Вивчення біохімічних процесів у гепатоцитах коропа і рака за дії пошкоджуючих чинників середовища

Размещено на http://www.allbest.ru/

ІНСТИТУТ БІОЛОГІЇ ТВАРИН УААН

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Вивчення біохімічних процесів у гепатоцитах коропа і рака за дії пошкоджуючих чинників середовища

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Тернопільському національному педагогічному університеті імені Володимира Гнатюка Міністерства освіти і науки України.

Науковий керівник доктор біологічних наук, професор СТОЛЯР Оксана Борисівна, Тернопільський національний педагогічний університет імені Володимира Гнатюка Міністерства освіти і науки України, професор кафедри хімії

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук,професор, член-кореспондент НАН України СТОЙКА Ростислав Стефанович, Інститут біології клітини НАН України, завідувач відділу регуляції проліферації клітин і апоптозу

доктор біологічних наук, професор СТАРОДУБ Микола Федорович, Інститут біохімії імені О.В. Палладіна НАН України, головний науковий співробітник відділу молекулярної біології

Захист відбудеться « 01 » жовтня 2008 р. о 12.00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 35.368.01 в Інституті біології тварин УААН за адресою: м. Львів, вул. В. Стуса, 38

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біології тварин УААН за адресою: м. Львів, вул. В. Стуса, 38

Автореферат розісланий « 29 » серпня 2008 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради Віщур О.І.

АНОТАЦІЯ

Мудра А.Є. Вивчення біохімічних процесів у гепатоцитах коропа і рака за дії пошкоджуючих чинників середовища. ? Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 - біохімія. Інститут біології тварин УААН. Львів, 2008.

Дисертація присвячена порівняльному дослідженню стану системи антиоксидантного захисту, глутатіону, залізозв'язувальної здатності (ЗЗЗ), гепатотоксичності та гострофазної відповіді в гепатоцитах коропа і рака за дії на організм іонів Cu, Zn, Mn, Pb, їх суміші та фенолу у екологічно реальних (0,1 ГДК) і (в коропа) двох сублетальних концентраціях (2 ГДК та 5 ГДК) протягом 14 діб.

Окремі характеристики та їх інтегральний аналіз (індекс антиоксидантного стану, принциповий Компонентний аналіз, ANOVA) показали, що дія 0,1 ГДК чинників викликає помітні й однотипні зміни антистресорних систем, СК - специфічні до природи чинника зміни, а 5 ГДК ? найменші відмінності від контролю. Антистресорні системи гепатоцитів рака чутливіші до дії іонів металів, ніж коропа, але більш толерантні до дії фенолу. 0,1 ГДК спричиняє зменшення активності супероксиддисмутази, ЗЗЗ та збільшення вмісту глутатіону в більшості груп. Гострофазна відповідь виражена в гепатоцитах за дії екологічно реальних концентрацій токсикантів, тоді як вищі концентрації її не викликають.

Ключові слова: короп (Cyprinus carpio), рак (Astacus leptodactylus), гепатоцити, оксидативний стрес, залізозв'язувальна здатність, молекули середньої маси, гепатотоксичність, інтегральні індекси.

АННОТАЦИЯ

Ключевые слова: карп (Cyprinus carpio), рак (Astacus leptodactylus), гепатоциты, оксидативный стресс, железосвязывающая способность, молекулы средней массы, гепатотоксичность.

ANNOTATION

Key words: carp Cyprinus carpio, crayfish Astacus leptodactylus, hepathocytes, oxidative stress, iron binding capacity, middle mass molecules, hepatic toxicity, integrative indexes.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Водні організми піддаються постійному впливу різноманітних факторів зовнішнього середовища відомого та невстановленого походження. Ці фактори змінюються в часі й в просторі та діють, як правило, у суміші, що ускладнює оцінку біологічної відповіді (Wu R.S. et al., 2005). Тому дедалі більше уваги приділяється пошуку адекватних біомаркерів гідробіонтів. До найперспективніших біомаркерів відносять біохімічні показники, які дозволяють виявити ранні ознаки дії несприятливого чинника (Афанасьев С.А., 2001; Стародуб М.Ф., 2002; Брагинский Л.П., Линник П.Н., 2003; Lam P.K.S., Wu R.S., 2003).

Особливу увагу при виборі тканин для пошуку біомаркерів приділяють печінці (гепатопанкреасу) ? одному з найбільших залозистих утворів, що бере участь в біосинтетичних, секреторних, екскреторних та детоксикаційних процесах в організмі (Романенко В.Д., 1978; Гичев Ю.П., 1990; Ballatori N., 1991) та є одним із органів, чутливих до стресорних умов (Pandey S. et al., 2003; Lushchak V.I., Bagnyukova T.V., 2006). У печінці досить детально досліджено показники енергетичного та азотистого обміну (Арсан В.О., 2001; Грубинко В.В., 2001; Курант В.З., 2001), антиоксидантного захисту (Леус Ю.В., Грубинко В.В., 1998; Meyer J.N. et al., 2003; Lushchak V.I., Bagnyukova T.V., 2006), депонування іонів металів з участю металотіонеїнів (Столяр О.Б., 2004). Проте здебільшого ці дослідження виконано за дії концентрацій токсикантів, що у десятки разів перевищують їх реальний вміст у водоймах. Порівняльний аналіз фізіологічної ролі гепатоцитів у регуляції метаболізму та антистресорній відповіді у тварин, які перебувають на різних рівнях філогенетичного розвитку, відсутній (Романенко В.Д., 1978; Головенко Н.Я., Карасева Т.Л., 1983; Labrot F. et al., 1999; Wu R.S., 2003; Barsiene J. et al., 2006). Ракоподібні виявляють унікальну здатність до акумуляції важких металів, проте стан їх детоксикаційних систем за цих умов не з'ясовувався (Anderson M.B. et al., 1997; Alcorlo P. et al., 2006). Коло біохімічних показників, необхідних для адекватної оцінки характеру відповіді організму гідробіонтів, не окреслено (Roberts A.P., Oris J.T., 2004), а одержані результати потребують співставлення з відомими характеристиками гепатотоксичності (Versteeg D.J. et al., 1988).

