Ідентифікація білків-партнерів туберозно-склерозного комплексу tsc1/2 та характеристика виявлених взаємодій

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЇ БІОЛОГІЇ ТА ГЕНЕТИКИ

АВТОРЕФЕРАТ

ІДЕНТИФІКАЦІЯ БІЛКІВ-ПАРТНЕРІВ ТУБЕРОЗНО-СКЛЕРОЗНОГО КОМПЛЕКСУ TSC1/2 ТА ХАРАКТЕРИСТИКА ВИЯВЛЕНИХ ВЗАЄМОДІЙ

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано на кафедрі мікробіології та загальної імунології Київського національного університету імені Тараса Шевченка та у відділі сигнальних систем клітини Інституту молекулярної біології та генетики НАН України.

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор Позур Володимир Костянтинович, Київський національний університет імені Тараса Шевченка, завідувач кафедри мікробіології та загальної імунології.

Науковий консультант: доктор біологічних наук, професор Філоненко Валерій Вікторович, Інститут молекулярної біології та генетики НАН України, завідувач відділу сигнальних систем клітини.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор Дробот Людмила Борисівна, Інститут біохімії імені О.В. Палладіна НАН України, завідувач лабораторії сигнальних механізмів клітини;

кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник Кухаренко Олександр Петрович, Інститут молекулярної біології та генетики НАН України, старший науковий співробітник відділу комбінаторної хімії.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту молекулярної біології та генетики НАН України.

Автореферат розіслано ____ листопада 2008 року.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, кандидат біологічних наук О. В. Підпала

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Вивчення молекулярних механізмів функціонування сигнальних шляхів клітини є актуальною проблемою сучасної молекулярної біології клітини, оскільки їхня координована взаємодія є запорукою нормального розвитку і життєдіяльності клітини та організму в цілому. На особливу увагу заслуговує вивчення регуляції ключових сигнальних молекул, наслідком порушення якої є розвиток низки патологій, зокрема неопластичної трансформації (Pain, 1996).

З огляду на вищесказане, перспективним є вивчення білкових продуктів пухлинно-супресорних генів туберозно-склерозного комплексу TSC1 (TSC1, гамартин) і TSC2 (TSC2, туберин), які формують фізичний та функціонально активний комплекс in vivo, залучений до контролю PI3К/Akt/mTOR-залежного сигнального шляху (Bender et al., 1982; Gao et al., 2001; Kwiatkowski, 2003).

На користь того, що TSC1/2 є супресором пухлин, свідчать дані мутаційного аналізу, а саме: мутації в будь-якому з двох генів TSC1 (9q34) чи TSC2 (16р13) призводять до неконтрольованої проліферації клітин і є однією з причин розвитку туберозного склерозу (TSC) - аутосомно-домінантного захворювання, для якого характерні нетипові пухлиноподібні утворення, так звані гамартоми, які виникають в широкому спектрі тканин та органів (Cheadle et al., 2000).

Встановлено, що третина випадків розвитку туберозного склерозу є результатом гермінальних мутацій, тоді як дві третини випадків - це результат мутацій de novo (Kwiatkowski et al., 2003). Однак, цікавим є той факт, що у 20 % хворих на туберозний склероз мутації в генах TSC1 чи TSC2 взагалі відсутні. В даному випадку виникнення захворювання, очевидно, є наслідком порушення механізму регуляції функціонування TSC2 та комплексу TSC1/2 в цілому.

На сьогодні накопичено багато даних щодо взаємодії туберину з різними сигнальними молекулами, білками адгезії, адаптерними білками тощо, активність яких виявляється на різних етапах життєвого циклу клітини (Kwiatkowski, 2003; Krymskaya, 2003). Дані взаємодії вказують на важливу роль туберину в процесах життєдіяльності клітини. Водночас, ці дані є недостатніми для остаточного з'ясування механізму функціонування комплексу TSC1/2 в сигнальних шляхах. Зокрема, на сьогодні не до кінця зрозумілі механізми регуляції активності даного супресора пухлин.

