Вплив кріопротекторів і режимів заморожування на механічне пошкодження клітин в області субевтектичних температур

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ПРОБЛЕМ КРІОБІОЛОГІЇ І КРІОМЕДИЦИНИ

УДК 57.043:612.111:536.54

03.00.19 - кріобіологія

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

ВПЛИВ КРІОПРОТЕКТОРІВ І РЕЖИМІВ ЗАМОРОЖУВАННЯ НА МЕХАНІЧНЕ ПОШКОДЖЕННЯ КЛІТИН В ОБЛАСТІ СУБЕВТЕКТИЧНИХ ТЕМПЕРАТУР

Кирилюк Ганна Леонідівна

Харків - 2008



Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України

Науковий керівник:

Доктор фізико-математичних наук, професор Осецький Олександр Іванович, Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України м. Харків, провідний науковий співробітник відділу низькотемпературного консервування

Офіційні опоненти:

Доктор біологічних наук, професор Зінченко Олександра Василівна, Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України м. Харків, провідний науковий співробітник відділу кріобіофізики

Доктор біологічних наук, професор Перський Євген Ефроїмович, Харківський Національний Університет ім. В.Н. Каразіна, завідувач кафедри біохімії

Захист відбудеться "18" листопада 2008 р. о 1330 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.242.01 в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України за адресою: 61015, м. Харків, вул. Переяславська, 23

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, за адресою: 61015, м. Харків, вул. Переяславська, 23

Автореферат розісланий "17" жовтня 2008 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, член - кореспондент НАН України, д.м.н., професор Гольцев А.М.



ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Життєздатність біологічних об'єктів після їх кріоконсервування залежить від великої кількості чинностей, які діють на клітини упродовж заморожування - нагріву. Найбільш вагомі чинники, що зумовлюють пошкодження біооб'єкту під час кріоконсервування пов'язані з фазовими та фазово-структурними перетворюваннями в ньому [Mazur P. et al., 1981; Белоус А.М. и др., 1994; Гордиенко Е.А. и др., 1994]. Ступінь кріопошкодження залежить від кінетики кристалоутворення та росту кристалів, їх форми та розміру, характеру розподілу рідини у кристалічній матриці, інтенсивності рекристалізаційних процесів, тощо. Наразі всебічно досліджено фізико-хімічні ефекти, що виникають на етапі від початку кристалізації біооб'єкту до евтектичних температур, тоді як пошкодження клітин в області субевтектичних температур майже не досліджувалось. Оскільки фазові і фазово-структурні перетворення у біооб'єктах при їх низькотемпературному консервуванні є нерівноважними, вони не припиняються після досягнення температури евтектики: в області субевтектичних температур і упродовж наступного нагріву продовжуються зміни кількості льоду, розміру і форми кристалів, характеру перерозподілу рідинної фази у льоді, концентрації кріопротектора у міжкристалічних каналах, тощо [Matters G. et al., 1990; Осецкий А.И. и др., 1997; Boutron P. et al., 2000; Bischof J.C. et al., 2004]. При цьому внаслідок руху меж розділу між твердою і рідинною фазою клітини піддаються механічним навантаженням і підвищеному тиску [Rubinsky B. et al., 1980; Бронштейн В.Л. и др., 1983; Зинченко А.В. и др., 2002; Wusteman M. et al., 2004; Rabin Y. et al., 2006]. Оскільки усі ці явища, які відбуваються в області субевтектичних температур, впливають на результат кріоконсервування і залежать від режимів охолодження - нагріву та складу кріозахисного середовища, актуальним є вивчення перебігу нерівноважних фазових перетворень в області температур від температури евтектики до температури рідкого азоту.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота є складовою частиною фундаментальних наукових досліджень Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України та виконана за відомчою науково-дослідною темою відділу низькотемпературного консервування «Теоретичний аналіз і експериментальне дослідження специфічних механізмів кріопошкодження та кріозахисту клітин, зумовлених особливостями їх функціонування», номер державної реєстрації 0106U002164.

Мета дослідження. Метою дисертаційної роботи є визначення впливу концентрацій кріопротекторів і режимів заморожування на пошкодження біологічних об'єктів в області субевтектичних температур при їх кріоконсервуванні під захистом диметилсульфоксиду (ДМСО), гліцерину, поліетиленоксиду з середньою молекулярною масою 1500 (ПЕО-1500).

Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити наступні задачі: кріоконсервування диметилсульфоксид заморожування біологічний

Розробити методику визначення механічних характеристик заморожених водних розчинів ДМСО, гліцерину, ПЕО-1500, розчинів ДМСО на середовищі 199 та розчинів ДМСО на середовищі 199 з додаванням 10% ембріональної сироватки великої рогатої худоби (ЕС) вище області температур їх склування.

Визначити порогові концентрації водних розчинів ДМСО, гліцерину, ПЕО-1500, розчинів ДМСО на середовищі 199 і розчинів ДМСО на середовищі 199 з додаванням 10% ЕС, за яких відокремлені одна від одної рідинні включення перетворюються у наскрізні рідинні прошарки.

Дослідити кінетику перебігу процесів, що відбуваються у заморожених кріозахисних розчинах кріопротекторів (ДМСО, гліцерин, ПЕО-1500) і у біологічних зразках нижче температури евтектики та в області температури склування цих розчинів.

На підставі отриманих даних провести аналіз імовірного механізму кріопошкодження біологічних об'єктів в області субевтектичних температур.

На основі отриманих даних оптимізувати режими кріоконсервування клітин Saccharomyces сerevisiae, клітин диплоїдної культури людини (КДКЛ) і клітин фібробластів людини (КФЛ) шляхом визначення оптимальних значень концентрацій кріопротекторних речовин у кріозахисному середовищі та швидкостей охолодження у субевтектичному інтервалі температур та інтервалі склування цих розчинів.

Об'єкт дослідження - фазові і фазово-структурні перетворення у розчинах кріопротекторів і біологічних зразках в залежності від режимів заморожування, складу кріозахисних середовищ і концентрації кріопротекторів.

Предмет дослідження - кріозахисні середовища різного складу і суспензії клітин S. cerevisia, КДКЛ і КФЛ у цих розчинах.

Методи дослідження. Для оцінки життєздатності дріжджових клітин S. cerevisiae використано чашковий метод Коха. Для оцінки життєздатності клітин культур людини застосовано метод суправітального забарвлення клітин трипановим синім. Статистичну обробку отриманих результатів проводили за методом Стьюдента.

