Вплив нітрату і нітриту на метаболізм у рубці великої рогатої худоби та їх перетворення в дослідах in vitro

Размещено на http://www.allbest.ru/

ІНСТИТУТ БІОЛОГІЇ ТВАРИН УААН

УДК 636.2:612.32:576.809.518

ВПЛИВ НІТРАТУ І НІТРИТУ НА МЕТАБОЛІЗМ У РУБЦІ ВЕЛИКОЇ РОГАТОЇ ХУДОБИ ТА ЇХ ПЕРЕТВОРЕННЯ В ДОСЛІДАХ IN VITRO

03.00.04 - біохімія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

МЕЛІКЯН СВІТЛАНА МІКАЄЛІВНА

Львів-2008

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті біології тварин УААН.

Науковий керівник Ї доктор біологічних наук, професор

СОЛОГУБ Леонід Ілліч,

Інститут біології тварин УААН,

головний науковий співробітник лабораторії обміну речовин.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

ЯНОВИЧ Вадим Георгійович,

Інститут біології тварин УААН,

головний науковий співробітник лабораторії живлення корів;

доктор біологічних наук, професор

СИБІРНА Наталія Олександрівна

Львівський національний університет

імені Івана Франка, завідувач кафедри біохімії

Захист відбудеться „10” червня 2008 р. о 1000 год. на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 35.368.01 в Інституті біології тварин УААН (79034, м. Львів, вул. В. Стуса, 38).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біології тварин УААН, за адресою: м. Львів, вул. В. Стуса, 38.

Автореферат розісланий „07” травня 2008 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради О. І. Віщур

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Накопичення нітратів та нітритів у кормах через нераціональне застосування азотних добрив, без урахування потреби рослин в азоті в різні фази вегетації, рання заготівля кормів - усе це призводить до частих хронічних і гострих токсикозів сільськогосподарських тварин. Застосування гербіцидів і стимуляторів росту спричинює накопичення у рослинах нітратних і нітритних іонів (Ажипа Я. И. с соавт., 1990; Борисов В. А., 1990; Vittozzi L., 1992). Корми вважаються токсичними для жуйних, якщо вони містять понад 1,5 % нітрату (приблизно 0,25 моль/кг корму). У дослідах на моногастричних тваринах з'ясовано, що нітрати й продукти їх відновлення ? нітрити, всмоктуючись у кров, окиснюють двовалентне залізо гему, переводячи гемоглобін у функціонально неактивну форму - метгемоглобін (Горішна О. В., 2002; Вракин В. Ф., Ковальчук И. С., 1984). У жуйних тварин значна частина цих агресивних окиснювачів може відновлюватись у рубці до аміаку, який амінує карбонові кислоти з утворенням амінокислот, що включаються у білки в клітинах мікроорганізмів (Долгов И. А., Тараканов Б. В., 1988; Пупін І. Г. зі співав., 1992; Реутов В. П., 2002). Відома група рубцевих бактерій, які використовують водень, що вивільняється під час розщеплення клітковини, у відновленні нітратів (Iwamoto M. et al., 2002; Leng R. A., 1984; Asanuma N. et al., 2004). Унаслідок цього зменшується утворення метану й емісія його в атмосферу (McAllister T. A., 1996; Johnson K. A., 1995; Hegarty R. S., 1999). Відновлення нітрату до аміаку термодинамічно більш вигідне, ніж вуглекислого газу до метану. Хоча нітрат і зменшує продукцію цього парникового газу, проте він і продукт його перетворення - нітрит у рубці при високій концентрації виявляють токсичну дію на мікроорганізми. До основних нітратредукуючих бактерій рубця жуйних тварин належать бактерії виду Selenomonas rumіnantium, популяція яких становить залежно від характеру кормів 1,3?6,7*107 клітин/мл. Кількість двох інших відомих видів бактерій рубця, що володіють нітратредуктазною активністю, - Veillonella parvula і Wollinella succinogenes набагато менша (відповідно 3,2-6,7*103 і 102-1,6*103 клітин/мл). Цим і деяким іншим видам бактерій рубця властива також нітритредуктазна активність, але інтенсивність редукції нітриту до аміаку набагато менша ніж швидкість перетворення нітрату на нітрит. Тому накопичуються в рубці й усмоктуються в кров ці токсичні сполуки. Цим і зумовлена актуальність досліджень впливу нітрату і нітриту на метаболічні процеси в рубці жуйних тварин.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота є частиною науково-дослідної роботи лабораторії обміну речовин Інституту біології тварин УААН, згідно з завданням “Дослідити механізми впливу деяких макро- і мікроелементів на метаболізм в організмі жуйних тварин, ріст популяції симбіотичних мікроорганізмів у передшлунках, продуктивність тварини-господаря та внести корективи у мінеральне живлення молодняка великої рогатої худоби” (№ держреєстрації 0101U003434, шифр 01.01), де дисертант вивчала in vitro вплив нітрату і нітриту на метаболізм рубця великої рогатої худоби.

Мета і завдання досліджень. Мета дисертаційної роботи ? з'ясувати в дослідах in vitro вплив нітратів і нітритів на метаболічні процеси в клітинах бактерій та інфузорій рубця великої рогатої худоби й залежність цього впливу від годівельних і вікових факторів.