Відомо, що комплекс TSC1/2, і туберин, зокрема, відіграє важливу роль у супресії утворення пухлин шляхом негативної регуляції PI3К-залежного сигнального шляху. TSC2, і комплекс TSC1/2 в цілому, завдяки своїй GAP (GTPаза активувальній) активності, спрямованій проти активатора mTOR GTPази Rheb, є негативним регулятором mTOR (Harris et al., 2003; Lekmine et al., 2003). Все це свідчить на користь того, що білкові партнери комплексу TSC1/2 є перспективними фармакологічними мішенями для лікування спадкових синдромів та онкологічних захворювань. У звЧязку з цим в останні роки особливу увагу вчених привертають механізми регуляції пухлинно-супресорного комплексу TSC1/2. Існують дані про те, що активність комплексу регулюється шляхом множинного фосфорилювання TSC2 за участі кіназ PKB/Akt, ERK, MK2 тa RSK1, які негативно впливають на туберин, тоді як кіназа, що активується AMР (AMPK), позитивно впливає на активність туберину (Inoki et al., 2003). Однак, на сьогоднішній день відсутні дані щодо регуляторної ролі дефосфорилювання TSC2 та комплексу TSC1/2 в цілому.

Отже, незважаючи на досягнутий в останні роки значний прогрес у розумінні основних механізмів регуляції процесів проліферації та росту, низка питань щодо визначення місця та ролі туберозно-склерозного комплексу TSC1/2 в цих процесах залишається нерозвЧязаною. Серед цих важливих питань особливе місце посідає, з одного боку, детальне вивчення молекулярного механізму, що опосередковує функціонування комплексу TSC1/2 як супресора пухлин, а з іншого - вивчення механізмів регуляції активності комплексу TSC1/2. З огляду на вищевикладене, на сьогодні залишається актуальним пошук нових білкових партнерів комплексу TSC1/2 та з'ясування регуляторної ролі виявлених взаємодій.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація відповідає основному плану науково-дослідних робіт відділу сигнальних систем клітини Інституту молекулярної біології та генетики НАНУ і виконувалась в рамках бюджетної теми №2.2.4.10 - “Дослідження структурно-функціональної організації PI3-кіназного сигнального шляху та пухлино-асоційованих антигенів” (номер державної реєстрації - 0105U005342, 2006-2010 рр.), а також у рамках співробітництва з кафедрою мікробіології та загальної імунології біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка та відділом біохімії та молекулярної біології Лондонського університетського коледжу (Велика Британія). Частину роботи було виконано за підтримки грантів Європейської Асоціації Ракових Досліджень (EACR) 2005 р., Міжнародної Організації Боротьби проти Раку (UICC) 2007 p. та Організації Об'єднаних Націй з питань Освіти, Науки і Культури (MCBN - UNESCO) 2007 р.

Мета та завдання дослідження. Метою дисертаційної роботи був пошук нових функціональних взаємодій комплексу TSC1/2 методом двогібридної системи дріжджів, а також з'ясування регуляторної ролі виявлених взаємодій в клітинах вищих евкаріотів.

Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити такі завдання:

Створити серію кДНК-«байт»-конструкцій повнорозмірного гена Tsc2 та його фрагментів та з'ясувати можливість використання отриманих конструкцій для скринування кДНК-бібліотек методом двогібридної системи дріжджів.

Провести скринування кДНК-бібліотек ембріона миші та клітин лінії HeLa з використанням відповідних «байт»-конструкцій та відібрати позитивні клони, що містять кДНК потенційних білків-партнерів.

Перевірити специфічність виявлених взаємодій методом статевого злиття клітин дріжджів, трансформованих кДНК «байт»-конструкцій та кДНК потенційних білків-партнерів.

Визначити нуклеотидні послідовністі кДНК позитивних клонів та ідентифікувати їх за базою даних первинних послідовностей GenBank.

Експресувати рекомбінантні TSC2 та TSC2-зв'язувальні білки з використанням

бактеріальної та бакуловірусної систем експресії. Отримати високоочищені препарати рекомбінантних білків.