Фазовий стан розчинів кріопротекторів досліджено методом об'ємної тензодилатометрії в процесі охолодження зразків та методом термопластичної деформації на етапі їх нагріву. Механічні характеристики заморожених розчинів кріопротекторів досліджено з використанням модифікованого методу термопластичної деформації, який здійснюється шляхом послідовних навантажень на заморожений зразок.

Наукова новизна одержаних результатів. Розроблена оригінальна методика дослідження механічних характеристик заморожених розчинів кріопротекторів. На основі даних щодо формування заморожених зразків у режимах послідовного навантаження та повзучості розроблено спосіб визначення порогових концентрацій розчинів кріопротекторів, за яких відокремлені одна від одної включення рідинної фази перетворюються у наскрізні прошарки рідини між кристалами льоду. Вперше встановлені чисельні значення порогових концентрацій для водних розчинів ДМСО, гліцерину, ПЕО-1500, розчинів ДМСО на середовищі 199 та розчинів ДМСО на середовищі 199 з додаванням 10% ЕС.

Теоретично обґрунтовано і експериментально підтверджено, що одним із механізмів кріопрошкодження біооб'єктів є пластична релаксація підвищеного тиску, який виникає в окремих рідиннофазних включеннях за рахунок нерівноважної кристалізації. Методом термопластичної деформації визначені субевтектичні інтервали температур водних розчинів кріопротекторів (ДМСО, гліцерин, ПЕО-1500), де спостерігаються механічні пошкодження біооб'єктів за рахунок пластичної релаксації підвищеного тиску, який виникає в окремих рідиннофазних включеннях, а також інтервали температур склування, де спостерігаються пошкодження біооб'єктів за рахунок пластичної релаксації термопружних напруг. На основі отриманих даних удосконалено режим кріоконсервування біооб'єктів (на прикладі клітин S. сerevisiae і клітин культур людини) з використанням досліджених кріопротекторних розчинів шляхом визначення оптимальних значень концентрацій кріопротекторних речовин у кріозахисному середовищі та визначення оптимальних значень швидкостей охолодження у досліджених температурних інтервалах.

На основі тензодилатометричних досліджень розроблено спосіб, який дозволяє визначати об'єм розчину, що засклувався у процесі його кристалізації за евтектичної температури, для будь-яких кріозахисних середовищ. Отримані формули, які визначають об'ємну частку льоду у рідинній міжкристалічній фазі при заморожуванні кріозахисного розчину в залежності від вихідної концентрації кріопротектора у цьому розчині та режиму охолодження.

Практичне значення одержаних результатів. На підставі проведених у роботі теоретичних і експериментальних досліджень, визначено механізм кріопошкодження біологічних об'єктів в області субевтектичних температур, сформульовані рекомендації щодо удосконалення способів кріоконсервування клітин S. сerevisiae, КДКЛ і КФЛ. Розроблена на базі методу термопластичної деформації методика визначення механічних характеристик заморожених зразків може бути використана при розробці режимів кріоконсервування будь-яких біологічних об'єктів.

Особистий внесок здобувача. Дисертантом вивчені і узагальнені дані вітчизняної та закордонної літератури по темі дисертаційної роботи, здійснено експериментальну частину роботи, проведено аналіз отриманих даних та їх статистичну обробку. В опублікованих зі співавторами працях особистий внесок здобувача полягає в:

у роботах [1, 5, 10, 12] - підготовка вагових розчинів кріопротекторів, дослідження їх методом термопластичної деформації, обробка експериментальних даних, побудова термопластичних кривих по експериментальним даним та побудова залежностей температур розсклування розчинів кріопротекторів від їх концентрації, підготовка графічного матеріалу;

у роботах [2, 4, 6, 9] - підготовка вагових розчинів кріопротекторів, дослідження зразків модифікованим методом термопластичної деформації, обробка експериментальних даних та побудова залежностей механічних характеристик розчинів кріопротекторів від їх концентрації, безпосередня участь у підготовці біологічного матеріалу до заморожування та при визначенні життєздатності клітин, підготовка графічного матеріалу;

у роботах [3, 8] - підготовка вагових розчинів кріопротекторів, проведення тензодилатометричних досліджень, статистична обробка результатів, побудова залежності об'ємної частки льоду в розчині кріопротектора від температури та залежності концентрації кріопротектора в рідкій фазі, що кристалізується від температури;

у роботах [7, 13] - підготовка біологічного матеріалу до кріоконсервування і визначення життєздатності клітин до та після кріоконсервування, статистична обробка результатів, участь у аналізі та обґрунтуванні отриманих результатів, підготовка графічного матеріалу для публікації;

у роботі [11] - розробка методики проведення експерименту для визначенню впливу коливань температури зберігання на життєздатність клітин, визначення граничних значень коливання температури зберігання по термопластичним даним для S. сerevisiae, відхилення від яких призводить до пошкодження біооб'єктів;

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертаційної роботи були представлені та обговорені на I Українській науковій конференції «Проблеми біологічної і медичної фізики» (20-22 вересня 2004 р., м. Харків, Україна); науково - практичній конференції з міжнародною участю «Актуальні проблеми і досягнення кріобіології і кріомедицини. Структурна і функціональна організація стовбурових клітин за умов дії низьких температур» (22-24 листопада 2005 р., м. Харків, Україна); щорічній конференції молодих вчених ІПКіК НАН України «Холод в биологии и медицине» (17-18 травня 2005 р., м. Харків, Україна); 43-й щорічній конференції суспільства Кріобіології разом із Суспільством Низькотемпературної біології «Cryo - 2006» (24-27 липня 2006 р., Гамбург, Німеччина), VI Міжнародній науковій конференції «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии» (2-6 червня 2008 р., м. Мінськ, Білорусь).

Публікації. Головні положення дисертації викладені у 13 роботах: 7 - у наукових профільних журналах, 4 - у збірниках наукових конференцій і у двох патентах на корисну модель.

Структура дисертації. Дисертаційна робота викладена на 135 сторінках і містить: вступ, основну частину, що складається з трьох розділів (огляд літератури за темою дисертації, розділів ”Матеріали і методи дослідження” та “Результати власних досліджень”), висновки, список використаної літератури - 149 найменувань (13 сторінок). Дисертація містить 57 рисунків.



ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи досліджень

Матеріалами для досліджень служили водні розчини ДМСО, гліцерину, ПЕО-1500 з масовими концентраціями речовин 3, 5, 6, 7, 10, 15, 20% та від 20 до 100% з інтервалом у 5%, розчини ДМСО на середовищі 199 і розчини ДМСО на середовищі 199 з додаванням 10% ЕС з масовими концентраціями ДМСО 3, 5, 7 та 10%, дріжджові клітини S. cerevisiae, КДКЛ і КФЛ.