Для досягнення мети необхідно було вирішити наступні завдання:

Провести дослідження впливу нітратів на ріст і життєдіяльність мікроорганізмів рубця телят;

Дослідити вплив нітратів разом з мікроелементами на життєдіяльність мікроорганізмів рубця телят;

Визначити активність нітрат- і нітритредуктази мікроорганізмів рубця телят за дії різних акцепторів і донорів водню та інших модуляторів;

Провести дослідження впливу нітрату і нітриту на ферменти антиоксидантного захисту мікроорганізмів рубця телят;

Вивчити вікові особливості відновлення нітратів і нітритів у рубці телят.

Об'єкт дослідження: метаболічні процеси в клітинах мікроорганізмів рубця телят, за in vitro впливу нітратів і нітритів.

Предмет досліджень: показники життєдіяльності мікроорганізмів (ріст популяції, продукція летких жирних кислот, активність ферментів антиоксидантного захисту, нітрат- і нітритредуктазна, целюлолітична, протеолітична та амілолітична активність).

Методи досліджень: біохімічні (метод газової хроматографії - розділення коротколанцюгових жирних кислот, спектрофотометричні - метод визначення активності ферментів антиоксидантного захисту, нітрат- і нітритредуктази, концентрації продуктів ПОЛ, вмісту загального білка, аміаку, целюлолітичної, протеолітичної та амілолітичної активності), статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. Уперше досліджено вплив нітратів і нітритів на життєдіяльність мікроорганізмів рубця великої рогатої худоби. З'ясовано, що близько третини загальної популяції мікроорганізмів володіє нітратредуктазною активністю, причому інтенсивність відновлення нітритів у рубці нижча, ніж нітратів, а інтенсивність цих процесів у бактерій вища, ніж у інфузорій. Уперше досліджено вплив різних сполук (карбонових кислот, мінеральних елементів) на редукцію нітратів і нітритів у рубці, зв'язок їх з пероксидними процесами й активністю ферментів антиоксидантного захисту в клітинах мікроорганізмів. Встановлено, що під впливом сульфату натрію у вмісті рубця значно знижується активність нітратредуктази, а активаторами нітрат- і нітритредуктази є молібден, залізо, цинк та редуктанти (глутатіон, дитіотреїтол, цистеїн). Окиснений глутатіон зменшує відновлення нітрату і нітриту. Активність нітритредуктази значно зростає під впливом етанолу, з одночасним накопиченням аміаку.

Практичне значення одержаних результатів. Одержані результати становлять теоретичну основу для розробки методів, спрямованих на зменшення токсичної дії нітратів і нітритів на організм великої рогатої худоби.

Обґрунтовано використання хлорату натрію з метою дослідження ролі нітратредуктази в перетворенні нітрату мікроорганізмами рубця жуйних тварин. Результати досліджень використовуються у навчальних процесах на кафедрі фармакології і токсикології, та кафедрі біохімії Львівського національного університету ветеринарної медицини та біотехнології ім. С. З. Ґжицького.

Особистий внесок здобувача. Дисертантом самостійно проведений аналіз наукової літератури, виконано експериментальну частину роботи і статистичну обробку даних. Планування роботи, аналіз та обговорення отриманого матеріалу, підготовка рукописів статей здійснювались із науковим керівником. Допомогу у проведенні аналізу на газовому хроматографі здійснював Вудмаска І. В., завідувач лабораторії живлення корів Інституту біології тварин УААН.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації були представлені на міжнародній конференції “Клітинні і субклітинні механізми функціонування травної системи”, присвяченій 80-річчю від дня народження проф. І. В. Шостаковської (Львів, 2004 р.); на І Міжнародній конференції студентів і аспірантів “Молодь і поступ біології” (Львів, 2005 р.); на ІХ Українському біохімічному з'їзді (Харків, 2006 р.); на конференціях молодих вчених в Інституті біології тварин УААН (Львів, 2004-2006 рр.).

Публікації. За результатами досліджень опубліковано 13 наукових праць, з яких 4 ? у фахових виданнях, що затверджені ВАК України, 3 роботи у матеріалах і тезах конференцій та з'їзду.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 122 сторінках й складається зі вступу, огляду літератури, матеріалів та методів, власних досліджень, аналізу і узагальнення результатів досліджень, висновків, списку використаної літератури із 223 джерела, у тому числі 124 - закордонних. Робота проілюстрована 20 таблицями та 17 рисунками, що складає 16 сторінок.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури. В огляді літератури висвітлено й проаналізовано сучасні дані про особливості травлення жуйних тварин і вплив нітратів і нітритів на організм великої рогатої худоби.

Матеріали і методи досліджень. Дослідження проводились протягом 2004-2006 років у дослідному господарстві “Чишки” Інституту біології тварин УААН на телятах української чорно-рябої молочної породи різного віку (1, 3, 6, і 12 місяців). Тварин годували згідно з деталізованими нормами (Калашникова А. П. с соавт., 2003). До раціону телят входили: сіно лугове, комбікорм, соковиті корми. Поживна вартість раціону за вмістом протеїну, мінеральних елементів і вітамінів відповідала віковим потребам телят. Утримання тварин - стійлове.