Отримати моноклональні антитіла проти TSC2 методом гібридомної технології.

Підтвердити специфічність взаємодії ендогенного TSC2 із потенційними TSC2-зв'язувальними білками за допомогою методу ко-імунопреципітації в клітинах ембріональних фібробластів мишей.

Проаналізувати фізіологічну значимість виявлених взаємодій між TSC2 та TSC2-зв'язувальними білками.

Об'єкт дослідження - молекулярні механізми функціонування РІ3К-залежного сигнального шляху.

Предмет дослідження - ідентифікація нових TSC2-зв'язувальних білків та з'ясування регуляторної ролі виявлених взаємодій в клітинах ссавців.

Методи дослідження - двогібридна система дріжджів, клонування фрагментів кДНК, тимчасова трансфекція клітин ссавців кДНК-конструкціями, експресія та афінна очистка рекомбінантних білків, імунопреципітація та Вестерн-блот аналіз, імуноцитохімія; гібридомна технологія, аналіз білково-білкових взаємодій за допомогою реципрокної ко-імунопреципітації білкових комплексів, кіназна реакція in vitro, фосфатазна реакція in vitro.

Наукова новизна одержаних результатів. За допомогою двогібридної системи дріжджів проаналізовано бібліотеки кДНК ембріона миші та клітин HeLa, що дозволило ідентифікувати низку нових білків-партнерів супресора пухлин TSC2, серед яких протеїнфосфатаза 5 (РР5), білки протеасомного комплексу та інші.

Вперше отримано моноклональні антитіла проти супресора пухлин TSC2, які здатні розпізнавати ендогенний TSC2 за допомогою методів Вестерн-блот аналізу та імуноцитохімії, а також імунопреципітувати ендогенний білок із лізатів клітин ссавців.

Специфічність утворення комплексу TSC2/РР5 підтверджено за допомогою методу реципрокної ко-імунопреципітації та встановлено, що ефективність його утворення залежить від фізіологічного стану клітини.

Вперше за допомогою фосфатазної реакції in vitro показано здатність РР5 дефосфорилювати TSC2 за потенційними сайтами фосфорилювання кінази АМРК.

Запропоновано гіпотетичну схему регуляції активності супресора пухлин TSC2 та комплексу TSC1/2 в цілому, згідно якої дефосфорилювання TSC2 відбувається завдяки його взаємодії з РР5. Припускається, що таке дефосфорилювання може відбуватись за потенційними сайтами фосфорилювання кіназою АМРК та призводити до інгібування GАP-активності TSC2.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані дані є суттєвим внеском у розуміння загальної картини функціонування TSC1/2-опосередкованих сигнальних мереж, залучених до контролю фізіологічної активності клітин. Відкриття взаємодії TSC2 з РР5 дає можливість припустити існування ще одного шляху регуляції акивності TSC2 та комплексу TSC1/2 в цілому, який полягає у дефосфорилюванні супресора пухлин TSC2 протеїнфосфатазою 5 за потенційними сайтами фосфорилювання кінази АМРК. Це відкриває нові перспективи як у вивченні механізмів регуляції процесів клітинного росту, проліферації, так і з'ясуванні причин їх порушення за умов патологій різного походження, зокрема, при розвитку злоякісних новоутворень.

Клонування генів супресора пухлин TSC2 та РР5 з використанням бакулові-

русних та бактеріальних векторів дозволяє експресувати і очищати дані білки для проведення наукових досліджень. Отримані моноклональні антитіла проти TSC2 можуть бути використані при дослідженні процесів проліферації, росту та апоптозу клітин, а також при вивченні особливостей передачі сигналу через PI3K/Akt/mTOR-залежний сигнальний шлях.

