Ангiдробіоз мікроводоростей як спосіб збереження їхньої життєздатності

10

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ БІОЛОГІЇ ПІВДЕННИХ МОРІВ ІМ. О.О. КОВАЛЕВСЬКОГО

АВТОРЕФЕРАТ

АНГIДРОБІОЗ МІКРОВОДОРОСТЕЙ ЯК СПОСІБ ЗБЕРЕЖЕННЯ ЇХНЬОЇ ЖИТТЄЗДАТНОСТІ

Дисертація є рукописом

Робота виконана в Інституті біології південних морів ім. О.О. Ковалевського НАН України, м. Севастополь

Науковий керівник: кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник Тренкеншу Рудольф Павлович Інституту біології південних морів ім. О.О. Ковалевського НАН України, в.о. зав. відділу біотехнологій та фіторесурсiв

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор, Костiков Ігор Юрійович Київський національний університет ім. Тараса Шевченка завідувач кафедри ботаніки

доктор біологічних наук, Рябушко Віталій Іванович Інститут біології південних морів О.О. Ковалевського НАН України завідувач відділу морської фармакологiї та бiотестування

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біології південних морів НАН України за адресою: 99011, м. Севастополь, пр. Нахiмова, 2

Автореферат розісланий « 10 » октября 2008 р.

Вчений секретар спеціалізованої ради Д 50.214.01 доктор біологічних наук, професор А.В. Гаєвська

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Мікроскопічні водорості - численна група рiзноманiтних за таксономічним положенням, філогенією та фізіологією фотосинтезуючих мікроорганізмів, яка включає прокаріотичні (ціанобактерії) й еукаріотичнi водорості і налічує за різними оцінками від 30 до 40 тисяч видів (Еремеев и др., 2002; Chaumont, 1993; Ordog, Pulz, 1995). Водорості багаті білками, амінокислотами, вітамінами, поліненасиченими жирними кислотами, пігментами, ефірними маслами, стеарином, імуностимуляторами та іншими біологічно активними речовинами. Будучи невід'ємним компонентом фіторесурсiв і відіграючи важливу роль у природі, мікроводорості набули істотного значення в практичному житті людини. Збіднення їх видової різноманітності може призвести до незворотньої втрати не лише сировинних, кормових, харчових, але й генетичних ресурсів.

Проблема збереження і відтворення біорізноманітності морського середовища найбільш актуальна в умовах нестабільного стану прибережних екосистем. З іншого боку, в зв'язку з розвитком біотехнології і можливістю використання окремих видів мікроводоростей для різних практичних цілей (Еремеев и др., 2002; Sommer et al., 1990; Skulberg, 2000; Pulz, Gross, 2004) виникла необхідність утримання колекцій, які забезпечують збереження цiнних властивостей культивованих штамів.

Одним із важливих завдань сучасної біології є надiйне збереження культур мікроводоростей і створення генетичних банків штамів. У альгологiчнiй практиці застосовується широкий спектр методів, що дозволяють зберігати мікроводорості в життєздатному станi: утримання на рідкому середовищi тривалого зберігання (Marsalek et al., 1998), агарі, альгiнатi (Chen, 2001, 2003), за допомогою ліофілізації, кріозбереження з використанням захисного середовища і кріопротекторiв (Айздайчер, 1987; Meyer, 1986; Caсavate et al., 1995; Day et al., 1997; Surek, 1998; Alexandra et al., 1999; Poncet et al., 2003). Однак, при використанні цих методів змінюются морфологічнi й функціональнi властивостi, а також вiдбувається зменшения розмiрів клітин культур, що зберігаються. Крім того, підтримка культур в життєздатному станi є трудомiстким процесом і потребує дорогого устаткування.

Зберігання мікроводоростей, переведених у стан ангiдробіозу шляхом їх збезводнювання є простим і економічно вигідним способом. Ангiдробіоз - глибоке і тривале гальмування метаболізму, оборотнє за сприятливих умов і достатньо розповсюджене явище в природі. Перехід клітин в ангiдробіотичний стан, вихід із нього і відновлення повної життєздатності становить загальнобіологiчний інтерес.

Досліджень ангiдробіозу надзвичайно мало. Основна частина експериментальних робіт проведена на бактеріях і дріжджах. Через те розробка методів тривалого зберігання мікроводоростей залишається важливою і складною проблемою, розв'язання якої неможливе без вивчення процесiв, що відбуваються при де- і регiдратації вегетативних клітин, що можливо досягти лише комплексними методами досліджень.

Дальшi пошуки способів тривалого зберігання мікроводоростей зумовлені розвитком і зростаючою потребою біотехнологій в постійній наявності життєздатних і стабільних культур, а також пов'язанi з проблемами збереження біорізноманітності флори України.

Зв'язок роботи з програмами, темами, планами. Робота виконана у відділі біотехнологій та фіторесурсiв ІнБПМ НАНУ в рамках досліджень за темами: «Розробка наукових основ біотехнології відтворення і використання морських ресурсiв» (№ держ. реєстрації 0101U001448, 2002-2005 рр.) «Розробка технологій культивування і підвищення адаптаційної здатності морських і прісноводних мікроводоростей з метою збереження існуючого генетичного фонду рослин і раціонального використання фіторесурсного потенціалу України» (№ держ. реєстрації 0102U004004, 2002-2006 рр.). У зазначених темах дисертант був відповідальним виконавцем.

Мета і завдання дослідження. Мета роботи - дослідження ангiдробіозу в мікроводоростях і розробка методу їх тривалого зберігання в життєздатному станi.

Для досягнення мети були поставлені такі завдання:

визначити оптимальну температуру переведення мікроводоростей в стан ангiдробіозу;

дослідити мінливість морфометричних і біохімічних характеристик мікроводоростей і вибрати критерії оцінки їх життєздатності в станi ангiдробіозу;

оцінити життєздатність клітин мікроводоростей в стані ангiдробіозу при різних термінах зберігання;

разробити метод реактивації мікроводоростей iз стану ангiдробіозу в активну культуру.

Об'єкт дослідження - альгологiчно чисті культури Spirulina (Arthrospira) platensis (Nordst.) Geitler, Dunaliella salina (Dunal) Teod, Porphyridium cruentum Naeg, Synechococcus elongatus Nageli, Phaeodactylum tricornutum Bohlin із колекції відділу біотехнологій та фіторесурсiв ІнБПМ НАН України.

Предмет дослідження - ростові, біохімічні і морфометричнi характеристики мікроводоростей, у залежності від умов дегідратації і реактивації.

