Молекулярно-генетичний аналіз дистрофін-дистрогліканового комплексу у модельного об’єкта drosophila melanogaster

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЇ БІОЛОГІЇ ТА ГЕНЕТИКИ

УДК 595.773.4:575.222.7:577.112:616.74

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Молекулярно-генетичний аналіз дистрофін-дистрогліканового комплексу у модельного об'єкта drosophila melanogaster

03.00.22 - молекулярна генетика

Яценко Андрій Сергійович

Київ - 2009

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано на кафедрі генетики та біотехнології Львівського національного університету імені Івана Франка.

Науковий керівник: кандидат біологічних наук, доцент Черник Ярослава Іванівна, Львівський національний університет імені Івана Франка, доцент кафедри генетики та біотехнології.

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Строковська Людмила Іванівна, Інститут молекулярної біології та генетики НАН України, завідувач відділу біохімічної генетики;

кандидат біологічних наук, доцент Козерецька Ірина Анатоліївна, Київський національний університет імені Тараса Шевченка, доцент кафедри загальної та молекулярної генетики.

Захист дисертації відбудеться 28 квітня 2009 р. о 10⁰⁰ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.237.01 Інституту молекулярної біології та генетики НАН України за адресою: 03680, м. Київ, вул. академіка Заболотного, 150. дрозофіла дистрофін ген

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту молекулярної біології та генетики НАН України за адресою: 03680, м. Київ, вул. академіка Заболотного, 150.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, кандидат біологічних наук О.В. Підпала.

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. М'язи, як основа опорно-рухової системи, необхідні для забезпечення нормального функціонування організму. Внаслідок порушення роботи м'язів виникають м'язові дистрофії, які призводять до втрати рухливості, і часто - до летальних наслідків (Baresi et al., 2006; Bushby et al., 1999; Campbell et al., 1995; Helbling-Leclerc et al., 1995; Karpati et al., 1993). Зважаючи на важкий перебіг та відсутність лікування м'язових дистрофій, вивчення природи цих захворювань та розробка методів їхньої терапії є однією з найактуальніших проблем сучасної біології та медицини. На сьогоднішній день виявлено такі основні групи м'язових дистрофій: дистрофія Дюшена та дистрофія Бекера (DMD/BMD) (Beggs et al., 1991; Klamut et al., 1990; Lanfossi et al., 1999), оперізуюча кінцівки дистрофія першого та другого типів (LGMD type1, type2) (Bushby et al., 1991; Lim et al., 1998), які розвиваються в результаті мутацій у генах, що кодують компоненти дистрофін-глікопротеїнового комплексу (ДГК). Результати досліджень, проведених у цьому напрямку (Beggs et al., 1991; Blake et al., 2002; Klamut et al., 1990; Suzuki et al., 1994), дали змогу зрозуміти загальну будову ДГК, однак складність комплексу та велика кількість ізоформ дистрофіну ускладнюють вивчення механізмів розвитку м'язових дистрофій людини (Koenig et al., 1987). Саме тому важливим завданням є розробка модельних систем із подібними фенотиповими проявами цих патологій, для проведення генетичних досліджень. Попередньо отримані дані показали, що у Drosophila melanogster присутні всі основні компоненти ДГК, але із дещо меншою різноманітністю ізоформ (Dekkers et al., 2004; Greener et al., 2000). Крім цього, дрозофіла є зручним об'єктом генетики, що дозволяє проводити генетичний скринінг з метою пошуку регуляторних елементів геному. Зважаючи на це, актуальним є детальне дослідження функціонування ДГК у D. melanogster, а також розробка модельної системи на основі цього організму для вивчення молекулярно-генетичних механізмів виникнення м'язових дистрофій.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконувалась на кафедрі генетики та біотехнології Львівського національного університету імені Івана Франка згідно з тематикою Міністерства освіти і науки України Ф25/169-2008 «Методичні підходи детекції мутацій, які спричинюють моногенні захворювання людини, та використання тест-системи Drosophila melanogaster для вивчення молекулярно-генетичних механізмів виникнення цих захворювань» (№ державної реєстрації 0107U006913, 2008-2009 рр.). Дослідження проводились за сприяння міжнародного гранту СRDF (Civilian Research and Development Foundation) UKB1-2464-LV-05 (2005-2008 рр.) «Drosophila as a Model System of Muscular Dystrophy: A Molecular-Genetic Analysis of the Dystroglycan-Dystrophin Complex».

Мета та завдання дослідження. Метою даної роботи було створити модельну систему для вивчення м'язової дистрофії людини на основі генетичного об'єкта Drosophila melanogaster. Для досягнення цієї мети були поставлені такі завдання:

1) отримати мутантів дрозофіли за генами дистрофіну та дистроглікану;

2) визначити константу взаємодії між дистрофіном і дистрогліканом у людини та у дрозофіли;

3) дослідити роль дистрофіну та дистроглікану у забезпеченні полярності ооцита та аксонів фоторецепторів;

4) вивчити динаміку локомоторної активності та параметри тривалості життя у мутантів за генами дистрофіну та дистроглікану;

5) отримати трансгенні лінії з конструктами, що кодують різні форми дистроглікану зі зміненими сайтами в С-кінцевому домені;

6) з'ясувати роль сайтів С-кінцевої послідовності дистроглікану у забезпеченні полярності ооцита.

Об'єктом дослідження є процеси, викликані мутаціями у генах дистрофіну та дистроглікану в Drosophila melanogaster - модельного об'єкта м'язової дистрофії.

Предметом дослідження є функції, які здійснює дистрофін та дистроглікан у дрозофіли.

Методи дослідження - генетичні (отримання та вивчення мутацій, генетична трансформація клітин Escherichia coli), генно-інженерні (виділення та рестрикційний аналіз сумарної та плазмідної ДНК, конструювання рекомбінантних молекул ДНК, полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР), ПЛР-мутагенез), молекулярно-біологічні (експресія та очищення рекомбінантних білків, гель-електрофорез ДНК та білків з метою вивчення зміни їхньої електрофоретичної рухливості), мікробіологічні (культивування штамів бактерій), біохімічні (очищення, кількісний та якісний аналіз білків), гістохімічні (дослідження тканин за допомогою хімічних барвників), імуногістохімічні (вивчення локалізації білків у тканинах за допомогою специфічних антитіл), фізіологічні (вивчення рухової активності та тривалості життя).