Особистий внесок здобувача. Всі експериментальні дослідження виконувались за безпосередньої участі здобувача. Біоінформаційний пошук та оцінка даних літератури виконані дисертантом особисто. Аналіз відповідності вимогам системи «байт»-конструкцій, аналіз отриманих позитивних клонів, імунізацію мишей, отримання та очистку антитіл проти TSC2, характеристику отриманих моноклональних антитіл проти TSC2 методами ELISA, Вестерн-блот аналізу, імунопреципітації та імуноцитохімії; очистку рекомбінантного білка РР5 з клітин комах, аналіз експресії РР5 та TSC2, перевірку можливості взаємодії між TSC2 та Мус-РР5 методом реципрокної ко-імунопреципітації, АМРК - кіназна та РР5 - фосфатазна реакції in vitro проведені особисто здобувачем.

Створення «байт»-конструкцій, трансформація дріжджів плазмідами, скринування кДНК-бібліотек, селекцію позитивних клонів дріжджів за фенотипом LacZ⁺Leu⁺, перевірку ізольованих позитивних клонів методом статевого злиття дріжджів було проведено у співробітництві із к.б.н., с.н.с. С. С. Пальчевським; клонування та експресію гена РР5 в бакуловірусній системі виконано у співпраці з к.б.н., с.н.с. О. М. Живолупом.

Слова щирої вдячності автор висловлює безпосереднім керівникам роботи д.б.н., проф. В. К. Позуру та д.б.н., проф. В. В. Філоненку за допомогу у розробці стратегії досліджень, аналізі та узагальненні результатів, а також к.мед.н. І. Т. Гуту за надану можливість виконання роботи на високому методологічному та технічному рівнях. Автор висловлює подяку к.б.н., с.н.с. С.С. Пальчевському, к.б.н., с.н.с. О. М. Живолупу та к.б.н., с.н.с. Г.В. Овчаренко за корисні поради і зауваження під час підготовки, проведення експериментів та при обговоренні результатів роботи. Одержані результати обговорено та опубліковано в спільних публікаціях.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації доповідались на I Міжнародній науковій конференції студентів і аспірантів (Львів, Україна, 2005), V Парнасівській конференції (Київ, Україна, 2005), VII Міжнародній конференції молодих онкологів (Київ, Україна, 2006), ІV Міжнародній науково-практичній конференції студентів, аспірантів та молодих вчених (Київ, Україна, 2007), Конференції молодих науковців, аспірантів і студентів з молекулярної біології і генетики, присвяченій 120 річниці з дня народження М.І. Вавилова (Київ, Україна, 2007), а також на засіданнях кафедри мікробіології та загальної імунології біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка (Київ, Україна), відділу сигнальних систем клітини Інституту молекулярної біології та генетики НАНУ (Київ, Україна) та загальних зборах відділу біохімії та молекулярної біології Лондонського університетського коледжу (Лондон, Велика Британія).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 10 праць, із них 4 статті у фахових наукових журналах, тези 5 доповідей у збірниках матеріалів з'їздів і конференцій та звіт до Європейської асоціації ракових досліджень (EACR).

Структура та обсяг роботи. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, матеріалів і методів досліджень, експериментальної частини, аналізу і узагальнення результатів досліджень, висновків, списку використаних джерел, який охоплює 184 найменування. Дисертацію викладено на 135 сторінках стандартного машинопису, вона містить 17 рисунків та 4 таблиці.

Основний зміст

Матеріали і методи дослідження. В роботі використано компоненти двогібридної системи дріжджів DupLexA^ТМ фірми OriGene (США). Перевірку створених кДНК-«байт»-конструкцій на відповідність вимогам двогібридного скринування проведено за допомогою аналізу здатності химерних білків проникати до ядра та аналізу їхньої здатності самоактивувати експресію репортерних генів. Великомасштабну трансформацію дріжджових клітин кДНК-бібліотеками ембріона миші (кількість індивідуальних клонів 7,5х10⁶) та клітин лінії HeLa (кількість індивідуальних клонів 2,65х10⁶) виробництва OriGene (США), проведено згідно модифікованого протоколу (Panasyuk et al., 2002) з використанням відібраної кДНК-«байт»-конструкції, що експресує LexA/TSC2Cterm. Скринування і тестування позитивних клонів методом статевого злиття проведено відповідно до оригінального кількісного методу (Живолуп та ін., 2000) та згідно з рекомендаціями фірми-виробника.

