Розробка імунних біосенсорів для визначення нонілфенолу

Размещено на http://www.allbest.ru/

Національна академія наук України

Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна

НАН України

УДК 577.15:543.395:543.424

03.00.20 - біотехнологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

РОЗРОБКА ІМУННИХ БІОСЕНСОРІВ ДЛЯ ВИЗНАЧЕННЯ НОНІЛФЕНОЛУ

Гордієнко Анна Валеріївна

Київ - 2008

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Київському національному університеті імені Тараса Шевченка та в Інституті біохімії ім. О.В. Палладіна.

Науковий керівник- доктор біологічних наук, професор Стародуб Микола Федорович, Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, головний науковий співробітник.

Офіційні опоненти:

- доктор біологічних наук, професор Позур Володимир Костянтинович, Київський національний університет імені Тараса Шевченка, завідувач кафедри мікробіології та загальної імунології;

- кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник Грузіна Тамара Григорівна, Інститут біоколоїдної хімії ім. Ф.Д. Овчаренка НАН України, провідний науковий співробітник.

Захист відбудеться "19" травня 2008р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.240.01 в Інституті біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України (01601, м. Київ - 30, вул. Леонтовича, 9).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України (м. Київ, вул. Леонтовича, 9).

Автореферат розісланий "18" квітня 2008 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, кандидат біологічних наук Кірсенко О.В.

Анотація

Гордієнко А.В. розробка імунних біосенсорів для визначення нонілфенолу. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.20 - біотехнологія. Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, Київ, 2008.

Дисертація присвячена розробці імунних біосенсорів для визначення нонілфенолу (НФ) в розчинах. Розроблено, випробувано та запропоновано для практичного використання оптичні імунні біосенсори на основі поверхневого плазмонного резонансу (ППР), еліпсометрії повного внутрішнього відбиття (ЕПВВ) та імуносенсор на основі мікрокалориметра для експресного визначення НФ в розчинах.

Показана можливість визначення НФ за допомогою імуносенсора на основі ППР в "конкурентному" режимі аналізу (з мінімальною границею виявлення 5 нг/мл), "прямим" способом (межа виявлення складає 5 нг/мл за умови попередньої модифікації поверхні), а також способом "донасичення" (границя виявлення якого сягає 1 нг/мл). Час аналізу за допомогою ППР імунного біосенсора складає близько 10 хв. (за умови попередньої підготовки поверхні трансдюсера, включаючи іммобілізацію селективних чутливих структур). Pозроблено і запропоновано імунний біосенсор на основі ЕПВВ і показано, що з його допомогою можна виявляти НФ при концентрації 1,2 нг/мл. Розроблені варіанти імунних біосенсорів за чутливістю відповідають методу ELISA а деякі з них є більш чутливими. Разом з тим, на відміну від останнього вони є експресними, та не потребують використання мічених антитіл. Здійснена розробка інструментального аналітичного засобу - термічного біосенсора, який забезпечує визначення НФ з мінімальною границею виявлення 0,5 мкг/мл, а загальний час аналізу складає приблизно 20-30 хв. Незважаючи на більш низьку чутливість, термобіосенсор є портативним і більш простим у використанні ніж імуносенсори на основі ППР та ЕПВВ, а тому є більш придатним для експрес- аналізу НФ у польових умовах.

Ключові слова: нонілфенол, антисироватка, імуносенсор, поверхневий плазмонний резонанс (ППР), еліпсометрія повного внутрішнього відбиття (ЕПВВ), калориметричний біосенсор (термобіосенсор).

Гордиенко А.В. разработка иммунных биосенсоров для определения нонилфенола. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.20 - биотехнология. Институт биохимии им. А.В. Палладина НАН Украины, Киев, 2008.

Диссертационная работа посвящена разработке иммунных биосенсоров для определения нонилфенола (НФ) в растворах. Разработаны, испытаны и предложены к практическому применению оптические иммунные биосенсоры на основе поверхностного плазмонного резонанса (ППР), эллипсометрии полного внутреннего отражения (ЭПВО) и иммунный биосенсор на основе микрокалориметра для экспрессного определения НФ в растворах.

Показана возможность определения НФ c помощью иммуносенсора на основе ППР в "конкурентном" режиме анализа (с минимальной границей обнаружения 5 нг/мл), "прямым" способом (граница обнаружения составляет 5 нг/мл при условии предварительной модификации поверхности), а также способом "донасыщения" (граница обнаружения достигает 1 нг/мл). Время анализа с помощью ППР иммуносенсора составляет около 10 мин. (при условии предварительной подготовки поверхности трансдюсера, включая иммобилизацию чувствительных компонентов). Разработан и предложен иммунный биосенсор, основанный на ЭПВО, и показано, что он позволяет определять НФ в концентрации до 1,2 нг/мл. Разработанные варианты иммунных биосенсоров по чувствительности соответствуют методу ELISА а некоторые даже превышают ее. Однако, в отличие от последнего они являются экспрессными и не требуют применения меченных антител. Осуществлена разработка инструментального аналитического прибора - термического биосенсора, обеспечивающего определение НФ с минимальной границей обнаружения 0,5 мкг/мл, а общее время анализа составляет приблизительно 20-30 мин. Несмотря на более низкую чувствительность, термобиосенсор является портативным и более простым в использовании, чем биосенсоры на основе ППР и ЭПВО, а, следовательно, более приемлемым для экспресс- анализа НФ в полевых условиях.