Наукова новизна одержаних результатів. В результаті виконаної роботи вперше використано та досліджено дрозофілу як модельний об'єкт м'язової дистрофії людини. Визначена константа взаємодії між дистрофіном і дистрогліканом у дрозофіли та у людини; встановлено, що така взаємодія є консервативною. Показано, що мутації за генами Dys і Dg впливають на життєздатність мух і призводять до зниження локомоторної активності, причиною якої є прогресуюча з віком дегенерація м'язів. З'ясовано роль дистрофіну та дистроглікану у функціонуванні аксонів фоторецепторів ока і виявлено їх значення у нервових і гліальних клітинах. Встановлено, що зв'язок дистрофіну та дистроглікану є необхідним для забезпечення полярності клітин ооцита та епітеліальних клітин. Вивчено роль певних амінокислотних послідовностей С-кінцевого домена дистроглікану у забезпеченні полярності клітин. Показано, що для формування полярності ооцита необхідний SH3bsII сайт зв'язування, роль якого до цього часу не була вивченою. Важливість цього сайту вказує на можливу регуляцію, яка відбувається за участю молекул з SH3-доменом. З'ясовано також роль сайту зв'язування WWbsII. На основі проведених in vitro та in vivo досліджень встановлено, що у людини, як і у дрозофіли дистрофін взаємодіє не лише з WWbsI, але і з WWbsII сайтом С-кінцевого домену дистроглікану; ці сайти зберегли свою амінокислотну послідовність впродовж еволюції, що вказує на їхнє важливе значення у функціонуванні дистроглікану.

Практичне значення одержаних результатів полягає у розробці D. melanogaster як модельного об'єкта м'язової дистрофії людини. Виявлені нами фенотипи у дрозофіли мають подібні прояви, як і у випадку міопатій людини, що свідчить про вдалий вибір модельного об'єкта. Крім цього, отримано низку відмінних фенотипів, які досі не були вивченими, що проливає світло на розуміння характеру перебігу патологій, спричинених порушеннями у структурі ДГК. D. melanogaster дозволяє проводити генетичні експерименти, які неможливо здійснювати на хребетних, та може бути в подальшому використана для проведення генетичного скринінгу з метою пошуку нових білків у складі ДГК. Виявлення таких компонентів дистрофін-глікопротеїнового комплексу дозволить у майбутньому краще зрозуміти механізми перебігу м'язових дистрофій і допоможе розробити більш ефективну стратегію лікування. Висока консервативність взаємодій між основними компонентами ДГК та подібність фенотипів, викликаних їх втратою, дає змогу інтерпретувати отримані нові результати на інші еукаріотичні організми.

Особистий внесок здобувача. Під час виконання дисертаційної роботи автором самостійно підготовано огляд літератури та виконано основний обсяг експериментальних досліджень. Зокрема, автором отримано трансгенні лінії дрозофіли з мутантними формами дистроглікану, а також гіпоморфного мутанта за геном дистрофіну Dys^8-2, сконструйовано вектори для експресії білків дрозофіли in vitro, проведено очищення та аналіз взаємодій дистрофіну та дистроглікану, отримано лінії дрозофіли для експериментів з реверсією мутантних фенотипів, проаналізовано локомоторну активність мутантів і здійснено імуногістохімічні та гістохімічні дослідження з метою виявлення фенотипів, зумовлених втратою дистрофіну та дистроглікану. Конструювання пептидів, послідовності яких відповідають С-кінцевому фрагменту дистроглікану, для вивчення in vitro взаємодій, проведено спільно з лабораторією проф. Д. Бейкера (Університету штату Вашингтон, США). Створення векторів, що кодують дистроглікан зі змінами у С-кінцевому фрагменті, отримання трансгенних ліній та аналіз експресії дистроглікану проведено спільно з аспірантами Б. Грей та Л. Петерсон (Університет штату Вашингтон, США). Мутант за геном дистроглікану (Dg³²³), використаний у дослідженнях наданий к.б.н. В.-М. Денгом. Постановка основних завдань, аналіз та обговорення отриманих результатів проведено спільно з науковим керівником - к.б.н, доцентом Я.І. Черник, а також з проф. Г.Р. Щербатою та проф. Х. Руохолою-Бейкер, з якими автор має спільні публікації.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень доповідались на таких вітчизняних та міжнародних конференціях, симпозіумах, з'їздах: 45-ій (Вашингтон), 46-ій (Сан Дієго), 47-ій (Х'юстон) та 48-ій (Філадельфія) Міжнародних щорічних конференціях з вивчення дрозофіли «Annual Drosophila Research Conference» (США, 2004-2007); VIII-X щорічних з'їздах, присвячених біології розвитку «Developmental Biology Winter Meeting» (Сієтл, США, 2004-2006); Першій міжнародній конференції для молодих науковців «Біологія: від молекули до біосфери» (Харків, 2006); Міжнародних конференціях для студентів та аспірантів «Молодь і поступ в біології» (Львів, 2004-2008); III-ій міжнародній науковій конференції «Фактори експериментальної еволюції організмів» (Алушта, Крим, 2006), а також на звітних наукових конференціях та семінарах співробітників кафедри генетики та біотехнології Львівського національного університету імені Івана Франка, та факультету біохімії Вашингтонського університету (Сієтл, США).

Публікації. Результати дисертації опубліковано в 4-х статтях у фахових наукових журналах, 2-х статтях у збірниках наукових праць та тезах 9-и доповідей на конференціях.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, матеріалів і методів, результатів досліджень, аналізу та узагальнення результатів, списку використаних джерел (193 найменування) та додатків. Роботу викладено на 160 сторінках машинописного тексту та проілюстровано 44 рисунками і 6 таблицями.