Методи дослідження. Фотоколориметричні і спектрофотометричні методи визначення оптичної щільності культур, вмісту в клітинах білка, вільних нуклеотидiв, РНК, ДНК, хлорофілiв і сумарних каротиноїдiв; об'ємно-ваговий метод визначення ліпідів; метод розрахунку об'ємiв і площ поверхні одноклітинних водоростей; загальноприйняті розрахункові методики визначення швидкостей росту культур; метод диференційного забарвлення клітин; електронно-мікроскопічний метод дослідження дегiдратованих клітин. Математичну і статистичну обробку даних виконано з використанням комп'ютерних програм для ПК.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше розроблено метод тривалого зберігання мікроводоростей без використання поживного середовища, який включає переведення мікроводоростей у стан ангідробіозу, збереження клітин у дегідратованому стані з наступним переведенням в активну культуру. Метод апробований на про- і еукаріотичних мікроводоростях: морських, галобних і прісноводних видах. Вперше проведено порівняльну оцінку морфометричних характеристик клітин Spirulina platensis, Dunaliella salina, Porphyridium cruentum, Synechococcus elongatus, Phaeodactylum tricornutum і біохімічного складу S. platensis, D. salina до і після збезводнювання, залежно від температури дегідратації й термінів зберігання. Вперше проведено оцінку життєздатності клітин, що знаходяться у стані ангідробіозу протягом різного періоду. Вивчені ростові і біохімічні показники реактивованих мікроводоростей, у залежності від терміну перебування культур у стані ангідробіозу. Встановлені межі залишкової вологості, при якій зберігається життєздатність мікроводоростей у стані ангідробіозу.

Практичне значення отриманих результатів. Розроблений метод тривалого зберігання мікроводоростей успішно використовується в Інституті біології південних морів НАН України, на базі якого створено єдине в Україні сховище ангідробіозних культур: закладено на тривале зберігання більше 100 зразків збезводнених культур мікроводоростей (Spirulina platensis, Dunaliella salina, Porphyridium cruentum, Phaeodactylum tricornutum, Tetraselmis viridis, Synechococcus elongatus, Oscillatoria amoena). Оптимізація методу дає можливість перевести в стан ангідробіозу мікроводорості, що відносяться до різних систематичних груп. Метод може бути рекомендований для застосування в наукових установах і учбових закладах, а також в біотехнологіях, коли потрібне тривале зберігання штамів музейних культур.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота є самостійним науковим дослідженням. Здобувачкою самостійно сформульовані завдання і вибрані методики досліджень, виконаний весь комплекс експериментальних робіт з культивування мікроводоростей і визначення їх морфометричних, біохімічних, ростових характеристик; виконані опрацювання і узагальнення результатів, а також статистичний аналіз отриманих даних.

В працях, опублікованих у співавторстві, внесок претендента полягав в обговоренні цілей, завдань і методів досліджень, проведенні експериментів, аналізі результатів і узагальненні матеріалів. У дисертації використані дані, отримані автором особисто. Права співавторів публікацій не порушені.

Апробація роботи. Результати досліджень були представлені на 11 наукових конференціях: III Міжнародній конференції «Актуальні проблеми сучасної альгології» (м. Харків, 2005); Міжнародній конференції «Проблеми біологічної океанографії XXI сторіччя» (м. Севастополь, 2006); ювілейних наукових конференціях студентів, аспірантів і молодих учених «Біорізноманіття. Екологія. Еволюція. Адаптація.» (м. Одеса, 2003, 2007); на конференціях молодих учених з проблем Чорного і Азовського морів «Понт Евксинський III, VI, IV» (м. Севастополь, 2003, 2005, 2007); «Актуальні проблеми ботаніки та екології» (м. Канів, 2004; м. Умань, 2005; м. Київ, 2007); Міжнародній конференції «Актуальні проблеми ботаніки, екології та біотехнології» (м. Київ, 2006), а також на наукових семінарах відділу біотехнологій та фіторесурсів ІнБПМ НАН України, на засіданні Українського ботанічного товариства (м. Севастополь, 2007).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 20 наукових праць; з них - 6 статей (4 без співавторів) в наукових виданнях, рекомендованих ВАК України, 14 - в наукових збірниках, матеріалах і тезах національних та міжнародних конференцій.

Структура роботи. Дисертація викладена на 155 сторінках машинописного тексту, складається зі вступу, п'яти розділів, висновків, списку літератури, який включає 219 джерел (у тому числі іноземних - 134) і додатків А, Б. Текст ілюстрований 19 таблицями і 41 рисунком.

Огляд літератури

У розділі наведено стислий огляд історії вивчення анабіозу у мікроорганізмів, насіння і спор рослин. Розглядаються основні закономірності анабіозу, обговорюються питання термінології. Детально описані морфологічні і біохімічні зміни, що відбуваються у вегетативних клітинах мікроорганізмів і рослин при дегідратації, регідратації і реактивації. Вивчені і узагальнені методи тривалого зберігання мікроорганізмів у світових колекціях. Проаналізовано сучасний стан проблеми збереження мікроводоростей і зроблено висновок про необхідність пошуку і вибору методу їх тривалого зберігання.

Матеріали і методи досліджень

Матеріалом дослідження слугували 5 видів мікроводоростей, що культивуються в лабораторних умовах у відділі біотехнологій та фіторесурсів ІнБПМ НАН України в період з 2002 по 2006 рр. за безпосередньою участю автора. За стандартними методиками був проведений морфометричний аналіз клітин водоростей (1500 проб) і біохімічний аналіз, що включає визначення хлорофілів, сумарних каротиноїдів і ліпідів, білків, вільних нуклеотидів, РНК і ДНК (2103 проби); визначена залишкова вологість культур (1209 проб). За оригінальною методикою виконана реактивація мікроводоростей із стану ангідробіозу (510 проб). Отримані результати і висновки підтверджені великим обсягом матеріалу і супроводжуются необхідною оцінкою достовірності.

Модельними об'єктами дослідження слугували ціанопрокаріот Spirulina platensis і зелена мікроводорість Dunaliella salina. Метод апробований на ціанопрокаріоті Synechococcus elongatus, червоній мікроводорості Porphyridium cruentum і діатомовій водорості Phaeodactylum tricornutum. Обгрунтуванням для вибору об'єктів було різне таксономічне положення видів мікроводоростей і перспективність використання в біотехнології.

