Порівняння ефективності застосування мікробіологічних методів діагностики туберкульозу різної локалізації

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Порівняння ефективності застосування мікробіологічних методів діагностики туберкульозу різної локалізації

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. За останні роки у різних країнах світу значно зросла захворюваність на туберкульоз [Фещенко Ю.І., Мельник В.М., Матусевич В.Г. (2003)]. Дана інфекція набула розмірів епідемії й переросла у загальнодержавну проблему, причому відбувається збільшення питомої ваги деструктивного та хіміорезистентного туберкульозу. Захворювання на туберкульоз найчастіше пов'язане з ураженням легень, проте дуже часто задіюються у процес кістки і суглоби, лімфатичні вузли, нервова тканина, нирки, тканина ока та інші органи. Останніми роками збудник туберкульозу зазнав морфологічних та біохімічних змін, які певною мірою зумовили збільшення кількості бактеріовиділювачів [Гусейнов Г.К. (2000), Гарбуз А.Е. (1998), Фещенко Ю.І., Ільницький І.Г. (1998)].

На сучасному етапі розроблені різні методи лабораторної діагностики туберкульозу, проте мікробіологічні методи не втратили своєї актуальності, їх удосконалення та освоєння нових залишається однією з важливих проблем сьогодення.

Бактеріологічне дослідження для виявлення збудника туберкульозу має важливе значення не тільки при встановленні діагнозу, але і протягом перебігу хвороби. При цьому відіграє роль не тільки виявлення мікобактерій туберкульозу, але і вивчення їх властивостей (ідентифікація, стійкість до антимікобактеріальних препаратів) [Хейфец Л.Б. (2004), Журило О.А., Барбова А. І І ін. (2005)].

Відомо, що надійним методом діагностики туберкульозу є виділення мікобактерій з культури. Використання традиційних методів культуральної діагностики з використанням твердих поживних середовищ Левенштейна-Йєнсена, Фінна потребує тривалий час для культивування. Введені в лабораторну практику нові комерційні автоматизовані і напів - автоматизовані системи для мікробіологічної діагностики туберкульозу знайшли широке використання у розвинутих країнах світу [Иртуганова О.А., Смирнова Н.С. (2005), CDC (1998-2003)]. Проте, в сучасній вітчизняній медичній літературі відсутні роботи, присвячені вивченню ефективності автоматизованої системи Bactec MGIT-960 в діагностиці туберкульозу легеневої та позалегеневої локалізації, а також визначенню чутливості МБТ до антимікобактеріальних препаратів у хворих з позалегеневим процесом.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами.

Дисертаційна робота виконана в рамках наукових досліджень, які проводились на базі Львівського науково-дослідного інституту епідеміології та гігієни і є фрагментом наукових тем: «Вивчити потенціал туберкульозної інфекції з метою розробки сучасних методів, спрямованих на стабілізацію епідемічної ситуації» (шифр теми Т-101 № державної реєстрації 0101U000227), «Вивчити епідемічну ситуацію з туберкульозу в вогнищах туберкульозної інфекції в західному регіоні України та розробити диференційовані заходи з її покращення» (шифр теми Т-1-05, № державної реєстрації 0104 U 010364).

Мета і завдання досліджень. Метою роботи було провести порівняння ефективності застосування мікробіологічних методів діагностики туберкульозу різної локалізації та визначити чутливість виділених мікобактерій туберкульозу до антимікобактеріальних препаратів.

Завдання були наступними:

1. Встановити переваги окремих методів обробки патологічного матеріалу для виявлення збудника туберкульозу у хворих з легеневими і позалегеневими формами туберкульозу.

2. Визначити результативність застосування наступних методів виявлення збудника захворювання при позалегеневому туберкульозі:

- бактеріоскопічних: методу прямої мікроскопії, методу «збагачення» патологічного матеріалу із застосуванням бікарбонату натрію, з наступним зафарбовуванням препаратів за Ціль-Нільсеном;

- культуральних: повністю автоматизованої системи Bactec MGIT-960 фірми (Becton Diskinson) та посіву на тверде яєчне середовище Левенштейна-Йєнсена для виявлення мікобактерій як при легеневих, так і при позалегеневих формах туберкульозу і проведення досліджень на чутливість виділених штамів M. tuberculosis до антимікобактеріальних препаратів першого ряду (стрептоміцину, ізоніазиду, рифампіцину, етамбутолу);

- біохімічних: модифікованого методу визначення редукції нітратів за Бараускене, методів виявлення каталазної і пероксидазної активності у виділених штамів;

3. Встановити переваги автоматизованої системи Bactec MGIT-960 для виділення мікобактерій туберкульозу над методом посіву на тверде поживне середовище Левенштейна-Йєнсена;

4. Вивчити особливості чутливості мікобактерій туберкульозу до антимікобактеріальних препаратів у хворих з туберкульозом позалегеневої локалізаціїї.