При виконанні роботи використовували лінії клітин фібробластів миші NIH3T3, ембріональні фібробласти миші TSC2^+/+ p53 ^-/- та TSC2^-/- p53 ^-/- MEFs. Клітини культивували в середовищі DMЕM (low and high glucose) із 2 мМ L-глутаміном, 10 мкг/мл пеніциліну, 0,25 мкг/мл стрептоміцину, 10 % ембріональної сироватки теляти (ЕСТ).

Для створення рекомбінантного білка TSC2 послідовність кДНК ампліфікували за допомогою полімеразної ланцюгової реакції з використанням специфічних олігонуклеотидів, які включали специфічні центри розпізнавання ендонуклеазами рестрикції. Ампліфіковану і плазмідну ДНК розщеплювали відповідними ендонуклеазами рестрикції. Очищений фрагмент ДНК лігували з ДНК відповідної плазміди, використовуючи LigaFast™ Rapid DNA Ligation System (Promega, США), згідно протоколу виробника. Рекомбінантний білок 6His-TSC2Cterm експресували в бактеріях та очищали афінною хроматографією на Ni-NTA агарозі в денатуруючих умовах. Рекомбінантний білок 6His-РР5 експресували і очищали з використанням клітин комах лінії Sf9 за допомогою бакуловірусної системи експресії білків Bac-to-Baс (Invitrogen, Велика Британія).

Моноклональні антитіла проти TSC2 отримували за допомогою гібридомної технології з використанням прискореної схеми імунізації мишей. Специфічність антитіл перевіряли за допомогою імуноферментного аналізу (ELISA), імунопреципітації рекомбінантних і ендогенних білків та Вестерн-блот аналізу.

Аналіз можливості утворення комплексу між TSC2 та Мус-РР5 у клітинах ембріональних фібробластів мишей TSC2^+/+ p53 ^-/-MEFs за різних фізіологічних умов досліджували методом реципрокної ко-імунопреципітації білкових комплексів з лізатів клітин із подальшим Вестерн-блот аналізом отриманих білкових комплексів.

Аналіз здатності РР5 дефосфорилювати TSC2 визначали в фосфатазній реакції in vitro.

Результати досліджень та обговорення.

Створення «байт»-конструкцій для скринування кДНК-бібліотек. Супресор пухлин TSC2 - це білок довжиною 1810 амінокислотних залишків. N-кінцева ділянка молекули містить гамартин - зв'язувальний домен (1 - 418 а.з.). С-кінцева ділянка білка містить GAP-домен, що має GAP-активність. Завдяки GAP-домену TSC2 здійснює функцію супресора mTOR. Туберин також містить кальмодулін-звЧязувальний домен, завдяки якому він здатний звЧязуватись з кальмодуліном і, таким чином, модулювати передачу сигналу від стероїдного рецептора до ядра. Крім того, TSC2 має лейцин-збагачену послідовність («LZ», 81 - 98 а.з.) та два суперспіралізовані домени, які відповідають за взаємодію супресора пухлин з іншими білками сигнальних каскадів. З огляду на особливості структурної організації TSC2, було сконструйовано і використано як «байти» в дріжджовому двогібридному скринуванні конструкцію повнорозмірної форми TSC2 (LexA/TSC2full) та ДНК-«байт»-конструкції, що містили N- та C-кінцеві ділянки TSC2 (LexA/TSC2Cterm та LexA/TSC2Nterm відповідно). В межах кожної із створених конструкцій знаходились як функціональні домени TSC2, так і регуляторні сайти фосфорилювання певними кіназами. Всі послідовності клоновано у вектор pEG202 в рамці з ДНК-зв'язувальним LexA-доменом активатора транскрипції для того, щоб химерні білки, згідно вимоги двогібридної системи дріжджів, взаємодіяли з ДНК промоторних ділянок репортерного гена.

З метою перевірки можливості використання створених ДНК-«байт»-конструкцій для скринування кДНК-бібліотек, проведено серію тестів для відбору тих конструкцій, що відповідали б таким вимогам: 1) «байт»- конструкція експресувалася з високою ефективністю у клітинах дріжджів як LexA-злитий «байт»-білок; 2) «байт»-білок ефективно проникав до ядра; 3) «байт»-білок не спричиняв самоактивацію транскрипції репортерних генів LacZ та Leu2.