Ключевые слова: нонилфенол, антисыворотка, иммуносенсор, поверхностный плазмонный резонанс (ППР), эллипсометрия полного внутреннего отражения (ЭПВО), калориметрический биосенсор (термобиосенсор).

Gordiienko A.V. Development of immune biosensors for detecting nonylphenol. - Manuscript.

Thesis for the scientific degree of Candidate of Biological Sciences by speciality 03.00.20 - biotechnology. O.V. Palladin Institute of Biochemistry, National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2008.

The thesis is devoted to the development of immune biosensors for detecting nonylphenol (NPh) in solutions. Optical biosensors based on the Surface Plasmon Resonance (SPR) and Total Internal Reflection Ellipsometry (TIRE) and thermal biosensor were developed, tested and recommended for express analysis of NPh in solutions.

There is considerable concern about the increasing incidence of endocrine-related cancers deteriorating reproductive health in humans and wildlife. Great numbers of natural and man-made chemicals have the ability to mimic the action of the endogenous steroid hormone 17в-estradiol by binding to and activating the nuclear estrogen receptor. NPh and short chain NPh ethoxylates also have oestrogenic activity. They can induce a dysfunction in humans and wildlife by mimicking the effect of the estrogenic hormones and can lead to feminization of males.

Unfortunately, there are no rapid methods for simple, specific and short detection of NPh in the environment. This drawback can be overcome with the use of modern instrumental analytical devices based on biosensor technology. In this respect biosensors, which utilize an optical effects of the SPR and TIRE or which are able to register the heat generated by the antigen-antibody interactions can provide direct, simple and sensitive analysis of small molecules, seem to be very promising for the detection of NPh.

The main goal of the research was the development of optical and thermal immune biosensors for highly sensitive and specific determination of NPh. So, the created immune biosensor based on the SPR for the NPh determination provides the analysis fulfilment in "competitive" regime with the detection limit on the level of about 5 ng/ml and working range - up to 1 mkg/ml. The developed algorithm of `'up to saturation'' allows detecting NPh with the detection limit of about 1 ng/ml and working controlled concentrations - 1-1000 ng/ml. It was shown the opportunity of "direct" determination of NPh with the detection limit of about 5 ng/ml (in case of the surface modification with dodecanthyol and simultaneous creation of intermediate layer with protein A from Staphylococcus aureus for the orientation of active sites of specific antibodies toward the solution). The time of analysis by immune SPR biosensor is about 10 min (at the previously prepared transducer surface, including immobilization of sensitive structures).

The method of TIRE, which was recently proposed as a combination of spectroscopic ellipsometry and SPR light coupling configuration, was exploited in this work for detection of NPh. This method showed great potential for bio-sensing as a very sensitive optical analytical technique. As a result of the ellipsometry restrictions in the simultaneous evaluation of the thickness and refractive index of thin transparent films, it was assumed that the refractive indices of all organic (bio-organic) layers are the same and equal to 1.42 at 633 nm, so that all changes in the adsorption layer are associated with the thickness. The main changes in the film thickness occur at the concentrations of NPh in the range of 20 - 200 ng/ml. The saturation of the response is observed at the concentrations of NPh higher than 200 ng/ml, which is most likely due to the saturation of antibodies binding sites. The combination of TIRE with direct immune assay approach, i.e. specific binding of NPh molecules to immobilised antibodies, allowed the registration of NPh in low concentrations down to 1,2 ng/ml. The value of d = 23 nm at saturation is much larger than the length of NPh molecule of 1.5 nm. This implies the mechanism of binding of large aggregates (micelles) of amphiphilic molecules of nonylphenol formed in aqueous solutions.

The thermal biosensor was fabricated in the Palladin Institute of Biochemistry and the Institute of Electrodynamics of the National Academy of Sciences of Ukraine. This thermal biosensor system is based on a biothermal transducer. Going into agency effect for him it is the response of the investigated component with specific reagent. Specific interaction between an antigen and antibody leads to temperature changes (about 80 kJ/mol) of the test mixture. These changes can be converted to electrical quantity by thermionic transducer (for example, the thermistor). The developed thermal biosensor provides direct detection of NPh with the detection limit of about 0,5 µg/ml and the overall time of analysis of about 20-30 min. In spite of a lower sensitivity of thermal biosensor, it is portable and simpler in use than biosensors based on SPR or TIRE and, consequently, the thermal biosensor is more applicable for express analysis in the field conditions.

Keywords: nonylphenol, antiserum, immune biosensor, Surface Plasmon Resonance (SPR), Total Internal Reflection Ellipsometry (TIRE), thermal biosensor.

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Велика кількість промислових хімічних речовин є забруднювачами оточуючого середовища і впливають на здоров'я людини шляхом порушення нормального функціонування ендокринної системи. Такі речовини називають ендокринними руйнівниками, до яких входять і деякі алкілфеноли, в тому числі і нонілфенол (НФ). Мішенню цих речовин є клітинні рецептори стероїдних гормонів, через які відбувається регуляція процесів розмноження і розвитку. Показанa здатність НФ до ендокринних впливів на організм водних тварин, птахів та ссавців. Він відомий як надзвичайно розповсюджений забруднювач промислових водних середовищ. Його знаходять в придонних, поверхневих та ґрунтових водах, а також в осадових породах, на полях, у продуктах харчування (навіть у дитячому харчуванні). Тестування ряду продуктів показало, що найбільша кількість НФ знаходилась у яблуках та томатах [Guenther, 2002, Tchounwou, 2004]. Цей факт пояснювався застосуванням пестицидів на основі нонілфенолетоксилатів, розпад яких міг призводити до накопичення НФ у зазначених вище фруктах та овочах. Концентрація останнього в загальновживаних продуктах варіювала від 0,1 до 19,4 мкг/кг, а у продуктах дитячого харчування - від 0,2 до 4,0 мкг/кг.