З огляду на вищесказане, доцільно порівняти стан біохімічних показників у тканині печінки (гепатопанкреасу) у представників прісноводних тварин ? коропа (Cyprinus carpio L.) та рака (Astacus leptodactylus Eschscholt), які мають важливе промислове значення, належать до одного біотопу, але філогенетично віддалені між собою. Модельними забруднювачами було обрано редокс-активні та неактивні іони важких металів, а також фенол, які є пріоритетними забруднювачами водойм та характеризуються специфічними механізмами токсичної дії.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Роботу виконано в межах держбюджетної теми кафедри хімії Тернопільського державного педагогічного університету ім. Володимира Гнатюка “Токсикоспецифічні адаптації гідробіонтів та водних екосистем до іонів важких металів та їх регуляція” (№ державної реєстрації 0101UO00303, 2001-2003 рр.), в якій автор досліджувала активність системи антиоксидантного захисту, гострофазну відповідь та метаболізм заліза в тканинах коропа і рака за дії іонів важких металів.

Мета і завдання дослідження. Метою роботи було виявити та охарактеризувати деякі біохімічні маркери гепатоцитів, важливі для оцінки впливу на організм прісноводних тварин пошкоджуючих чинників залежно від виду організму, природи і концентрації токсичного чинника.

Завдання:

1. Вивчити вплив іонів міді, цинку, марганцю, свинцю, їх суміші та фенолу протягом 14 діб у підпорогових (0,1 ГДК) та (у коропа) у 20 і 50 разів вищих (2 ГДК і 5 ГДК) концентраціях іонів металів на стан системи антиоксидантного захисту в гепатоцитах коропа і рака за активністю супероксиддисмутази і каталази та продуктами пероксидного окиснення ліпідів (ПОЛ).

2. Визначити вміст глутатіону в гепатоцитах прісноводних тварин за дії на організм пошкоджуючих чинників.

3. Дослідити залізодепонуючу функцію гепатоцитів коропа і рака та вплив іонів заліза на ПОЛ у коропа залежно від умов інкубації гомогенату (спонтанне ПОЛ, індукція ферментного або неферментного ПОЛ).

4. Визначити вміст молекул середньої маси в гепатоцитах коропа і рака як маркерів гострофазного стану за впливу на організм пошкоджуючих чинників.

5. Визначити клінічні характеристики гепатотоксичності (активність лужної фосфатази, г-глутамілтранспептидази, вміст магнію і фосфату) в гепатоцитах коропа і рака за впливу на організм пошкоджуючих чинників.

6. Порівняти чутливість та селективність досліджених показників у коропа і рака залежно від природи чинника та (у коропа) його концентрації.

Об'єкт дослідження - вплив пошкоджуючих чинників середовища на потенційні біохімічні маркери гепатоцитів прісноводних тварин.

Предмет дослідження - активність системи антиоксидантного захисту, залізозалежні процеси пероксидного окиснення ліпідів, показники гострофазної відповіді та гепатотоксичності у коропа та рака за впливу на організм іонів важких металів та фенолу, наявних у водному середовищі.

Методи дослідження ? ензиматичні (визначення активності супероксиддисмутази, каталази, лужної фосфатази, г-глутамілтранспептидази), аналітичної біохімії (визначення вмісту й утворення продуктів пероксидного окиснення ліпідів, вмісту відновленого та окисненого глутатіону, заліза, магнію і фосфату, молекул середньої маси); статистичні (кореляційний, дисперсійний (ANOVA) та факторний (принциповий компонентний, РСА) аналізи).

Наукова новизна одержаних результатів. Досліджено концентраційну залежність та видову специфічність дії пошкоджуючих чинників на організм водних тварин. Уперше одержано дані про неспецифічну активацію антистресорних систем у гепатоцитах коропа та їх пригнічення у рака за дії екологічно реальних концентрацій іонів важких металів на організм. Встановлено вищу толерантність гепатоцитів рака до дії фенолу. Доведено селективність стосовно природи чинника компенсаторної відповіді за перевищення його екологічно реальної концентрації та формальну нормалізацію показників антистресорного захисту за переважання адаптивних можливостей в печінці коропа. Вперше виявлено високу чутливість залізодепонуючої функції гепатоцитів коропа і рака до несприятливих чинників зовнішнього середовища. Запропоновано інтегральний показник стану системи антиоксидантного захисту КАС для оцінки стану гепатоцитів.

Практичне значення одержаних результатів. Одержані результати про ступінь збалансованості антиоксидантно-прооксидантної системи (АПС) гепатоцитів та редокс-індекс глутатіону можуть бути використані як адекватні критерії оцінки стану функціонально-метаболічної активності організму та для розробки методів оцінки рівня токсичності водного середовища за допомогою біомаркування. Клінічні маркери гепатотоксичності визнано за недоцільні для застосування у біомаркуванні стану водойм. Запропоновано біохімічні критерії оцінки впливу середовища на коропа і рака. Результати дослідження є основою для формування вимоги про необхідність порівняння біомаркерів двох віддалених видів тварин за дослідження неідентифікованих джерел забруднення у природному водному середовищі.