Основний зміст

Матеріали і методи. Матеріалом досліджень були мутантні за генами дистрофіну та дистроглікану лінії Drosophila melanogaster. У проведеній роботі використано мутантів за геном дистроглікану - Dg³²³ (Deng et al., 2003) та dsDg30A (трансгенний конструкт, який призводить до зниження рівня експресії гена дистроглікану) (Deng et al., 2003), а також мутантів за геном дистрофіну - Dys^8-2 (гіпоморфний алель, отриманий в результаті вирізання мобільного елементу) та ряд трансгенних ліній для зниження рівня синтезу транскриптів: довгих ізоформ dsDysN-term (tg3, tg4), для зниження рівня короткої ізоформи Dp186 - dsDysRB (tg2) і для зниження рівня експресії транскриптів всіх ізоформ дистрофіну - dsDysС-term (tg5, tg6). Мутантний алель дистрофіну та трансгенні лінії для негативної регуляції експресії дистрофіну було отримано під час виконання роботи. З метою зниження рівня експресії транскриптів дистрофіну та дистроглікану у специфічних тканинах було використано UAS/Gal4 систему експресії та відповідні лінії активатори (Duffy, 2002). Для детекції експресії дистрофіну та дистроглікану використали специфічні антитіла до дистрофіну (van der Plas et al., 2006) та до дистроглікану (Deng et al., 2003) дрозофіли. Для отримання клональних клітин гермінативного типу, мутантних за геном дистроглікану, використано FRT систему; для отримання індивідуальних маркованих аксонів фоторецепторних клітин, мутантних за геном дистроглікану, використали систему MARCM (Theodosiou and Xu, 1998).

Зв'язування білка з пептидами визначали методом флуорисцентної поляризації на пристрої Wallac1420 Victor3 (Perkin Elmer Life Sciences, США). Пептиди, що містили послідовність С-кінцевої ділянки дистроглікану, були синтезовані і мічені тетраметилродаміном компанією Invitrogen Evoquest Services (США). Фрагмент дистрофіну дрозофіли, що містить WW-домен та стабілізуючий компонент EF-hand мічений послідовністю із шести гістидинів, експресували в клітинах штаму BL21(DE3) Escherichia coli, індукуючи за допомогою ІПТГ (інозитол-в-D-1-тіогалактозидом) впродовж 3 год. Дистрофін очищали методом афінної хроматографії на Ni-NTA колонці (Sigma, США). Константи дисоціації (Kd) визначали за допомогою побудови графіків, на яких значення анізотропії відповідали показникам зростаючої концентрації з подальшим обрахунком у програмі Kaleidagraph.

Дослідження полярності клітин проводили в оваріолах та мозку личинок, попередньо препарованих та фіксованих із подальшою детекцією за допомогою специфічних антитіл до маркерів полярності: ооцита - ORB (Hybridoma Bank), аксонів фоторецепторів - 24B10 (Hybridoma Bank), глії - Repo (Hybridoma Bank) та фолікулярних клітин - в-HSpec (Hybridoma Bank). Препарати аналізували за допомогою двофотонного лазероскануючого конфокального мікроскопу Leica TCS SP/MP. Ядра клітин ідентифікували флуорисцентним барвником - DAPI (діаміно-2-феніліндол, Sigma).

Показники середньої тривалості життя (S₅₀) мух визначали шляхом побудови кривих виживання (Lints et al., 1979). Локомоторну активність досліджували на апараті Бензера (Benzer, 1967). Гістологічні зрізи м'язів мух та гістохімічне фарбування проводили згідно з методом Хайзенберга та Боля (Heisenberg and Bohl, 1979). Препарати аналізували на світловому мікроскопі (Leica LEITZ BMRB).

Трансгенні лінії дрозофіли, з векторами, які кодують форми дистроглікану зі змінами в С-термінальному домені, отримані в результаті трансформації у клітини ембріона з подальшою їхньою ізогенізацією, хромосомною локалізацією та балансуванням.

Результати досліджень та обговорення.

Еволюційна консервативність взаємодії між дистрофіном та дистрогліканом. Кристалічна структура взаємодії дистрофіну та дистроглікану людини є вивченою досить детально (Huang et al., 2000). Цікавим залишалось питання про те, чи взаємодія між цими компонентами відбувається подібно і у дрозофіли. З цією метою було застосовано метод флуорисцентної поляризації, який дозволяє вивчати взаємодії білків in vitro. Нами було синтезовано та очищені білки дистрофіну людини та дрозофіли, а також використано пептиди, які відповідали С-кінцевому фрагменту дистроглікану дрозофіли та людини. Внаслідок проведених експериментів були побудовані криві зв'язування досліджуваного білка з пептидом і визначені константи дисоціації (K_d): для людського дистрофіну з пептидом дистроглікану людини (HmWWbsI) - 7,6±1,6 мкM, для дистрофіну дрозофіли з відповідним пептидом (DmWWbsI) - 16±4 мкM (рис. 1, табл.).

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 1. Показники взаємодії дистрофіну з пептидами дистроглікану HmWWbsI (), HmWWbsI-P (), DmWWbsI (), BSA (): а - зв'язування з дистрофіном людини; б - зв'язування з дистрофіном дрозофіли

Константи дисоціації були в межах взаємодій, передбачених для цього класу WW-доменів (Kato et al., 2002). Отримані дані свідчать, про те що у D. melanogster, як і у Homo sapiens дистрофін та дистроглікан взаємодіють між собою. Надалі ми проаналізували, чи взаємодіє дистрофін людини з пептидом дистроглікану дрозофіли, і навпаки. Встановлені константи взаємодії з використанням міжвидових компонентів ДГК залишались на рівні тих, що були виявлені у випадку взаємодії внутрішньовидових зразків Dg та Dys, і становили: 24±8 мкM для людського дистрофіну та пептиду дистроглікану дрозофіли (рис. 1, табл.); 3,7±0,3 мкM для дистрофіну дрозофіли та пептиду Dg людини.

Для перевірки специфічності цієї взаємодії ми використали пептид, який містив заміну тирозину на пролін (HmWWbsI-P). Як і передбачалось, така заміна призвела до зниження взаємодії (K_d=172,6±39 мкМ), що майже у 100 разів менше, ніж з пептидом, у якого ця заміна не була здійснена. Підтверджена нами консервативність взаємодії дистрофіну та дистроглікану вказує на те, що дрозофіла є хорошим вибором модельного об'єкта для вивчення ролі основних компонентів дистрофін-глікопротеїнового комплексу.