Загальноприйняті методи визначення НФ є занадто дорогими і довготривалими, щоб сформувати базу для створення програм із нагляду за екологічною ситуацією при аналізі великої кількості зразків. Необхідність у швидких, недорогих, надійних і чутливих методах для моніторингу забруднюючих речовин у мікрокількостях і, зокрема НФ, у воді та для визначення токсичності відходів, що потрапляють у довкілля, вимагає створення альтернативних інструментальних аналітичних засобів, що може бути успішно досягнуто, використовуючи принципи біосенсорики. На даний момент є ряд повідомлень про розробку біосенсорів для визначення НФ. Описано імунний біосенсор на основі поверхневого плазмонного резонансу (ППР) (з використанням стаціонарного приладу "Biocore") [Samsonova, 2004], який дозволяє реєструвати НФ способом "конкуренції" при мінімальній концентрації в межах 2-5 нг/мл. Також є відомості щодо ППР біосенсора, в якому селективним елементом був естрогеновий рецептор [Usami, 2002]. Повідомляється також про створення амперометричного імунного біосенсора, який забезпечує мінімальний рівень виявлення НФ близько 10 нг/мл, але він потребує використання мічених антитіл і спеціальних високоефективних барвників [Evtugyn, 2006]. Описано імуносенсор на основі п'єзокристалів, нижня межа детекції НФ якого була на рівні 0,8 нг/мл [Ermolaeva, 2006]. Проте слід зазначити, що всі ці методи є відносно складними, оскільки вимагають здійснення ряду етапів аналізу, залучення висококваліфікованих фахівців, використання додаткових реактивів та є досить коштовними. Отже, розробка більш простих та дешевих, але досить чутливих інструментальних засобів, придатних для визначення НФ, як в стаціонарних, так і в польових умовах, є актуальним завданням сьогодення.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана на кафедрі біохімії Київського національного університету імені Тараса Шевченка та у відділі молекулярної біології Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна і пов'язана з науковими програмами та планами інституту, а саме: 1. "Пошук шляхів створення біологічних сенсорів для оцінки загальної токсичності та наявності окремих токсикантів в навколишньому середовищі", державна реєстрація №0102V000630. 2. "Пошук шляхів біосенсорного контролю наявності в довкіллі низькомолекулярних деструкторів ендокринної системи", державна реєстрація №0107V007202.

Мета і завдання дослідження. З огляду на викладене вище метою даної роботи була розробка методів імунного аналізу НФ на основі імуноферментного аналізу (ІФА) та принципів біосенсорики. Для досягнення мети були поставлені наступні завдання:

- оптимізувати імуноферментну тест-систему для детекції НФ;

- дослідити ефективність різних алгоритмів кількісного визначення НФ за допомогою імуносенсора на основі ППР, а саме, з виконанням "прямого" і "конкурентного" аналізів та способу "донасичення";

- визначити оптимальні варіанти модифікації поверхні трансдюсера для підвищення чутливості і стабільності відгуку імунного біосенсора на основі ППР;

- відпрацювати методику визначення НФ за допомогою еліпсометрії повного внутрішнього відбиття (ЕПВВ);

- оцінити ефективність використання імунного термобіосенсора для контролю рівня НФ в розчинах та відпрацювати оптимальний алгоритм його аналізу за допомогою цього біосенсора.

Наукова новизна одержаних результатів. Розроблено і запропоновано метод визначення НФ в розчинах за допомогою оптичного імунного біосенсора на основі ППР та вивчено основні аналітичні характеристики розробленого біосенсора. Вперше запропоновано ряд алгоритмів кількісного визначення НФ за допомогою ППР імуносенсора, а саме з виконанням "прямого" і "конкурентного" аналізів та способу "донасичення" і досліджено ефективність їх використання. Відпрацьовано оптимальний варіант модифікації поверхні трансдюсера для підвищення чутливості і стабільності відгуку імунного біосенсора на основі ППР. Вперше запропоновано методики визначення НФ у розчинах за допомогою ЕПВВ і термобіосенсора та відпрацьовано оптимальні алгоритми виконання аналізу за допомогою цих біосенсорів.

Практичне значення одержаних результатів. Розроблені методи визначення НФ у розчинах за допомогою ППР та ЕПВВ імунних біосенсорів можуть бути рекомендовані для впровадження в практику з метою високочутливого та експресного визначення кількості НФ у водоймах, воді очисних споруд, в продуктах харчування і т.д. Зазначені вище методи можуть бути використані в лабораторних умовах. Термобіосенсор, незважаючи на його меншу чутливість, є портативним та більш простим у використанні ніж імунні біосенсори на основі ППР та ЕПВВ, а отже є більш придатним до застосування у польових умовах.