Альгологічно чисті культури прокаріотичних мікроводоростей вирощували на середовищі Zarouk (Faucher et al., 1979), зелені - на середовищі Ben-Amotz (Shaish et al., 1990), діатомові й червоні - на середовищі Тренкеншу (Тренкеншу и др., 1981) методом накопичувальної культури в умовах цілодобового освітлення. Інтенсивність освітлення на поверхні середовища в культиваторах з S. platensis становила 10,7 кЛк, для D. salina, Ph. tricornutum, S. elongatus, P. cruentum - 8 кЛк. Інтенсивність освітлення оцінювали за методикою Т.Я. Чурилової (1992). Температура поживного середовища змінювалася в межах 20-25°С. Рівномірне перемішування суспензії водоростей здійснювали за допомогою барбатування повітря компресорною установкою, потужністю 0,5 л повітря на 1 л культури за 1 хв. Ріст культур реєстрували фотометричним методом за оптичною щільністю суспензії водоростей у діапазоні 750 нм (D750), на фотоелектроколориметрі КФК-2 в кюветах з робочою довжиною поверхні 5 мм.

Культури сконцентровували на стаціонарній фазі росту: трихоми S. platensis за допомогою планктонного сита 100-105 ПЕ (Richmond, 1990), з наступним промиванням дистильованою водою; клітини D. salina, Ph. tricornutum, P cruentum, S. elongatus - центрифугуванням (3000 об./хв) на лабораторній центрифузі
ОПН-3-УХЛ 42. Пасту водоростей промивали ізотонічним розчином вуглекислого амонію (Воронова, 1994).

Стану ангідробіозу клітин досягали трьома способами: 1) 0,1 мл суспензії водоростей наносили на покривне скло і висушували в термостаті при температурі 30 і 60°С протягом 24 год; 2) такий самий об'єм культури дегідратували в ексикаторі з силікагелем при кімнатній температурі в темряві протягом 24 год; 3) сконцентровані клітини мікроводоростей ділили на дві частини, одну з яких відмивали від солей. Потім кожну половину проби ділили на три частини і збезводнювали в термостаті при температурі 30, 60, 70°С протягом 24 год. Збезводнені культури мікроводоростей зберігали в темряві в герметично закритих поліетиленових упаковках при температурі навколишнього середовища 18-20°С. Контролем слугували клітини, які не підлягали збезводнюванню. ангiдробіоз мікроводорость життєздатність

Проби мікроводоростей обробляли за схемою комплексного хімічного аналізу гідробіонтів (Копытов и др., 1985). Масову долю білка у водоростях визначали за методикою Лоурі (Lowry et. al., 1951), вміст пігментів - методами спектрофотометрії на приладі СФ - 2000 (Rowan, 1989). Хлорофіл (ХЛ) а і в із вологих клітин S. platensis і D. salina екстрагували 100 % ацетоном. Для розрахунку його концентрації в клітинах S. platensis використовували специфічний коефіцієнт екстинкції, що дорівнює 88,15 дм³Мг^-1 см^-1 (при = 663 нм) (Jeffrey, Humphrey, 1975). В екстрактах із клітин D. salina оптичну щільність реєстрували при 662 і 644 нм, для розрахунку використовували формули (Большой практикум…, 1975). Хлорофіл а і в із сухих клітин S. platensis і D. salina екстрагували 90 % ацетоном; оптичну щільність отриманих супернатантів реєстрували для S. platensis при довжині хвилі 663 нм (Jeffrey, Humphrey, 1975), для D. salina при - 664 і 647 нм (Rowan, 1989). Каротиноїди (КР) оцінювали в сумарній витяжці пігментів: у вологій культурі зелених водоростей в діапазоні 440,5 нм (Большой практикум…, 1975), а в сухій - в діапазоні 480 нм (Rowan, 1989). Для S. platensis концентрацію каротиноїдів визначали за поглинанням в діапазоні 480 нм (Rowan, 1989). Сумарний вміст ліпідів знаходили ваговим методом (Методы.., 1975). Кількість вільних нуклеотидів (ВН), РНК і ДНК визначали методом спектрофотометрії (Спирин, 1958). Реєстровані показники хімічного складу клітин виражали в перерахунку на суху масу (СМ) мікроводоростей і відсоток органічної маси. Зольність визначали ваговим методом після спалюванням наважок мікроводоростей у муфельній печі при температурі 600С до постійної ваги. Вологість у збезводнених культурах визначали стандартним методом доведення до постійної маси (Методы…, 1975).

Виявлення живих і мертвих клітин мікроводоростей здійснювали методом диференційного забарвлення клітин метиленовим синім, еозином і трипановим синім (Методы., 1975) за допомогою світлового мікроскопа. Одночасно враховували кількість реактивованих клітин і визначали частку життєздатних клітин. Під життєздатністю розуміли здатність мікроводоростей ендогенно поглинати барвник. Критерієм життєздатності також був ріст мікроводоростей на рідкому поживному середовищі. Для кількісного підрахунку росту мікроводоростей в культурі використовували камеру Горяєва (Методы…, 1975).

Морфологічні дослідження проводили з використанням растрового електронного мікроскопа JSM-6060 LV (фірми JEOL, Японія) і світлового мікроскопа Axiostar plus (CARL ZEISS, Німеччина). Традиційні методи підготовки зразків для скануючої електронної мікроскопії викликають обводнення препарату. Щоб уникнути обводнення клітин при їх хімічній фіксації, до дисків-підкладок приклеювали гранули водоростей, збезводнених звичайним способом. Потім зразки напилювали металом (Ровенский, 1979).

Об'єми, площі поверхні мікроводоростей розраховували за формулами (Брянцева, 2005; Брянцева и др., 2005) за програмою «Plankton.2». Ростові показники водоростей на різних фазах розвитку періодичної культури обчислювали за рівняннями, приведеними у роботі Р. П. Тренкеншу (2005).

Достовірність результатів оцінювали за допомогою критерію Стьюдента (Лакин, 1973). Статистичну обробку даних виконували за стандартними програмними пакетами.

У роботі, згідно з правилами “Міжнародного ботанічного кодексу”, застосовано традиційну номенклатуру (Кондратьева, 2001).

Переведення мікроводоростей в стан ангідробіозу

Морфометричні зміни клітин мікроводоростей при збезводнюванні. У розділі наведені узагальнені результати експериментальних даних, які вказують на видоспецифічні зміни морфометричних характеристик клітин водоростей (довжини, ширини, об'єму, площі) під час їх збезводнювання.

