні зразків листя із застосуванням сироватки, специфічної до ВШС, вірус був ідентифікований у всіх відібраних зразках. За зовнішнім виглядом колонії були двох типів - особини із зеленим та темно-коричневим забарвленням покривів тіла. У всіх колоніях були присутні як безкрилі, так і крилаті особини.

При ідентифікації попелиць на рослинах P. domestica була встановлена наявність колоній чотирьох видів попелиць. Це були сливова обпилена (Hyalopterus pruni), хмелева (Phorodon humuli), хеліхризова (Brachycaudus helichrysi) та татарникова (B. сardui) попелиці. На рослинах P. cerasifera були ідентифіковані B. helichrysi та B. сardui. Найбільш часто в насадженнях сливи та аличі зустрічались B. helichrysi та H. pruni. Цікавим є те, що і рослини аличі, і рослини сливи у більшості випадків були заселені не одним, а декількома видами попелиць.

Так, одним видом попелиць були заселені лише 23,7 % рослин P. cerasifera і 22,6 % рослин P. domestica, в той час як двома і трьома видами попелиць були заселені 76,3 та 77,4 %, відповідно. Така заселеність значно підвищує можливість поширення ВШС природним шляхом.

Для всіх ідентифікованих нами попелиць кісточкові культури, зокрема слива (P. domestica), є первинними хазяями. Взимку, весною та восени вони перебувають на кісточкових культурах (основний хазяїн), а влітку - на неспоріднених рослинах (вторинні хазяї). Для B. helichrysi вторинними хазяями є велика кількість трав'янистих рослин, особливо з родини Складноцвітих (Asteraceae). P. humuli влітку мігрують на рослини хмелю (Humulus lupulus), B. сardui - на рослини з родів Carduus (чортополох) та Cirsium (осот), а H. pruni - на рослини з родів Phragmites (очерет) та Scirpus (ситник) [Чумак В.О., 1999]. Значна кількість трав'янистих рослин, які є вторинними рослинами-хазяями для B. helichrysi та B. сardui, може бути резерваторами ВШС. Останній неодноразово був ідентифікований в Senecio sylvaticus, Taraxacum officinale, Cirsium arvense та Cichorium spp. [Thomidis T. et al., 2003; Virscek Man M. et al., 2004]. Ці види присутні у флорі Закарпатської області і можуть бути проміжною ланкою у ланцюзі поширення ВШС між віддаленими кісточковими культурами. Враховуючи високий рівень мутацій, властивий вірусам, в тому числі і ВШС, це може призвести до появи нових штамів вірусу шарки сливи, що відрізнятимуться значною "агресивністю".

Таким чином, в результаті ідентифікації попелиць, відібраних в насадженнях кісточкових культур Закарпатської області, була встановлена наявність чотирьох видів попелиць - сливової обпиленої попелиці, хмелевої попелиці, хеліхризової попелиці та татарникової попелиці. Ці попелиці належать до видів, які вважають найбільш ефективними переносниками вірусу шарки сливи, тому при локалізації ВШС та розробці стратегій з контролю шарки сливи в Закарпатській області необхідно обов'язково здійснювати хімічний контроль попелиць в насадженнях кісточкових культур.

ВИСНОВКИ

В результаті виконання дисертаційної роботи було проведено візуальну, серологічну та молекулярно-біологічну діагностику вірусу шарки сливи, отримано продукти ампліфікації закарпатських ізолятів ВШС, які при порівнянні з даними Генбанку показали 99 % гомологій із послідовностями гену капсидного білка ВШС штаму D. Головні наукові та практичні результати роботи сформульовано у наступних висновках:

1. В результаті візуального дослідження насаджень кісточкових культур 13 районів Закарпатської області протягом 2004-2008 рр. на наявність вірусу шарки сливи встановлено, що вірус поширений в 11 районах; вірус не виявляли у Воловецькому та Міжгірському районах Закарпатської області. Найбільший відсоток уражених рослин знаходиться в насадженнях Іршавського, Хустського, Берегівського та Мукачівського районів (52, 48, 40,1 та 29,4 %, відповідно).

2. Тестування в ІФА 668 зразків кісточкових культур (490 з симптомами та 178 без видимих симптомів ураження ВШС) показало, що найбільший відсоток уражених рослин знаходиться в Хустському та Іршавському районах Закарпатської області (87,1 та 76,9 % відповідно).