Об'єкт дослідження: виявлення, ідентифікація та визначення резистентності мікобактерій туберкульозу.

Предмет дослідження: порівняльний аналіз ефективності застосування мікробіологічних методів виявлення, ідентифікації та визначення резистентності збудника туберкульозу при різній локалізації процесу.

Методи дослідження: мікробіологічні: метод посіву на тверде поживне середовище Левенштейна-Йєнсена і використання повністю автоматизованої системи Bactec MGIT-960 - для виявлення мікобактерій туберкульозу, методи визначення чутливості виділених збудників (МБТ) до антимікобактеріальних препаратів; біохімічні: модифікований метод виявлення редукції нітратів за Бараускене у виділених штамів M. tuberculosis, методи виявлення каталазної і пероксидазної активності у виділених штамів M. tuberculosis; статистичні - для обробки результатів досліджень.

Інформаційною базою досліджень були офіційні статистичні дані обласного центру медичної статистики, режимні нормативні накази МОЗ України та наукові публікації, а також спеціальні обстеження за участю автора.

Наукова новизна одержаних результатів.

Вперше:

- доведено ефективність виявлення збудника туберкульозу із застосуванням нової повністю автоматизованої системи Bactec MGIT-960 при різних клінічних формах туберкульозу, в тому числі при специфічному процесі позалегеневої локалізації, оскільки відсоток бактеріовиділення при позалегеневому туберкульозі та при малих формах туберкульозу легень є невисоким;

- вивчено частоту та структуру хіміорезистентності M. tuberculosis до антимікобактеріальних препаратів у хворих на позалегеневий туберкульоз.

Удосконалено:

- обробку патологічного матеріалу, що зменшує у 2,1 рази відсоток проростів поживного середовища та сприяє підвищенню частоти виявлення кислотостійких бактерій у 1,2 рази, особливо при позалегеневому туберкульозі;

- новим при вирішенні досліджуваної проблеми є підвищення відсотку виявлення кислотостійких бактерій з використанням запропонованого методу «збагачення» та з врахуванням локалізації специфічного процесу.

Набули подальшого розвитку:

- використання модифікованого біохімічного методу визначення редукції нітратів за Бараускене, як простого і доступного у виконанні, для підтвердження приналежності виділених культур до мікобактерій туберкульозного комплексу.

Впровадження результатів дослідження в практику. За матеріалами дисертаційної роботи отримано патент:

1. «Спосіб удосконалення методу попередньої обробки патологічного матеріалу для підвищення ефективності виявлення кислотостійких бактерій у автоматизованій системі Bactec MGIT-960» (№31341 від 10.04 2008 р.).

Подано патент:

2 «Спосіб удосконалення методу визначення редукції нітратів для ідентифікації мікобактерій» (№ а 200708924). Удосконалений спосіб рекомендовано для широкого застосування в практичних лабораторіях фтизіатричного профілю.

Результати роботи апробовані у лабораторії Волинського обласного протитуберкульозного медичного об'єднання та Волинського дитячого територіального медичного об'єднання.

Результати роботи впроваджені та використовуються у викладанні курсів «Долікарська допомога» та «Судова медицина і судова психіатрія» на кафедрі криміналістики, судової медицини та психіатрії Львівського державного університету внутрішніх справ, спецкурсів на кафедрі мікробіології Львівського національного університету імені Івана Франка.

Практичне значення одержаних результатів. Рекомендовано застосовувати новітні мікробіологічні методи для діагностики туберкульозу і захворювань легень, що надзвичайно актуальне у випадках встановлення та спростування діагнозу.

Доцільно застосовувати автоматизовану систему Bactec MGIT-960 для виділення МБТ від хворих на позалегеневий туберкульоз, оскільки застосування автоматизованої системи Bactec MGIT-960 у два рази прискорює етап дослідження, на 10-15% збільшує виявлення МБТ при легеневих формах туберкульозу та у 1,2 рази збільшує відсоток виявлення мікобактерій при позалегеневих формах, особливо при ураженні нервової і кістково-суглобової систем, тому, враховуючи складну епідемічну ситуацію в Україні та значні витрати на виявлення і лікування хворих туберкульозом, виникає необхідність впровадження Bactec MGIT-960 для широкого застосування у протитуберкульозних закладах.