Показано, що збезводнювання S. platensis супроводжувалося статистично значущим зменшенням ширини клітин трихом на 28 % (t = 7,98 > t₀₅ = 2,04) при температурі 30°С, на 31 % (t = 9,05 > t₀₅ = 2,02) при температурі 60°С, на 25 % (t = 7,29 > t₀₅ = 2,02) при дегідратації на силікагелі і збільшенням їх довжини на 22 % (t = 2,37 > t₀₅ = 2,05) при температурі 60°С у порівнянні з контролем, тоді як при температурі 30°С і кімнатній температурі на силікагелі збільшення довжини клітин було статистично незначущим 2-3 % (t = 0,37 < t₀₅ = 2,04 и t = 0,26 < t₀₅ = 2,05). Товщина і об'єм трихом після збезводнювання скорочувалися приблизно в 2 рази. Отримані результати підтверджені електронно-мікроскопічними дослідженнями. Таким чином, збезводнювання S. platensis незалежно від способу дегідратації призводить до зменшення розмірів клітин і трихом, порівняно з контрольною культурою водоростей.

Збезводнювання D. salina призводило до зміни форми і об'єму клітин. Найбільш суттєві морфометричні зміни спостерігали у водоростей, збезводнених при температурі 60°С: діаметр клітин скорочувався на 36 % (t = 12,41 > t₀₅ = 1,98), при цьому їх довжина зменшувалася на 24 % (t = 7,42 > t₀₅ = 1,98) у порівнянні з контролем. Світлова мікроскопія дозволила виявити в збезводнених культурах клітини з пошкодженими оболонками; при використанні електронного мікроскопа також були виявлені зморщені клітини, без чітких контурів. В залежності від умов збезводнювання була проведена оцінка мінливості форми клітин водоростей. Вивчення збезводнених зразків D. salina показало, що в культурі, дегідратованій при 30°С, домінували клітини кулястої форми, які зберігали здатність до відновлення життєдіяльності протягом 2-х днів після дегідратації. В культурі, збезводненій при температурі 60°С і на силікагелі, переважала невластива для даного виду форма клітин (куля + параболоїд), яка при наступній реактивації не відновлювалась. У всіх зразках були виявлені цистовані клітини. Таким чином, проведені дослідження показали, що збезводнювання D. salina при високих значеннях температури призводить до необоротних наслідків. Завдяки інцистуванню, даний вид переживає несприятливі умови навколишнього середовища, як природні, так і штучно створені.

Зміни форми і розмірів клітин при дегідратації були зареєстровані у морських видів мікроводоростей: P. cruentum, Ph. tricornutum, S. elongatus. Результати морфометричних вимірів виявили при збезводнюванні статистично достовірне зменшення розмірів клітин. Так, діаметр клітин P. cruentum зменшувався на 25 % (t = 9,68 > t₀₅ = 2,00) у порівнянні з контролем, при цьому відповідно відбувалося зниження об'єму і площі їх поверхні в 2 рази. У культурі S. elongatus так само, як і в S. platensis під час дегідратації відмічено статистично достовірне скорочення ширини клітин на 20 % (t = 7,31 > t₀₅ = 2,00) при їх незначному здовженні на 5 % (t = 1,04 < t₀₅ = 2,00) порівняно з морфометричними показниками клітин до збезводнювання.

Діапазон коливань морфометричних характеристик розмірів клітин Ph. tricornutum під час дегідратації не перевищував одного мікрона, проте ці зміни були статистично значущими. Ширина клітин зменшувалась на 5 % (t = 2,12 > t₀₅ = 2,00), довжина - на 11 % (t = 5,54 > t₀₅ = 2,00), а об'єм - на 18 % (t =2,74 > t₀₅ = 2,00); при цьому площа поверхні скорочувалась на 13 % (t = 3,31 > t₀₅ = 2,00) у порівнянні з контрольними зразками. Електронно-мікроскопічне дослідження Ph. tricornutum дозволило виявити в збезводнених клітинах складчастість поверхні, утворення невеликих заглибин або вип'ячувань у вигляді пухирців різних форм і розмірів.

Зміна біохімічного складу клітин мікроводоростей при збезводнюванні. Показано, що дегідратація культур мікроводоростей супроводжувалась зміною їх біохімічного складу (рис. 1). Після збезводнювання в S. platensis виявлено статистично значуще зниження вмісту вільних нуклеотидів на 56 % (t = 5,84 > t₀₅ = 2,78) та підвищення вмісту РНК на 41,5 % (t = 4,30 > t₀₅ = 2,78), білка на 33 % (t = 59,25 > t₀₅ = 2,78) у порівнянні з біохімічними показниками до дегідратації (рис. 1. А). Статистично незначуще знизився вміст пігментів: ХЛ a - на 3 %, КР - на 15 % (t = 2,29 > t₀₅ = 2,78), сумарних ліпідів - на 32 % (t = 2,69 > t₀₅ = 2,78); тоді як ДНК підвищилась - на 29% (t = 2,29 > t₀₅ = 2,78).

Рис. 1. Динаміка компонентів біохімічного складу Spirulina platensis (А, В), Dunaliella salina (Б, Г) до і після дегідратації в залежності від температури збезводнювання.

При порівнянні біохімічних показників D. salina до і після збезводнювання, реєстрували статистично значущі зміни пігментного комплексу (рис. 1. Б). Вміст ХЛ а знизився на 43 % (t = 14,15 > t₀₅ = 2,78), ХЛ b - на 70 % (t = 8,74 > t₀₅ = 2,78), КР - на 64 % (t = 28,44 > t₀₅ = 2,78). Статистично значуще зменшилася кількість вільних нуклеотидів - на 53 % (t = 9,44 > t₀₅ = 2,78). Зміна вмісту РНК, ДНК, сумарних ліпідів і білків була статистично незначущою.

У S. platensis з підвищенням температури дегідратації, від 30 до 60°С відмічено статистично значущі зміни вмісту пігментів (рис. 1. В). У D. salina із збільшенням температури збезводнювання від 30 до 70°С, вміст компонентів пігментного комплексу знижувався. У цього виду, в цьому ж діапазоні виявлено значуще зменшення вмісту вільних нуклеотидів, підвищення ДНК і ліпідів (рис. 1. Г).

Таким чином, як у про-, так і еукаріотичних водоростях при переведенні їх в стан ангидробіозу, зареєстровано зниження вмісту пігментного комплексу, вільних нуклеотидів і ліпідів. При цьому, якщо у S. platensis зміни стосувалися лише пігментного комплексу, то у D. salina - пігментного, нуклеотидного і ліпідного комплексів.