Експериментальна частина роботи виконана на телятах з фістулами рубця. Для біохімічних досліджень вміст рубця відбирали через 2 год. після ранішньої годівлі тварин приладом, виготовленим на основі колби Бунзена та вакуумної помпи Комовського, фільтрували через 4 шари марлі. Одержані зразки вмісту рубця розділяли на окремі фракції - бактерії, інфузорії (Алиев А. А., Кафаров М. Ш., 1971) і переносили в буферну суміш. До суміші додавали сечовину або нітрат натрію, як джерело азоту, глюкозу, як джерело енергії. Посудини закривали корками, продували СО2 та інкубували упродовж 24 год. за температури 38 С. До і після завершення інкубації відбирали зразки рідини й газу для досліджень. Одержані фракції мікроорганізмів використовували у дослідженнях. Контролем слугували зразки вмісту рубця, в які не додавали досліджувані речовини.

У середовищі визначали концентрацію летких жирних кислот (ЛЖК) (Кроткова А. П. зі співавт., 1957), білка (Lowry O. H. et al., 1951), аміаку (Курилов Н. В., Радченкова Т. А., 1970), молочної кислоти (Barker J. B., Summerson W. H., 1941). Для розділення ацетату, пропіонату і бутирату застосовували газову хроматографію (Cottyn B. G., Boucque C. V., 1968; Курилов Н. В. зі співавт., 1974). Масу мікроорганізмів визначали ваговим методом після висушування її до постійної маси. Інтенсивність процесів пероксидного окиснення ліпідів оцінювали за накопиченням ТБК-активних продуктів (Коробейникова С. Н., 1989; Тимирбулатов Т. А., Селезнев С. И., 1981) і гідроперекисів ліпідів (Мирончик В. В., 1982). Визначали активність ферментів антиоксидантного захисту у клітинах мікроорганізмів - супероксиддисмутази (Дубинина Е. Е. с соавт., 1983; Чевари С. с соавт., 1991), каталази (Королюк М. А. с соавт., 1988), глутатіонпероксидази (Моин В. М., 1986), глутатіонредуктази (Моин В. М., 1986), крім цього, активність глюкозо-6-фосфатдегідрогенази (Астауров Б. Л., 1974), протеолітичну, целюлолітичну та амілолітичну активність (Тараканов Б. В., 1998), нітрат- і нітритредуктазну активність (Simon J. еt al., 2003).

Результати досліджень оброблялись статистично з використанням t-критерію Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Вплив нітрату натрію на життєдіяльність мікроорганізмів рубця великої рогатої худоби в дослідах in vitro. З'ясовано, що в присутності нітрату натрію інтенсивність утворення летких жирних кислот після інкубації нижча, ніж за додавання сечовини (рис. 1). За цієї умови особливо різко знижується утворення пропіонату, і меншою мірою - ацетату і бутирату. Кількість молочної кислоти (лактату) під впливом нітрату натрію вища, ніж за наявності сечовини.

Як видно із рис. 2, в клітинах мікроорганізмів загальної популяції рубця великої рогатої худоби функціонують: нітратредуктаза, що каталізує відновлення нітратів до нітритів, і нітритредуктаза, що каталізує перетворення останніх до окису азоту. Нітрат- і нітритредуктазна активність у вмісті рубця суттєво зростає за інкубації його з нітратом, що свідчить про адаптивну природу цих ферментів і залежність їх від наявності субстрату. За цих умов активність першого ферменту значно вища, ніж другого, що може призвести до накопичення особливо токсичного для організму тварин нітриту.

Рис. 1. Концентрація коротколанцюгових жирних кислот і лактату у вмісті рубця після інкубації з сечовиною і нітратом натрію відносно контролю у відсотках.

Примітка. Тут і далі: * - різниця вірогідна, порівняно з контролем, (р<0,05);

а - різниця між показниками, отриманими в дослідах in vitro за наявності в середовищі сечовини і нітрату натрію, вірогідна (М±m, n=3).

Рис. 2. Концентрація аміаку та активність нітрат- і нітритредуктази у вмісті рубця після інкубації з сечовиною і нітратом натрію відносно контролю у відсотках.

Про подальше відновлення нітриту в рідині рубця свідчить зростання вмісту аміаку після додавання до інкубаційного середовища нітрату натрію. Проте утворення аміаку за інкубації вмісту рубця з нітратом натрію менш виражене, ніж за інкубації з сечовиною (рис. 2).

Активність нітрат- і нітритредуктази мікроорганізмів рубця за інкубації вмісту рубця з різними акцепторами і донорами водню. З'ясовано, що мікроорганізми рубця містять нітрат- і нітритредуктазу. Активність цих ферментів у клітинах бактерій вища, ніж у клітинах інфузорій. Якщо врахувати, що інфузорії поглинають бактерії, які є для них важливим джерелом поживних речовин, а також містять їх у великій кількості на своїй поверхні, то цілком ймовірно, що ця відносно низька нітрат- і нітритредуктазна активність, виявлена у фракції інфузорій, є бактерійного походження. Правдоподібно, в клітинах інфузорій рубця внаслідок специфіки їх живлення й використання поживних речовин, швидкість відновлення окиснених нітросполук невисока, хоча в інших одноклітинних еукаріот (Candida) нітратредуктазна активність досить висока (Hipkin C. R. еt al., 1993).