Для кріобіологічних досліджень був використаний тензодилатометричний комплекс з пристроями для реалізації методу термопластичної деформації та методу об'ємної тензодилатометрії.

Методом термопластичної деформації вивчали процеси, що протікають у попередньо заморожених зразках на етапі наступного нагріву. Для цього водні розчини ДМСО та ПЕО-1500 різних концентрацій охолоджували зі швидкістю 4°С/хв до температури -160°С, при цій кінцевій температурі стабілізували їх протягом 10 хвилин і здійснювали навантаження на зразок, оптимальне значення якого підбиралося у ході конкретного експерименту. Після цього зразок нагрівали зі сталою швидкістю 1°С/хв і реєстрували термопластичну криву, тобто залежність деформації зразка від температури. Типовий вид термопластичної кривої та граничні значення температурних інтервалів, що підлягали вивченню, представлені на рис. 1. Температуру розсклування Тg визначали по бісектрисі кута, що створюють дотичні, проведені до ділянок термопластичної кривої з постійною швидкістю зростання пластичної деформації зразка.



Рис. 1. Типовий вид термопластичної кривої замороженого розчину кріопротектора.

Правомірність і точність визначення Тg таким методом була підтверджена при проведенні державної метрологічної атестації в ННЦ «Інститут метрології» (ат. cвід. № 435 від 28.01.2008 р.) тензодилатометричного комплексу для кріобіологічних досліджень. Після температури розсклування починається різке наростання швидкості пластичного плину зразка. Це обумовлено деформацією зразка шляхом зрушення в області, де аморфна фракція зазнає розсклування. Інтервал температур ДTc визначається як ДTc=|Тg'-Tс|, де Тg' - температура кінця процесу розсклування, Tс - температура кінця перегину на термопластичній кривій.

Методом об'ємної тензодилатометрії досліджена кінетика процесів кристалізації, що протікають при охолодженні водних розчинів кріопротекторів. Зразки вміщували у робоче середовище, охолоджували від 20°С до -80°С зі швидкостями 1°С/хв або 5°С/хв і в процесі охолодження на двокоординатному самозаписувачі реєстрували зміну відносного об'єму зразка як функцію температури. На основі отриманої тензодилатограми будували графік залежності зміни відносного об'єму зразка від температури: , де ?V=V-V0.

За допомогою методики послідовних навантажень, яка була розроблена на базі метода термопластичної деформації, вивчали механічні властивості розчинів кріопротекторів. Принцип реалізації цієї методики схематично проілюстровано на рис. 2. Величину деформації заморожених зразків можна варіювати в широких межах, змінюючи як величину навантаження у, що прикладається до зразка, так і час між двома послідовними довантаженнями ?t.

?еу1 і ?еу2 - величина деформації зразка в момент додатка навантажень у1 і у2 відповідно (у1>у2);

Дt1 і Дt2 - проміжок часу, через який прикладали навантаження (Дt1<Дt2).

Рис. 2. Схематичне зображення експериментальних деформаційних кривих (1 і 2) заморожених розчинів кріопротекторів.

За цією методикою досліджено пружнопластичну деформацію заморожених водних розчинів ДМСО, гліцерину та ПЕО-1500 з концентраціями 3, 5, 6, 7, 10, 15, 20 та 30%, а також розчинів ДМСО на середовищі 199 та розчинів ДМСО на середовищі 199 з додаванням 10% ЕС з концентраціями ДМСО 3, 5, 7 та 10%. Зразки охолоджували зі швидкістю 4°С/хв до температури, що перевищує температури склування цих зразків на 30°С, стабілізували їх при цій кінцевій температурі протягом 10 хвилин і потім здійснювали деформацію зразків. Проміжки часу між довантаженнями були однакові для всіх кріопротекторів та становили 4 хвилини. Величина зовнішніх напруг підбиралася в ході експерименту і не перевищувала межу текучості ут відповідних зразків. Реєстрацію експериментальних деформаційних кривих здійснювали при постійній температурі, що для розчинів ДМСО становила -90°С, для водних розчинів гліцерину - -70°С, а для водних розчинів ПЕО-1500 - -50°С.

По експериментальним деформаційним кривим е=е(t) розраховували криві напруга-деформація у=у(е), за якими визначали межі текучості ут і модулі зрушення G зразків. Далі для кожного виду захисної речовини будували залежності цих показників від концентрації кріопротектора. Стрибкоподібний вид отриманих залежностей меж текучості та модулів зрушень від концентрації кріопротектора свідчить про зміну співвідношення кількостей кристалічної та аморфної фаз у зразках та визначає чисельні значення порогових концентрацій кріопротекторних речовин, тобто ту концентрацію кріопротектора, за якої відокремлені одна від одної рідинні включення перетворюються у наскрізні прошарки. Вказаний перехід визначається не тільки зміною параметрів ут і G, але і величиною пластичної деформації повзучості зразка Деn, яка здійснюється за проміжок часу між окремими послідовними довантаженнями. Різке зростання такої деформації Деn при збільшенні концентрації кріопротекторної речовини свідчить про виникнення в замороженому зразку при температурах вище температури його склування наскрізних рідких прошарків.

Підготовку клітин до заморожування та кріоконсервування в експериментах по вивченню впливу різних концентрацій кріопротекторних речовин поблизу порогових значень на життєздатність клітин при кріоконсервуванні здійснювали наступним чином. Клітини S. cerevisiae вирощували протягом 48 годин при 30°С на агаризованому середовищі Сабуро і потім підрощували в рідкому середовищі Сабуро протягом 24 годин з аерацією. Після підрощування клітини осаджували центрифугуванням і ресуспендували у середовищі консервування: дистильованій воді без кріопротектора, водних розчинах ДМСО, гліцерину та ПЕО-1500 з концентраціями 3, 5, 6, 7 і 10%. Життєздатність клітин визначали чашковим методом Коха по кількості макроколоній, що сформувалися на агаризованих середовищах. Серійні розведення клітинних суспензій проводили в 0.9% водному розчині NaCl. У якості контролю брали незаморожені суспензії клітин у відповідних середовищах консервування.