Реактивація культур мікроводоростей із ангідробіозу

Вибір умов регідратації. Відновлення життєдіяльності клітин мікроводоростей із ангідробіозу залежить від способу збезводнювання, умов зберігання, а також від успішної регідратації. З метою виявлення оптимальних умов регідратації (освітленість, зволожувач) було проведено ряд експериментів. Для вибору оптимального зволожувача регідратацію клітин проводили розчинами кімнатної температури (20°С) і підігрітими до 30°С: 1) хлоридом натрію 0,25 М; 2) середовищем Zarouk, розбавленим дистильованою водою в співвідношенні 1:1; 3) нерозбавленим середовищем Zarouk. До наважок культури S. platensis, масою 0,02 г, збезводнених при температурі 30°С, додавали по 0,5 мл вище зазначених розчинів (рис. 2. А).

Регідратацію водоростей проводили двома способами: а) після зволоження перерахованими розчинами, культуру витримували 24 год при освітленості 2 кЛк, б) культуру поміщали на 2 год у темряву, а потім переносили на люміностат (освітленість 2 кЛк) (рис. 2. Б). В обох експериментах через 2 год після початку регідратації до зразків, зволожених першим і другим розчинами, додавали 3-5 мл середовища Zarouk, розбавленого дистильованою водою (1:1). При зволоженні нерозбавленим середовищем Zarouk, додавали 3 - 5 мл того ж розчину.

Рис. 2. Вплив температури розчинів, використовуваних для регідратації (А) і умов реактивації (Б) на життєздатність Spirulina platensis (1 - хлорид натрію; 2 - середовище Zarouk, розбавлене 1: 1; 3 - середовище Zarouk).

Отримані результати засвідчують про те, що реактивація S. platensis відбувалась ефективніше на світлі, при зволоженні збезводнених клітин розбавленим середовищем Zarouk (1: 1), при температурі розчинів 30°С.

Залежність життєздатності клітин мікроводоростей від температури їх збезводнювання. Аналіз отриманих даних показав, що кількість життєздатних клітин залежить від температури дегідратації культури (рис. 3). У S. platensis у перші години реактувації найбільшу частку життєздатних клітин (90-95 %) було виявлено в культурах, збезводнених при температурі від 20 до 60°С. Відсутність життєздатних клітин і наявність лізованих зареєстровано в культурах, збезводнених при 70°С.

В культурах, збезводнених при температурах 30 - 60°С, протягом 24 - 72 год відзначали зниження кількості життєздатних клітин до 80-75 %; починаючи від 96 до 192 год їх кількість залишалася стабільною і становила 75-83 %. Частка живих клітин у культурі, дегідратованій при 20°С, залишалася незмінною 72 год (90 %). Істотне зниження життєздатних клітин до 50 % було зафіксовано через 96 год від початку реактивації, яке потім залишалося без змін до 192 год. В культурі S. platensis, висушеній при температурі 70°С, через 48 год від початку реактивації частка життєздатних клітин склала 10 %, а через 72 год - спостерігали збільшення життєздатних клітин до 85 %. Проте, після 96 год їх кількість знову знижувалась і продовжувала спадати до 192 год, після чого стабілізувалась (рис.3). У всіх досліджуваних зразках через 384 год реактивації відзначали збільшення кількості життєздатних клітин.

10

Размещено на http://www.allbest.ru/

Аналіз отриманих даних показав, що відповідно до класифікації клітин за життєздатністю, розробленої М. Н. Мейсель (1961), в реактивованих культурах присутні клітини 5-ти типів (табл. 1). В культурах S. platensis, збезводнених при 20-60°С, розподілення на 1-й і 2-й типи клітин слід вважати умовним через труднощі їх диференціації. Дуже пошкоджені клітини, які повільно відновлювались, були відмічені лише в культурі, збезводненій при 70°С; на репарацію пошкоджень їм було потрібно 8 днів. Загальна втрата клітин під час реактивації в культурі, дегідратованій при температурі 20°С, сягала 50 %, при 30-60°С - 20-25 %, при 70°С - 55 %.

Таблиця 1. Класифікація клітин Spirulina platensis за життєздатністю при різних значеннях температури дегідратації

Таким чином, для вступу S. platensis в лог-фазу клітинам необхідно відновити всі пошкодження, які зазнали при дегідратації. Дегідратація при температурі 20 і 70°С супроводжується пошкодженням більшої кількості клітин. Оптимальна температура дегідратації S. platensis знаходиться в діапазоні від 30 до 60°С.

Морфометричні зміни клітин мікроводоростей при реактивації. В S. platensis через 30 хв регідратації, незалежно від способу збезводнювання, ширина клітин відновлювалась на 88-91 % (t = 2,79 > t₀₅ = 2,02, t = 4.49 > t₀₅ = 2,02) і не змінювалась протягом 24 год. Довжина клітин через 30 хв після зволоження перевищувала таку в контрольних клітинах. У клітин, збезводнених при 30°С, вона зростала на 18 % (t = 2,38 > t₀₅ = 2,00), при 60°С - на 11 % (t = 0,99 < t₀₅ = 2,02), в ексикаторі з силікагелем - на 5 % (t = 0,66 < t₀₅ = 2,02). Клітини набували своєї нативної форми через добу, і їх довжина відповідала 88 % контрольного зразка в клітинах, дегідрованих при 30°С, 85 % - при 60°С, 92 % - на силікагелі. Товщина клітин зростала вдвічі, незалежно від умов дегідратації. Після 24 год реактивації спостерігали зменшення довжини трихом в 3-5 разів при всіх способах збезводнювання культур. Об'єм сухих трихомів становив половину їх об'єму до дегідратації. Через 30 хв регідратації він відновлювався, проте через 24 год зменшувався в середньому на 30 %, що пов'язано зі скороченням довжини трихомів у процесі реактивації.

У D. salina ширина клітин, збезводнених при 60°С, через 2 год після зволоження відновилась на 76 % (t = 8,37 > t₀₅ = 1,98), а у клітин, дегідратованих в ексикаторі з силікагелем - на 73 % (t = 6,37 > t₀₅ = 2,00), при цьому довжина складала 88 і 95 % (t = 3,85 > t₀₅ = 1,98, t = 1,21 < t₀₅ = 2,00) їх попереднього розміру відповідно. У клітин, дегідратованих при 30°С і 45°С, відновлення розмірів відбувалося значно швидше. Так, через 30 хв ширина клітин становила 95 і 87 %, а довжина - 96 і 85 % контрольного зразка. Крім того, в культурі, дегідратованій при 30°С, через 30 хв після зволоження, спостерігали відновлення клітин, серед яких переважали кулясті форми, тоді як у клітин, збезводнених при температурі, вищій за 30°С, під час регідратації відбувалося незначне відновлення форми. У цих клітин об'єм і площа поверхні не досягали первинних показників.