У присутності відновлених сірковмісних сполук - глутатіону, дитіотреїтолу і цистеїну, як у бактеріальній фракції (рис. 3), так і у фракції інфузорій вмісту рубця (рис. 4), підвищується активність нітрат- і нітритредуктази. Найбільш ефективним стосовно цього є дитіотреїтол, найменш - цистеїн. Додавання ж окисненої форми глутатіону в інкубаційне середовище, навпаки, зменшує відновлення нітратів і нітритів, що свідчить про більшу спорідненість до водню, порівняно з спорідненістю окиснених форм азоту. Щоправда, на відновлення нітритів глутатіон чинить менший вплив, ніж на відновлення нітратів. Отже, ці два подібні за функціональними властивостями ферменти, мають певні відмінності.

Рис. 3. Нітрат- і нітритредуктазна активність у клітинах бактерій рубця за наявності в інкубаційному середовищі акцепторів і донорів водню відносно контролю у мкмоль/100 мг білка.

К - контроль; 2 - глутатіон відновлений; 3 - глутатіон окиснений; 4 - янтарна кислота; 5 - лимонна кислота; 6 - фумарова кислота; 7 - олеїнова кислота;

8 - дитіотреїтол; 9 - цистеїн.

Додавання метилового спирту до інкубаційного середовища суттєво не вплинуло на активність нітрат- і нітритредуктаз порівняно з контрольними зразками (рис. 5), тоді як під впливом етанолу активність нітритредуктази зростає, а нітратредуктази залишається на рівні контролю. Це дає підставу вважати, що етиловий спирт сприяє перетворенню нітрату до кінцевих продуктів і, відповідно, зменшує накопичення токсичного нітриту. Підтвердженням є значне зростання вмісту аміаку і мікробної маси в інкубаційному середовищі.



Рис. 4. Нітрат- і нітритредуктазна активність у клітинах інфузорій рубця за наявності в інкубаційному середовищі акцепторів і донорів водню відносно контролю у мкмоль/100 мг білка.

К - контроль; 2 - глутатіон відновлений; 3 - глутатіон окиснений; 4 - янтарна кислота; 5 - лимонна кислота; 6 - фумарова кислота; 7 - олеїнова кислота;

8 - дитіотреїтол; 9 - цистеїн.

Рис. 5. Вплив спиртів і лактату на нітрат-і нітритредуктазну активність та деякі показники життєдіяльності мікроорганізмів загальної популяції рубця відносно контролю у відсотках.

Дослідження впливу нітрату натрію разом з мікроелементами на життєдіяльність мікроорганізмів рубця телят. Як відомо, ферментативні реакції можуть активуватись або інгібуватись катіонами й аніонами мікроелементів. Тому науково-практичний інтерес становлять дані про залежність реакцій перетворення нітратів у рубці телят під впливом деяких мікроелементів. Як видно з рис. 6, додавання в інкубаційне середовище сульфату натрію призводить до значного зниження активності нітратредуктази, тоді, як під впливом відновленої сірки у вигляді сульфіду активність цього ферменту не змінюється. Це можна пояснити тим, що сульфат, як окиснювач, конкурує з нітратами за відновлені еквіваленти, внаслідок чого активуються сульфатредукуючі бактерії, які інгібують редукцію нітратів. Аніон сульфату частково впливає на активність нітритредуктази, що свідчить про відносне зниження в середовищі вмісту нітритів, порівняно з рівнем у контрольних зразках.

На тлі таких змін активності редукції нітратів є цікавою зміна рівня аміаку в інкубаційному середовищі. Під впливом сірки (VI) його рівень у середовищі зростає, тоді, як під впливом сульфіду - значно зменшується. Зазначимо також, що за різкого зниження активності нітратредуктази під впливом сульфату натрію активність нітритредуктази не змінюється. Тому можна вважати, що сульфат разом із зменшеним використання нітратів посилює продукцію аміаку, знижуючи, тим самим, накопичення в організмі нітриту. Сульфід, який незначною мірою впливає на редукцію нітрату, очевидно, інгібує нітритредуктазу, внаслідок чого також зменшується утворення аміаку, що призводить до нагромадження нітриту. З огляду на це, сульфід чинить шкідливу дію як на мікроорганізми рубця, так і відповідно на організм тварини.

Заслуговує на увагу також активуючий вплив молібдату на нітрат- і нітритредуктазу, що приводить до збільшення продукції аміаку (рис. 6). Відомо, що цей мікроелемент входить до складу молекули кофактора цих редуктаз - молібдоптерину. Крім молібдату, активатором нітрат- і нітритредуктаз є також залізо (II), яке сприяє утворенню відновлених форм нікотинамідних коферментів, потрібних для редуктазних реакцій. Не менш

Рис. 6. Відмінності концентрації аміаку та нітрат- і нітритредуктазної активності у вмісті рубця великої рогатої худоби за умов інкубації з мінеральними відносно контролю у відсотках.

Необхідним мікроелементом є цинк (II), який або є у складі молекули цих ферментів, або активує їх. При внесенні в інкубаційне середовище заліза або цинку спостерігається також накопичення аміаку. Такий самий вплив виявляє хром (ІІІ), хоча точка прикладання його дії у мікроорганізмів не з'ясована. Хром (VI), як окиснювач, інгібує ці процеси.