Кріоконсервування S. cerevisiae здійснювали на програмному заморожувачі «Cryoson» (Німеччина), який пройшов державну метрологічну атестацію в ННЦ «Інститут метрології» (ат. свід. № 1895 від 26.03.2008 р.). Суспензію дріжджових клітин вносили по 1 мл у пластикові кріопробірки фірми “Nunc” (Німеччина) об'ємом 2 мл. Кількість клітин у зразку становила 108 КОЕ/мл. Зразки охолоджували зі швидкістю 2°С/хв, яка за літературними даними є оптимальною для цих клітин. Охолодження проводили до -40°С з наступним зануренням у рідкий азот. Зразки відігрівали на водяній бані при 37°С до зникнення твердої фази.

Клітини культур людини (КДКЛ і КФЛ) культивували на 199 середовищі з додаванням 5% ЕС. Для кріоконсервування клітини переводили у суспензійний стан, обробляючи моношар сумішшю розчину Версена із трипсином. Одну групу клітин ресуспендували в середовищі 199, другу групу - в 199 середовищі з додаванням 10% ЕС. Готували розчини з 6, 10, 14 і 20% концентрацією ДМСО на середовищі 199 без додавання ЕС та такі ж концентрації на середовищі 199 з додаванням 10% ЕС. До суспензії клітин в 199 середовищі та в 199 середовищі з 10% ЕС додавали повільно, по краплях рівну кількість розчинів ДМСО на відповідному середовищі, доводячи кінцеву концентрацію ДМСО до 3, 5, 7 і 10%. Підготовлені в такий спосіб суспензії клітин розливали по 1 мл у кріопробірки. Кількість клітин у зразку становила 5·105. Тривалість експозиції клітин із кріозахисним середовищем до початку заморожування становила 15 хвилин. Зразки охолоджували зі швидкістю 1°С/хв до -70°С з наступним зануренням у рідкий азот. Такий режим охолодження був обраний як один із таких, що найчастіше застосовується для заморожування клітинних культур, що перевиваються. Відігрівали зразки на водяній бані при температурі 41°С. Потім переносили їх у центрифужні пробірки, відмивали від кріопротектора та додавали середовище 199 з 5% ЕС. Життєздатність клітин оцінювали за допомогою методу суправітального забарвлення клітин трипановим синім. Контролем служили незаморожені зразки і для першої групи зразків це були клітини у середовищі 199, для другої групи - клітини у середовищі 199 з додаванням 10% ЕС.

Використовуючи дані, отримані методом термопластичної деформації, щодо фізичних процесів, які відбуваються у зразках під час заморожування - нагріву, сформульовані рекомендації з оптимізації технології кріоконсервування для клітин S. cerevisiae. У якості середовища кріоконсервування використовувались 3, 5 і 10% водні розчини ДМСО, гліцерину та ПЕО-1500. Контролем служили незаморожені суспензії клітин у відповідних середовищах консервування. Підготовку клітин до заморожування та визначення їх життєздатності проводили по описаній вище схемі. Статистичну обробку отриманих результатів проводили по методу Стьюдента. Вірогідність результатів склала 95%.

При оптимізації режимів кріоконсервування основну увагу приділяли субевтектичному інтервалу температур, який визначали за серією термопластичних кривих для кожного виду кріопротекторного розчина. На першому етапі від кімнатної температури (18...20°С) до температури -20…-40°С зразки охолоджували зі швидкістю 2°С/хв. Кінцеве значення температури охолодження зразків на першому етапі до евтектичного температурного інтервалу визначалося типом кріопротектора. Температурні кордони другого етапу охолодження (субевтектичного температурного інтервалу) були пов'язані з евтектичною температурою кожного конкретного виду кріопротекторного розчину. Для охолодження в субевтектичному температурному інтервалі використовували повільну швидкість охолодження 0.5...1°С/хв (режим 1), швидку 20...25°С/хв (режим 2) та занурення у рідкий азот (режим 3). В області склування усіх розчинів кріопротекторів швидкість охолодження була однаковою і дорівнювала 1°С/хв.

Результати досліджень та їх аналіз

Модифікованим методом термопластичної деформації, який здійснюється шляхом послідовних навантажень на заморожений зразок проведені дослідження механічних властивостей заморожених розчинів кріопротекторів при температурах вище температур їх склування, тобто в тій області температур, де зразок є сумішшю кристалів льоду та незасклованої аморфної фази.

Побудовані криві напруга - деформація для водних розчинів ДМСО, гліцерину, ПЕО-1500, розчинів ДМСО на середовищі 199 та розчинів ДМСО на середовищі 199 з додаванням 10% ЕС. Криві напруга - деформація є найбільш зручними для аналізу механічних властивостей зразків. Як приклад, серія таких кривих для водних розчинів ДМСО представлена на рис. 3.

На рис. 4 на прикладі водних розчинів ДМСО представлені визначені по кривим напруга - деформація показники межі текучості ут, модулю зрушення G та сумарного збільшення деформації повзучості ?е? заморожених зразків між послідовними довантаженнями в залежності від концентрації кріопротектора.

Рис. 4. Залежність межі текучості ут (а), модулю зрушення G (б) та сумарного збільшення деформації повзучості ?е? (в) від концентрації заморожених водних розчинів ДМСО.



З рис. 4 видно, що при досягненні визначених значень концентрацій ДМСО межа текучості та модуль зрушення заморожених водних розчинів різко зменшується, у той час як сумарне збільшення деформації повзучості між послідовними довантаженнями збільшується (перехід від точки А до В на рис.4). Різка зміна цих параметрів характерна для всіх досліджених водних розчинів кріопротекторів. Так, для водних розчинів ДМСО спостерігається різка зміна всіх перерахованих вище параметрів при досягненні концентрації 5% (точки В на рис. 4), для водних розчинів гліцерину - 7% і для водних розчинів ПЕО-1500 - 6%. При досягненні цих концентрацій, очевидно, відбувається зміна структури зразка, тобто співвідношення кристалічної та аморфної фаз. Така зміна структури кріопротекторного розчину, імовірно, зменшує механічні пошкодження біооб'єктів при їх кріоконсервуванні.

Особливо значні механічні пошкодження клітин мають спостерігатися у випадку існування в замороженому зразку замкнених включень рідинної фази у льоді, наявність яких, у свою чергу, визначається, зокрема, початковою концентрацією кріопротектора у кріозахисному розчині. Зі зменшенням концентрації кріопротектора товщина прошарків рідини між кристалами льоду зменшується та сягає значень, при яких їм енергетично вигідно за рахунок зменшення поверхневої енергії перетворитися у відокремлені одна від одної рідинні включення. У цьому випадку пошкодження клітин можуть реалізовуватися за рахунок пластичної деформації льоду при релаксації тиску, що виникає у замкнутих рідинних включеннях за рахунок деформації льоду на його межі. Зменшити дію такого механізму пошкодження можна шляхом збільшення концентрації кріопротекторних речовин. Однак, у цьому випадку з ростом концентрації кріопротектора збільшується його токсична дія на біологічні об'єкти. У зв'язку з цим при розробці технологій низькотемпературного консервування виникає необхідність визначення таких концентрацій кріопротекторних речовин, при яких більша частина відокремлених одна від одної рідинних включень перетворюється у наскрізні прошарки. Концентрації кріопротекторів, при яких здійснюється такий перехід, визначені нами як порогові.