Константи дисоціації (K_d , мкМоль) для взаємодії між дистрофіном та дистрогліканом у людини та дрозофіли

Експресія дистрофіну та дистроглікану під час ембріогенезу та оогенезу. Для вивчення експресії ми використали антитіла, які специфічно впізнають білки дистрофіну та дистроглікану. Імуногістохімічна детекція виявила, що дистрофін, як і дистроглікан, присутні у тканинах мезодермального походження - серці та шлунку а також у тканинах екто- та ендодерми ембріону. Дистрофін та дистроглікан мають подібну локалізацію під час оогенезу: на апікальній стороні стінки фолікулярних клітин і у стінках клітин гермінативного ряду - ооциті та клітинах-годувальницях. Крім цього було показано, що рівень експресії в аналогічних тканинах у мутантів за генами дистрофіну та дистроглікану був значно зниженим.

Зниження тривалості життя у мутантів за генами дистрофіну та дистроглікану. Одним із перших фенотипів, який був виявлений нами у мутантів за генами дистрофіну та дистроглікану було зниження тривалості життя. Для підтвердження цього фенотипу нами були побудовані криві виживання та визначено показник середньої тривалості життя S₅₀ (день, коли 50 % мух залишилося живими). Усі мутанти характеризувалися зниженими параметрами тривалості життя в порівнянні з контролем (рис. 2). Отримані дані дають підстави стверджувати, що у дрозофіли дистрофін і дистроглікан є необхідними для нормальної життєдіяльності.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 2. Тривалість життя мутантів за генами дистрофіну та дистроглікану: a - криві виживання; б - показник середньої тривалості життя (S₅₀ - день, коли залишилися живими 50 % мух)

Локомоторна активність мутантів за генами дистрофіну та дистроглікану. Відомо, що у людей втрата компонентів ДГК призводить до регресії м'язів і до зниження тривалості життя (Campbell et al., 1995). Ми дослідили локомоторну функцію у мутантів дрозофіли зі зниженим рівнем дистрофіну та дистроглікану на стадії імаго (рис. 3). Негативна регуляція дистрофіну і дистроглікану з використанням лінії P-tubGal4 призводила до зниження локомоторної активності уже в перші дні життєдіяльності мутантів у порівнянні з контролем (рис. 3). Для кількісної оцінки результатів визначали день, коли спостерігалось зниження індексу локомоторної активності на 50 %; у мух дикого типу це відбувалося на 25 день життя, натомість у мутантів за генами дистрофіну та дистроглікану на 10-12 день життя імаго (рис. 3). Оскільки негативна регуляція досліджуваних білків відбувалася у всіх тканинах, цікаво було дізнатись чи призведе до аналогічного результату втрата функції дистрофіну та дистроглікану специфічно у м'язах. Для цього в експериментах було використано комбінацію трансгенів і транскрипційного активатора 24BGal4, який специфічно експресується у тканинах мезодермального походження. Як і у попередньому випадку, у особин зі зниженою експресією дистрофіну та дистроглікану в м'язах виявлено швидку втрату локомоторної здатності, порівняно з контролем (рис. 3). Таким чином, можна стверджувати, що дистрофін і дистроглікан відіграють важливу роль у нормальному функціонуванні м'язів і забезпеченні локомоторної функції дрозофіли.

Рис. 3. Індекс локомоторної активності мутантів за генами дистрофіну та дистроглікану

Причиною порушення локомоторної активності у мутантів за генами дистрофіну та дистроглікану є дегенерація м'язових волокон. Щоб пояснити зниження локомоторної активності мутантів, ми проаналізували морфологічні зміни у м'язовій тканині. Дослідження гістологічних зрізів непрямих літальних м'язів D.melanogaster показали, що у таких мух спостерігається дегенерація м'язів. Так у 20-денних особин лінії дикого типу м'язи мають чітко організовану структуру м'язових волокон із перицентрично розміщеними ядрами (рис. 4, а). У мутантів 20-денного віку зі зниженим рівнем дистрофіну (dsDys/24BGal4; рис.4, б) та дистроглікану (dsDg/24BGal4 рис.4, в) виявлені значні порушення структури м'язових волокон, вакуолізація і повна відсутність окремих м'язів. Таким чином у дрозофіли, як і у людини, для забезпечення нормального функціонування м'язів упродовж життя, є необхідним нормальне функціонування дистрофін-дистрогліканового комплексу.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 4. Дорзо-вентральні гістологічні зрізи непрямих літальних м'язів D.melanogaster: Контроль (а); мутант за геном дистрофіну (б); мутант за геном дистроглікану (в)

Дистрофін та дистроглікан необхідні у головному мозку личинок дрозофіли для забезпечення полярності фоторецепторних аксонів. Для візуалізації аксонів фоторецепторних нейронів використано специфічні моноклональні антитіла 24B10. У мозку мух дикого типу в ділянці lamina plexus, R1-R6 аксони фоторецепторів формують термінуючий сайт у вигляді півкола (рис. 5, а). Гістохімічне фарбування мозків, у яких були присутні популяції клітин з повною втратою дистрогліканувиявило, що негативна регуляція цього білка не супроводжується порушеннями формування аксонів нейронів R-типу. Однак, в результаті детального аналізу прогресії цих аксонів у глибші шари мозку показано, що за відсутності дистроглікану порушена нормальна термінація аксонів у ділянках оптичних долей (рис. 5, б). Більшість таких аксонів мігрувала у правильному напрямку в зоні ламіни, але з формуванням абнормальних згустків у ділянці lamina plexus. Подібний фенотип був виявлений нами і у мутантів за геном дистрофіну (рис. 5, в). Визначення напрямку міграції аксонів фоторецепторів вимагає нормального функціонування не тільки фоторецепторних клітин, але й клітин глії мозку. Формування відростків аксонів відбувається вздовж гліальних клітин, які містять сигнали про термінацію відповідних аксонів у зонах утворення синапсів з нейронами ламіни (Clandinin et al., 2002; Perez et al., 1996). У мух дикого типу диференційовані гліальні клітини мігрують у шар ламіни, формуючи два чітко розділені шари гліальних клітин - епітеліальний (e.g.) та граничний (m.g.), простір між якими є місцем термінації R1-R6 аксонів у ламіні (рис. 5, г). При дослідженні мутантів зі зниженим рівнем експресії дистрофіну та дистроглікану було виявлено, що клітини глії мігрують у правильному напрямку, однак розташування шарів цих клітин є неорганізованим (рис. 5, д), внаслідок чого немає чітко визначеної межі між епітеліальним та граничним шарами гліальних клітин. На підставі отриманих даних можна зробити висновок, що дистрофін та дистроглікан у дрозофіли є необхідними для забезпечення полярності аксонів фоторецепторів та функціонування клітин глії мозку.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис.5. Ділянка мозку личинок дрозофіли з зоною термінації фоторецепторних аксонів R-типу: а-в - аксони фоторецепторів (24B10); г, д - клітини глії (Repo); дужками позначено ділянку термінації аксонів