Одержані результати і теоретичні узагальнення впроваджено на кафедрі хімії у Тернопільському національному педагогічному університеті імені Володимира Гнатюка, кафедрі біохімії Львівського національного університету імені Івана Франка, кафедрах медичної біохімії та клініко-лабораторної діагностики і фармакології Тернопільського державного медичного університету імені І.Я. Горбачевського.

Особистий внесок здобувача. Підбір та аналіз літератури, постановка методик дослідження, одержання експериментальних даних, їх оформлення здійснювались автором самостійно. Дослідження впливу важких металів і фенолу на коропа виконано спільно з іншими співробітниками держбюджетної теми. Планування основних напрямків дослідження, аналіз отриманих даних та їх обговорення проведено спільно з науковим керівником. Друковані роботи підготовлено за безпосередньої участі автора.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації доповідались на VIIІ Українському біохімічному з'їзді (Чернівці, 2002); ІІІ і IV з'їздах гідроекологічного товариства України (Тернопіль, 2001, Карадаг, 2005); Установчому з'їзді Українського товариства клітинної біології (Львів, 2004); конференціях: Міжнародній науково-практичній конференції “Біологічні основи підвищення продуктивності тварин”, присвяченій 40-річчю створення Інституту біології тварин УААН (Львів, 2002); ІІ Львівсько-Люблінській конференції з експериментальної та клінічної біохімії (Люблін, 2002); симпозіумі “Metals and Genes Symposium” (Кентербері, 2001); Міжнародній науково-практичній конференції “Біологічні основи підвищення продуктивності тварин” (Львів, 2004); VIII Міжнародній науковій екологічній конференції «Актуальні проблеми збереження стійкості живих систем» (Бєлгород, 2004); Міжнародних наукових конференціях «Сучасні проблеми фізіології і біохімії водних організмів» (Петрозаводськ, 2004); «Сучасний стан і проблеми експериментальної і клінічної біохімії (Тернопіль, 2004); щорічних звітних наукових конференціях викладачів і співробітників хіміко-біологічного факультету ТДПУ, (Тернопіль, 2001) - 2004 р.р.

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 20 праць, у тому числі 12 статей у фахових виданнях, що затверджені ВАК України (з них 1 - одноосібна).

Структура та обсяг дисертації. Дисертацію викладено на 146 сторінках комп'ютерного набору, вона складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів дослідження, результатів роботи та їх обговорення, узагальнення, висновків, списку використаних джерел. Робота містить 11 рисунків, 30 таблиць, які складають 23 сторінки. Бібліографічний список становить 256 джерел, з них 177 латиною.

Основний зміст роботи

Огляд літератури. Проаналізовано сучасну інформацію про молекулярні механізми адаптації водних тварин. Дається характеристика сучасним уявленням про оксидативний стрес, гострофазну відповідь та метаболічні адаптації в гепатоцитах як прояви клітинного стресу. В результаті аналізу встановлено, що наявні дані розрізнені й недостатні для визначення участі гепатоцитів прісноводних тварин в адаптації організму до дії пошкоджуючих чинників. Очевидною є необхідність формування інтегрального набору біохімічних показників стану антистресорних систем прісноводних тварин.

Матеріали та методи дослідження. Дослідження проводили на коропі лускатому (Cyprinus carpio L.) дворічного віку масою 200-250 г (120 екземплярів) та дорослих особинах рака вузькопалого (Astacus leptodactylus Eschscholtz) масою (505) г та довжиною тіла (101) см (48 екземплярів).

Досліди на тваринах виконували із дотриманням ухвали Першого національного конгресу з біоетики про захист хребетних тварин, які використовуються для експериментальних та наукових цілей (Київ, 2001). Комісія з біоетики Тернопільського державного медичного університету імені І.Я. Горбачевського (протокол № 14 від 18 жовтня 2007 р. ) порушень морально-етичних норм при проведенні науково-дослідної роботи не виявила.

У кожному досліді одна група була контрольною, а в іншій у воду додавали солі важких металів або фенол. Для дослідження використовували іони металів, які є поширеними забруднювачами прісних водойм України. Найнижчі із створених нами модельних концентрацій чинників відповідають 0,1 рибогосподарських ГДК та діапазону їх екологічно реальних концентрацій у прісних водоймах України (Линник П.Н., 1999). У коропа досліджували також у 20 і 50 разів вищі концентрації іонів металів (відповідно 2 ГДК і 5 ГДК). За умов індивідуальної дії вміст у воді Cu²⁺ (CuSO₄) в розрахунку на катіон складав 0,01, 0,2 або 0,5 мг/л; Zn²⁺ (ZnSO₄) - 0,1, 2,0 або 5,0 мг/л; Mn²⁺ (MnCl₂) - 0,13, 2,6 або 6,0 мг/л; Pb²⁺ (Pb(NO₃)₂) - 0,01, 0,2 або 0,5 мг/л, фенолу - 0,002 мг/л. При дослідженні дії суміші іонів вміст компонентів становив Cu²⁺ - 0,01 мг/л, Zn²⁺ - 0,1 мг/л, Mn²⁺ - 0,13 мг/л, Pb²⁺ - 0,01 мг/л.

Протягом експерименту вміст металу контролювали за допомогою атомно-абсорбційної спектроскопії. Застосовувані концентрації не призводили до летального кінця протягом 14 діб утримання. Відповідний вміст аніонів у воді був на один або два порядки нижчим, ніж їх дозволений вміст у рибогосподарських водоймах та вміст у водопровідній воді, й не призводив до осадження солей за їх внесення в акваріум у суміші. Період утримання тварин становив 14 діб.

Для аналізу використовували передню частку печінки коропа і гепатопанкреас рака. Всі процедури з виділення та обробки зразків проводились на холоді. Для визначення біохімічних показників готували 10 %-ний гомогенат тканини у 10 мМ трис-HCl буферному розчині, рН 7,4.