Порогові концентрації кріопротекторів за розробленим нами способом визначаються за зміною механічних властивостей зразків і знаходяться саме у тому діапазоні концентрацій, де токсична дія кріопротектора ще незначна, тобто в тій області, що становить найбільший практичний інтерес для кріобіології (0...10%).

Аналізуючи отримані залежності меж текучості, модулів зрушень та сумарного збільшення пластичної деформації повзучості між послідовними довантаженнями в залежності від концентрацій ДМСО, гліцерину та ПЕО-1500 можна визначити концентраційну область (до точки А рис. 4), де у зразках утворюються замкнені рідинні включення. Зі збільшенням початкової концентрації кріопротектора у кріозахисному розчині об'єм фази, що склується, зростає. Це призводить до змикання рідинних мікрофаз і утворення міжкристалічних тонких рідинних прошарків. При пороговій концентрації (точки В на рис.4) більша частина відокремлених одна від одної рідинних включень перетворюється у наскрізні прошарки. Подальше зростання концентрації кріопротектора призводить до остаточного перетворення замкнених рідинних включень у міжкристалічні наскрізні прошарки та розширення цих прошарків.

Можливість суттєвих механічних пошкоджень біооб'єктів, що кріоконсервуються, зумовлена тим, що в кріопротекторних розчинах утворення кристалів льоду не завершується при температурі евтектики, а триває іноді аж до температури склування і може відбуватися також під час нагріву зразків відразу після досягнення температури розсклування. Особливо значні механічні пошкодження за таким механізмом виникають при малих значеннях концентрацій кріопротекторних речовин, коли заморожений зразок є монолітною матрицею льоду з відносно невеликими по об'єму відокремленими одна від одної рідинними включеннями. Оскільки ці включення є замкненими, то утворення додаткової кількості льоду при охолодженні супроводжується збільшенням тиску в них. Надлишковий тиск Р, що створюється таким чином усередині замкнутого включення з об'ємом V0, розташованого в крижаній матриці, за рахунок утворення додаткової кількості льоду об'ємом ДV можна оцінити по формулі:

,

де Pатм - атмосферний тиск, Е - модуль пружності (для льоду Е=9·1014 Па), н - коефіцієнт Пуассона (для льоду н=0,31), ч - стисливість розчину, що заповнює рідке включення (ч?3·10-10 Па-1для суміші «вода-гліцерин» у співвідношенні 1:1), V0 - об'єм замкнутої порожнини.

Для ДV/V0=0.01 надлишковий тиск у включенні Р-Ратм дорівнює16 МПа. Звичайно у крижаній матриці, межа текучості становить утік?4 МПа і такі великі значення тиску у замкнутому включенні реально не досягаються за рахунок пластичної деформації полікристалічного льоду. Таким чином, пошкодження різних біологічних об'єктів при їх кріоконсервуванні за рахунок пластичної релаксації тиску в замкнутих рідкофазних включеннях може виявитися досить сильним фактором, а вивчення можливостей його зменшення - актуальною проблемою сучасної кріобіології.

Для підтвердження ефективності використання отриманих чисельних показників порогових концентрацій та їх значення у практичній кріобіології проведені експерименти по вивченню зміни життєздатності клітин S. cerevisiae і клітин культур людини (КДКЛ і КФЛ) при переході початкової концентрації кріопротектора у кріозахисному середовищі через їх порогові значення. На рис. 5 представлені дані щодо життєздатності клітин S. cerevisiae після кріоконсервування їх з водними розчинами ДМСО, гліцерину та ПЕО-1500. Середні значення життєздатності обчислені з шести незалежних значень.

Отримані результати свідчать, що життєздатність клітин після заморожування та нагріву під захистом ДМСО, ПЕО-1500 і гліцерину зазнає стрибкоподібної зміни при досягненні концентрацій 5, 6 і 7% відповідно. Стрибкоподібний характер залежності життєздатності клітин від концентрації кріопротектора у кріозахисному середовищі спостерігається для трьох різних кріопротекторів, що свідчить про спільність механізму пошкодження клітин для різних видів кріопротекторів.

При заморожуванні КДКЛ і КФЛ з ДМСО на середовищі 199 та на середовищі 199 з додаванням 10% ЕС (порогова концентрація ДМСО у кріозахисному розчині становила 5%) також спостерігається різке зростання у 2-2,5 рази життєздатності клітин при перевищенні порогової концентрації.

На підставі отриманих результатів можна зробити висновок, що перехід через порогові значення концентрацій кріопротекторних речовин значно впливає на життєздатність різних видів клітин незалежно від типу кріопротектора, середовища, на якому готували захисні розчини та можливих домішок.

Показане на рис. 5 стрибкоподібне збільшення життєздатності клітин можна пояснити якісно новим станом систем, що охолоджуються, який наступає при досягненні порогових концентрацій кріопротекторів, тобто переходом від замкнутих рідинних включень до міжкристалічних наскрізних прошарків. Такий перехід зменшує пошкодження кріоконсервуючих біооб'єктів за рахунок пластичної релаксації тиску, що виникає у замкнутих рідкофазних включеннях.

Розроблений у роботі теоретико-експериментальний підхід дозволяє на основі тензодилатометричних вимірів визначати кількість льоду та об'єм розчину кріопротектора, що склується в процесі нерівноважного фазового переходу, а також залежність зміни концентрації кріопротектора у міжкристалічній рідині під час заморожування від температури. Кількості об'єму розчину, що склується в процесі заморожування кріопротекторного розчину, визначали наступним чином.

Із законів збереження маси кріопротектора і розчинника при кристалізації витікає, що максимальна зміна відносного об'єму розчину, яка відповідає кристалізації при нескінченно повільному охолодженні дорівнює:

, (1)

де - початковий об'єм розчину, що кристалізується; і - початкова і евтектична концентрації розчину кріопротектора; - початкова питома щільність водного розчину кріопротектора; і - відповідно питома щільність льоду та води, які вважаються сталими величинами.