Доведено співпадіння результатів (92,4%) тестів чутливості мікобактерій туберкульозу до антимікобактеріальних препаратів у автоматизованій системі Bactec MGIT-960 і методу абсолютних концентрацій на твердому поживному середовищі Левенштейна-Йєнсена. Визначено ефективність застосовування тесту Bactec MGIT-960 AST у широкій лабораторній практиці, як більш швидкого та надійного для обстеження хворих з вперше діагностованим туберкульозом, з метою своєчасного підбору схеми лікування, що сприятиме підвищенню ефективності хіміотерапії і попередженню розвитку вторинної резистентності.

Запропоновано використання модифікованого тесту на редукцію нітратів за Бараускене для підтвердження приналежності виділених культур до мікобактерій туберкульозу, як простого і доступного у виконанні.

Рекомендовано застосовувати запропоновані мікробіологічні методи виділення МБТ у наукових розробках з вивчення позалегеневих форм туберкульозу, у лабораторній діагностиці, фтизіатрії, гінекології та урології.

Особистий внесок здобувача. Згідно з поставленою метою і завданням здобувачем самостійно опрацьовано значну кількість джерел літератури, отримано чисті культури Mycobacterium tuberculosis, виділених від хворих на легеневі і позалегеневі форми туберкульозу з використанням як класичних методів культивування, так і з застосуванням автоматизованої системи Bactec MGIT-960, проведено їх ідентифікацію, вивчено особливості резистентності виділених культур МБТ до основних антимікобактеріальних препаратів. Спільно з науковим керівником, д.б.н. професором Сибірною Р. І. здійснено планування основних напрямків досліджень, визначено методи досліджень, проведено аналіз, інтерпретацію та узагальнення одержаних результатів. Підготовку до друку публікацій за матеріалами дисертаційних досліджень здійснено за участю співавторів - к.б.н. Сибірного А.В. та к.б.н. Яворської Г.В.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертаційної роботи представлені на IV Міжнародному медичному конгресі студентів та молодих вчених (Тернопіль, 2000 р.), 7-му Міжнародному медичному конгресі студентів та молодих вчених (Тернопіль, 2003 р.), ІІІ з'їзді фтизіатрів та пульмонологів України (Київ, 2003 р.), науково-практичній конференції «Актуальні питання контролю за особливо-небезпечними та керованими інфекціями в Україні» (Львів, 2004 р.), науково-практичній конференції «Сучасні проблеми епідеміології, мікробіології та гігієни» (Львів, 2004 р.), науково-практичній конференції «Інфекційні хвороби, туберкульоз та сучасний стан довкілля. Епідеміологія, діагностика, мікробіологія.» (Львів, 2005 р.), науково-практичному семінарі «Актуальные аспекты диагностики туберкулеза. Настоящее и будущее» (Санкт-Петербург, 2006 г.)

Публікації. Результати дисертаційної роботи викладені у 10 наукових працях, із них: 4 статті у фахових виданнях та 6 тез доповідей.

Структура та обсяг дисертації. Робота викладена на 129 сторінках комп'ютерного тексту і складається із вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів дослідження, трьох розділів власних досліджень, підсумку, висновків та списку літератури, що нараховує 219 джерел (166 - з країн СНД і 53 - інших країн).Робота містить 22 таблиці та 9 рисунків, додатки.

Основний зміст роботи

мікобактерія туберкульоз патологічний легеневий

Огляд літератури складається із трьох розділів, в яких висвітлено сучасні уявлення про проблему епідемії туберкульозу, його етіології. Детально описано сучасні лабораторні методи діагностики туберкульозу, розглянуто основні біологічні властивості, в тому числі медикаментозна резистентність збудника туберкульозу.

Матеріали і методи досліджень. Мікробіологічне дослідження біоматеріалу на наявність M.tuberculosis проведено у 1977 пацієнтів із різною локалізацією специфічного процесу. Серед них - 1694 пацієнти з туберкульозом органів дихання, у яких досліджено 3283 зразки патологічного матеріалу: харкотиння, промивні води бронхів, промивні води шлунку, бронхо-альвеолярний лаваж (БАЛ).При позалегеневому туберкульозі: центральної нервової системи - обстежено 20 хворих і отримано 31 зразок патологічного матеріалу (спиномозкова рідина (ліквор)), туберкульозі кісток і суглобів - обстежено 28 хворих і підготовлено 50 зразків патологічного матеріалу (гній із нориці уражених кісток і суглобів, вміст із нориці уражених суглобів і кісток), туберкульозі сечостатевих органів - обстежено 95 хворих (сеча, менструальна кров у жінок, простатичний сік та сперма у чоловіків), туберкульозі лімфатичних вузлів - обстежено 6 хворих і 6 зразків патологічного матеріалу (виділення із лімфатичних вузлів, біопсійний матеріал), туберкульозі шкіри - досліджено 5 зразків патологічного матеріалу (гній із нориці ураженої ділянки шкіри, виділення із нориці ураженої ділянки шкіри), туберкульозі кишківника - досліджено 6 зразків патологічного матеріалу (фекалії), ексудативний плеврит - обстежено 147 хворих та 203 зразки патологічного матеріалу (плевральна рідина, харкотиння). При неспецифічних захворюваннях легень - обстежено 16 хворих досліджено 22 зразки патологічного матеріалу. Виділено 50 штамів мікобактерій туберкульозу від хворих легеневим і позалегеневим туберкульозом, у 50 пацієнтів вивчено чутливість МБТ до основних антимікобактеріальних препаратів методами абсолютних концентрацій і у автоматизованій системі Bactec MGIT-960.