Стан антиоксидантних систем організму характеризували за активністю антиоксидантних ферментів та утворенням продуктів пероксидації ліпідів. До антиоксидантних факторів відносили активність супероксиддисмутази (СОД) [КФ 1.15.1.1], каталази (КАТ) [КФ 1.11.1.6], вміст відновленого глутатіону (GSH), а до прооксидантних ? вміст кінцевих продуктів пероксидного окиснення ліпідів (ПОЛ), який визначали при їх взаємодії з тіобарбітуровою кислотою (ТБК-активні продукти, ТБК-АП).

Активність СОД оцінювали за зниженням швидкості відновлення нітротетразолію синього в присутності феназинметасульфату і NADH (Чевари С. и соавт., 1991), КАТ ? за здатністю пероксиду гідрогену утворювати з солями молібдену стійкий забарвлений комплекс (Королюк М.А. і співавт., 1988). Вміст глутатіону (GSH і загального глутатіону) в тканині визначали неферментативно за реакцією з 5,5-дитіобіс-2-нітробензойною кислотою. Для визначення загального вмісту глутатіону дисульфідні зв'язки відновлювали за допомогою NaBH₄ у 8 М сечовині (Habeeb A.F.S., 1973). Вміст окисненого глутатіону (GSSG) обчислювали як різницю вмісту загального глутатіону і GSН, редокс-індекс глутатіону, РІ GSH ? як співвідношення ([GSH]+2[GSSG])/2[GSSG]. Визначали вміст ТБК-АП у гомогенаті тканини (Стальная И.Д., Гаришвили Т.Г., 1977) та їх утворення за спонтанної інкубації гомогенату та за активації ферментного або неферментного ПОЛ, а також індекс антиоксидантної активності (ІАА) як показник впливу концентрації гомогенату на ПОЛ (Мартынюк В.Б. и соавт., 1991). Гомогенати інкубували 30 хв. при 25 ^оС: для визначення інтенсивності спонтанного ПОЛ - без доданків. Інкубаційна суміш для визначення неферментного ПОЛ містила 80 мМ аскорбінової кислоти, 0,2 мМ АDP, 0,012 мМ FeSO₄, а ферментного ПОЛ - замість аскорбінової кислоти 0,5 мМ NADPH.

Для характеристики гострофазної відповіді визначали вміст молекул середньої маси (МСМ) за інтенсивністю світлопоглинання небілкового екстракту тканини при 254 нм і 280 нм (Туряница И.М. и соавт.., 1991). Гепатотоксичність досліджуваних чинників оцінювали за активністю лужної фосфатази (ЛФ) [К.Ф. 3.1.3.1] та г-глутамілтранспептидази [К.Ф. 2.3.2.2], які визначали із застосуванням наборів реактивів “Біо-ЛА-Тест” (Lachema, Чеська Республіка) відповідно до інструкцій фірми виробника. Вміст заліза, магнію, неорганічного фосфату та залізозв'язувальну здатність (ЗЗЗ) визначали за допомогою наборів реактивів “Біо-ЛА-Тест” (Lachema, Чеська Республіка). Загальний вміст білків у гомогенаті тканини визначали методом Lowry O.H. et al. (1951), використовуючи як стандарт сироватковий альбумін після їх осадження НСlО₄, відмивки і розчинення в 0,5 н КОН.

Результати визначення показників подавали у вигляді Mm, де n=5. За результатами обчислювали коефіцієнт антиоксидантного стану (КАС) як відношення сум показників стану антиоксидантного (А) і прооксидантного (П) статусу: КАС = У А/У П. Для уніфікації одиниць вимірів різних показників кожний з них обчислювали за формулою: 1 ± (М_д - М_к)/М_к, де 1 - характеристика показника в нормі, М_д і М_к - середньоарифметичні значення показників дослідної і контрольної серій відповідно. До “А” відносили такі показники як активність СОД і КАТ та вміст GSH в тканині, до “П” - вміст ТБК-АП. Статистичну обробку експериментальних даних здійснювали за Г.Ф. Лакіним (1990). Вірогідною вважали відмінність між рядами при р<0,05. Порівняльний аналіз біохімічних показників проводили з використанням пакета дисперсійного аналізу Anova, кореляційного тесту Пірсона (відмінності вірогідні при p<0,05), а також Принципового компонентного аналізу (Principal component analysis, ПКА), застосотовуючи комп'ютерні програми Statistical Analysis System (SPSS), Statistica v5.5 та Exell для Windows-2000.

Результати досліджень та їх обговорення

Маркери оксидативного стресу. Різноманітні забруднювачі середовища викликають оксидативний стрес. Забруднення середовища іонами важких металів створює потенційну небезпеку ініціації радикальних процесів з руйнівними наслідками для біологічних структур. Це стосується не лише іонів металів перемінної валентності (заліза, міді, марганцю) завдяки їх здатності до редокс-перетворення, але й іонів стабільної валентності (цинку, кадмію, свинцю) через конкуренцію за ліганди, зокрема тіоли, які забезпечують відновний стан у клітині (Stohs S.J., Bagchi D., 1995; Maret W., 2004). Потужним оксидативним чинником є і фенол (Bukowska B., Kowalska S., 2004). Як свідчать результати (табл. 1), вже за дії 0,1 ГДК більшості досліджуваних чинників у печінці коропа зменшується активність СОД, яку вважають ключовим ферментом антиоксидантного захисту.

Таблиця 1. Вплив іонів важких металів та фенолу на стан антиоксидантної системи гепатоцитів коропа і рака, M±m, n=5

Примітка. Тут і на рисунках 1, 2:*, **, *** - відмінності, порівняно з контролем, вірогідні, *- p<0,05, ** - p<0,01 *** - p<0,001.