У S. elongatus клітини набували початкових параметрів протягом 30 хв після зволоження. Швидкість їх відновлення не залежала від температури дегідратації і була однакова в усіх експериментах.

У мікроводорості P. cruentum не спостерігали відновлення діаметра, об'єму і площі поверхні клітин протягом 24 год реактивації. Окремі клітини цього виду набували первинних розмірів лише через 10 днів.

Морфометричні характеристики Ph. tricornutum (ширина, довжина, об'єм і площа поверхні клітин) за період 24 год реактивації також залишалися без змін. Через 1 місяць в реактивованій культурі відмічено збільшення розмірів клітин і їх поділ.

Отже, у червоних P. cruentum і діатомових Ph. tricornutum мікроводоростей, у процесі збезводнювання відбуваються стійкі зміни параметрів клітин, для відновлення яких потрібний тривалий час.

Динаміка реактивації мікроводоростей із стану ангідробіозу. Викладені в попередніх розділах розроблені способи дегідратації, регідратації і реактивації були апробовані на двох видах водоростей класу Cyanophyceae і трьох видах класів Chlorophyceae, Rhodophyceae і Bacillariophyceae. Процеси, що відбуваються при реактивації, прослідили в динаміці, починаючи від моменту зволоження і до початку ділення клітин.

Реактивація S. platensis починалася з відносно швидкого обводнювання висушених клітин і відновлення їх морфометричних характеристик. Диференціальне вітальне забарвлення показало, що клітини, які за своєю морфологією відповідні живим і здатні до подальшого розвитку, характеризуються дифузним синім забарвленням цитоплазми. Виявлено, що в процесі збезводнення клітин змінюються фізико-хімічні властивості цитоплазми, внаслідок чого в ній відбувається сорбування барвника і його дифузний розподіл, що є якісною реакцією, яка вказує на стан паранекрозу. Через 1-2 год від початку реактивації деякі трихоми розпадалися на окремі клітини. Через 24 год за допомогою фазово-контрастної мікроскопії виявляли клітини, які невідновлюються. При цьому в самих трихомах спостерігали чергування живих і пошкоджених клітин. Загибла частина клітин не фарбовувалася. Через 72 год пошкоджені ділянки трихомів поступово піддавалися автолізу, а через 96 год в культурі переважали короткі трихоми, розміри яких варіювали від 20 до 60 мк. Вони були життєздатні, мали сформовані кінцеві клітини. В збезводненій S. platensis період лаг-фази (від початку реактивації до першого поділу) тривав до 2-х тижнів, тоді як у контролі аналогічна фаза становила 24 год, що засвідчує про стійкі фізіолого-біохімічні зміни в клітинах. Стадія експоненціального росту S. platensis починалася через 672 год (4 тижні).

У процесі регідратації D. salina були відмічені стиснені, деформовані, з пошкодженими оболонками клітини. Відновлені клітини були виявлені в культурах, збезводнених на покривних склах з культуральним середовищем, а також серед клітин, осаджених з перекристалізованою сіллю поживного середовища. У цього виду, дегідратованого при 30°С, через 30 хв після обводнення було виявлено 10 % живих рухливих клітин від їх загальної кількості. В пробах, збезводнених при 60°С, через 24 год реактивації кількість життєздатних клітин становила близько 1 %. При реактивації водоростей, збезводнених після центрифугування при температурі 30, 60 і 70°С, як промитих, так і не промитих від культурального середовища, життєздатних нецистованих клітин не було виявлено. У всіх зразках були присутні цисти.

Відновлення первинних розмірів S. elongatus було зареєстровано через 30 хв після реактивації. Через 24 год від початку реактивації мікроводорості переходили до стадії експоненціального росту. При забарвленні клітин метиленовим синім спостерігали явище паранекрозу з подальшим виходом із цього стану. В культурах, що зберігаються в збезводненому стані протягом від 6 місяців до 3 років, реєстрували швидке відновлення життєздатності клітин, не залежно від температури і часу дегідратації. Регідратація P. cruentum супроводжувалася виділенням у реактиваційне середовище пігменту фікоеритрину, що очевидно, пов'язано з руйнуванням мембран і втратою клітинної речовини під час реактивації. Протягом 24 год клітини не відновлювали свої первинні морфометричні характеристики; їх відновлення було зареєстровано в окремих клітинах через 10 днів від початку реактивації. Через 25 днів клітини переходили до поділу. Відновлення Ph. tricornutum тривало протягом місяця, після чого клітини починали ділитися.

Таким чином, після збезводнювання клітин мікроводоростей видів Spirulina platensis і Synechococcus elongatus, представників класу Cyanophyceae, їх репарація відбувається в значно короткі терміни, порівняно з іншими мікроводоростями, і супроводжується переходом клітин до ділення.

Ростові й біохімічні характеристики реактивованих культур. Криві росту реактивованих культур S. platensis, D. salina аналогічні і не залежать від термінів перебування їх у стані ангідробіозу (рис. 4).

1)

2)

Рис. 4. Динаміка біомаси накопичувальних культур Spirulina platensis (1) і Dunaliella salina (2) після реактивації. А - контрольна культура, Б - культура, яка перебувала в стані ангідробіозу 3 роки, В - культура, яка перебувала в стані ангідробіозу 1 рік, Г - культура, що знаходилася в стані ангідробіозу 2 роки, збезводнена з сіллю при температурі 30°С.

Ростові характеристики реактивованих водоростей практично ідентичні контролю (табл. 2).

Таблиця 2. Ростові характеристики реактивованих мікроводоростей на різних фазах розвитку періодичної культури

Умовні позначки: м_m - максимальна питома швидкість росту на логарифмічній стадії росту (доб^-1), g - час подвоєння біомаси на логарифмічній стадії росту (доб), В - динаміка щільності (г СМ/л доб), Р_m - середня продуктивність на лінійній фазі росту (г СМ/л доб), м_r - питома швидкість дихання на стадії уповільнення росту (доб^-1), В_m - максимальне значення біомаси в кінці стадії уповільнення росту (г СМ/л).