Для вирішення поставлених задач було використано комплекс мікробіологічних методів дослідження. Посів на тверде поживне середовище Левенштейна-Йєнсена - (контрольна група), посів у автоматизованій системі Bactec MGIT-960 - (основна група).

Для вивчення морфологічних і культуральних особливостей мікобактерій використовували методи: прямої мікроскопії за Ціль-Нільсеном, у випадку відсутності мікобактерій при прямому мікроскопічному дослідженні та при наявності клінічних ознак туберкульозу, застосовували різні методи обробки досліджуваного матеріалу з метою концентрації збудника - метод «збагачення» та посів патологічного матеріалу як класичним методом, так і при застосуванні автоматизованої системи Bactec MGIT-960. Чутливість 50 штамів Mycobacterium tuberculosis, виділених від хворих легеневим та позалегеневим туберкульозом до стрептоміцину, ізоніазиду, рифампіцину та етамбутолу визначали методом абсолютних концентрацій на твердому поживному середовищі Левенштейна-Йєнсена згідно з наказом №45 МОЗ України [2002], та методом MGIT-960 SIRE Kit (for the Antimycobacterial Susceptibility Testing of Mycobacterium tuberculosis). Мультирезистентними вважали штами, стійкі одночасно до двох протитуберкульозних препаратів - рифампіцину та ізоніазиду.

Визначення каталазної та пероксидазної активності виділених культур мікобактерій проводили згідно з наказом №45 МОЗ України [2002].

Статистична обробка матеріалу включала визначення середньоарифметичного відхилення, показника вірогідності різниці вірогідності за таблицею Ст'юдента. Результати досліджень оброблялися за параметричними та непараметричними методами варіаційної статистики Уілконсона-Уітні за допомогою ліцензійних програмних продуктів, які входять в пакет Microsoft Office Professional 2000 (Exсel), ліцензія Russian Academic OPEN No Level №17016297.

Результати та їх обговорення.

У розділі «Епідемічні особливості захворюваності на туберкульоз» проведено аналіз епідеміологічної ситуації з легеневого туберкульозу у Волинській області, проаналізовано дані про бактеріовиділення у цих пацієнтів.

Відомо, що основний резервуар інфекції - це хворі туберкульозом легень, які створюють вогнище, виділяючи мікобактерії. На рис. 1. видно, що у структурі захворюваності на туберкульоз легень виявлено незначну тенденцію до спаду. Якщо у 2002 році таких хворих було 2546, то у 2005-2037 і у 2007 році - 2164. Часто питання про наявність активного туберкульозного процесу вирішується за фактом виявлення МБТ у патобіологічному матеріалі. Тому застосування мікробіологічних методів має велике значення не тільки при встановленні діагнозу, але і протягом перебігу хвороби як контроль за ефективністю хіміотерапії. Однак, серед цієї категорії хворих збільшився відсоток бактеріовиділювачів (рис. 2.). Якщо у 2002 році ця цифра становила 23,96%, то у 2005 році - 31,99%, а у 2007 році - 31,3% (Р < 0,01).

У розділі «Ефективність бактеріологічних методів виявлення мікобактерій у хворих на туберкульоз різної локалізації» визначено ефективність застосування різних бактеріологічних методів виявлення мікобактерій у хворих на легеневий і позалегеневий туберкульоз.

При дослідженні патологічних зразків як традиційним методом культивування на твердому яєчному середовищі Левенштейна-Йєнсена, так і при культивуванні у автоматизованій системі Bactec MGIT-960 встановлено, що виявлення мікобактерій туберкульозу було більш ефективним при культивуванні на рідкому поживному середовищі Міддлбрук 7Н9 у автоматизованій системі Bactec MGIT-960.