За дії свинцю та суміші металів відбувається і зменшення активності КАТ, причому в останньому випадку воно не супроводжується пригніченням СОД. Фенол викликає активацію КАТ. ПОЛ активується лише за дії фенолу, тоді як усі досліджувані іони металів не впливають на нього.

Вплив 2 ГДК досліджуваних чинників на коропа викликає залежні від природи металу зміни активності СОД ? пригнічення іонами міді й цинку та активацію іонами свинцю та, особливо, марганцю. Активність КАТ збільшується удвічі проти контролю, тобто спостерігається розбалансованість функції ключових антиоксидантних ферментів, яка, проте, не позначається на стані ПОЛ. За дії 5 ГДК зміни активності СОД і КАТ виражені меншою мірою, а за дії іонів цинку і марганцю посилюється ПОЛ.

Дія всіх досліджуваних чинників на рака призводить до оксидативного стресу, який проявляється пригніченням СОД, активацією КАТ та, за винятком дії фенолу, активацією ПОЛ. Отже, найбільш характерні ознаки ураження системи антиоксидантного захисту були спільними для обох видів, однак у рака вони виражені при меншій концентрації чинника, ніж у коропа. З іншого боку, дія фенолу на систему антиоксидантного захисту гепатоцитів рака виявилась толерантнішою.

Висока чутливість системи антиоксидантного захисту рака до іонів металів може бути проявом унікальної здатності ракоподібних до їх акумуляції з середовища (Alcorlo P. et al., 2006) на тлі низької ефективності депонуючої функції металотіонеїнів (Фальфушинська Г.І. зі співавт., 2003).

GSH є поліфункціональним клітинним тіолом, вміст якого чутливо реагує на різноманітні зміни (Wang W., Ballatori N., 1998; Мещишен І.Ф. і співавт., 2002). Дія 0,1 ГДК всіх досліджуваних чинників на коропа спричиняє підвищення вмісту GSH і ступеню його окиснення (рис. 1). За дії 2 ГДК чинників лише мідь викликає вірогідне зменшення вмісту GSH у печінці коропа, а інші чинники не впливають на його вміст. Дія 5 ГДК металів призводить до збільшення вмісту GSH у тканині за дії цинку і свинцю та не впливає на його вміст за дії інших металів. Вміст GSH у тканині рака вищий удвічі, ніж у тканині коропа. За дії важких металів він зростає, як і у коропа, тоді як за дії фенолу, навпаки, зменшується.

Вплив іонів важких металів та фенолу на вміст заліза і залізозв'язувальну здатність гепатоцитів. Вміст заліза в тканині печінки коропа є досить стабільним і лише за дії 0,1 ГДК марганцю та свинцю він зазнає змін. Залізозв'язувальна здатність зменшується за дії 0,1 ГДК іонів міді, свинцю, суміші металів і фенолу та 2 ГДК всіх іонів металів і не зазнає змін за дії їх 5 ГДК. У гепатопанкреасі рака загальний вміст заліза збільшується лише за дії суміші металів, а залізозв'язувальна здатність зменшується за дії міді, марганцю і свинцю, а в інших випадках не зазнає змін. Зменшення залізозв'язувальної здатністі може бути проявом гіпопротеїнемії різного походження, запальних процесів (Mandelli C. et al., 1992) і є однією з найбільш чутливих реакцій гепатоцитів серед тих, які досліджували.

А Б

Рис. 1. Вміст відновленого глутатіону (мкмоль/г тканини) у гепатоцитах коропа і рака (А) та редокс-індекс глутатіону в гепатоцитах коропа (Б) за дії важких металів і фенолу, M±m, n=5.

Ступінь насичення клітинних мішеней залізом у нормі є значно вищим у коропа, ніж у рака (відповідно, близько 30 і 10 %). Гемові білки та вільний гем є важливими компонентами системи антиоксидантного захисту в хребетних, а вільні іони заліза ? сильним прооксидантним чинником (Калиман П.А., Баранник Т.В., 2001). Тому ми дослідили, як ураження іонами важких металів впливає на процеси ПОЛ у печінці коропа за насичення інкубаційного середовища залізом у різних умовах (рис. 2). Всупереч традиційним уявленням про загальну прооксидантну дію іонів важких металів, інкубація гомогенату та активація ферментного ПОЛ не призвели до посилення ПОЛ або навіть викликали його пригнічення, зокрема, за дії 0,1 ГДК цинку і марганцю. Неферментне ПОЛ більше залежить від природи іонів металу ? іони міді, і цинку пригнічують його, тоді як іони свинцю і суміш іонів активують. Разом із тим, у гомогенаті тканини за дії допорогових концентрацій міді, марганцю і свинцю та 2 ГДК усіх металів виявлено прооксидантні чинники, однак суміш металів призводить до зростання індексу антиоксидантної активності гомогенату.

Отже, проведене дослідження інтенсивності ПОЛ за навантаження залізом дозволило виявити взаємопротилежні тенденції у стані антиоксидантних резервів організму, які не проявляються шляхом визначення лише вмісту ТБК-АП у системі.

Маркери гепатотоксичності та гострофазної відповіді. Маркери гепатотоксичності зазнають змін різного спрямування в окремих досліджуваних групах. ЛФ вважається ферментом, чутливим до дії важких металів (Jing G. et al., 2006) та індикатором цирозу печінки (Маршалл В.Дж., 2002). У печінці коропа її активність зростає лише за дії суміші іонів металів і зменшується за дії 2 ГДК свинцю. У рака активність ЛФ збільшують іони цинку, суміш іонів, зменшує фенол. Визначення вмісту фосфату і марганцю свідчить про відсутність істотних порушень мінерального обміну, переродження тканини печінки.