Згідно з даними літератури, нітратредуктаза характеризується значною специфічністю і, крім нітратів, здатна відновлювати деякі інші аніони, зокрема відносно нетоксичний хлорат (Callaway T. R., Edrington T. S. еt al., 2003). Унаслідок відновлення хлорат перетворюється на цитотоксичну сполуку - хлорит, який пригнічує життєдіяльність мікроорганізмів і призводить до їх загибелі. За відсутності експресії нітратредуктаз хлорат у клітинах бактерій не відновлюється і, відповідно, життєдіяльність мікроорганізмів не порушується (Callaway T. R. еt al., 2002; Anderson R. C. еt al., 2000). Тому цей метод елімінування зручний для з'ясування впливу нітратредукуючих бактерій на обмінні процеси екосистеми рубця та дослідження їх участі в конкуренції за водень з іншими групами бактерій, наприклад, сульфатредукуючими і метаногенними бактеріями.

Як видно із рис. 7, за умов інкубації вмісту рубця з доданим хлоратом натрію, кількість мікробної маси значно менша, ніж у контролі, що може свідчити про загибель деяких груп мікроорганізмів. Водночас, у вмісті рубця різко знижується активність нітратредуктази (на 80 %), що підтверджує припущення про дію хлорату лише на нітратредукуючі бактерії. Зауважимо, якщо дія хлорату поширюється лише на бактерії з активною нітратредуктазою, то за зменшенням маси мікроорганізмів можна вважати, що їх кількість у вмісті рубця становить 30 % загальної кількості. Приблизно в тих самих межах знижується і активність нітритредуктази, про що свідчить накопичення в клітинах бактерій у процесі інкубації нітриту або цитотоксичного хлориту.

Рис. 7. Вплив хлорату натрію на деякі показники життєдіяльності мікроорганізмів рубця великої рогатої худоби відносно контролю у відсотках.

Стосовно гідролаз, як видно з рис. 7, під впливом хлорату значно знижується інтенсивність деградації полісахаридів - целюлози і крохмалю. Очевидно, ці вуглеводи використовуються нітратредукуючими бактеріями як джерело енергії.

Дослідження впливу нітрату і нітриту на ферменти антиоксидантного захисту мікроорганізмів рубця. Слід відзначити, що нітрати й нітрити впливають на процес пероксидного окиснення ліпідів, і, відповідно, на антиоксидантну систему мікроорганізмів рубця телят (рис. 8). Зокрема, за умов інкубації змішаної фракції мікроорганізмів рубця з нітратом натрію зросла концентрація гідроперекисів ліпідів (ГПЛ) і ТБК-активних продуктів на 36 і 67 %, а під впливом нітриту - на 61 і 126 % відповідно.

Як видно з рис. 8, інкубація з нітратом суттєво не впливає на активність супероксиддисмутази (СОД) мікроорганізмів рубця, а інкубація з нітритом, вірогідно, знижує її активність. І нітрат, і нітрит знижують відповідно на 40 і 60 % активність каталази, ключового ферменту системи антиоксидантного захисту в клітинах мікроорганізмів. Водночас іони нітрату і нітриту не мають істотного впливу на активність глутатіонпероксидази (ГП) і глутатіонредуктази (ГР). Дехто з авторів вважає, що в клітинах бактерій глутатіонова система антиоксидантного захисту слабо виражена, а основну роль у знешкодженні пероксиду водню відіграє каталаза (Meister A., 1983; Волторністий А. В. зі співавт., 2004). Разом з тим, нітрат і нітрит інгібують активність глюкозо-6-фосфатдегідрогенази - ключовий фермент пентозофосфатного шунта, що забезпечує реакції відновлення нітратів і нітритів протонами водню.

Рис. 8. Відносні зміни показників продуктів пероксидного окиснення ліпідів та активність ферментів антиоксидантного захисту в клітинах мікроорганізмів рубця відносно контролю у відсотках.

Підсумовуючи одержані результати, слід зазначити, що під дією нітрату, і особливо нітриту, збільшується утворення продуктів пероксидного окиснення змішаною популяцією мікроорганізмів рубця, тоді як вірогідно зменшується активність супероксиддисмутази (під дією нітриту) і каталази (під дією нітрату і нітриту).

Вікові особливості відновлення нітратів і нітритів у рубці телят. Одержані результати свідчать про особливості формування і активації популяції мікроорганізмів з різною функціональною активністю у рубці телят на ранніх стадіях постнатального розвитку. Як бачимо з таблиці, у 3- і 6-місячних телят активність антиоксидантних ферментів мікроорганізмів рубця великої рогатої худоби підвищується упродовж росту тварин, тоді як целюлолітична активність у 1,5-місячних телят досить висока і становить близько 2/3, порівняно з 6-місячними тваринами.