Максимальну зміну відносного об'єму розчину при його кристалізації також можна знайти експериментально за допомогою тензодилатометричних досліджень. На рис. 6 представлений типовий вид залежності відносного об'єму розчину під час кристалізації для розчину ДМСО з концентрацією 20% при його охолодженні зі швидкістю 5°С/хв.

Об'єм розчину, що засклувався в процесі кристалізації при охолодженні з кінцевою швидкістю при евтектичній температурі визначає різниця між максимальною зміною відносного об'єму розчину при кристалізації, розрахованого по формулі (1), і максимальною зміною відносного об'єму, знайденою експериментально за допомогою тензодилатометрії:

.

Даний спосіб дозволяє оцінити об'єм розчину, що засклувався у процесі його кристалізації за евтектичної температури для будь-яких кріозахисних середовищ. Таким чином, можливо визначити ступінь відхилення фазового переходу при кристалізації розчину кріопротектора від рівноважної кристалізації.

При розробці способів низькотемпературного консервування з використанням кріопротекторних речовин потрібно враховувати режим охолодження зразка у субевтектичному інтервалі температур та інтервалі температур, де спостерігається склування зразка. При цьому має значення час знаходження зразка у цих інтервалах температур, тобто швидкість охолодження, а також кінцеві концентрації кріопротекторних речовин. За рахунок варіації цих параметрів можна, як показано в роботі, значною мірою регулювати схоронність кріоконсервованих біооб'єктів. Субевтектичний інтервал температур необхідно проходити з високими швидкостями охолодження, оскільки процес утворення мікрокристалів льоду, що протікає в цьому інтервалі, є процесом активаційного типу, тобто імовірність його реалізації залежить від часу знаходження системи в цьому інтервалі. З іншого боку, в інтервалі температур, де відбувається склування, варто знизити швидкість охолодження. Це зумовлено тим, що заморожений об'єкт в області низьких температур перебуває в твердофазному стані і високі швидкості охолодження у цій області температур супроводжуються виникненням істотних градієнтів температур вздовж зразка, що призводить до значних термопружних напруг і додаткових пошкоджень біологічних об'єктів.

Виходячи з цих міркувань, проведені експерименти по вивченню впливу швидкості охолодження в субевтектичному інтервалі температур розчинів кріопротекторів та інтервалі склування зразків на життєздатність клітин S. cerevisiae при їх кріоконсервуванні. Для визначення цих інтервалів за допомогою методу термопластичної деформації проведені дослідження водних розчинів ДМСО, гліцерину та ПЕО-1500 у діапазоні концентрацій 0...40%, а також клітин S. cerevisiae у водних розчинах ДМСО, гліцерину та ПЕО-1500 із концентрацією кріопротекторів 3, 5 і 10%.

Субевтектичний інтервал температур та інтервал склування розчинів кріопротекторів становить для водних розчинів ДМСО [-40°С; -90°С] та [-90°С; -120°С], для водних розчинів гліцерину [-30°С; -70°С] та [-70°С; -100°С], для водних розчинів ПЕО-1500 [-20°С; -60°С] та [-60°С; -95°С] відповідно. На рис. 7 представлені дані щодо життєздатності клітин S. cerevisiae після кріоконсервування їх з водними розчинами ДМСО та гліцерину з використанням розглянутих вище режимів заморожування.

Таким чином, швидкість охолодження зразків у субевтектичному інтервалі температур значно впливає на життєздатність S. cerevisiae при кріоконсервуванні з водними розчинами ДМСО, гліцерину та ПЕО-1500. При використанні малих (допорогових) значень концентрацій кріопротекторів вплив контрольованих швидкостей охолодження є більш істотним, ніж в області більш високих концентрацій. Для підвищення показників життєздатності біологічних об'єктів при розробці протоколів кріоконсервування необхідно, визначивши субевтектичний інтервал температур розчину кріопротектора та інтервал склування зразків, підбирати швидкості охолодження та нагріву у цих температурних інтервалах за викладеною вище методикою.



ВИСНОВКИ

Наразі всебічно досліджено фізико-хімічні ефекти, що виникають на етапі від початку кристалізації біооб'єкту до евтектичних температур, тоді як пошкодження клітин в області субевтектичних температур майже не досліджувалось. Оскільки фазово-структурні переходи, які відбуваються в області субевтектичних температур, впливають на результат кріоконсервування і залежать від режимів охолодження - нагріву та складу кріозахисного середовища актуальним є вивчення перебігу нерівноважних фазових перетворень в області температур від температури евтектики до температури рідкого азоту та розробка нових підходів до оптимізації режимів охолодження біологічних об'єктів у цій області температур.

Визначено межі текучості, модулі зрушення та сумарне збільшення деформації повзучості заморожених водних розчинів ДМСО, гліцерину, ПЕО-1500, розчинів ДМСО на середовищі 199 та ДМСО на середовищі 199 з додаванням 10% ЕС поблизу температур склування цих розчинів.

Запропоновано новий підхід до визначення значень концентрацій розчинів кріопротекторів, за яких відокремлені одна від одної рідинні включення перетворюються у наскрізні прошарки між кристалами льоду. Ці порогові концентрації для водних розчинів ДМСО, розчинів ДМСО на середовищі 199 та розчинів ДМСО на середовищі 199 з додаванням 10% ЕС складають 5% (мас/мас), а для водних розчинів ПЕО-1500 та гліцерину - 6 і 7% відповідно.

Встановлено, що після заморожування та нагріву клітин S. сerevisiae та клітин культур людини (КДКЛ та КФЛ) з розчинами кріопротекторів спостерігається стрибкоподібне збільшення життєздатності клітин при досягненні концентрації ДМСО, ПЕО-1500 та гліцерину 5, 6 і 7% відповідно. Отримані результати вказують на існування загального механізму виявленого ефекту.

При кріоконсервуванні S. сerevisiae з водними розчинами ДМСО, гліцерину та ПЕО-1500 збільшення початкової концентрації кріопротектора у кріозахисному розчині від 3% до 5% для ДМСО, від 5% до 6% для ПЕО-1500, від 6% до 7% для гліцерину призводить до стрибкоподібного зростання життєздатності клітин на 25% для ДМСО, на 21% для ПЕО-1500 та на 18% для гліцерину.

Життєздатність клітин культур людини (КДКЛ та КФЛ) при кріоконсервуванні з розчинами ДМСО на середовищі 199 та ДМСО на середовищі 199 у присутності 10% ЕС стрибкоподібно збільшується у відсутності ЕС на 31% для КДКЛ та на 18% для КФЛ, а при додаванні 10% ЕС на 33% для КДКЛ та на 24% для КФЛ.