При дослідженні 1507 зразків патологічного матеріалу від 1046 хворих встановлено високоефективне виявлення мікобактерій, особливо, при інфільтративному, дисемінованому та фіброзно-кавернозному туберкульозі легень, де їх відсоток у 2 рази вищий, ніж при культивуванні на твердому поживному середовищі Левенштейна-Йєнсена, а також при ексудативних плевритах і неспецифічних захворюваннях легень, що дає можливість для правильної діагностики і ефективного лікування. Отримання культурального росту мікобактерій у системі Bactec у порівнянні з твердим поживним середовищем було у 2-3 рази швидшим і становило в середньому від 6 до 16 днів.

Проведено дослідження патологічного матеріалу при туберкульозі позалегеневої локалізації. При цьому ефективність виявлення МБ у автоматизованій системі у 1,5-2 рази більша у порівнянні з традиційним методом культивування на твердому поживному середовищі.

Особливо ефективним було виявлення мікобактерій при туберкульозі нервової системи, а також при кістково-суглобовому туберкульозі.

Отже, застосування Bactec MGIT-960 дозволяє майже у двічі скоротити час виявлення мікобактерій і значно раніше провести тест чутливості МБТ до антимікобактеріальних препаратів, що надзвичайно актуально у випадках встановлення, спростування діагнозу, отримання результату чутливості МБ, що свідчить про ефективність хіміотерапії.

Вивчалась ефективність виявлення мікобактерій туберкульозу від хворих на позалегеневий туберкульоз із застосуванням різних методів обробки патологічного матеріалу і різних методів дослідження. Встановлено, що при захворюванні сечостатевих органів виділення культур мікобактерій туберкульозу становило (23,7 ± 5,5)% (Р < 0,05) від загальної кількості обстежених хворих. Однак, вагоме місце займало і бактеріовиділення при туберкульозі центральної нервової системи. Хоча ці хворі складали незначний відсоток - 6,8%, проте виділення МБ серед них становило (5,1 ± 2,9)% (Р < 0,05) від загальної кількості хворих на позалегеневий туберкульоз. Аналіз виявлення збудника туберкульозу при конкретних його позалегеневих локалізаціях показав, що у 41 хворого на туберкульоз сечостатевих органів, де виявлено мікобактерії у 14 пацієнтів, методом із застосуванням бікарбонату натрію було виявлено МБ у (26,8 ± 5,8)% (Р < 0,01) випадків, методом посіву з використанням 3-х заміщеного фосфорнокислого натрію у (21,9 ± 5,4)% (Р < 0,01) хворих від загальної кількості обстежених. А застосування сірчаної кислоти для попередньої обробки патологічного матеріалу при посіві на середовище осаду і піни дало всього (9,7 ± 3,9)% (Р < 0,05) (від загальної кількості хворих сечостатевим туберкульозом) виявлення Mycobacterium tuberculosis. При цьому метод прямої мікроскопії у хворих на туберкульоз сечостатевих органів дав негативний результат. При туберкульозі центральної нервової системи, то встановлено, що серед чотирьох хворих, обстежених на наявність збудника, у трьох було знайдено мікобактерії туберкульозу методом посіву з використанням фосфорнокислого натрію. При цьому метод посіву із застосуванням сірчаної кислоти, метод прямої мікроскопії і метод «збагачення» дали негативний результат. При ураженні периферичних лімфатичних вузлів, збудника туберкульозу було виявлено методом посіву з використанням 3-х заміщеного фосфорнокислого натрію у (16,6 ± 4,8)% хворих (табл. 1).

Таким чином, результати проведеного дослідження свідчать про малий відсоток виявлення збудника туберкульозу в біологічному матеріалі, особливо при його позалегеневій локалізації. Це повґязано з певними труднощами, в першу чергу особливістю специфічної локалізації. Разом з тим, частоту виявлення збудника підвищує не тільки вибір середовища культивування, але і правильна передпосівна обробка патологічного матеріалу з врахуванням локалізації специфічного процесу. Уваги заслуговує метод «збагачення», особливо при застосуванні його для діагностики туберкульозу сечостатевої системи.

Проведено первинну обробку 2506 зразків патологічного матеріалу з наступним посівом на рідке поживне середовище у автоматизовану систему Bactec MGIT-960. При застосуванні уніфікованого методу попередньої обробки біоматеріалу на основі стандартного розчину Мусо рreр, контамінація становила (11,1 ± 1,0)%, а відсоток виявлення кислотостійких бактерій - (28,8 ± 1,5)%. При застосуванні модифікованого методу, перевагою якого є використання дешевих хімічних реагентів: лугу і соляної кислоти, контамінація становила (5,4 ± 0,6)%, а виявлення КСБ - (33,1 ± 1,2)% (Р < 0,01), від загальної кількості досліджених зразків (табл.).