Дистрофін та дистроглікан є необхідними для забезпечення полярності ооцита та фолікулярних клітин. Оогенез у дрозофіли представлений 12-а стадіями розвитку яйця, до складу якого входять клітини гермінативного ряду (ооцит і клітини-годувальниці) та фолікулярні клітини (рис. 6, а). Для вивчення полярності ооцита ми використали маркер ORB, який у мух дикого типу локалізується на задній частині ооцита під час ранніх стадій (4-6) оогенезу (рис. 6, б). У гермінативних клонів, гомозиготних за мутантним алелем дистроглікану Dg³²³, на стадіях 4-6 ORB був відсутній або розташований нерівномірно, що свідчить про порушення полярності ооцита (рис. 6, в). Подібний фенотип було виявлено і у мутантів за геном дистрофіну, в яких маркер ORB був розташований навколо ооцита (рис. 6, г). Полярність була також порушеною в клітинах фолікулярного покриву, які огортають ооцит під час розвитку. У фолікулярних клітинах із зниженим рівнем дистроглікану маркер полярності в-H-Speс розташовувався хаотично або був відсутній (рис. 6, е), на відміну від дикого типу, де цей маркер був локалізований на апікальній стороні клітин (рис. 6, д). Подібні порушення локалізації маркера полярності в-H-Spec виявлені і у мутантів за геном дистрофіну (рис. 6, є).

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 6. Локалізація маркерів полярності ооцита (ORB) та клітин фолікулярного покриву (в-H-Spec) у D.melanogaster під час оогенезу: a - схема оогенезу у D.melanogaster; б, д - клітини дикого типу (контроль); в, е - мутанти за геном дистроглікану; г, є - мутанти за геном дистрофіну

Роль сайтів взаємодії в С-термінальному домені дистроглікану. У проведеній нами роботі, крім досліджень, спрямованих на вивчення основних функцій ДГК у дрозофіли, ми дослідили роль окремих сайтів імовірного зв'язування з SH2-, SH3- та WW-доменами, які присутні в С-термінальній ділянці дистроглікану. Інтерес до цих сайтів полягає у дослідженні їхньої можливої ролі в регулюванні взаємодії між основними компонентами ДГК, яка досі не була вивченою. Попередні дослідження, з використанням методів кристалографії стверджували, що WW-домен дистрофіну взаємодіє з сайтом зв'язування WWbsI (PPPY) С-кінцевої ділянки дистроглікану (Huang et al., 2000). На жаль, роль додаткового сайту зв'язування WWbsII (PPSY), який також присутній у цій ділянці залишалась невстановленою. Разом з тим, крім сайтів зв'язування з WW-доменом дистрофіну в С-термінальній ділянці дистроглікану присутні також інші сайти зв'язування, функціональна роль яких є не вивченою. Попередні дослідження дистроглікану у дрозофіли показали, що надекспресія дистроглікану в клітинах епітелію призводить до порушення нормальної локалізації маркерів полярності (Deng et al., 2003). Зважаючи на чутливість цієї системи, ми дослідили, як зміни в С-термінальному домені дистроглікану впливають на здатність цього білка викликати порушення полярності клітин. Для цього ми створили ряд трансгенних ліній D.melanogaster, які несли в собі конструкти, що кодували дистроглікан з амінокислотними замінами на С-кінцевому домені (рис. 7). Ми експресували отримані конструкти за допомогою UAS/Gal4 системи in vivo та аналізували здатність різних форм дистроглікану викликати порушення полярності ооцита та відновлювати мутантний фенотип, зумовлений нокаутом дистроглікану (Dg³²³) в гермінативних клітинах (рис 8). Виявлено, що надекспресія повнорозмірної форми дистроглікану (FL конструкт) у клітинах дикого типу призводить до порушень полярності ооцита та до реверсії Dg³²³ мутантного фенотипу. Натомість надекспресія форми дистроглікану з видаленим С-термінальним фрагментом (С1 констукт), а також форми дистроглікану з лише присутнім сайтом WWbsI (С2 констукт) не викликали порушень полярності та не призводила до реверсії мутантного фенотипу. При використанні DC2 конструкту, що містив сайти ймовірного зв'язування - WWbsII та SH3bsII, спостерігалось збереження функції білка, як і при надекспресії повнорозмірної форми дистроглікану (рис. 8, а, б).

Надекспресія 4P конструкту із мутацією в сайті WWbsI не призводила до порушень функціональної властивості білка (рис. 8, а, б). Це вказує на те, що взаємодія дистроглікану з дистрофіном може відбуватись за участю сайту WWbsII. Необхідність хоча б одного з сайтів зв'язування дистроглікану з WW-доменом дистрофіну була підтверджена в результаті досліджень конструкту 2WW, у якого ці сайти (WWbsI та WWbsII) були мутантними. Така форма дистроглікану не зберігала функціональних властивостей (рис. 8, а, б). Натомість мутація лише у одному з сайтів (WWbsII), яка кодується конструктом PPSG, не спричиняла втрати функціональності дистроглікану (рис. 8, а, б).