Таблиця

Показники життєдіяльності мікроорганізмів рубця телят у різному віці (М±m, n=3)

Вік телят, міс. Показники	1	1,5	2	3	6	12
Мікробна маса, мг/100 мл	72±4	138±6*	149±7	159±6	165±5	159±6
Вміст аміаку, ммоль/л	6,7±0,4	13,3±0,3*	15,6±0,9	17,5±0,9	18,2±1,1	17,9±1,2
Вміст летких жирних кислоти, ммоль/л	49±3	105±8*	122±7	136±9	141±13	143±10
Целюлолітична активність, %	15,2±0,9	36,1±1,6*	42,6±1,8	50,3±2,4	49,7±2,9	50,5±1,2
Нітратредуктазна активність, нмоль/100 мг білка / хв	2,9±0,1	3,9±0,2*	4,4±0,2	6,7±0,2*	8,2±0,2*	8,0±0,1
Супероксиддисмутазна активність, у.о. /мг білка / хв	13,4±1,3	20,5±1,0*	24,8±1,1	35,4±1,5*	47,3±2,0*	45,4±1,8
Активність каталази, у.о./мг білка / хв	678±31	1583±55*	2261±72*	2397±69	2540±95	2442±87
Глутатіонпероксидазна активність, нмоль GSH/мг білка /хв	1,3±0,1	1,5±0,2	1,9±0,2	2,1±0,1	2,2±0,1	2,3±0,2

Примітка: * ? різниця між показниками у телят на суміжних стадіях досліджень достовірна (р<0,05).

ВИСНОВКИ

У дисертації отримано нові дані про метаболізм нітрату і нітриту у мікроорганізмів рубця великої рогатої худоби. В умовах in vitro вивчено вплив нітрату і нітриту на ріст мікроорганізмів, продукцію ними летких жирних кислот, на процеси пероксидного окиснення і активність ферментів антиоксидантного захисту в їх клітинах.

За умов інкубації вмісту рубця великої рогатої худоби з нітратом стимулюються ферментативні процеси, унаслідок чого збільшується мікробна маса, продукція летких жирних кислот. Проте ступінь цих змін менший, ніж за інкубації вмісту рубця з сечовиною. Під дією нітрату у вмісті рубця знижується відносний рівень пропіонової кислоти, дещо менше ? оцтової і найменше ? масляної.

Інтенсивність відновлення нітриту у вмісті рубця значно нижча (в 1,5-2,5 разів), ніж відновлення нітрату, а загалом інтенсивність цих процесів у бактерійній фракції вища, ніж у фракції інфузорій.

У присутності редуктантів (глутатіону, дитіотреїтолу, цистеїну) активність нітратредуктази і нітритредуктази у бактерій і інфузорій зростає. Окиснений глутатіон зменшує відновлення нітрату і нітриту. Додавання насичених карбонових кислот (янтарної, лимонної), а також ненасичених карбонових кислот (олеїнової, фумарової) мало впливає на редукцію нітрату і нітриту. Активність нітритредуктази значно зростає, якщо додати до вмісту рубця етанол, з одночасним накопиченням аміаку, тоді як на нітратредуктазну активність етанол не впливає.

Під впливом сульфату натрію у вмісті рубця значно знижується активність нітратредуктази, а під впливом відновленої сірки (сульфіду) активність її не змінюється. Активаторами нітрат- і нітритредуктази є молібден, залізо і цинк.

Нітрит- і нітрат-іони посилюють пероксидні процеси в клітинах мікроорганізмів з утворенням гідроперекисів ліпідів і ТБК-активних продуктів. На активність супероксиддисмутази нітрат суттєво не впливає, тоді, як за умов інкубації з нітритом, вона знижується. Особливо інгібують ці азотні сполуки активність каталази.

Нітратредуктазна активність у вмісті рубця телят з віком поступово зростає: в 6-місячному віці вона у 2,7 разів вища, ніж у 1-місячному. Ріст целюлолітичних мікроорганізмів забезпечує розвиток нітратредукуючих бактерій.

СПИСОК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Вплив нітрату натрію на життєдіяльність мікроорганізмів рубця телят в дослідах in vitro / С. М. Мелікян, М. Г. Герасимів, Л. І. Сологуб, Р. О. Федяков // Журн. агробіології та екології. - 2004. - Т. 1, № 1. - С. 136-140.

(Дисертантом визначено активність нітрат- і нітритредуктази, вміст аміаку та загальних летких жирних кислот, взято участь в опрацюванні та аналізі експериментальних даних, написанні та оформленні статті).

Мелікян С. М., Сологуб Л. І., Герасимів М. Г. Вплив in vitro нітрату натрію і деяких мікроелементів на ріст і життєдіяльність мікроорганізмів рубця телят // Біологія тварин. ? 2004. - Т. 6, №1?2. - С. 344?349.

(Здобувачем проведено експериментальні дослідження, проаналізовано одержані результати).

Мелікян С. М., Сологуб Л. І., Герасимів М. Г. Вплив мінеральних елементів на перетворення нітратів у рубці великої рогатої худоби // Біологія тварин. ? 2005. - Т. 7, №1?2. - С. 109?113.

(Дисертантом визначено активність нітрат- і нітритредуктази, вміст аміаку та летких жирних кислот, проаналізовано одержані результати).

Мелікян С. М., Герасимів М. Г., Сологуб Л. І. Нітрат- і нітритредуктазна активність мікроорганізмів рубця великої рогатої худоби за дії про- і антиоксидантів // Наук.-техн. бюл. Інституту біології тварин УААН і ДНДКІ ветпрепаратів та кормових добавок. ? Львів, 2005. ? Вип. 6, №1. ? С. 93?96.

(Дисертантом визначено активність нітрат- і нітритредуктази, взято участь в опрацюванні та аналізі експериментальних даних, написанні та оформленні статті).