Розроблено оригінальний тензодилатометричний спосіб визначення кількості льоду та об'ємної частки зразка, що склується в процесі кристалізації кріозахисного середовища і залежності зміни концентрації кріопротектора у міжкристалічній рідині під час заморожування від температури.

Методом термопластичної деформації визначено субевтектичні інтервали температур водних розчинів кріопротекторів (ДМСО, гліцерин, ПЕО-1500), де підвищується імовірність механічного пошкодження біологічних об'єктів за рахунок пластичної релаксації підвищеного тиску, який виникає у відокремлених одне від одного рідиннофазних включеннях, а також інтервали температур склування, де відбувається пошкодження біооб'єктів за рахунок термопружних напруг.

З урахуванням отриманих експериментальних даних оптимізовано режими охолодження клітин S. cerevisiae і встановлено, що життєздатність цих клітин після кріоконсервування їх з водними розчинами ДМСО, гліцерину та ПЕО-1500 підвищується, якщо перетин субевтектичного температурного інтервалу здійснюється зі швидкістю охолодження 20...25єС/хв, а перетин температурного інтервалу склування - зі швидкістю охолодження 1°С/хв.



СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ РОБІТ

1. Осецкий А.И. Изучение кинетики расстеклования водных растворов криопротекторов методом термопластической деформации / А.И. Осецкий, А.Л. Кирилюк, Т.М Гурина // Проблемы криобиологии. - 2005. - Т.15, № 2. - С. 137-146.

2. Осецкий А.И. Экспериментальное определение пороговых концентраций криопротекторных веществ, обеспечивающих ингибирование механических повреждений криоконсервируемых биообъектов / А.И. Осецкий, А.Л. Кирилюк // Проблемы криобиологии. - 2005. - Т.15, № 3. - С. 245-247.

3. Кирилюк Г.Л. Теоретичне та експериментальне дослідження процесу льодоутворення в розчинах кріопротекторів методом тензодилатометрії / Г.Л. Кирилюк, В.І. Рєзников, Т.М. Гуріна // Біофізичний вісник. - 2006. - Вип.17(1). - С. 95-102.

4. Осецкий А.И. Применение метода пластической деформации для определения пороговых концентраций криопротекторных веществ при криоконсервировании Saccharomyces cerevisiae / А.И. Осецкий, А.Л. Кирилюк, Т.М. Гурина, И.П. Высеканцев // Проблемы криобиологии. - 2007. - Т.17, № 1. - С. 71-79.

5. Осецкий А.И. О возможном механизме повреждения криоконсервируемых биологических объектов за счет пластической релаксации давлений в замкнутых жидкофазных включениях / А.И. Осецкий, А.Л. Кирилюк, Т.М Гурина // Проблемы криобиологии. - 2007. - Т.17, № 3. -

6. Гурина Т.М. Влияние пороговой концентрации криозащитного раствора на жизнеспособность клеток культур человека в процессе их криоконсервирования / Т.М Гурина, А.Л. Кирилюк, Т.Ф. Петренко, Е.И. Гончарук // Експериментальна і клінічна медицина. - 2008. - №1. - С. 81-84.

7. Гурина Т.М. Влияние контролируемых скоростей охлаждения при температурах ниже -30°С на жизнеспособность криоконсервированных дрожжей Saccharomyces cerevisiae / Т.М Гурина, А.Л. Кирилюк, И.П. Высеканцев // Медицина сьогодні і завтра. - 2008. - №1. - С.43-46.

8. Пат. України № 18660, МПК G 01 N 25/02 Спосіб дослідження розчинів охолоджуваних кріопротекторів / Рєзніков В.І., Кирилюк Г.Л.; заявник і патентовласник Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України. - № u 2006 05586. заявл. 22.05.06; опубл. 15.11.06. Бюл. №11.

9. Пат. України № 26502 МПК G 01 N 25/02 Спосіб дослідження розчинів кріопротекторів при заморожуванні / Оcецький О.І., Кирилюк Г.Л., Гуріна Т.М.; заявник і патентовласник Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України. - № u 2007 05234. заявл. 14.05.07; опубл. 25.09.07. Бюл. №15.

10. Осецкий А.И. Особенности кинетики расстеклования замороженных криопротекторных растворов / А.И. Осецкий, А.Л. Кирилюк, Т.М. Гурина // Проблеми біологічної і медичної фізики: I Укр. наук. конф., 20-22 вересня 2004 р.: тези доп. - Х., 2004. - С. 122.

11. Кирилюк А.Л. Влияние колебаний температуры хранения в диапазоне -196°С…-100°С на жизнеспособность клеток с различной структурной организацией / А.Л. Кирилюк, Л.Г. Абрафикова, С.В. Казанжан // Холод в биологии и медицине: конф. молодых ученых ИПКиК НАН Украины, 17-18 мая, 2005 р.: тезисы докл. - Х., 2005. - С. 10.

12. Kyryliuk A.L. Physical substantiation of three-step freeze-thawing as optimal regimen for changing temperature during biological system cryopreservation / A.L. Kyryliuk, A.I. Osetsky, T.M. Gurina // Cryo-2006: 43rd Annual Meeting of the Society for Cryobiology, July 24-27, 2006 y.: abstract. - Hamburg, 2006. - Р. 15.

13. Высеканцев И.П. Роль контролируемых скоростей охлаждения в субэвтектическом температурном интервале при криоконсервировании криолабильных микроорганизмов / И.П. Высеканцев, Т.М. Гурина, А.Л. Кирилюк // Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии: VI Междунар. науч. конф., 2-6 июня, 2008 г.: материалы конф. - Минск, 2008. - С. 45-46.

АНОТАЦІЯ

Кирилюк Г.Л. Вплив кріопротекторів і режимів заморожування на механічне пошкодження клітин в області субевтектичних температур. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.19 - кріобіологія. - Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, Харків, 2008.