Ефективність удосконаленого методу обробки патологічного матеріалу для виявлення кислотостійких бактерій

Виявлення МБТ у хворих на позалегеневий туберкульоз при різних методах обстеження і обробки патологічного матеріалу

Примітка:

* - зміни вірогідні відносно даних, отриманих за методом 2 (Р < 0,01).

** - зміни вірогідні відносно даних, отриманих за методом 3 (Р < 0,05).

Отримані результати свідчать, що застосування удосконаленого методу де оптимізовано умови (збільшення концентрації, зміна рН середовища) обробки патологічного матеріалу зменшує відсоток проростів у 2,1 рази та збільшує відсоток виявлення кислотостійких бактерій. Технічна простота, доступна вартість запропонованих хімічних реагентів, роблять можливим використання даного способу у практичних лабораторіях, що займаються мікробіологічною діагностикою туберкульозу з використанням автоматизованих систем.

Встановлено, що збудник позалегеневого туберкульозу має ряд особливостей. Так, при туберкульозі мозкових оболонок і центральної нервової системи тест на редукцію нітратів по Бараускене був слабко-вираженим, тоді як, при туберкульозі периферичних лімфатичних вузлів, туберкульозі кісток і суглобів та туберкульозі сечостатевих органів штами мікобактерій туберкульозу посилено редукували нітрати і спостерігалася яскраво виражена реакція. Усі виділені культури при позалегеневих формах туберкульозу мали помірно чи сильно виражену пероксидазну активність і характеризувались термолабільністю каталази. Жодна з культур не дала росту на поживному середовищі з натрієм саліциловокислим. При цьому досліджені культури при позалегеневих формах туберкульозу мали слабко-виражену активність ферменту каталази і пероксидази, хоча після дослідження їх чутливості, було встановлено стійкість до ізоніазиду. Це свідчить про те, що не завжди культури МБТ, стійкі до препаратів ГІНК, втрачають здатність синтезувати ендогенну каталазу і розщеплювати перекис водню (табл.).

Біохімічні особливості виділених мікобактерій туберкульозу при позалегеневій локалізації процесу

Примітки:

+ + + - реакція сильно виражена

+ + - реакція помірно виражена

+ - реакція слабо виражена

- - реакція відсутня

Отже, застосування модифікованих біохімічних тестів для доведення приналежності виділеної культури до мікобактерій туберкульозу має важливе діагностичне значення в клініці туберкульозу і дає можливість виявляти вірулентність досліджуваної культури. Модифікований тест на редукцію нітратів за Бараускене, як простий і доступний у виконанні, рекомендовано для підтвердження приналежності виділених культур до мікобактерій туберкульозу в бактеріологічних лабораторіях фтизіатричного профілю.

У розділі «Особливості стійкості штамів мікобактерій туберкульозу до антимікобактеріальних препаратів» визначено ефективність застосування різних методів визначення медикаментозної чутливості МБТ до антимікобактеріальних препаратів, визначена резистентність збудника туберкульозу при позалегеневій локалізації процесу, а також дані бактеріологічних досліджень чутливості МБТ до антимікобактеріальних препаратів у вперше діагностованих хворих на легеневий туберкульоз.

Проводили визначення медикаментозної чутливості 36 штамів мікобактерій туберкульозу, виділених від хворих легеневим і кістково-суглобовим туберкульозом.

У системі Bactec MGIT-960, за допомогою готового набору з антимікобактеріальними препаратами Bactec MGIT-960 SIRE KIT, було проведено тестування чутливості AST (Antimicrobic Susceptibility Testing) штамів мікобактерій, виділених від хворих на туберкульоз, а також проведено порівняння одержаних даних з результатами чутливості, отриманими за методом абсолютних концентрацій на твердому поживному середовищі Левенштейна-Йєнсена. При визначенні чутливості у системі Bactec MGIT-960 встановлено, що серед досліджуваних штамів домінують штами збудника туберкульозу резистентні до стрептоміцину - (47,2 ± 8,3)% та ізоніазиду (41,7 ± 8,2)%, методом абсолютних концентрацій - (58,3 ± 8,2)% і (44,4 ± 8,3)% (Р < 0,05), (38,9 ± 8,1)% штамів МБТ були стійкими до рифампіцину (відповідно методом абсолютних концентрацій - (36,1 ± 8,0)% (Р < 0,05). Кількість стійких штамів до етамбутолу у системі MGIT-960 становила (16,7 ± 6,2)%, а за методом абсолютних концентрацій - (36,1 ± 8,0)% (Р < 0,05). Виявлено, що значна кількість штамів мікобактерій туберкульозу (36,1% від загальної кількості досліджених культур) є мультирезистентними, тобто стійкими до 2-3-х і більше антимікобактеріальних препаратів одночасно, включаючи рифампіцин та ізоніазид) (табл.).