Особистий внесок. Дисертація є самостійною роботою автора, окрім розділу 3.3. (експериментальний матеріал, наведений в розділі було отримано у співробітництві з д.б.н. Набоком А.В. (університет Халам м. Шефілда, Англія), з яким автор має спільні публікації). Головну ідею роботи та напрям досліджень було запропоновано науковим керівником, а її практичне втілення належить здобувачеві. Автором дисертаційної роботи здійснено аналіз літератури, проведено біохімічні дослідження, статистичну обробку даних, підготовлено до публікації статті за матеріалами отриманих результатів. Разом із керівником здійснювалося представлення експериментального матеріалу на наукових семінарах та конференціях. Аналіз результатів, узагальнення їх, інтерпретацію та формулювання основних положень і висновків, написання та подання статей до друку проведено також спільно з науковим керівником. Кон'югати НФ з білками були синтезовані в Інституті біохімії ім. А.Н. Баха РАН, а специфічні антисироватки були отримані і попередньо охарактеризовані в Інституті біоорганічної хімії НАН Республіки Білорусь.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень, які викладено в дисертації, були представлені на таких міжнародних наукових конференціях: 84 ICB Seminar Biochemical sensing - utilisation of micro- and nanotechnologies, Warsaw, 2005; International Conference Biosensing and Biodynamics: From Basics to Applications, Bucharest (Romania), 2006; Международная молодежная конференция "Биология - наука ХХI века", Пущино, 2006; IX Український біохімічний з'їзд, Харків, 2006; Ukrainian - German Symposium on Nanobiotechnology, Kyiv, 2006; Міжнародна наукова конференція "Молодь та поступ біології", Львів, 2007.

Публікації. За матеріалами дисертаційної роботи опубліковано 6 статей у фахових виданнях та 6 тез доповідей.

Структура та обсяг роботи. Дисертаційна робота викладена на 121 сторінці друкованого тексту і складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів досліджень, викладення результатів та їх обговорення, висновків та списку літератури, що містить 243 посилання. Робота містить 26 рисунків та 3 таблиці.

Основний зміст

Огляд літератури

Огляд літератури складається із трьох розділів. У першому розділі наведено загальну характеристику НФ та механізми його впливу на живі організми на клітинному рівні, а також розглянуто існуючі на даний момент методи його визначення. Другий розділ присвячено опису основних типів біосенсорів та їх застосування. У третьому розділі розглянуто основні методи функціоналізації поверхонь біосенсорів за допомогою органічних і неорганічних компонентів, а також методи іммобілізації біологічних молекул на ці поверхні.

Матеріали та методи досліджень

Матеріали. В роботі використовували: НФ (виробництва фірми "Sigma-Aldrich"), кон'югати НФ з білками, що були синтезовані на базі Інституту біохімії ім. А.Н. Баха РАН та специфічні антисироватки, отримані в Інституті біоорганічної хімії НАН Республіки Білорусь.

Оптичний імуносенсор, оснований на явищі ППР. Дослідження виконувались на приладі Плазмон-Sрr-4M, розробленому в Інституті фізики напівпровідників НАН України. Спектроскопія ППР проводилась в конфігурації Кретчмана з використанням He-Ne лазера з = 632,8 нм як джерела світла, гоніометра Г-5М, скляної призми та фотодіоду (ФД 263). Золоту плівку товщиною 45 нм наносили на поверхню скляної пластинки термічним випарюванням у вакуумі. Для забезпечення міцної адгезії між металом та склом спочатку напилювали тонкий шар хрому (товщиною 1-3 нм). Для забезпечення оптичного контакту між призмою і металевою плівкою, нанесеною на скляну поверхню, використовували імерсійну рідину (з коефіцієнтом заломлення n = 1,62). Іммобілізація на поверхні біологічного матеріалу та виникнення з ним специфічних взаємодій супроводжується зміною резонансного кута.

Метод ЕПВВ. Дослідження методом ЕПВВ виконані на базі Університету Халам м. Шефілда (Англія) за допомогою спектроскопічного ротаційного аналізатора M-2000V, Компанії J.A. Woollam, який працює в межах 370-1000 нм хвильового діапазону. У складі приладу є трапецієподібна скляна призма з робочим кутом 680 (BK7, n = 1.515), на якій за допомогою імерсійної рідини фіксується скляна пластинка з шарами хрому (товщиною 3-5 нм) та золота (25-30 нм). Призма забезпечує умови повного внутрішнього відбиття між склом і водними розчинами (n = 1.33). Поляризований промінь потрапляє до зразка через призму; відображений промінь після проходження через інший поляризуючий елемент (аналізатор) потрапляє до фотодетектора.

В результаті проведення еліпсометричних вимірювань отримують еліпсометричні кути Ш та Д, які відповідають амплітуді співвідношення

та зсуву фази

Д= ?p ??s

між p- і s-компонентами поляризованого світла, де р - площина падіння поляризованого світла, s- площина субстрату. Відомо, що для тонких (менше 10 нм) діелектричних покриттів на рефлективних поверхнях, зміни і індексу заломлення, і товщини більше впливають на значення величини Д, тоді як значення Ш практично не змінюється. Це і обумовило вибір Д(л) спектра для дослідження специфічного зв'язування НФ.