Дисертаційну роботу присвячено вивченню впливу концентрацій кріопротекторів (ДМСО, гліцерин, ПЕО-1500) і режимів заморожування на пошкодження біологічних об'єктів (на прикладі клітин Saccharomyces cerevisiae, клітин диплоїдної культури людини та клітин фібробластів людини) в області субевтектичних температур у процесі кріоконсервування. На основі метода термопластичної деформації розроблена методика визначення механічних характеристик зразків і досліджені пружнопластичні властивості розчинів кріопротекторів поблизу температур їх склування. Запропоновано новий підхід до визначення оптимальних концентрацій кріопротекторних речовин при застосуванні їх у процесі кріоконсервування. Визначено порогові концентрації досліджених кріопротекторів, при яких у заморожених зразках спостерігається різка зміна співвідношення між аморфної та кристалічної фазами, тобто відокремлені одна від одної рідинні включення перетворюються у наскрізні рідинні прошарки. При кріоконсервуванні клітин S. cerevisiae і клітин культур людини спостерігається різке зростання життєздатності клітин при перевищенні порогових концентрацій кріопротекторних речовин після кріоконсервування із ДМСО, гліцерином і ПЕО-1500, що вказує на загальний характер виявленого явища. Встановлено, що одним із механізмів кріопрошкодження біооб'єктів є пластична релаксація підвищеного тиску, який виникає в окремих рідиннофазних включеннях за рахунок нерівноважної кристалізації. Визначені субевтектичні температурні інтервали та інтервали температур, де відбувається склування розчинів кріопротекторів методом термопластичної деформації. Встановлено, що ці температурні інтервали необхідно враховувати у процесі кріоконсервування для зменшення механічного пошкодження біологічних об'єктів. З обліком отриманих експериментальних даних оптимізовано режими охолодження біологічних об'єктів на прикладі клітин S. cerevisiae.

Ключові слова: кріоконсервування, кріопротектор, пружнопластичні властивості, субевтектичні температури, склування, життєздатність, механічне пошкодження, пластична релаксація тиску.



АННОТАЦИЯ

Кирилюк А.Л. Влияние криопротекторов и режимов замораживания на механическое повреждение клеток в области субэвтектических температур. - Рукопись. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.19 - криобиология. Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, Харьков, 2008.

Диссертационная работа посвящена изучению влияния концентраций криопротекторов (ДМСО, глицерин, ПЭО-1500) и режимов замораживания на механическое повреждение биологических объектов (на примере клеток Saccharomyces cerevisiae, клеток диплоидной культуры человека и клеток фибробластов человека) в области субэвтектических температур в процессе криоконсервирования. На основе метода термопластической деформации разработана методика определения механических характеристик образцов, которая осуществляется путем последовательных нагрузок на замороженный образец. Проведены исследования упругопластических свойств растворов криопротекторов вблизи температур их стеклования. Определены пределы текучести, модули сдвига и суммарное приращение деформации ползучести образцов. Предложен новый подход к определению оптимальных концентраций криопротекторных веществ в защитном растворе при применении их в процессе криоконсервирования биологических объектов. Разработан способ определения пороговых концентраций криопротекторов в криозащитном растворе, при которых наблюдается резкое изменение соотношения между аморфной и кристаллической фазами в образцах, т.е. замкнутые жидкофазные включения переходят в сквозные прослойки. Установлены численные значения пороговых концентраций для водных растворов ДМСО, глицерина, ПЭО-1500, растворов ДМСО на среде 199 и растворов ДМСО на среде 199 с добавлением 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота (ЭС). С учетом полученных значений порогових концентраций криопротекторов оптимизирована технология криоконсервирования клеток S. сerevisiae и клеток культур человека. Установлено, что при превышении порогових концентраций криопротекторов после криоконсервирования их с ДМСО, глицерином и ПЭО-1500 наблюдается резкое увеличение жизнеспособности клеток S. сerevisiae, что указывает на общий характер выявленного явления. Жизнеспособность клеток культур человека увеличивается в 2-2,5 раза при превышении порогової концентрации ДМСО после криоконсервирования этих клеток с ДМСО различной концентрации на среде 199 и с ДМСО на среде 199 с добавлением 10% ЭС. На основе тензодилатометрических исследований разработан способ определения количества льда и стеклующегося объема растворов криопротекторов в процессе неравновесного фазового перехода. Теоретически обосновано и экспериментально подтверждено, что одним из возможных механизмов криоповреждения биообъектов является пластическая релаксация давления, которое возникает в отдельных жидкофазных включениях за счет неравновесной кристаллизации. Определены субэвтектические температурные интервалы и интервалы стеклования водных растворов ДМСО, глицерина и ПЭО-1500 методом термопластичної деформации. Установлено, что эти температурные интервалы необходимо учитывать в процессе криоконсервирования для уменьшения механического повреждения биологических объектов. С учетом полученных экспериментальных данных оптимизированы режимы охлаждения клеток S. cerevisiae. Наибольшая жизнеспособность этих клеток после криоконсервирования их с водными растворами ДМСО, глицерина и ПЭО-1500 наблюдается в случае прохождения субэвтектического температурного интервала со скоростью охлаждения 20...25єС/мин и температурного интервала стеклования со скоростью охлаждения 1°С/мин. Ключевые слова: криоконсервирование, криопротектор, упругопластические свойства, субэвтектические температуры, стеклование, жизнеспособность, механическое повреждение, пластическая релаксация давления.

ANNOTATION

Kyryliuk G.L. Influence of cryoprotectants and freezing regimens on mechanical damage of cells within subeutectic interval of temperatures. - Manuscript.

Thesis for a candidate of biological sciences degree in specialty 03.00.19 - cryobiology. Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, 2008.

The thesis is devoted to studying the cryoprotectants' action (DMSO, glycerol, PEO-1500) and freezing regimens on mechanical damage of biological objects (Saccharomyces cerevisiae, cells of diploid human cultures and human fibroblast cells) within sub-eutectic interval of temperatures during their cryopreservation. The technique of determining of mechanical characteristics of samples by consecutive loadings has been developed on the basis of a method of thermoplastic deformation. By means of this technique the researches of elastic-plastic properties of cryoprotective solutions near to the temperatures of their glasstransition are carried out. The new approach to definition of optimum concentration of cryoprotective substances is offered at their application during cryopreservation. There are established the threshold concentrations of the studied cryoprotective solutions, at which in the frozen samples sharp change of a correlation between amorphous and crystal phases is observed, i.e. closed liquid-phase inclusions transform through layers. During cryopreservation of S. cerevisiae cells and those of human cultures there was observed an abrupt increase in cell viability at reaching the threshold concentrations after freezing and thawing with DMSO, glycerol and PEO-1500, pointing to general character of the revealed phenomenon. By means of the method of thermoplastic deformation the sub-eutectic temperature intervals and the vitrification ones for the solutions of cryoprotectants have been found. It has been established that these temperature intervals should be taken into account during cryopreservation for lessening mechanical damage of biological objects due to plastic deformation of pressures in closed inclusions at the non-equilibrium crystallization. Taking into account the obtained experimental data there was optimized the freezing regimens of biological objects on the example of S. cerevisiae cells.

...