Вплив акцепторів водню на перекисні процеси і деякі показники життєдіяльності мікроорганізмів рубця великої рогатої худоби в дослідах in vitro / А. В. Волторністий, С. М. Мелікян, І. В. Лучка, Р. О. Федяков, М. Г. Герасимів, Л. І. Сологуб // Наук.-техн. бюл. Інституту біології тварин УААН і ДНДКІ ветпрепаратів та кормових добавок. ? Львів, 2005. ? Вип. 6, №2. ? С. 24?28.

(Дисертант брала участь в опрацюванні та аналізі експериментальних даних).

Мелікян С. М., Сологуб Л. І., Герасимів М. Г. Участь нітратредукуючих бактерій в метаболічних процесах вмісту рубця великої рогатої худоби // Наук.-техн. бюл. Інституту біології тварин УААН і ДНДКІ ветпрепаратів та кормових добавок. ? Львів, 2005. ? Вип. 6, №2. ? С. 153?156.

(Дисертантом визначено активність нітрат- і нітритредуктази, вміст аміаку та загальних летких жирних кислот, взято участь в опрацюванні та аналізі експериментальних даних, написанні та оформленні статті).

Мелікян С. М., Лучка І. В., Сологуб Л. І. До регуляції редукції нітратів і утворення метану у рубці телят // Наук.-техн. бюл. Інституту біології тварин УААН і ДНДКІ ветпрепаратів та кормових добавок. ? Львів, 2006. ? Вип. 7, №1?2. ? С. 188?192.

(Дисертантом визначено активність нітрат- і нітритредуктази, вміст аміаку та летких жирних кислот, взято участь в опрацюванні та аналізі експериментальних даних, написанні та оформленні статті).

Мелікян С. М., Сологуб Л. І. Вплив рН на метаболічні процеси у рубці великої рогатої худоби // Наук.-техн. бюл. Інституту біології тварин УААН і ДНДКІ ветпрепаратів та кормових добавок. ? Львів, 2006. ? Вип. 7, №3?4. ? С. 58?62.

(Здобувачем проведено експериментальні дослідження, статистично опрацьовано та проаналізовано одержані результати).

Мелікян С. М., Сологуб Л. І. Вплив нітрату і нітриту на систему антиоксидантного захисту у мікроорганізмів рубця великої рогатої худоби // Біологія тварин. ? 2006. ? Т. 8, №1?2. ? С. 140?144.

(Дисертантом визначено активність ферментів антиоксидантного захисту та продуктів ПОЛ, взято участь в опрацюванні та аналізі експериментальних даних, написанні та оформленні статті).

Мелікян С. М., Сологуб Л. І. Вікові особливості метаболізму в мікроорганізмах рубця великої рогатої худоби // Експеримент. та клінічна фізіологія і біохімія. ? 2006. ? №4 (36). ? С. 33?36.

(Дисертантом визначено активність нітратредуктази та ферментів антиоксидантного захисту, вміст аміаку та летких жирних кислот, взято участь в опрацюванні та аналізі експериментальних даних, написанні та оформленні статті).

Порівняльне дослідження впливу in vitro сечовини та нітрату натрію на метаболізм у рубці телят / С. М. Мелікян, Л. І. Сологуб, Р. О. Федяков, М. Г. Герасимів // Матеріали міжнар. конф. “Клітинні і субклітинні механізми функціонування травної системи”. - Львів, 2004. - С. 53.

(Дисертант опрацювала та проаналізувала експериментальні дані, написала та оформила тези).

Мелікян С. М. Вплив про- і антиоксидантів на нітратредуктазну активність в рубці великої рогатої худоби // І міжнар. конф. студентів та аспірантів “Молодь і поступ біології”. - Львів, 2005. - С. 18.

(Здобувач брала участь у проведенні досліджень, опрацюванні та аналізі експериментальних даних, написанні та оформленні тез доповіді).

Мелікян С. М., Сологуб Л. І., Дудкевич Р. М. Роль мінеральних елементів у детоксикації нітратів у рубці великої рогатої худоби // Матеріали ІХ Українського біохімічного з'їзду. ? Харків, 2006. ? Т. 1. ? С. 150.

(Дисертант брала участь в опрацюванні та аналізі експериментальних даних, написанні тез).

АНОТАЦІЯ

рубець худоба мікроорганізми нітрат

Мелікян С.М. Вплив нітрату і нітриту на метаболізм у рубці великої рогатої худоби та їх перетворення в дослідах in vitro. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 - біохімія. - Інститут біології тварин УААН, Львів, 2008.

Дисертація присвячена дослідженню біохімічних механізмів впливу іонів нітратів і нітритів на мікроорганізми рубця телят в умовах in vitro, його зв'язку з метаболічними процесами в клітинах бактерій і інфузорій та залежності від годівельних та вікових чинників.