Калориметричний біосенсор. Прилад було розроблено у співпраці Інституту біохімії ім О.В. Палладіна та Інституту електродинаміки НАН України. Як інформативний параметр використано сконцентрований тепловий потік з реакторної кювети, що перетворювався в електричний сигнал диференціальною парою термісторів. Калориметрична комірка являє собою трьохшаровий пасивний термостат, усередині якого встановлено реакторний пристрій. Цей пристрій складається з циліндричної кювети, в яку поміщають реагент, що аналізує (реагент 2) і мікрошприц, що містить пробу досліджуваної речовини (реагент 1). Між дном реакторної кювети і дном стакану розміщуються два пласких термістора, відокремлені один від одного, а також від кювети і стакану прокладками з відносно невеликим тепловим опором. Ці прокладки і сенсори утворюють між реактором і внутрішнім стаканом теплопровідну перемичку.

Принцип дії калориметричної вимірювальної комірки полягає в наступному. За допомогою багатошарового пасивного термостата створюється однорідне теплове поле на внутрішній поверхні внутрішнього металевого стакану. Якщо температура в реакторі відрізняється від температури внутрішнього стакану, між ними виникає тепловий потік, основна частина якого протікає через перемичку, що проводить тепло. Величина теплового потоку пропорційна різниці температур (?Т) між дном реакторної кювети і дном склянки.

Результати модельних експериментів показують, що досягнуті чутливість і стабільність вимірювального каналу забезпечують вимоги по розрізнювальній здатності термобіосенсорної системи на рівні (1 - 2)·10-3 К, що дозволяє використовувати її для біохімічного аналізу.

Результати та їх обговорення

Визначення НФ за допомогою методу ELISA. Для детекції НФ було обрано "конкурентний" варіант постановки методу ELISA з використанням других ("антивидових") мічених антитіл. В процесі оптимізації протоколу постановки цього варіанту методу ELISA визначено, що оптимальна концентрація антигену - НФ-ОВА на стадії адсорбції складає 5 мкг/мл, тривалість імунохімічної реакції - 60 хвилин, робоче розведення антисироватки - 1:7000. Критерієм оптимізації була максимальна чутливість визначення НФ за умови, що прийнятна точність аналізу зберігається (остання вимога означала, що рівень реєстрованого оптичного поглинання за відсутності конкуруючого антигену був не менше 0,5 од.).

Порівняння калібрувальних кривих "конкурентного" варіанту методу ELISA, отриманих для різних сполучень антисироваток (проти НФ-СІТ і НФ-БСА) і іммобілізованих антигенів (НФ-ОВА, НФ-СІТ і НФ-БСА) дозволило вважати, що оптимальною парою для детекції НФ є антисироватка, отримана проти НФ-БСА, та іммобілізований антиген НФ-ОВА. За її допомогою вдається досягти межі виявлення НФ на рівні 20 нг/мл з робочим діапазоном обумовлених концентрацій 50-1000 нг/мл. Тривалість аналізу складає близько 4 годин.

Розробка оптичного імуносенсора для визначення НФ, основаного на явищі ППР. Для успішної розробки імунного біосенсора, призначеного для визначення НФ, необхідно було, насамперед, встановити робочі концентрації компонентів, що приймають участь у специфічній реакції. Для іммобілізації кон'югатів типу НФ-СІТ та НФ-ОВА на поверхні трансдюсера була обрана концентрація в 500 мкг/мл. Робоча концентрація антисироваток була обрана як концентрація по білку 10 мг/мл. В результаті проведення ряду експериментів встановлено, що оптимальною парою для імунобіосенсорних досліджень є пара НФ-СІТ і антисироватка, отримана на кон'югат НФ-БСА.

Визначення НФ в розчинах за допомогою ППР біосенсора в "конкурентному" режимі аналізу. Далі було встановлено можливість,,конкурентного'' визначення НФ за допомогою ППР імунного біосенсора і побудовано відповідні калібрувальні криві. Для цього спочатку проводили іммобілізацію НФ-СІТ і,,блокування'' вільних місць, що залишились на поверхні трансдюсера. Потім вносили суміш антисироватки (у концентрації 10 мг/мл) і чистого НФ (у 30% розчині етилового спирту) у діапазоні концентрацій від 0,1 нг/мл до 1000 нг/мл у співвідношенні 1:1.Час інкубації для кожної проби становив 10 хвилин. Кожного разу комірку промивали трис-HCl буфером, що містив 0,05 % Tвін-20, для видалення незв'язаних компонентів. Після цього реєстрували відгук імунного сенсора. Таким чином, було показано, що використовуючи ППР біосенсор можна проводити визначення НФ у,,конкурентному" режимі аналізу з межею виявлення 5 нг/мл і робочим діапазоном концентрацій в межах 5-1000 нг/мл (рис 3).

Слід відмітити, що чутливість імунного біосенсора виявилась навіть трохи вище традиційного методу ELISA, а час аналізу складає не більше 10 хв. (за умови попередньої іммобілізації на поверхні трансдюсера кон'югатів НФ з білками), що набагато менше ніж у випадку традиційного методу ELISA. Крім того, визначення НФ за допомогою імунного біосенсора не потребує використання "антивидових" антитіл, мічених ПХ.

Визначення НФ в розчинах за допомогою ППР імунного біосенсора в режимі аналізу "донасичення". Для цього спочатку проводили іммобілізацію кон'югату НФ-СІТ і заповнення вільних місць зв'язування на поверхні біосенсора, а потім вносили суміш специфічної антисироватки (у концентрації 10 мг/мл) і НФ (у 30% спиртовому розчині) у діапазоні концентрацій від 0,1 нг/мл до 1000 нг/мл у співвідношенні 1:1. Останнім етапом було "донасичення" іммобілізованого НФ, що не вступив в імунну реакцію, шляхом внесення антисироватки в концентрації 10 мг/мл. При цьому спостерігався зсув резонансного кута, величина якого була пропорційна концентрації вільного НФ в розчині.