3. Встановлено, що із кісточкових культур найбільш інфікованими в Закарпатській області є дерева сливи, найменш ураженими - дерева персика - 85,8 та 9,3 % відповідно.

4. Тестування 6 сортів сливи, які вирощують в насадженнях Закарпатської області, показало, що епідеміологічне значення для ВШС мають три сорти - „Угорка звичайна”, „Угорка італійська” та „Угорка молдавська”, сорт “Ренклод фіолетовий” має обмежене епідеміологічне значення, а сорти “Анна Шпет” та “Стенлі” - не мають епідеміологічного значення для ВШС в умовах Закарпаття.

5. Показано, що ВШС найбільш поширений в насадженнях кісточкових культур, що зростають в передгірному агро-кліматичному районі Закарпаття.

6. В результаті ідентифікації попелиць, відібраних в насадженнях кісточкових культур Закарпатської області, ідентифіковано чотири види попелиць, які є найбільш ефективними переносниками вірусу шарки сливи, а саме - сливова обпилена (Hyalopterus pruni), хмелева (Phorodon humuli), хеліхризова (Brachycaudus helichrysi) та татарникова (B. сardui) попелиці.

7. При дослідженні динаміки накопичення ВШС в вегетативних органах рослини-хазяїна показано, що локалізація вірусу протягом вегетаційного періоду значно варіює, що необхідно враховувати при відборі зразків кісточкових культур для тестування методом ІФА.8. В результаті електронномікроскопічних досліджень соку хворих рослин, що давали позитивний результат в ІФА з тест-системою до ВШС, була встановлена наявність ниткоподібних вірусних часток довжиною біля 700-720 нм та 20 нм в діаметрі, що за літературними даними характерні для ВШС.

9. При проведенні ПЛР з праймерами до гена капсидного білка ВШС показана наявність продукту ампліфікації 243 по. Сіквенс продуктів ампліфікації та порівняння їх з даними Генбанку показав до 99 % гомології із послідовностями гена капсидного білка ВШС штаму D, що дало змогу ідентифікувати закарпатські ізоляти ВШС саме як штам D.

ПЕРЕЛІК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Юсько Л.С. Вірусні хвороби кісточкових культур / Л.С. Юсько, А.М. Садляк // Карантин і захист рослин. - 2006. - № 10. - С. 8-12. (Дисертантом визначено ідею роботи, проведено пошук та узагальнено літературні дані, крім того дистертантом підготовлено статтю до друку. Висновки зроблено колективно).

Staniulis J. Incidence of Plum pox virus in Lithuania and Ukraine / J. Staniulis, M. Юiюytл, T. Norkus, L. Yusko, H. Snihur, I. Budzanivska // Вісник Київського національного університету імені Тараса Шевченка. Сер. Біологія. - 2008. - № 51. - С. 40-42. (Дисертантом проведені обробка одержаних результатів, виготовлення ілюстрацій. Відбір зразків та їх тестування здійснено колективно. Висновки зроблено при участі всіх авторів).

Юсько Л.С. Поширення вірусу шарки сливи на кісточкових в різних агрокліматичних зонах Закарпатської області / Л.С. Юсько, Г.О. Снігур, О.О. Афоніна, С.М. Петренко, В.П. Поліщук // Вісник аграрної науки. - 2008. - № 4. - С. 42-45. (Дисертантом визначено ідею роботи та виконано експериментальну частину. Висновки зроблено колективно).

Norkus T. Molecular identification of Plum pox virus isolates from Lithuania and Ukraine / T. Norkus, J. Staniulis, M. Ћiюytл, M. Melnyk, L. Yusko, H. Snihur, I. Budzanivska, V. Polischuk // Zemdirbyste-Agriculture. - 2008. - T.95, № 3. - С. 277-285. (Дисертантом визначено ідею роботи. Відбір зразків та їх тестування здійснено колективно. Висновки зроблено при участі всіх авторів).

Юсько Л.С. Попелиці - потенційні вектори вірусу шарки сливи в Закарпатті / Л.С. Юсько, В.О. Чумак, Г.О. Снігур // Науковий вісник Ужгородського університету. Серія Біологія. - 2008. - № 24. - С. 96-99. (Дисертантом визначено ідею роботи. Відбір попелиць та їх визначення здійснено колективно. Висновки зроблені при участі всіх авторів)

Yusko L. Identification of Plum pox virus in Ukraine / L. Yusko, H. Snihur, O. Afonina, S. Petrenko, V. Polischuk // Journal of plant patology. - V. 90 (1). - 2008. - P. 81.