Рис. 2. Утворення продуктів ферментного і неферментного пероксидного окиснення ліпідів у печінці коропа при дії на організм іонів важких металів у сублетальних концентраціях залежно від умов інкубації, M±m, n=5:.

Відомо, що г-глутамілтрансфераза реагує на токсичні процеси у печінці, причому її рівень часто підвищений, а інші індикатори - трансамінази та ЛФ - у нормі (Цыганенко А.Я. и соавт., 2002). У коропа зміни активності цього ферменту, порівняно з контролем, спостерігаються за дії 2 ГДК іонів міді, марганцю та свинцю, тоді як 0,1 ГДК досліджуваних чинників не викликають її змін. Отже, результати, отримані нами, свідчать про відсутність патологічних процесів гепатоцитах тварин у більшості досліджених груп і про їх здатність до адаптації у цих умовах.

Визначення вмісту МСМ широко використовують у вищих хребетних для характеристики гострофазної відповіді на дію несприятливих чинників середовища та ендогенну інтоксикацію (Арцимович Н.Г. и соавт., 1991). До них належать переважно пептиди, що утворюються в клітинах за умов запальних процесів і проявляють високу біологічну активність (Stoika R.S. et al., 2002). Для гідробіонтів цей тест, за нашою інформацією, не застосовували. У печінці коропа зростання вмісту МСМ спостерігали лише за дії міді (0,1 ГДК і 2 ГДК) та суміші іонів металів. Збільшення концентрації цинку і свинцю (5 ГДК) у воді та дія фенолу призводять до пригнічення цієї системи захисту. У рака зміни вмісту МСМ більш чутливі до дії 0,1 ГДК чинників, ніж у коропа, причому, залежно від природи чинника, часто спостерігаються зміни їх вмісту, визначеного лише при 254 нм або 280 нм.

Порівняння впливу різних чинників показує, що дія 0,1 ГДК чинників викликає неспецифічну адаптивну відповідь, за винятком впливу фенолу на рака. Дія на коропа 2 ГДК чинників спричиняє індивідуальні реакції, які за сумою ознак подібні при дії міді і цинку та дії марганцю і свинцю, однак, крім поодиноких випадків не мають аналогів серед інших моделей відповіді в обох тварин. За дії 5 ГДК металів помітних змін не спостерігається, що свідчить про неспроможність до адаптаційних пристосувань, очевидно, у зв'язку з глибоким ураженням білоксинтезуючих систем печінки.

Принциповий компонентний аналіз показників стану антистресорних систем гепатоцитів коропа і рака за дії на організм 0,1 ГДК чинників дозволив виділити оптимальний набір маркерів для аналізу відповіді організму. Це КАТ, ТБК-АП і МСМ₂₅₄, тобто характеристики антиоксидантно-прооксидантної рівноваги та гострофазної відповіді, стан яких у представників обох видів характеризує адаптаційну здатність (рис. 3). У коропа до набору рекомендованих біомаркерів також входять СОД і залізозв'язувальна здатність, а в рака ? ЛФ, що характеризує специфіку антистресорних систем кожного виду.

А Б

В

Рис. 3. Принциповий компонентний аналіз показників стану антистресорних систем гепатоцитів коропа (А) і рака (Б) за дії на організм 0,1 ГДК іонів металів та дії на коропа 0,1 ГДК, 2 ГДК і 5 ГДК іонів металів (В). Стрілками відзначені показники, належність яких до компоненти вірогідна (Р>|0,85|).

Для порівняння ефекту природи чинника і концентрації (0,1 ГДК, 2 ГДК, 5 ГДК) на коропа було використано також метод визначення головного ефекту ANOVA (табл. 2). При цьому виявлено, що лише показник вмісту фосфату наближається до вірогідно залежного від природи чинника. Разом із тим, вплив концентрації чинника є достовірним для КАТ, що підтверджує особливе місце цього ферменту у визначенні сили ураження системи антиоксидантного захисту. Показники гепатотоксичності та гострофазної відповіді також із високою вірогідністю залежать від концентрації чинника. Ці характеристики є важливими компонентами доказової бази ступеня ураження організму риб, хоча спостерігається толерантність до дії 0,1 ГДК.

На тлі індивідуальної варіабельності окремих показників антиоксидантного захисту обчислення інтегрального показника коефіцієнта антиоксидантного стану з мінімальною кількістю індивідуальних складових (активність СОД, КАТ і вміст ТБК-АП) відображає стан антиоксидантно-прооксидантної рівноваги в цілому (рис. 4).

Результати обчислення демонструють значну відмінність у ступені толерантності двох видів до дії металів та концентраційну залежність адаптивних можливостей організму в коропа. Коефіцієнт антиоксидантного стану відображає і токсикоспецифічність молекулярних адаптацій за дії 2 ГДК у коропа, зокрема антиоксидантні прояви дії марганцю та прооксидантні ? свинцю.

Таблиця 2. Дисперсійний аналіз ANOVA головного ефекту впливу іонів важких металів на біохімічні маркери гепатоцитів коропа

Отже, одержані нами результати та їх узагальнення дозволили встановити чутливі та селективні показники стану молекулярних антистресорних систем гепатоцитів водних тварин і з'ясувати особливості видової і концентраційної специфіки їх проявів.

антиоксидантний гепатоцит короп рак

ВИСНОВКИ

У дисертаційній роботі представлено нові дані про механізми впливу пошкоджуючих чинників середовища (іонів міді, цинку, марганцю, свинцю, їх суміші та фенолу в підпорогових концентраціях, 2 ГДК і 5 ГДК) на біохімічні процеси в гепатоцитах коропа і рака та запропоновано критерії оцінки їх ураження. Доведено, що за дії підпорогових концентрацій чинників має місце їх неспецифічна дія на гепатоцити, за дії 2 ГДК ? токсикоспецифічні адаптації, а за дії 5 ГДК - пригнічення адаптаційної здатності гепатоцитів. У коропа, порівняно з раком більше, виражений токсичний ефект фенолу та менше - іонів важких металів.