Таким чином, в результаті постановки серії тестів було відібрано ДНК-«байт»-конструкцію LexA/TSC2Cterm, що повністю відповідала вимогам двогібридної системи, і яку використовували у скринуванні кДНК-бібліотек.

Скринування кДНК-бібліотек. У роботі використовували комерційні кДНК-бібліотеки ембріона миші (OriGene Inc, США) та клітин HeLa (Invitrogen, Велика Британія). Для скринування кДНК-бібліотек використано дріжджовий штам EGY48 з максимально чутливим до активації репортерним геном Leu2, і плазміду pSH18-34 з максимально чутливим до активації репортерним геном LacZ. Великомасштабну трансформацію клітин EGY48, попередньо трансформованих репортерною плазмідою pSH18-34 та «байт»-конструкцією, що експресує LexA/TSC2Cterm, було проведено згідно з протоколом.

За результатами скринування двох кДНК-бібліотек відібрано 375 первинних позитивних клони, що містили кДНК потенційних білків-партнерів TSC2 (таблиця 1).

Таблиця 1 Результати первинного скринування к ДНК бібліотек «байт»-конструкцією LexA/TSC2Cterm

Повторний аналіз позитивних клонів за фенотипом дозволив відібрати 97 позитивних клони, з яких виділено бібліотечні плазміди, а специфічність взаємодії перевірено за допомогою методу статевого злиття.

Аналіз позитивних клонів методом статевого злиття дріжджів. Для підтвердження специфічності білково-білкових взаємодій використано метод статевого злиття дріжджів, що базується на явищі злиття двох гаплоїдних дріжджових клітин штамів: штаму MATa, трансформованого однією з «байт»-конструкцій і плазмідою з репортерним геном, і штаму МАТб, трансформованого плазмідою з кДНК потенційного партнера. Специфічність активації експресії репортерного гена Leu2 перевіряли за здатністю дріжджів рости на селективному безлейциновому середовищі з галактозою (HULTgal), що є індуктором експресії, та за відсутністю росту таких дріжджів на селективному безлейциновому середовищі із глюкозою (HULTdex). Специфічність активації експресії репортерного гена LacZ перевіряли на селективному середовищі з галактозою (HUTgal) за активністю в-галактозидази при внесенні субстрату X-gal і за відсутністю її активності на селективному середовищі ura--, his--, trp-- із глюкозою (HUTdex). Крім того, справжні позитивні клони не росли на безлейциновому середовищі HULTgal і не мали в-галактозидазної активності на середовищі HUTgal у присутності X-gal, якщо їх зливали з дріжджами, трансформованими системною конструкцією pBait замість «байт»-конструкції. Таким чином, за допомогою методу статевого злиття підтверджено специфічність взаємодії для 82 позитивних клонів.

Визначення нуклеотидних послідовностей кднк-вставок бібліотечних плазмід з відібраних позитивних клонів дріжджів. Всі кДНК-вставки бібліотечних плазмід позитивних клонів було секвеновано. Для ідентифікування кДНК вставок секвенованих клонів було проведено пошук гомологічних або ідентичних ДНК послідовностей за базою даних первинних послідовностей (GenBank) з використанням стандартної програми BLAST. Даний аналіз показав, що 82 виділені клони (серед яких 35 клонів є фальш-позитивами) кодують 24 білки.

Маланчук О.М. Ідентифікація білків - партнерів туберозно-склерозного комплексу TSC1/2 та характеристика виявлених взаємодій. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.03 - молекулярна біологія. - Інститут молекулярної біології та генетики НАН України, Київ, 2008.