Таким чином, в результаті проведення ряду експериментів була показана можливість визначення концентрації НФ описаним способом з межею виявлення 1 нг/мл і робочим діапазоном 1-1000 нг/мл.

Дослідження впливу модифікації поверхні ППР біосенсора на його чутливість та стабільність відгуку. Поверхню біосенсора було модифіковано за допомогою поліелектролітів (поліаліламін гідрохлориду (ПАА) та полістірен сульфонату (ПСС)) і додекантіолу. Було показано, що у випадку визначення НФ у "конкурентному" режимі аналізу, чи в режимі "донасичення" за допомогою ППР імунного біосенсора модифікація поверхні трансдюсера за допомогою поліелектролітів (ПАА/ПСС/ПАА) призводила до стабілізації відгуку біосенсора, що можна пояснити формуванням суцільних шарів кон'югату НФ-СІТ з оптимальною постійною щільністю. Слід зазначити, що на чутливість аналізу така модифікація не впливає.

Функціоналізація поверхні трансдюсера за допомогою додекантіолу теж сприяла отриманню стабільних результатів, проте призводила до зменшення величини відгуку біосенсора. Створення на поверхні трансдюсера додаткових шарів ПАА/ПСС мало негативний вплив на процес іммобілізації кон'югату НФ-СІТ (що пояснюється наявністю на поверхні трансдюсера і кон'югату однойменно заряджених зон).

Розробка "прямого" варіанту визначення НФ в розчинах за допомогою ППР імуносенсора та відпрацювання оптимальних способів модифікації поверхні трансдюсера. Для варіанту "прямого" визначення НФ на поверхню трансдюсера біосенсора спочатку іммобілізували антисироватку і витримували протягом 20 хв., і проводили заповнення "вільних" місць зв'язування за допомогою 1%-го розчину желатину, після чого у вимірювальну комірку вносили розчини НФ (у 30% спиртовому розчині) в діапазоні концентрацій від 0,1 до 2000 нг/мл і будували калібрувальну криву.

Таким чином, було показано принципову можливість безпосереднього ("прямого") визначення НФ з межею виявлення 80 нг/мл.

Цей спосіб постановки аналізу є досить простим у виконанні, проте не є достатньо чутливим. Тому для покращення чутливості і стабільності результатів було проведено ряд досліджень щодо модифікації поверхні трансдюсера біосенсора (було застосовано модифікацію за допомогою поліелектролітів, додекантіолу та сульфату декстрану і глутарового альдегіду).

Так, було встановлено, що при визначенні НФ "прямим" способом ефективна товщина шару іммобілізованих імунних компонентів, а також сформованого специфічного імунного комплексу на золотій поверхні ППР суттєво збільшується в ряду: їх пряма фізична сорбція на золотій поверхні > з проміжним шаром поліелектролітів і білку А зі Staphylococcus aureus, який попередньо був іммобілізований на тому ж шарі > іммобілізація за участю білку А на поверхні, що була попередньо модифікована за допомогою додекантіолу.

Отже, рекомендованою є модифікація поверхні ППР біосенсора за допомогою додекантіолу і орієнтації антитіл за допомогою білку А, оскільки метод є досить простим і водночас чутливим (межа виявлення становить 5 нг/мл).

Крім того, було проведено визначення впливу стану поверхні трансдюсера ППР імунного біосенсора на стабільність його відгуку при "прямому" варіанті постановки аналізу НФ в розчинах шляхом порівняння відгуків біосенсора на внесення однакових концентрацій НФ (дані наведено в табл.1)

Таблиця 1. Відгуки імунного біосенсора (кут. хв.) на внесення різних концентрацій НФ за умови застосування різних способів модифікації поверхні трансдюсера в разі постановки "прямого" варіанту аналізу

Виявилось, що найбільш стабільні результати відповідали модифікації поверхні трансдюсера додекантіолом, отже рекомендованим є саме цей спосіб модифікації.

Розробка методу визначення НФ за допомогою ЕПВВ. Зразки для досліджень за допомогою ЕПВВ готували шляхом напилювання 3-5 нм шару хрому на скляні пластинки з наступним напилюванням (25-30 нм) золота. Досліджувані біологічні зразки іммобілізували на золотій поверхні пластинки. Усі етапи іммобілізації та обробки поверхні виконувались в кюветі, через яку пропускали відповідні розчини у наступній послідовності: ПАА (у концентрації 2 мг/мл), білок А (у концентрації 0,02 мг/мл), антисироватка (у концентрації 0,1 мг/мл), НФ (в діапазоні концентрацій від 1,2 нг/мл до 1 мкг/мл).

Просте моделювання зміни значень Д та Ш у відповідь на зміни товщини і індексу заломлення прозорого покриття на Cr/Au поверхні при постійній довжині хвилі 633 нм демонструє набагато вищу чутливість (у 7-15 разів) параметра Д в порівнянні з Ш. Ці обчислення виправдовують вибір в нашій роботі Д(л) спектра для дослідження специфічного зв'язування НФ.