Біохімічні показники реактивованих культур S. platensis практично не відрізнялися від таких у контролі і не залежали від термінів перебування в збезводненому стані, за винятком вмісту ліпідів, який був нижчий на 35 % у культурі, яка знаходилася в стані ангідробіозу один рік. Відмічено також зниження білків на 12 % (t = 7,43 > t₀₅ = 3,18) і підвищення ДНК на 60 % у культурі, реактивованій після 3-річного зберігання в стані ангідробіозу.

Зберігання культур мікроводоростей в стані ангідробіозу

Вплив тривалості зберігання на життєздатність культур у стані ангідробіозу. Для оцінки стану культур мікроводоростей в ангідробіозі проводили їх реактивацію. У S. platensis, що зберігалась у збезводненому стані від 0,5 до 1 року, частка життєздатних клітин через 2 год від початку регідратації становила 93-94 %. Із зростанням термінів зберігання зразків до 6 років їх кількість знизилася до 76 % від загальної кількості клітин.

Виявлено зв'язок залишкової вологості клітин S. platensis з їх життєздатністю. Так залишкова вологість в межах 9-11 % сприяє збереженню їх життєздатності, тоді як ії підвищення до 12 % є критичним для виживання клітин у висушеному стані.

Кількість життєздатних клітин D. salina залежить від часу перебування їх у стані ангідробіозу. Після 24 год зберігання збезводнених водоростей без промивання культури від поживного середовища частка живих клітин становила 2 %, через 48 год - 0,73 % і через 144 год - 0,03 % від загального числа проаналізованих клітин. При тривалішому зберіганні життєздатних нецистованих клітин не виявлено. У всіх зразках, незалежно від часу їх перебування в стані ангідробіозу, були виявлені цистовані клітини, що становили 0,7-2 % від загального числа проаналізованих клітин. У промитій від солей і збезводненій культурі D. salina, незалежно від тривалості ії зберігання, цистовані клітини складали 0,7 % від загального числа клітин.

Таким чином, зберігання водоростей у повітряно-сухому стані протягом 7 діб приводило до загибелі нецистованих клітин, а на кількість цистованих клітин не впливали терміни зберігання, температура збезводнювання, тривалість процесу дегідратації і залишкова вологість, що пов'язано з видоспецифічністю виду.

Частка життєздатних клітин S. elongatus у всіх збезводнених пробах була високою, не залежно від часу перебування в стані ангідробіозу. Після зволоження протягом 30 хв клітини відновлювали свої первинні розміри; через добу починали ділитися, не залежно від температури (30-70°С), часу збезводнювання (4-36 год), тривалості зберігання (0,6-3 роки) і залишкової вологості (8-11 %) у висушених культурах.

Через 4 місяці після переведення в стан ангідробіозу частка життєздатних клітин P. cruentum склала 6-8 % від загальної кількості клітин, при їх залишковій вологості 12,5 %. Внесок живих клітин, збезводнених в таких самих умовах, але до вмісту залишкової вологості 27,9 %, при зберіганні протягом 2-х місяців знаходився в межах 4 %; до залишкової вологості 11 % при терміні зберігання 1 місяць - 10 % від загальної кількості клітин. У культурах, що зберігаються протягом року при залишковій вологості 10,5 - 12,45 %, частка життєздатних клітин становила всього 1 %.

Критерієм життєздатності Ph. tricornutum було ріст клітин на рідкому поживному середовищі. Через 1 місяць від початку реактивації відзначали ділення клітин. Найбільшу кількість молодих клітин виявлено в культурах із залишковою вологістю 14 %, що зберігаються протягом 24 і 36 місяців, менше - в культурах, збезводнених до залишкової вологості 11,6 і 12,1 %, що також перебувають в стані ангідробіозу відповідно 24 і 36 місяців. У Ph. tricornutum, із залишковою вологістю 7,7 %, після реактивації молодих клітин не виявлено. Отже, для збереження Ph. tricornutum в життєздатному стані необхідно, щоб залишкова вологість збезводнених культур знаходилася в межах 11,6-14 %.

Динаміка вмісту біохімічних речовин в клітинах мікроводоростей у процесі їх зберігання. Аналіз біохімічних показників виявив, що у S. platensis після року зберігання в збезводненому стані відбувалося зниження концентрації ХЛ а на 7-12 % порівняно з показниками, визначеними при закладанні зразків на зберігання, тоді як вміст каротиноїдів зменшувався незначно. Частка вільних нуклеотидів у клітинах за цей же період зросла в 4 рази, а ДНК знизилася в 9, 27 і 26 разів при 30, 60 і 70°С відповідно. Частка РНК у зразках, збезводнених при 30, 60, 70°С, знизилася на 20, 16, і 9 %. При тривалому зберіганні S. platensis показник РНК/ДНК підвищився в 10 (збезводнювання при 30°С) і в 30 разів (при 60 - 70°С). Різке зростання концентрації вільних нуклеотидів в S. platensis сталося, очевидно, через деструкцію ДНК і РНК.

Відмічено, що у D. salina під час зберігання в стані ангідробіозу протягом одного року відбувалася деструкція пігментного комплексу: вміст ХЛ а знизився на 39 %, ХЛ b - на 72 %, а КР - на 87 % порівняно з результатами біохімічного аналізу перед закладкою на зберігання, що можливо, пов'язано з відмиранням клітин у стані ангідробіозу. В збезводненій культурі D. salina, через рік після збезводнювання, нецистовані життєздатні клітини були відсутні. Виявлено, що деструкції була піддана лише ДНК, ії частка знижувалася на 58 %.

У наших експериментах зареєстровано максимальне зниження вмісту РНК лише на 20 %. Відомо, що для збереження життєздатності клітин водоростей кількість РНК повинна бути не менше 60 %, порівняно з первинною (Беккер и др., 1990). Цей факт засвідчує про збереження клітинами їх життєздатності.

Висновки

Вперше показано, що мікроводорості водного середовища можуть зберігатися в збезводненому стані тривалий час (протягом декількох років). Розроблені методи їх переведення у стан ангідробіозу, тривалого зберігання і реактивації. Методи апробовані на 5 видах мікроводоростей різних систематичних груп.

У стан ангідробіозу переведено 2 види прокаріотичних (Spirulina platensis, Synechococcus elongatus) і 3 види еукаріотичних (Dunaliella salina, Porphyridium cruentum, Phaeodactylum tricornutum) мікроводоростей. Експериментальним шляхом визначено, що температура 30-60°С є оптимальною для переведення в стан ангідробіозу досліджуваних видів.