Дисертацію присвячено ідентифікації білків-партнерів туберозно-склерозного комплексу TSC1/2 та характеристиці виявлених взаємодій в системі вищих евкаріотів. Методом двогібридної системи дріжджів ідентифіковано 10 TSC2-зв'язувальних білків, серед яких адапторні білки родини 14-3-3, білки протеасомного комплексу та серин/треонінова протеїнфосфатаза 5. Вперше отримано та охарактеризовано моноклональні антитіла проти TSC2. Специфічність утворення комплексу TSC2/РР5 доведено на моделі клітин ембріональних фібробластів мишей за допомогою методу реципрокної ко-імунопреципітації. Вперше показано, що ефективність взаємодії TSC2 з РР5 залежить від фізіологічного стану клітин, а саме: комплексоутворення TSC2/РР5 підсилюється в клітинах, що активно проліферують. Вперше показано здатність РР5 дефосфорилювати in vitro TSC2 за потенційними сайтами фосфорилювання АМРК. Запропоновано модель регуляції активності TSC2 шляхом РР5 опосередкованого дефосфорилювання.

Аннотация

Маланчук О.Н. Идентификация белков-партнеров туберозно-склерозного комплекса TSC1/2 и характеристика выявленых взаимодействий. - Рукопись.

Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.03 - молекулярная биология. - Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины, Киев, 2008.

Диссертация посвящена идентификации белков-партнёров туберозно-склерозного комплекса TSC1/2 и характеристике выявленых взаимодействий в системе высших эукариот. Методом двугибридной системы дрожжей идентифицировано 10 TSC2-связывающих белков, среди которых адапторные белки семейства 14-3-3, белки протеасомного комплекса и серин/треониновая протеинфосфатаза 5 (РР5). Впервые получены и охарактеризованы моноклональные антитела против TSC2. Специфичность образование комплекса TSC2/РР5 доказано на моделе клеток эмбриональных фибробластов мышей с помощью метода ко-иммунопреципитации. Впервые показано, что эфективность взаимодействия TSC2 с РР5 зависит от физиологического состояния клеток, а именно: комплексообразование TSC2/РР5 усиливается в активно пролиферирующих клетках. Впервые показано способность РР5 дефосфорилировать in vitro TSC2 по потенциальным сайтам фосфорилирования АМРК. Предложено модель регуляции активности TSC2 путём РР5 опосредованного дефосфориливания.

Summary

Malanchuk O.M. Identification of binding partners of tuberous sclerosis complex TSC1/2 and characterization of identified interaction. - Manuscript.

Thesis for Philosophy Doctor (PhD) degree in Biology, speciality 03.00.03 - molecular biology. - Institute of molecular biology and genetics NAS of Ukraine, Kyiv, 2008.

PI3-К/Akt/mTOR signaling pathway is implicated in signals transduction from mitogenic growth factors, nutrients, cellular energy levels and stress conditions to stimulate protein synthesis and cell growth. Recent progress in understanding the mechanisms of growth control indicates that the tuberous sclerosis complex TSC1/2 serves as a point of integration between growth-stimulatory and growth-suppressive signaling upstream of mTOR in this pathway.

Tsc1 and Tsc2 are tumour suppressor genes encoding hamartin and tuberin, respectively. Both proteins form a regulatory complex which has been implicated in pathogenesis of tuberous sclerosis, a neurological disorder connected with the development of hamartomas in a wide range of tissues. Both TSC1 and TSC2 have coiled-coil regions which mediate heterodimer formation. In contrast to TSC1 which has no known enzymatic activity, TSC2 possesses a C-terminal GAP domain for the small G

protein, Ras homologue enriched in brain (Rheb). Consistent with its function as a negative regulator of mTOR and its targets, the TSC complex has been found to regulate various cellular functions such as cell cycle progression, cell size control, cell survival, and apoptosis.

TSC2 is phosphorylated on multiple sites by various kinases, including PKB/Akt, RSK1, AMPK, ERK, and MK2 in response to various extracellular stimuli. For example, when cells are stimulated by growth factors or serum, the phosphophorylation of TSC2 by PKB/Akt at several sites is known to inhibit its cellular functions. On the other hand, AMP activated protein kinase (AMPK) is a cellular energy sensor and it plays an important role in the regulation of TSC2 activity. AMPK-mediated phosphorylation of TSC2 at Ser 1345 induces its GAP activity towards small GTPase Rheb, resulting in its inactivation. However, the identity of the phosphotase(s) catalyzing dephosphorylation of these sites is unknown.