Одночасна оцінка товщини і коефіцієнта заломлення тонких прозорих плівок практично неможлива для еліпсометрії, оскільки коефіцієнти всіх органічних і біоорганічних сполук ідентичні і рівні 1,42 при 633 нм, так що всі зміни в іммобілізованих шарах залежать від зміни товщини.

Найбільші зміни товщини плівки спостерігались при внесенні НФ в діапазоні концентрацій 20 - 200 нг/мл. Вихід кривої на плато спостерігався за концентрацій НФ вище, ніж 200 нг/мл, що якнайкраще відповідає насиченню сайтів зв'язування на антитілах.

Мінімальна зареєстрована концентрація НФ складала 1,2 нг/мл, робочий діапазон 20-200 нг/мл. Значення d = 23 нм при насиченні є набагато більшим, ніж довжина молекули НФ 1,5 нм. В даному випадку мається на увазі механізм зв'язування великих агрегатів (міцел) амфіфільних молекул НФ, сформованих у водних розчинах.

Розробка імунного термобіосенсора для визначення НФ в розчинах. Відомо, що взаємодія антигенів з антитілами супроводжується виділенням тепла. Так, наприклад, для реакції антидинітрофенільних антитіл з динітрофенільним гаптеном величина ?Н становить 73,5 кДж/моль, а в разі взаємодії імуноглобулінів, що продукуються плазмоцитомами МОРС 315 і 460 миші, з ди- та тринітрофенільними групами - в діапазоні від 84 до 50,4 кДж/моль [Кульберг,1985]. Це дає можливість безпосередньої реєстрації взаємодії антиген - антитіло за допомогою термобіосенсора, що і було запропоновано в нашій роботі.

Експериментальні дослідження термобіосенсорного комплексу. Перш за все необхідно було встановити, що калориметричний біосенсор фіксує виділення тепла, що утворюється саме в результаті специфічної реакції між гаптеном та антитілом. Для цього у вимірювальну комірку вносили 150 мкл антисироватки в концентрації 10 мг/мл і витримували її протягом 15 хвилин для одержання базової лінії (за цей час температура в комірці встановлювалась на певному рівні). Потім до комірки вносили 50 мкл розчину ОВА в концентрації 1 мкг/мл чи 50 мкл розчину НФ (1 мкг/мл). Таким чином, було показано, що відгук біосенсора (зміни температури) спостерігався лише в результаті специфічної взаємодії між НФ і специфічними антитілами.

Визначення НФ за допомогою термобіосенсорної комірки. Для успішної розробки калориметричного біосенсора спочатку необхідно було встановити робочу концентрацію антисироватки, отриманої проти НФ-БСА. Для цього у вимірювальну комірку вносили 150 мкл антисироватки в різних концентраціях і витримували їх протягом 15 хв. для встановлення базової лінії. Потім до комірки вносили 50 мкл розчину НФ в діапазоні концентрацій від 0,1 до 10 мкг/мл і фіксували покази приладу. Всі зазначені розчини містили 30% етилового спирту. Як робочу концентрацію антисироватки було обрано концентрацію 10 мг білку в 1 мл.

Для визначення НФ в розчинах за допомогою термобіосенсора необхідно було побудувати відповідну калібрувальну криву. З цією метою використовували лінію 3. Так, було продемонстровано можливість визначення НФ за допомогою калориметричного біосенсора при постановці "прямого" варіанту аналізу з межею виявлення 0,5 мкг/мл. Отже метод детекції НФ за допомогою термобіосенсора є менш чутливим у порівнянні з розглянутими вище методом ELISA, а також методами аналізу за допомогою ППР імуносенсора та ЕПВВ. Проте методика визначення за допомогою термобіосенсора є набагато простішою для виконання, дослідження можна проводити в реальному режимі часу, а сам прилад є портативним. Отже він може бути запропонований для проведення експрес- аналізу у польових умовах.

Висновки

імуносенсор нонілфенол мікрокалориметр еліпсометрія

1. Нонілфенол відомий як надзвичайно розповсюджений забруднювач навколишнього середовища. Окрім високої токсичності він володіє і естроген-подібною активністю. Проте загальноприйняті методи визначення нонілфенолу є відносно складними і дорогими. Розроблено, досліджено та запропоновано для практичного використання оптичні імунні біосенсори на основі поверхневого плазмонного резонансу і еліпсометрії повного внутрішнього відбиття, а також термічний імуносенсор для експресного визначення нонілфенолу в розчинах.

2. Відпрацьовано варіант "конкурентного" методу ELISA з мінімальним рівнем виявлення нонілфенолу на рівні 20 нг/мл і робочим діапазоном обумовлених концентрацій 50-1000 нг/мл.

3. Показано, що, використовуючи імунний біосенсор на основі поверхневого плазмонного резонансу, можна проводити визначення нонілфенолу при постановці "прямого" варіанту аналізу з межею виявлення 80 нг/мл і робочим діапазоном концентрацій в межах 100-2000 нг/мл. Продемонстрована можливість визначення концентрації нонілфенолу імунним біосенсором на основі поверхневого плазмонного резонансу в режимі,,конкурентного'' аналізу з межею виявлення 5 нг/мл і робочим діапазоном концентрацій 5-1000 нг/мл. При виконанні аналізу в режимі,,донасичення'' межа виявлення складає 1 нг/мл, а робочий діапазон імунного біосенсора лежить в діапазоні 1-1000 нг/мл.