1. Встановлено, що система антиоксидантного захисту гепатоцитів коропа і рака реагує на дію підпорогових концентрацій несприятливих чинників зменшенням активності супероксиддисмутази (p<0,01).Зокрема, виявлено активацію перокидного окиснення ліпідів у коропа за дії фенолу, а в рака ? за дії іонів важких металів (p<0,01). Відбувається зростання активності каталази за дії 2 ГДК іонів металів у коропа і їх підпорогової концентрації у рака (p<0,01).

2. Дія підпорогових концентрацій чинників викликає у коропа і рака (за винятком фенолу в останнього) збільшення вмісту відновленого глутатіону в гепатоцитах (p<0,05), що у коропа поєднується із зменшенням редокс-індексу глутатіону на 20?60 %. За дії 2 ГДК і 5 ГДК чинників зміни вмісту відновленого глутатіону виникають у поодиноких випадках.

3. Загальний вміст заліза у гепатоцитах коропа і рака за дії більшості досліджуваних чинників не зазнає змін. Загальна залізозв'язувальна здатність тканини зменшується у обох видів тварин за дії підпорогових концентрацій та 2 ГДК (на 35 ?71 %, p<0,05) і залишається стабільною за дії 5 ГДК більшості чинників.

4. У коропа дія іонів металів міді, цинку, марганцю і свинцю у суміші або в поєднанні з надлишком іонів заліза (ІІ) призводить до пригнічення пероксидного окиснення ліпідів (за дії іонів марганцю ? на 44 %). Разом із тим, за дії окремо іонів міді, марганцю і свинцю антиоксидантні властивості гомогенату тканини пригнічуються на 19-34 % .

5. Активність лужної фосфатази, вміст неорганічного фосфату та магнію у гепатоцитах коропа і рака у більшості дослідних груп не відрізняються від контрольних значень. Активність г-глутамілтрансферази в печінці коропа за дії підпорогових концентрацій чинників відповідає контролю. За дії 2 ГДК міді, марганцю і свинцю вона зростає на 33?72 % (p<0,05), що вказує на гепатотоксичну дію цих катіонів.

6. Активація гострофазної відповіді спостерігається за дії міді у коропа, цинку і марганцю у рака та суміші іонів у обох видів (p<0,05). Фенол і свинець (0,5 мг/л у коропа і 0,02 мг/л у рака) пригнічують її в обох видів тварин (p<0,05).

Практичні рекомендації

1. Запропоновано визначення біохімічних маркерів ураження гепатоцитів, який включає в обох видів активності каталази й вмісту продуктів пероксидного окиснення ліпідів, молекул середньої маси (254 нм), а у коропа загальну залізозв'язувальну здатність.

2. Рекомендується для кількісної оцінки сумарної ефективності системи антиоксидантного захисту гепатоцитів коропа і рака обчислювати інтегральний коефіцієнт антиоксидантного стану на підставі визначення мінімального набору показників ? активності супероксиддисмутази, каталази і продуктів перекисного окиснення ліпідів.

СПИСОК ПУБЛІКАЦІЙ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Мудра А. Є. Вміст заліза і магнію у печінці коропа за забруднення середовища солями важких металів / А. Є. Мудра // Мед. хімія. -- 2004. -- Т. 6, № 3. --С. 44--46.

2. Мудра А. Є. Вплив сублетальної концентрації йонів міді на метаболічну активність та прооксидантно-антиоксидантний стан гепатопанкреасу коропа / А. Є. Мудра, О. Б. Столяр // Наукові записки Тернопільського педуніверситету. Серія: Біологія. -- Тернопіль, 2001. №3 (14). -- С. 218--219. (Здобувач визначила показники метаболічної функції печінки та активності системи антиоксидантного захисту, провела статистичну обробку результатів, взяла участь у написанні статті).

3. Мудра А. Є. Порівняльний аналіз біохімічних процесів у гепатопанкреасі коропа та рака за забруднення води фенолом / А. Є. Мудра, О. Б. Столяр, В. О. Хоменчук // Наукові записки Тернопільського педуніверситету. Серія: Біологія. -- Тернопіль, 2004. -- № 3--4 (24). -- С. 93--97. (Здобувач визначила показники метаболічної функції печінки та активності системи антиоксидантного захисту, провела статистичну обробку результатів, взяла участь у написанні статті).

4. Мудра А. Є. Мультимаркерний підхід у оцінці впливу забруднення води з використанням показників печінки коропа / А. Є. Мудра, Г. І Фальфушинська, О. Б. Столяр, // Наукові записки Тернопільського педуніверситету. Серія: Біологія. -- Спец. Випуск: Гідроекологія. -- Тернопіль, 2005. -- № 3 (26). - С. 317--319. (Здобувач визначила показники метаболічної функції печінки та активності системи антиоксидантного захисту, провела статистичну обробку результатів, взяла участь у написанні статті).

5. Мудра А. Є. Редокс-індекс глутатіону і вміст металів у печінці коропа за дії на організм іонів важких металів та фенолу / А. Є. Мудра, Г. І Фальфушинська, В. О. Хоменчук, О. Б. Столяр // Наукові записки Тернопільського педуніверситету. Серія: Біологія. -- Тернопіль, 2005. -- № 1--2 (25). -- С. 137--142. (Здобувач визначила показники метаболічної функції печінки та активності системи антиоксидантного захисту, провела статистичну обробку результатів, взяла участь у написанні статті).