Юсько Л.С. Результати моніторингу вірусу віспи сливи в Закарпатській області / Л.С. Юсько // Міжнародна наукова конференція “Мікробні біотехнології”, 11-15 вересня 2006 р., - Одеса, Україна. - С. 165.

Юсько Л.С.Карантинні вірози кісточкових культур в Закарпатській області та методи їх ідентифікації / Л.С. Юсько, Н.В. Козіко // Матеріали Міжнародної науково-практичної конференції “Інтегрований захист рослин. Проблеми та перспективи”, 13-16 листопада 2006 р., Київ, Україна. - С. 179-182.

Станіоліс Ю. Виявлення вірусу шарки сливи в Литві та Україні / Ю. Станіоліс, М. Жижите, Г. Снігур, І. Будзанівська, В. Поліщук, Л. Юсько // V Міжнародна конференція "Біоресурси та віруси", 10-13 вересня 2007, Київ, Україна. - С. 198.

Юсько Л.С. Поширення вірусу шарки слив в Закарпатській області / Л.С. Юсько, Г.О. Снігур, О.О. Афоніна, Н.В. Козіко, В.П. Поліщук // V Міжнародна науково-практична конференція студентів, аспірантів та молодих вчених "Шевченківська весна", 1-4 березня 2007, Київ, Україна. - С. 24.

Юсько Л.С. Ідентифікація вірусу шарки слив в Закарпатській області / Л.С. Юсько, Г.О. Снігур, О.О. Афоніна, В.П. Поліщук // ІІІ Міжнародна наукова конференція студентів і аспірантів "Молодь та поступ біології". 23-27 квітня 2007, Львів, Україна. - С. 381-382.

Yusko L. Identification of Plum pox virus in Ukraine / L. Yusko, H. Snihur, O. Afonina, S. Petrenko, V. Polischuk. // European meeting on Plum pox 2007, 24-28 September 2007, Pula, Croatia. - P. 55.

Yusko L. Spread of Plum pox virus in Ukraine / L. Yusko, H. Snihur, I. Budzanivska, О. Afonina and V. Polisсhuk. // 10th International Plant Virus Epidemiology Symposium. 15-20 October 2007, ICRISAT, Hyderabad, India. - Р. 102.

Norkus T. Molecular identification of Plum pox virus isolates from Lithuania and Ukraine / T. Norkus, J. Staniulis, M. Юiюytл, M. Melnyk, L. Yusko, H. Snihur, I. Budzanivska, V. Polischuk // Аbstracts of International Plant Protection Conference "Advances in Plant Protection Strategies", 10-12 September 2008, Druskininkai, Lithuania. - P. 51.

АНОТАЦІЯ

Юсько Л.С. Епідеміологія вірусу шарки сливи (Plum pox virus) в Закарпатському регіоні. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеню кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.06 - вірусологія. - Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Київ, 2009 р.

Дисертація присвячена визначенню ареалу розповсюдження вірусу шарки сливи в Закарпатській області та вивченню молекулярно-біологічні властивостей закарпатських ізолятів ВШС.

В результаті обстеження насаджень кісточкових плодових культур 13 районів Закарпатського регіону на наявність вірусу шарки сливи встановлено, що найвищий відсоток ураження кісточкових культур вірусною інфекцією знаходиться в Іршавському, Хустському, Берегівському та Мукачівському районах.

Досліджено, що в насадженнях кісточкових культур Закарпатського регіону найбільш ураженими ВШС із представників роду Prunus є дерева сливи (P. domestica), найменш ураженими - дерева персика (P. persicae).

За допомогою електронної мікроскопії виявлені нитковидні вірусні частки біля 700-720±0,5 нм завдовжки та 20±0,5 нм в діаметрі, що характерні для ВШС.

Ідентифіковано чотири види попелиць - потенційних векторів ВШС в Закарпатському регіоні, а саме - Hyalopterus pruni, Phorodon humuli, Brachycaudus helichrysi та B. сardui.

Вперше при проведенні ЗТ-ПЛР та порівнянні продукту ампліфікації з даними Генбанку, показано до 99 % гомології із послідовностями гена капсидного білка ВШС штаму D, що дало змогу ідентифікувати закарпатські ізоляти ВШС саме як штам D.