4. Встановлено, що при "прямому" варіанті аналізу нонілфенолу за допомогою імунного біосенсора на основі поверхневого плазмонного резонансу покращується стабільність його відгуку та чутливість, а межа виявлення становить 5 нг/мл при попередній модифікації поверхні трансдюсера за допомогою додекантіолу та білку А із Staphylococcus aureus. В режимі,,конкурентного'' аналізу або в режимі,,донасичення'' жодна із запропонованих модифікацій не призводила до підвищення їх чутливості. Створення поліелектролітних додаткових шарів на поверхні біосенсора сприяло отриманню більш стабільних результатів, ніж у випадку проведення аналізу на немодифікованій поверхні.

5. Відпрацьовано методику детекції нонілфенолу за допомогою імунного біосенсора на основі еліпсометрії повного внутрішнього відбиття та продемонстровано, що межа виявлення складає 1,2 нг/мл.

6. Показана принципова можливість визначення нонілфенолу в розчинах за допомогою термобіосенсора на основі диференціації теплового потоку з межею виявлення 0,5 мкг/мл.

7. Таким чином, розроблені варіанти імунних біосенсорів для визначення нонілфенолу на основі поверхневого плазмонного резонансу та еліпсометрії повного внутрішнього відбиття можуть бути рекомендовані для використання в лабораторних умовах. Тоді як термобіосенсор, незважаючи на його меншу чутливість, є портативним та більш простим у використанні ніж інші варіанти розроблених імуносенсорів, а тому є придатним для проведення експрес-аналізу у польових умовах.

Список робіт за темою дисертації

1. Стародуб Н.Ф, Пивень Н.В., Демченко (Гордиенко) А.В., Гончарик А.В., Орлова Е.Е., Бураковский А.И., Мартьянов А.А., Жердев А.В., Дзантиев Б.Б. Иммуно-ферментный анализ неионных поверхностно активных веществ в воде // Укр. біохім. журн. - 2005. -Т. 77, №6. - С. 116-121.

2. Стародуб Н.Ф., Демченко (Гордиенко) А.В., Пивень Н.В., Гончарик А.В.,Орлова Е.Е., Бураковский А.И., Мартьянов А.А., Жердев А.В., Дзантиев Б.Б. Разработка новых методов контроля качества воды// Химия и технол. воды. - 2005. - Т. 27, №6. - C. 591-599.

3. Starodub N.F., Pirogova L.V., Demchenko (Gordiienko) A., Nabok A.V. Antibody Immobilisation on the Metal and Silicon Surfaces. The Use of Self-Assembled Layers and Specific Receptors// Bioelectrochem. - 2005. - Vol 66, № 1-2. - Р. 111-115.

4. Демченко (Гордієнко) А.В., Стародуб М.Ф., Модифікація поверхні імунного біосенсора на основі поверхневого плазмонного резонансу при аналізі нонілфенолу// Біополімери і клітина. - 2007. - Т. 23, №2. - С. 143-147.

5. Nabok A., Tsargorodskaya A., Holloway A., Starodub N.F., Demchenko (Gordiienko) A. Specific binding of large aggregates of amphiphilic molecules to the respective antibodies// Langmuir. - 2007. - Vol. 23, №16. - P. 8485-8490.

6. Demchenko (Gordiienko) A.V., Mel'nik V.G., Starodub N.F. Thermal biosensor for detecting nonylphenol in the environment// Укр. біохім. журн. - 2007. - Т.79, №5.- С. - 212-315.

7. Starodub N.F., Nabok A.V., Tsargorodskaya A., Kukla O.V., Demchenko (Gordiienko) A.V., Gojster O., Kanjuk M.I. Optical And Electrochemical Biosensors For Express Control Of Drinking Water, Food And Feed Quality// International Conference Biosensing and Biodynamics: From Basics to Applications. - Bucharest (Romania), 2006. - P. 17-18.

8. Starodub N.F., Nabok A.V., Tsargorodskaya A., Demchenko (Gordiienko) A.V., GojsterO. Optical biosensors for the registration of some pesticides, mycotoxins and endocrine disrupting substances in environmental objects//84 ICB Seminar Biochemical sensing - utilisation of micro- and nanotechnologies. - Warsaw, 2005. - Р.30.

9. Демченко (Гордиенко) А.В., Стародуб Н.Ф. Разработка оптического иммунного сенсора на основе поверхностного плазмонного резонанса для определения нонилфенола// Международная молодежная конференция "Биология - наука ХХI века". - Пущино, 2006. - С. 366.

10. Демченко (Гордієнко) А.В., Стародуб Н.Ф. Визначення нонілфенолу в розчинах за допомогою імунного термобіосенсора та оптичного імуносенсора на основі поверхневого плазмонного резонансу// IX Український біохімічний з'їзд. - Харків, 2006. - Т. 2. - С. 147.

11. Starodub N.F., Gojster O.V., Demchenko (Gordiienko) A.V., Pirogova L., Mel'nikV.G., Kal'chenko V.I., Kukla A.L. Biosensors and nanostructures: theoretical and practical aspects// Ukrainian - German Symposium on Nanobiotechnology. - Kyiv, 2006. - P. 146.

12. Демченко (Гордієнко) А.В., Стародуб М.Ф. Визначення нонілфенолу за допомогою оптичних імунних біосенсорів// Міжнародна наук. конф. "Молодь та поступ біології". - Львів, 2007. - С. 47-48.

Размещено на Allbest.ru