Стійкість штамів Mycobacterium tuberculosis до антимікобактеріальних препаратів

Примітка:

* - зміни вірогідні відносно методу абсолютних концентрацій (Р < 0,05).

При порівнянні співпадіння результатів обох методів, встановлено, що у (97,2 ± 2,7)% випадках спостерігалося співпадіння результатів чутливості до рифампіцину та ізоніазиду, у (94,4 ± 3,8)% - до стрептоміцину, найменший відсоток співпадіння зареєстровано при визначенні резистентності до етамбутолу - у (80,6 ± 6,6)% випадків (табл.).

Порівняння результатів чутливості мікобактерій туберкульозу до антимікобактеріальних препаратів у системі MGIT-960 і методом абсолютних концентрацій

Оскільки співпадіння результатів за тестами чутливості МБТ до АБП у системі Bactec MGIT-960 і методом абсолютних концентрацій на середовищі Левенштейна-Йєнсена є високим і, в середньому, для досліджуваних активних субстанцій (S, R, H, E) складає 92,4%. Це дає підставу рекомендувати для впровадження у лабораторну практику фтизіатричної служби разом із використанням методу абсолютних концентрацій на твердому поживному середовищі Левенштейна-Йєнсена, метод Bactec MGIT-960 AST, як більш швидкий, не менш надійний для обстеження хворих з вперше діагностованим туберкульозом, з метою своєчасного і правильного підбору схеми лікування. Це сприятиме підвищенню ефективності хіміотерапії та попередженню розвитку вторинної резистентності.

Серед причин, які сприяють підвищенню захворюваності, називають зростання кількості випадків хіміорезистентного туберкульозу, викликаного мультирезистентними штамами мікобактерій туберкульозу, стійкими, як мінімум, до двох головних протитуберкульозних препаратів - ізоніазиду і рифампіцину.

Проаналізовано дані бактеріологічних досліджень чутливості МБТ до антимікобактеріальних препаратів у вперше діагностованих хворих на туберкульоз за 2003-2005 роки у Волинській області.

У 2003 році відсоток хворих, що виділяли чутливі МБТ становив 57,3% (Р < 0,01), а вже у 2005 році - 23,7% (Р < 0,01). Якщо у 2003 році хворих з первинною полірезистентністю було - 19,5% (Р < 0,01), то у 2004 - 27,1%

(Р < 0,01), а у 2005році - 44,5% (Р < 0,01). Що стосується хворих-бактеріовиділювачів з первинною мультирезистентністю, то видно, що їх кількість коливалася в межах 7 - 10% (Р < 0,01). Результати аналізу проведених досліджень свідчать, що кількість хворих з хіміорезистентним туберкульозом у Волинській області з року в рік невпинно зростає. Особливо збільшується відсоток нових випадків з первинною полірезистентністю. Це свідчить про розповсюдженість вторинної стійкості у хворих з вперше діагностованим туберкульозом та про недостатньо ефективне лікування.

Таким чином, на даний момент, проблема хіміорезистентного туберкульозу потребує термінової уваги для розробки нових режимів лікування, швидких методів ранньої діагностики та пошуку ефективних лікарських протитуберкульозних препаратів для боротьби з цією недугою.

Було виділено 14 штамів збудника туберкульозу від хворих на позалегеневі його форми. В результаті встановлено, що майже при всіх досліджених формах позалегеневого туберкульозу були виділені штами зі стійкістю до двох препаратів. Так, при туберкульозі сечостатевих органів (3,1 ± 2,1)% (Р < 0,05) культур (від загальної кількості досліджених штамів при сечостатевому туберкульозі) були полірезистентними, тобто стійкими до 2-3-х антимікобактеріальних препаратів (восновному до рифампіцину, стрептоміцину і етамбутолу) і (3,1 ± 2,1)% (Р < 0,05) виділених культур були мультирезистентними (тобто стійкими одночасно до рифампіцину і ізоніазиду). При туберкульозі мозкових оболонок і центральної нервової системи (11,1 ± 10,5)% (Р < 0,05) штамів були полірезистентні і стільки ж відсотків культур мультирезистентними (від загальної кількості досліджених штамів при туберкульозі мозкових оболонок і центральної нервової системи). При туберкульозі кісток і суглобів (6,7 ± 6,5)% (Р < 0,05) культур МБТ були стійкими до одного антибактеріального препарату (стрептоміцину), тобто монорезистентні, при туберкульозі периферичних лімфатичних вузлів усі досліджені штами характеризувалися як чутливі до всіх застосованих антимікобактеріальних препаратів.