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 7. Форми дистроглікану зі змінами в С-термінальному домені. FL - повнорозмірна форма; 4P - заміна в WWbsI (PPPY>PPPP); DC2 - делеція (присутні лише WWbsII та SH3bsII; C2 - делеція (присутній лише WWbsI); С1 - повна делеція; P>A - заміна в обох сайтах SH3 домен зв'язування: SH3bsII (PLLP>ALLP), SH3bsI (PATP>AATA); ALLP - заміна в SHbsII (PLLP>ALLP); AATA - заміна в SH3bsI (PATP>AATA); 2WW - заміна в обох WW- сайтах зв'язування: WWbsI (PPPY>WAPY), WWbsII (PPSY>PPSG); PPSG - заміна в WWbsII (PPSY>PPSG)

Крім сайтів зв'язування з WW-доменом дистрофіну, було досліджено роль сайтів зв'язування з SH3-доменом (домени Src гомології-3). У дистроглікану, що кодується конструктом P>A з мутаціями у сайтах SH3-зв'язування (SH3bsI та SH3bsII) функціональність білка була втраченою (рис. 8, а, б). Подальші дослідження показали, що лише SH3bsII сайт (AATA конструкт) зберігав функціональну активність дистроглікану (рис. 8, а, б), тоді як мутація цього сайту (ALLP конструкт) призводила до її втрати (рис. 8, а, б). На основі отриманих даних можна зробити висновок, що обидва сайти зв'язування дистроглікану - WWbsI та WWbsII є функціональними і можуть взаємодіяти з WW-доменом дистрофіну. У забезпеченні полярності клітин показано важливу роль SH3bsII сайту зв'язування.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 8. Кількісна характеристика фенотипів, зумовлених надекспресією трансгенних конструктів зі змінами в С-термінальному домені дистроглікану: a - кількісна характеристика порушень локалізації маркера ORB; б - кількісна характеристика індексу відновлення мутантного за геном дистроглікану фенотипу

Висновки

У результаті виконаної роботи отримано мутантів та сконструйовано трансгенні лінії D.melanogaster зі зниженим рівнем експресії дистрофіну, а також трансгенні лінії, які продукують форми дистроглікану зі змінами в амінокислотній послідовності С-кінцевого домену. Показано, що Drosophila melanogaster є зручним об'єктом для вивчення м'язової дистрофії - фенотипові прояви міопатій у цього організму є подібними, як і у хребетних.

1. Дистрофін та дистроглікан експресуються під час оогенезу та ембріогенезу у тканинах мезо-, екто- та ендодерми.

2. Присутність дистрофіну та дистроглікану є необхідною для формування полярності ооцита, фолікулярних клітин, полярності аксонів фоторецепторів та організації клітин глії.

3. Відсутність продуктів генів дистрофіну та дистроглікану у дрозофіли призводить до зниження локомоторної активності та тривалості життя; причиною цього є дегенерація м'язів, яка прогресує з віком.

4. Взаємодія між дистрофіном та дистрогліканом у дрозофіли та у людини є висококонсервативною.

5. Надекспресія повнорозмірної форми дистроглікану призводить до порушення полярності ооцита та реверсії мутантного за геном дистроглікану фенотипу. Сайт SH3bsII С-термінального домену дистроглікану є необхідним для збереження функціональної активності цього білка.

6. Сайт зв'язування дистроглікану WWbsII є функціональним і може взаємодіяти з WW-доменом дистрофіну як у дрозофіли, так і у людини.

Перелік наукових праць, опублікованих за темою дисертації

1. A putative SH3-domain binding motif but not the C-terminal Dystrophin WW-domain binding motif is required for Dystroglycan function in cellular polarity in Drosophila / A.S. Yatsenko, E.E. Gray, H.R. Shcherbata, L.B. Patterson, V.D. Sood, M.M. Kucherenko, D. Baker, H. Ruohola-Baker // J. Biol. Chem. - 2007. - Vol. 282, №20. - P. 15159-15169. Особистий внесок здобувача - отримання трансгенних ліній, аналіз експресії, аналіз фенотипових проявів при надекспресії, вивчення взаємодії білків дистрофіну та дистроглікану in vitro, аналіз амінокислотної послідовності та пошук гомологічних ділянок С-термінального домену дистроглікану у людини та дрозофіли.

2. Dissecting muscle and neuronal disorders in a Drosophila model of muscular dystrophy / H.R. Shcherbata, A.S. Yatsenko, L. Patterson, V.D. Sood, U. Nudel, D. Yaffe, D. Baker, H. Ruohola-Baker // EMBO J. - 2007. - Vol.26, №2. - P. 481-493. Особистий внесок здобувача - отримання мутантів за геном дистрофіну, аналіз фенотипових проявів пов'язаних з негативною регуляцією дистрофіну, вивчення взаємодії білків in vitro.

3. Genetic modifier screens reveal new components that interact with the Drosophila dystroglycan-dystrophin complex / M.M. Kucherenko, M. Pantoja, A.S. Yatsenko, H.R. Shcherbata, K.A. Fischer, D.V. Maksymiv, Ya.I. Chernyk, H. Ruohola-Baker // PLoS ONE. - 2008. - Vol.3. - e2418. Особистий внесок здобувача - участь у проведенні скринінгу мутантів, що взаємодіють з дистрофін-дистроглікановим комплексом у дрозофіли.

4. Drosophila melanogaster як модельна система для пошуку модифікаторів дистрофін-дистрогліканового комплексу / М. Кучеренко, А. Яценко, Х. Руохола-Бейкер, Д. Максимів, Я. Черник // Вісник Львів. ун-ту. Сер. біол. - 2008. - Вип. 46. - С.71-77. Особистий внесок здобувача - аналіз фенотипів у мутантів отриманих в ході скринінгу.

5. The importance of WW and SH3 binding sites in Dg C-terminus end for interaction with Dystrophine / A.S. Yatsenko, H.R. Shcherbata, L.B. Patterson, V.D. Sood, M.M. Kucherenko, D. Baker, H. Ruohola-Baker, Ya.I. Chernyk // Фактори експериментальної еволюції організмів. - Київ: Логос, 2006. - Т.3. - С. 432-437. Особистий внесок здобувача - вивчення взаємодії білків дистрофіну та дистроглікану in vitro.