Ключові слова: вірус шарки сливи, кісточкові плодові культури, діагностика вірусу, вектори-попелиці.

Юсько Л.С. Эпидемиология вируса шарки сливы (Plum pox virus) в Закарпатском регионе. - Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.06 - вирусология. - Киевский национальный университет имени Тараса Шевченко, Киев, 2009.

В диссертационной работе представлены результаты диагностики насаждений косточковых плодовых культур 13 районов Закарпатского региона на присутствие вируса шарки сливы. Наибольший процент инфицирования косточковых культур ВШС выявляли в Иршавском, Хустском, Береговском и Мукачевском районах. Проведено сравнение полученных результатов при использовании визуальной диагностики и тестирования с помощью иммуноферментного анализа. Показано, что визуальная диагностика в случае вируса шарки сливы при видимых симптомах инфицирования растений достоверна на 85,9±3 %, а при отсутствии - на 82±3 %.

При тестировании образцов листьев косточковых культур с помощью метода ИФА определено, что в насаждениях Закарпатского региона из представителей рода Prunus наиболее инфицированными ВШС являются деревья сливы (P. domestica), наименее инфицированными - деревья персика (P. persicae). Показано, что в условиях Закарпатской области эпидемиологическое значение для ВШС имеют три сорта сливы - “Венгерка обыкновенная”, “Венгерка итальянская” и “Венгерка молдавская”. Сорт “Ренклод” имеет ограниченное эпидемиологическое значение, а сорта “Анна Шпет” и “Стенли” не имеют эпидемиологического значения.

Биологическое тестирование закарпатских изолятов ВШС на растениях-индикаторах показало наличие симптомов, типичных для данного вируса. С помощью электронной микроскопии определены нитевидные вирусные частицы около 700-720±0,5 нм в длину и 20±0,5 нм в диаметре, которые соответствуют ВШС.

На пораженных ВШС растениях сливы идентифицировано четыре вида тлей - потенциальных векторов вируса шарки сливы в Закарпатском регионе, а именно - Hyalopterus pruni, Phorodon humuli, Brachycaudus helichrysi и B. сardui.

При исследовании динамики накопления ВШС в вегетативных органах растения-хозяина показано, что локализация вируса во время периода вегетации растения значительно варьирует. Максимальное содержание отмечали в цветках, молодых листьях и зрелых плодах. С мая по август ВШС слабо накапливался в молодых плодах и однолетних побегах, что нужно учитывать при отборе образцов косточковых культур для тестирования с помощью ИФА.

Впервые, используя ОТ-ПЦР и сравнивая продукт амплификации с данными Генбанка, показано до 99 % гомологии с последовательностями гена белка оболочки ВШС штамма D, что позволило сделать вывод о принадлежности закарпатских изолятов этого вируса к штамму D.

Ключевые слова: вирус шарки сливы, косточковые плодовые культуры, диагностика вируса, векторы-тли.

Yusko L.S. Epidemiology of sharka virus (Plum pox virus) in Transcarpathian region. - Manuscript.

The thesis for obtaining PhD degree in speciality 03.00.06 - virology. Taras Shevchenko' Kyiv National University, Kyiv, 2009.

Results of investigations of stone fruit orchards in 13 areas Transcarpathian region for occurrence of Plum pox virus are summarized in the thesis. It was established that the highest percentage of virus-infected stone fruit trees was characteristic for nurseries of Irshavsky, Khustsky, Beregovsky and Mukachivsky areas.

It was demonstrated that in orchards of Transcarpathian region the highest level of PPV infection for genus Prunus was typical for plum trees (P. domestica), and the lowest, in turn, for peach trees (P. persicae).

Using electronic microscopy, we revealed virus particles approx 700-720±0,5 nm long and 20±0,5 nm in diameter, which is typical for PPV.

The four species of aphids, which are potential vectors of Plum pox virus in Transcarpathian region were identified. These are Hyalopterus pruni, Phorodon humuli, Brachycaudus helichrysi and B. сardui.

For the first time, RT-PCR identification of PPV and sequencing of obtained nucleotide of coat protein gene with their comparison with Gene bank data allowed concluding that Transcarpathian PPV isolates belong to strain D.

Keywords: Plum pox virus, stone fruit trees, virus diagnostics, aphids-vector.

Размещено на Allbest.ru

...