Дегідратація культур мікроводоростей спричинює морфометричні зміни клітин (у порівнянні з контролем), які носять видоспецифічний характер: для Spirulina platensis характерне збільшення довжини (при 60°С на 22%) і зменшення ширини клітин (на 25-31%); для Phaeodactylum tricornutum виявлено зниження їх ширини (на 5 %) і довжини (на 11 %); для Synechococcus elongatus відмічено скорочення ширини (на 20 %); для Porphyridium cruentum - зменшення їх діаметра (на 25 %), тоді як клітини Dunaliella salina набувають кулястої форми.

Переведення про- і еукаріотичних мікроводоростей у стан ангідробіозу супроводжується статистично значущим зниженням вмісту пігментів, вільних нуклеотидів і ліпідів. Зміна нуклеотидного і пігментного комплексів може слугувати критерієм оцінки життєздатності водоростей в ангідробіозі.

Встановлено, що реактивація мікроводоростей із стану ангідробіозу ефективна за таких умов: використанні розбавлених середовищ у співвідношенні 1 : 1, температурі розчинів 25-30°С і освітленості близько 2 кЛк.

Відновлення морфометричних показників реактивованих клітин і здатності їх до ділення у прокаріотичних водоростей відбувається швидше, ніж в еукаріотичних. Розміри клітин прокаріотичних мікроводоростей відновлюються протягом 30 хв - 24 годин, а еукаріотичних через 10-30 днів. Процес ділення клітин після реактивації починається у прокаріотів через 1 день (Synechococcus elongatus) і 14 днів у (Spirulina platensis), в еукаріотів - 20-30 днів. Ростові і біохімічні характеристики реактивованих водоростей як прокаріотичних, так і еукаріотичних не залежать від термінів перебування їх у стані ангідробіозу.

Визначені оптимальні умови зберігання ангідробіозних культур, які дозволяють зберегти високу частку життєздатних клітин протягом 0,5-6 років (76 % клітин Spirulina platensis протягом 6 років, 100 % клітин Synechococcus elongatus і цист Dunaliella salina протягом 3-х років). Необхідні умови: герметичність упаковки, без доступу світла, температура навколишнього середовища 15-20°С.

Виявлена тенденція до зниження частки життєздатних клітин мікроводоростей при зберіганні їх у стані ангідробіозу, яка найінтенсивніше виражена в період від 1 до 4 років знаходження культур у стані ангідробіозу, після чого частка відмираючих клітин незначна. Кількість клітин, зберігаючих життєздатність, є видоспецифічною ознакою.

Виявлена залежність життєздатності мікроводоростей у стані ангідробіозу від залишкової вологості, оптимум якої становить: 9-11 % у Spirulina platensis, 8-11 % у Synechococcus elongatus, 12-14 % у Phaeodactylum tricornutum.

Розроблений метод зберігання мікроводоростей є економічно вигідним і дозволяє рекомендувати його для широкого використання в біологічних галузях науки і виробництва.

Список праць, опублікованих за темою дисертації

1. Харчук И. А. Способ реактивации цианобактерий Spirulina platensis (Nordst) из ангидробиоза / И. А. Харчук // Экология моря. - 2003. - Вып. 64. - С. 86-89.

2. Харчук И. А. Влияние температуры дегидратации на нуклеиновые кислоты Dunaliella salina / И. А. Харчук // Экология моря. - 2005. - Вып. 69. - С. 64-67.

3. Харчук И.А. Анабиоз: закономерности и сопровождающие его процессы / И. А. Харчук // Экология моря. - 2005. - Вып. 70. - С. 62-78.

4. Харчук И. А. Динамика фракционного состава липидов в клетках Spirulina platensis (Nordst) в зависимости от температуры дегидратации / И. А. Харчук, Ю. П. Копытов // Экология моря. - 2005. - Вып. 70. - С. 79-83.

5. Брянцева Ю. В. Характеристика цианобактерий Spirulina (Artrospira) platensis / Ю. В. Брянцева, И. В. Дробецкая, И. А. Харчук // Экология моря. - 2005. - Вып. 70. - С. 24-30.

6. Харчук И. А. Влияние длительности хранения на жизнеспособность клеток Spirulina platensis Nords в состоянии ангидробиоза / И. А. Харчук // Экология моря. - 2007. - Вып. 74. - С. 80-83.

7. Харчук И. А. Влияние температурных режимов обезвоживания на нуклеиновые кислоты Spirulina platensis / И. А. Харчук, И. Н. Гудвилович // Зб. наук. праць «Актуальні проблеми ботаніки та екології» / гол. ред. Я. Н. Дидух. - Київ : Фітосоціоцентр, 2005. - Вип. 1. - С. 230-234.

8. Харчук И. А. Влияние дегидратации на морфометрические и биохимические характеристики цианобактерий Spirulina platensis (Nordst) Geitler / И. А. Харчук, Ю. В. Брянцева // Зб. наук. праць «Актуальні проблеми ботаніки та екології» / гол. ред. Я. Н. Дидух. - Київ : Фітосоціоцентр, 2008. - Вип. 2 - С. 21-24.

9. Харчук И. А. Изменчивость морфометрических характеристик клеток морских микроводорослей в результате дегидратации - регидратации / И. А. Харчук, Ю. В. Брянцева // Труды ЮгНИРО «Основные результаты комплексных исследований в Азово-Черноморском бассейне и мировом океане» (Юбилейный выпуск) / гл. ред. Б. Н. Панов. - Керчь : Изд-во ЮгНИРО, 2008. - Том. 46 - С. 87-92.

10. Харчук И. А. Изменения, происходящие в процессе реактивации цианобактерий Spirulina platensis / И. А. Харчук // XXIV конф. молодых учёных Мурманского морского биологического института, май 2006 г. : материалы докл. - Мурманск : Мзд. ММБИ КНЦ РАН, 2006. - С. 139-141.

11. Харчук И. А. Реактивация микроводорослей из состояния ангидробиоза / И. А Харчук, Р. П. Тренкеншу, А. В. Алисеевич // Биоразнообразие. Экология. Эволюция. Адаптация. : науч. конф. студентов, аспирантов и молодых учёных, посвящ. 180 - летию со дня рождения Л. С. Ценковского, 28 марта - 1 апреля 2003 г. : материалы докл. Одесса, 2003. - С. 177.