Висновки

Проведено порівняльний аналіз ефективності застосування мікробіологічних методів виявлення, ідентифікації та визначення чутливості мікобактерій туберкульозу до антимікобактеріальних препаратів. Головні наукові і практичні результати роботи викладено у наступних висновках:

1. Показано, що застосування автоматизованої системи Bactec MGIT-960 у два рази прискорює виявлення росту мікобактерій при усіх досліджених формах туберкульозного процесу, а також збільшує, в середньому, у 1,2 рази відсоток виявлення мікобактерій при позалегеневих формах, особливо при ураженні нервової і кістково-суглобової систем.

2. Встановлено, що при посіві патологічного матеріалу з подальшим культивуванням у автоматизованій системі Bactec MGIT-960 виявлення мікобактерій на 10-15% більше, ніж при культивуванні на твердому поживному середовищі Левенштейна-Йєнсена при різних формах туберкульозу.

3. Використання методу «збагачення» з попередньою обробкою патологічного матеріалу розчином бікарбонату натрію збільшує відсоток виявлення мікобактерій туберкульозу у хворих на туберкульоз урогенітальної локалізації.

4. Оптимізовано умови (збільшення концентрації, зміна рН середовища) методу обробки патологічного матеріалу, застосування таких умов попередньої обробки патологічного матеріалу зменшує у 2,1 рази відсоток проростів поживного середовища та у 1,2 рази збільшує відсоток виявлення кислотостійких бактерій.

5. Для підтвердження приналежності виділених культур до мікобактерій туберкульозу, рекомендовано застосовувати модифікований тест на редукцію нітратів за Бараускене, як простий і доступний у виконанні.

6. При усіх досліджених формах позалегеневого туберкульозу виділені стійкі штами: при туберкульозі сечостатевих органів - полірезистентні штами (в основному стійкі до рифампіцину, стрептоміцину і етамбутолу) і мультирезистентні штами (одночасно стійкі до рифампіцину та ізоніазиду), при туберкульозі кісток і суглобів - монорезистентні (стійкі до стрептоміцину).

7. Доведено співпадіння результатів (92,4%) тестів чутливості мікобактерій туберкульозу до антимікобактеріальних препаратів у автоматизованій системі Bactec MGIT-960 і методу абсолютних концентрацій на твердому поживному середовищі Левенштейна-Йєнсена.

8. Визначено ефективність застосовування тесту Bactec MGIT-960 AST у широкій лабораторній практиці як більш швидкого та надійного для обстеження хворих з вперше діагностованим туберкульозом, з метою своєчасного підбору схеми лікування, що сприятиме підвищенню ефективності хіміотерапії і попередженню розвитку вторинної резистентності.

Список опублікованих праць за темою дисертації

1. Сибірна Р.І., Кондратюк Н.В., Яворська Г.В. Виявлення збудника туберкульозу позалегеневої локалізації різними мікробіологічними методами. // Мікроб. журн. - 2004. - №1 - С. 62 - 67. (Особистий внесок: збір, узагальнення та аналіз даних, організація забору матеріалу, безпосереднє проведення мікроскопії та посіву на поживні середовища, підбір деконтамінуючого засобу, статистична обробка даних, підготовка до публікації).

2. Сибірна Р.І., Кондратюк Н.В. Особливості діагностики туберкульозу позалегеневої локалізації // Мікроб. журн. - 2004. - №6 - С. 58-63. (Особистий внесок: організація забору матеріалу, безпосереднє проведення біохімічних тестів, узагальнення і статистична обробка отриманих даних, підготовка до публікації).

3. Сибірна Р.І., Кондратюк Н.В. Культивування Mycobacterium tuberculosis із застосуванням автоматизованої системи Bactec MGIT - 960 // Мікроб. журн. - 2006. - №3. - С. 47-51. (Особистий внесок: збір даних та їх узагальнення, безпосереднє проведення посіву із застосуванням автоматизованої системи Bactec MGIT - 960, статистична обробка даних, підготовка до публікації).

4. Кондратюк Н.В., Сибірна Р.І., Сибірний А.В. Порівняльна характеристика медикаментозної чутливості штамів Mycobacterium tuberculosis // Мікроб. журн. - 2006. - №4. - С. 54-59. (Особистий внесок: безпосереднє проведення тестів чутливості МБТ до ПТП, виділення культури МБТ, узагальнення даних, їх статистична обробка, підготовка до публікації).

Размещено на Allbest.ru