6. Взаємодія polyEGF та основних компонентів дистрофін-глікопротеїнового комплексу у Drosophila melanogaster / M.M. Kучеренко, А.С. Яценко, Д.В. Максимів, В.М. Рішко, Х. Руохола-Бейкер, Я.І. Черник // Збірник наукових праць I-ої міжнародної конференції “Дрозофіла в експериментальній генетиці та біології”. Харків; - 2008, - С. 43-46. Особистий внесок здобувача - аналіз фенотипів у мутантів отриманих в результаті скринінгу.

7. Використання Drosophila melanogaster як модельної системи для вивчення м'язової дистрофії людини // А.С. Яценко, М.М. Кучеренко, Я.І. Черник // Молодь і поступ в біології: IV міжнар. конф. студ. аспір. (Львів, 7-10 квіт. 2008 р.): тези доп. - Л., 2008. - С. 155. Особистий внесок здобувача - отримання мутантів, аналіз фенотипів у мутантів, вивчення взаємодій білків in vitro.

8. Role of Dystroglycan-Dystrophin complex in signaling / M.M. Kucherenko, A.S. Yatsenko, Ya.I. Chernyk, H. Ruohola-Baker // 48^th Drosophila Conference (Philadelphia, 7-11 mar. 2007): abstracts - P., 2007. - P.34. Особистий внесок здобувача - отримання мутантів, аналіз фенотипів у мутантів, вивчення взаємодій білків in vitro.

9. Drosophila as a model system to study complexity of Dys-Dg complex / A.S. Yatsenko, G.R. Shcherbata, E.E. Gray, L.B. Patterson, Ya.I. Chernyk, H. Ruohola-Baker // Молодь і поступ в біології: II міжнар. конф. студ. аспір. (Львів, 11-14 квіт. 2006 р.): тези доп. - Л., 2006. - С. 169. Особистий внесок здобувача - отримання мутантів, аналіз фенотипів у мутантів, вивчення взаємодій білків in vitro.

10. A putative SH3-domain binding motif but not the C-terminal Dystrophin WW-domain binding motif is required for Dystroglycan function in cellular polarity in Drosophila / A.S. Yatsenko, E.B. Gray, H.R. Shcherbata, L. Patterson, Ya.I. Chernyk, H. Ruohola-Baker // 47^th Drosophila Conference (Houston, 29 mar. - 02 apr. 2006): abstracts - H., 2006. - P. 206. Особистий внесок здобувача - отримання мутантів, аналіз фенотипів у мутантів, вивчення взаємодій білків in vitro.

11. Dissecting muscular dystrophy in Drosophila // H.R. Shcherbata, A.S. Yatsenko, K. Fisher, M.M. Kucherenko, U. Nudel, D. Baker, H. Ruohola-Baker // 47^th Drosophila Conference (Houston, 29 mar. - 02 apr. 2006): abstracts - H., 2006. - P. 106. Особистий внесок здобувача - отримання мутантів, аналіз фенотипів у мутантів, вивчення взаємодій білків in vitro.

12. Drosophila as a model system of muscular dystrophy: a molecular-genetic analysis of Dystrophin-Dystroglycan complex / H.R. Shcherbata, A.S. Yatsenko, L. Paterson, E.E. Gray, U. Nudel, H. Ruohola-Baker // 46^th Drosophila Conference (San Diego, 30 mar. - 03 apr. 2005): abstracts - S., 2005. - P. 409. Особистий внесок здобувача - отримання мутантів, аналіз фенотипів у мутантів, вивчення взаємодій білків in vitro.

13. Dystroglycan WW and SH3-domain binding motifs are required for the proper regulation of Dystroglycan complex / E.B. Gray, A.S. Yatsenko, H.R. Shcherbata, L. Paterson, V. Shcherbatyy, H. Ruohola-Baker // 46^th Drosophila Conference (San Diego, 30 mar. - 03 apr. 2005): abstracts - S., 2005. - P.171. Особистий внесок здобувача - отримання мутантів, аналіз фенотипів у мутантів, вивчення взаємодій білків in vitro.

14. Dystroglycan C-terminal WW-domain and SH3 binding motifs are required for the proper regulation of Dystroglycan-Dystrophin complex / A.S. Yatsenko, E. Gray, H.R. Shcherbata, L. Patterson, H. Ruohola-Baker // Молодь і поступ в біології: I міжнар. конф. студ. аспір. (Львів, 11-14 квіт. 2005 р.): тези доп. - Л., 2005. - С. 139. Особистий внесок здобувача - отримання мутантів, аналіз фенотипів у мутантів, вивчення взаємодій білків in vitro.

15. Dystroglycan-Dystrophin complex in signal transduction / A.S. Yatsenko, H.R. Shcherbata, L. Patterson, K. Fischer, B. Gray, V. Shcherbatyy, W.-M. Deng, U. Nudel, H. Ruohola-Baker // 45^th Drosophila Conference (Washington DC, 24-28 mar. 2005): abstracts - W., 2005. - P .171. Особистий внесок здобувача - отримання мутантів, аналіз фенотипів у мутантів, вивчення взаємодій білків in vitro.

Анотація

Яценко А.С. Молекулярно-генетичний аналіз дистрофін-дистрогліканового комплексу у модельного об'єкта Drosophila melanogaster. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.22 - молекулярна генетика - Інститут молекулярної біології та генетики НАН України, Київ, 2009.

Дисертація присвячена дослідженню дрозофіли як модельного об'єкта для вивчення м'язових дистрофій. Мутанти за генами дистрофіну та дистроглікану характеризувались фенотиповими проявами, які притаманні для м'язової дистрофії людини. Показано, що взаємодія між дистрофіном та дистрогліканом є консервативною у людини, і у дрозофіли. Вивчено роль сайтів на С-темрінальному домені дистроглікану дрозофіли у забезпеченні полярності клітин ооцита та епітелію. Показано, що обидва сайти зв'язування дистроглікану (WWbsI та WWbsII) є функціональними. Встановлено, що сайт SH3bsII на С-термінальному кінці дистроглікану є необхідним для правильної полярності ооцита.

Ключові слова: дрозофіла, дистрофін, дистроглікан, тривалість життя, м'язова дегенерація, полярність клітин, сайти зв'язування.