The aim of this work was the search of novel functional interaction of TSC1/2 complex and elucidation of regulatory role of identified interactions in mammalian cells. In the course of this study, we have used Duplex-A^TM yeast two-hybrid system to identify novel binding proteins for TSC2. The C-terminal region of TSC2, which possesses GAP domain and regulatory sites of phosphorylation, was used as bait. In that study, we have isolated 82 cDNA positive clones which encoded for 24 proteins. Among the isolated clones, a number of known TSC2 binding partners were found (including different isoforms of 14.3.3) as well as several potentially novel interactors with various cellular functions. Notably, 20 clones contained sequences corresponding to Ser/Thr protein phosphatase 5.

Serine/threonine protein phosphatase 5 (PP5) has a unique feature in that it consists of a single polypeptide chain containing a phosphatase catalytic domain near its C-terminus and three tetratricopeptide repeat (TPR) domains at the N terminus. TPR domains mediate protein-protein interactions, and there is evidence that the TPR domain of PP5 targets the phosphatase to other proteins.

The specificity of interaction between the C-terminal TSC2 bait construct and isolated PP5 clones was further confirmed by mating assay. Sequence analysis of these clones indicated that 18 clones contained full length coding sequence of PP5, while the other two clones started 2 and 3 amino acid residues downstream of the start codon. These results clearly indicate that the N-terminal region of PP5, which possesses TPR regulatory domains, is possibly responsible for mediating the interaction with TSC2. Since the C-terminal region of TCS2 was used as a bait in the yeast two-hybrid screening, we can conclude that the TSC2/PP5 interaction is mediated through the C-terminal region of TCS2 and the N-terminal regulatory domain of PP5.

Taking into account that the function of TSC1/2 tumor suppressor complex is known to be regulated by multiple phosphorylation events mediated by various signaling pathways, we hypothesized that the interaction with PP5 may control the phosphorylation status of TSC2. To verify the identified interaction in mammalian cells, we used TSC2^+/+, p53^-/- mouse embryo fibroblasts, transiently transfected with pcDNA3.1/Myc-PP5 plasmid. Initially, we tested in Western blotting the expression of endogenous TSC2 and transiently overexpressed Myc-PP5 in MEFs. The results indicate clearly that MEFs

express high level of TSC2 and Myc-PP5. In the immunoprecipitation analysis of TSC2/PP5complex, we used D6 monoclonal antibodies which were developed using hybridoma technique and found to recognize specifically endogenous TSC2 in various immunological assays. As have been shown D6 mAb specifically immunoprecipitated TSC2 from exponentially growing MEFs and MEFs transiently transfected with pcDNA3.1/Myc-PP5. Furthermore, the immunoblotting of the TSC2 immune complexes with Myc-tag antibody clearly indicated that Myc-PP5 is efficiently co-immunoprecipitated with TSC2 in exponentially growing cells.

To explore a potential effect of PP5 on TSC2 phosphorylation status, we determine the phosphatase activity of PP5 towards TSC2 in vitro phosphorylated by AMPK.

In this analysis TSC2 was immunoprecipitated from exponently growing TSC2^+/+ p53^-/- MEFs and then phosphorylated in vitro by AMPK kinase. Then, pre-phosphorylated TSC2 was used as s substrate for PP5 in in vitro phosphatase assay. PP5 reproducibly dephosphorylated TSC2 at AMPK specific sites.

To summarize, data presented in this work indicate that TSC2 interacts with PP5 in vivo and efficiency of such interaction depends on physiological status of cells. In addition, PP5 is capable of dephosphorylating TSC2 in vitro at AMPK potential sites. Our data suggest that the physiological relevance of TSC2/PP5 interaction should be in reversing the stimulatory signaling mediated by AMPK on TSC2 activity. As the conclusion the hypothetic model of regulation of TSC2 activity by PP5 dephosphorylation has been proposed. Размещено на Allbest.ru