6. Мудра А. Є. Інтегральний аналіз стану антистресорних систем гепатоцитів прісноводних тварин за дії пошкоджуючих чинників середовища / А. Є. Мудра, Г. І Фальфушинська, О. Б. Столяр // Наукові записки Тернопільського педуніверситету. Серія: Біологія. -- Тернопіль, 2008. -- № 2 (26). -- С. 317--319. (Здобувач визначала біохімічні показники у гепатоцитах коропа та рака, провела статистичну обробку результатів, взяла участь у написанні статті).

7. Столяр О. Б. Інтегральний показник антиоксидантно-прооксидантного стану організму як інструмент біомолекулярного моніторингу / О. Б. Столяр, В. В. Грубінко, Н. Г. Зіньковська, А. Є. Мудра, О. В. Міщук // Мед. хімія. -- 2004. -- Т. 6, № 3. -- С. 66--68. (Здобувач визначала показники системи антиоксидантного захисту в печінці коропа, провела статистичну обробку результатів, взяла участь у написанні статті).

8. Столяр О. Б. Антиоксидантно-прооксидантний статус тканин коропа при дії на організм сублетальної концентрації марганцю (ІІ) / О. Б. Столяр, Н. Г. Зіньковська, А. Є. Мудра // Науково-технічний бюлетень інституту біології тварин УААН -- Львів, 2001. -- Вип. 1 -- 2. -- С. 263--267. (Дисертанту належать визначення показників метаболічної активності печінки та вмісту продуктів перекисного окиснення ліпідів та активності ферментів у печінці коропа, участь в аналізі результатів і написанні статті).

9. Столяр О. Б. Антиоксидантно-прооксидантний статус організму коропа при дії сублетальної концентрації міді (ІІ) / О. Б. Столяр, Н. Г. Зіньковська, А. Є. Мудра, О. В. Водвуд, О. М. Марчук, С. М. Шепетюк // Наукові записки Тернопільського педуніверситету. Серія : Біологія. -- 2000. -- №3 (10). -- С. 72--78. (Здобувач визначила показники активності системи антиоксидантного захисту, провела статистичну обробку результатів, взяла участь у написанні статті).

10. Столяр О. Б. Прооксидантна та антиоксидантна дія марганцю (ІІ) на організм коропа (Cyprinus carpio L.) / О. Б. Столяр, А. Є. Мудра, Н. Г. Зіньковська, В. В. Грубінко // Біологія тварин. -- 2002. -- Т. 4, № 1 -- 2. -- С. 193--199. (Здобувач визначила показники активності системи антиоксидантного захисту, провела статистичну обробку результатів, взяла участь у написанні статті).

11. Столяр О. Б. Селективність металотіонеїнів печінки коропа у зв'язуванні іонів металів та антиоксидантний захист організму за дії суміші міді, цинку, марганцю і свинцю / О. Б. Столяр, А. Є. Мудра, Н. Г. Зіньковська, В. О. Хоменчук, В. О. Арсан, В. В. Грубінко // Доп. НАН України. -- 2004. -- № 5. -- С. 184--189. (Здобувач визначила показники метаболічної функції печінки та активності системи антиоксидантного захисту, провела статистичну обробку результатів, взяла участь у написанні статті).

12. Столяр О. Б. Вплив сублетальних концентрацій йонів цинку на метаболічну функцію та антиоксидантно-прооксидантний статус гепатопанкреасу коропа / О. Б. Столяр, А. Є. Мудра, О. Л. Клебан, С. А. Костюк // Наукові записки Тернопільського педуніверситету. Серія: Біологія. -- Тернопіль, 2001. -- №1(12). -- С. 97--100. (Здобувач визначила показники метаболічної функції печінки та активності системи антиоксидантного захисту, провела статистичну обробку результатів, взяла участь у написанні статті).

13. Столяр О. Б. Система антиоксидантной защиты гепатопанкреаса рака узкопалого Astacus leptodactylus L. как биомаркер загрязнения воды ионами тяжелых металлов / О. Б. Столяр, А. Е. Мудрая, Г. И. Фальфушинская // Гидробиол. журн. 2005. -- Т. 41, № 5. -- С. 84--91. (Здобувач визначила показники активності системи антиоксидантного захисту, провела статистичну обробку результатів, взяла участь у написанні статті).

14. Мудра А. Є. Процеси перекисного окиснення ліпідів і деякі показники метаболічної активності у печінці й крові коропа за дії суміші іонів металів / А. Є. Мудра, Н. Г. Зіньковська, О. Б. Столяр // Журн. агробіології та екології. - 2004. -- Т. 1, № 1--2. -- С. 118--122.

15. Stolyar O. B. The role of low weight proteins and thiols of hepatopancreas in the protection of carp organs from copper uptake / O. B. Stolyar, N. G. Zin'kovs'ka, A. Y. Mudra, V. O. Khomenchuk, V. V. Grubinko // Metals and Cell Symposium Canterbury: Materiale, University of Kent at Canterbury, 2-6 April. 2001. -- Р. 1.126.

16. Stolyar О. The effects of lead on the antioxidant status and lipid peroxidation in carp hepatopancreas / O. Stolyar, A. Mudra // Annales Universitatis Marie Curie-Sklodowska. -- 2002. -- Vol. XV, N 31. -- P. 391--394.

17. Stolyar O. The ability of the metallothioneins of the freshwater animals to form the “Hormesis”-type answer on the metals poisoning / O. Stolyar, V. Grubinko, R. Myhayliv, O. Mischuk, H. Falfushynska, A. Mudra // Матеріали Установчого з'їзду Українського товариства клітинної біології. -- Львів, 2004 -- С. 46.

Размещено на Allbest.ru