Аннотация

Яценко А. С. Молекулярно-генетический анализ дистрофин-дистрогликанового комплекса на модельном объекте Drosophila melanogaster.- Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.22 - молекулярная генетика - Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины, Киев, 2009.

Диссертация посвящена исследованию дрозофилы как модельного объекта для изучения мышечных дистрофий. Мутанты по генам дистрофина и дистрогликана характеризовались фенотипическими проявлениями, которые присущи мышечным дистрофиям человека. Показано, что взаимодействие между дистрофином и дистрогликаном является консервативным у человека и у дрозофилы. Изучена роль сайтов С-терминального домена дистрогликана дрозофилы в обеспечении полярности клеток ооцита и эпителия. Показано, что оба сайта связывания дистрофина (WWbsI WWbsII) являются функциональными. Установлено, что сайт SH3bsII С-термінального фрагмента дистрогликана необходим для обеспечения полярности ооцита.

Ключевые слова: дрозофила, дистрофин, дистрогликан, продолжительность жизни, мышечная дегенерация, полярность клеток, сайти взаимодействия.

Summary

Yatsenko A.S. Molecular and genetic analysis of dystropin-dystoglycan complex in the model organism Drosophila melanogaster. - Manuscript.

Thesis for a Ph.D. degree on speciality 03.00.22 - molecular genetics. - The Institute of Molecular Biology and Genetics, Kyiv, 2009.

The fly genome contains many highly conserved orthologues to human disease genes, including neurological, cardiovascular, endocrine and metabolic disease-genes. Among these, nearly all components of the Dg-Dys complex, which is involved in muscular dystrophies, are present in flies Animal models have been used efficiently in muscular dystrophy studies. Some of the models are naturally occurring mutations (mdx-mouse, muscular dystrophy dog, cat and hamster), others have been generated by gene targeting. However, the regulation and the control of Dg-Dys complex are not understood, and no successful therapeutics exist yet for muscular dystrophies however, systemic delivery-studies using adeno-associated viral vectors show promise. Studies in new model organisms with easy-to-manipulate genetics might reveal the mode of regulation of the complex by identifying key regulatory components through suppressor screens. In addition, careful functional analysis of the complex in different cell types in model organisms might result in a unifying theme that will reveal its molecular mechanism of function.

The transmembrane protein Dystroglycan (Dg) is part of a complex that links the extracellular matrix (ECM) to cytoskeletal actin via the cytoplasmic protein Dystrophin (Dys). The Dys contains an actin binding domain on its N-terminus and the Dg interacting WW-domain and EF-hand on its C-terminus. These linkages are vital and disruption of any component or the interaction between them can cause muscular dystrophy and brain defects in humans. For example, several muscular dystrophies exhibit neuronal migration disorders, showing that Dg interactions are essential for normal neuron migration. However, what is the mechanism of action and regulation of this complex in any given cell type is not well understood. The major goal of this work is focused on showing that Drosophila is an excellent genetically tractable model to study muscular dystrophies and neuronal abnormalities caused by defects in this complex. Using a fluorescence polarization assay, we show a high conservation in Dg-Dys interaction between human and Drosophila. Genetic and RNAi-induced perturbations of Dg and Dys in Drosophila cause cell polarity and muscular dystrophy phenotypes: decreased mobility, age-dependent muscle degeneration. Furthermore, we have now shown that Dg-Dys complex is required both in neural and in targeting glial cells for correct neuronal axon path-finding in Drosophila brain. These data reveal that Dg-Dys complex also has a non-cell autonomous effect on axon path-finding and suggest that Dg-Dys-controlled ECM both from neuron and glial cells regulate neuronal axon path-finding.

In vitro studies have suggested that the interaction between Dg and Dys is mediated by the most C-terminal WW domain binding motif, PPXY, on Dg and the Dys WW and EF-hand domains. To shed light on the regulation of Dg and its role in signaling, we have analyzed the binding motifs that are required for the function of the Dg-Dys complex in cellular polarity in Drosophila. The proline-rich C terminus of Dg has several potential protein-binding motifs, which suggests that it may be involved in regulating the complex and potentially may have a signaling role. Proline-rich sequences have been shown to be the targets of several protein interaction domains involved in signal transduction. For example, SH3 domains have been shown to bind core PXXP motifs (where P is proline and X indicates any amino acid). Drosophila Dg contains two putative SH3-binding sites, consisting of the core PXXP motif. Proline-rich sequences also serve as targets for binding by WW domains. In particular, the class I WW domain ligand, PPXY (where Y is tyrosine), appears twice in the C-terminal region of Dg. The more C-terminal PPXY motif has been established as a binding site for the WW domain of dystrophin in humans and in Drosophila by in vitro binding studies. The role of a putative second, more N-terminal WW domain binding site or the potential SH3 domain binding sites are not yet understood. In current studies we show role of some binding sites present in the C-terminal domain of dystroglycan by creating transgenic lines of Drosophila that express different forms of dystoglycan with mutations on its C-teminal binding domain. Using overexpression and rescue experiments we now find that both WW binding sited in dystroglycan C-terminal end are functional. We confirm this hypothesis by using a sensitive fluorescence polarization assay to show that both WW domain binding sites of Dg bind to Dys in humans and Drosophila can bind WW-domain of Dystrophin. We also show that for the preservation of dystroglycan functionality one of the Src homology 3 domain (SH3) binding sites SH3bsII is required. This suggests that an SH3-containing protein, which has yet to be identified, functionally interacts with Dg.

Taken together, the phenotypes caused by Drosophila Dg and Dys mutations are remarkably similar to phenotypes observed in human muscular dystrophy patients, and therefore suggest that functional dissection of Dg-Dys complex in Drosophila should provide new insights into the origin and potential treatment of these fatal neuromuscular diseases. Developing Drosophila as a model will help better understand the mechanism by which muscular dystrophies occur in vertebrates and will also help better understand interaction that are needed for normal functioning of Dystroohin-Dystroglycan (Dys-Dg) complex.

Key words: Drosophila, Dystoglycan, Dystrophin, lifespan, muscle degeneration, cell polarity, binding sites.

Размещено на Allbest.ru