Уперше проведено порівняльні дослідження перетворень нітратів і нітритів у рубці великої рогатої худоби. Показано, що нітратредуктазною активністю володіє близько третини змішаної популяції мікроорганізмів, причому інтенсивність відновлення нітритів у рубці значно нижча, ніж нітратів, загалом активність цих процесів у бактерій вища, ніж для інфузорій. Мікроорганізми вмісту рубця неодночасно досягають максимальної функціональної активності з віком телят. Висока активність целюлолітичних мікроорганізмів стимулює розвиток нітратредукуючих бактерій. Уперше досліджено вплив карбонових кислот i мінеральних елементів на редукцію нітратів і нітритів у вмісті рубця й показано їх зв'язок з пероксидними процесами у клітинах бактерій і інфузорій. За присутності глутатіону, дитіотреїтолу та цистеїну нітрат- і нітритредуктазна активність бактерій та інфузорій зростає. Активність нітритредуктази у вмісті рубця після додавання етанолу значно підвищується, що призводить до накопичення аміаку. Під впливом сульфату натрію нітратредуктазна активність значно знижується.

Ключові слова: велика рогата худоба, рубець, мікроорганізми, нітрат, нітрит, мікроелементи.

Меликян С. М. Влияние нитрата и нитрита на метаболизм в рубце крупного рогатого скота и их превращение в исследованиях in vitro. - Рукопись.

Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04 - биохимия. - Институт биологии животных УААН, Львов, 2008.

Диссертация посвящена исследованию биохимических механизмов влияния нитратов и нитритов на микроорганизмы рубца телят, на его связь с метаболическими процессами в клетках бактерий и инфузорий и зависимости от кормовых и возрастных факторов в условиях in vitro.

Впервые проведены сравнительные исследования редукции нитратов и нитритов в рубце крупного рогатого скота. Показано, что около трети смешанной популяции микроорганизмов обладает нитратредуктазной активностью. Причем интенсивность этих процессов у бактерий выше, чем у инфузорий. Интенсивность восстановления нитритов в рубце значительно ниже, чем нитратов. Микроорганизмы рубца неодновременно достигают максимальной функциональной активности с возрастом телят. Высокая активность целлюлозолитических микроорганизмов стимулирует развитие нитратредуцирующих бактерий. При инкубации содержимого рубца крупного рогатого скота с нитратом снижается относительный уровень пропионовой кислоты, уменьшается уровень уксусной и остается на исходном уровне масляная кислота. Нитрит и нитрат усиливают перекисные процессы в клетках микроорганизмов с образованием гидроперекисей липидов и ТБК-активных продуктов. Нитрат не влияет на активность супероксиддисмутазы, тогда как отмечается ее снижение при инкубации с нитритом. Особенно ингибируют эти азотные соединения активность каталазы. Впервые изучено влияние карбоновых кислот и ряда минеральных элементов на редукцию нитратов и нитритов в содержимом рубца, их связь с перекисными процессами и активностью ферментов антиоксидантной защиты в клетках микроорганизмов. Добавка в инкубационную смесь карбоновых кислот (янтарной, лимонной), а также ненасыщенных карбоновых кислот (олеиновой, фумаровой) мало влияет на редукцию нитрата и нитрита. Активность нитритредуктазы в содержимом рубца повышается под действием этанола, это дает основание считать, что этиловый спирт способствует редукции нитрата на конечные продукты и, соответственно, уменьшает накопление токсичного нитрита. Подтверждением этого является значительное увеличение микробной массы и повышение концентрации аммиака в инкубационной среде. Под влиянием сульфата натрия нитратредуктазная активность значительно снижается, и, соответственно, повышается уровень аммика в содержимом рубца, тем самым уменьшает накопление в организме нитрита. Также отмечено, что молибден, железо, цинк активируют нитрат- и нитритредуктазу, что приводит к увеличению продукции аммиака. В присутствии глутатиона, дитиотреитола и цистеина нитрат- и нитритредуктазная активность возрастают и у бактерий и инфузорий.

Ключевые слова: крупный рогатый скот, рубец, микроорганизмы, нитрат, нитрит, микроэлементы.

Melikyan S. M. The influence of nitrate and nitrite on the metabolism in cattle rumen and their conversion in experiments in vitro. - Manuscript.

Thesis for a candidate degree of biological science by speciality 03.00.04 - biochemistry - Animal Biology Institute UAAS, Lviv, 2008.

The dissertation is devoted to the research of biochemical mechanisms of nitrates and nitrites influence on cattle rumen microorganisms, its connection with metabolic processes in bacteria and protozoa cells and dependence of that influence on feeding, mineral and age factors. For the first time the comparative researches of a reduction of nitrates and nitrites in cattle rumen were conducted. It was shown, that considerable nitrate reductase activity is possessed by about one third of total microorganisms population in rumen, being the level of nitrite reduction is significantly lower, the level of nitrate reduction. On the whole, the intensity of these processes in bacteria was higher, than in protozoa.

The different groups of rumen microorganisms nonsimultaneously reach the maximal functional activity in postnatal growth and development of calves. A high activity cellulolytic bacteria provides the development of nitrate reductive bacteria, and the activity of methanogenic archaea reaches maximal level later. For the first time the influence of carboxylic acids and mineral elements on a reduction of nitrates and nitrites in the rumen and its links with peroxidative processes and its influence on antioxidant defence system in microorganisms cells was investigated. In the presence of glutathione, dithiothreitol and cysteine the nitrate and nitrite reductase activity increase in bacteria and protozoa. The activity of nitrite reductase considerably increases under influence of ethanol with simultaneous storage of ammonia. Nitrate reductase activity considerably decreases under the influence of sulfate.

Key words: cattle, rumen, microorganism, nitrate, nitrite, microelements.

Размещено на Allbest.ru

...