Дія надвисокочастотного електромагнітного випромінювання на культури дріжджів Saccharomyces cerevisiae, бактерій Escherichia coli і водорості Dunaliella viridis

Размещено на http://www.allbest.ru/

Київський національний університет імені Тараса Шевченка

УДК 577.3.04

03.00.02 - біофізика

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Дія надвисокочастотного електромагнітного випромінювання на культури дріжджів Saccharomyces cerevisiae, бактерій Escherichia coli і водорості Dunaliella viridis

Ніжельська Олена Ігорівна

Київ - 2008



Дисертацією є рукопис

Роботу виконано у Навчально-науковому центрі «Фізико-хімічне матеріалознавство» Київського національного університету імені Тараса Шевченка та Національної академії наук України.

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор Васильєв Олександр Миколайович ННЦ «Фізико-хімічне матеріалознавство» Київського університету імені Тараса Шевченка та НАН України, провідний науковий співробітник.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор, член-кореспондент НАН України Говорун Дмитро Миколайович, Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, заступник директора інституту з наукової роботи, завідувач відділу молекулярної та квантової біофізики;

доктор біологічних наук, доцент Мартинюк Віктор Семенович, Київський національний університет імені Тараса Шевченка, доцент кафедри біофізики.

Захист відбудеться « 18 » лютого 2009 р. о 16 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.001.38 Київського національного університету імені Тараса Шевченка (м. Київ, проспект академіка Глушкова, 2, біологічний факультет, ауд. 215).

Поштова адреса: 01033, Київ-33, вул. Володимирська, 64.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Київського національного університету імені Тараса Шевченка (01033, Україна, м. Київ, вул. Володимирська, 58).

Автореферат розіслано «15» січня 2009 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради Д 26.001.38 Цимбалюк О.В.



ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Електромагнітне випромінювання надвисокої частоти (ЕМВ НВЧ) або міліметрове випромінювання (що відповідає частотам 30-300 ГГц) з щільністю потужності меншою за тепловий фон (10 мВт/см2) належить до слабких чинників довкілля [Пресман, 1968, Дев'ятков, 1973]. Складність спостереження і дослідження біологічних ефектів НВЧ полягає у тому, що вони лежать на межі теплових і нетеплових явищ і залежать від початкового стану системи [Чукова, 2006].

Проблема біологічної дії ЕМВ НВЧ є важливою, оскільки невідомі механізми адаптації організмів до підвищення рівня електромагнітного фону, зумовленого техногенними факторами. У сучасних технологіях несуча частота постійно зростає - від 900 МГц до 2,45 ГГц, 5 ГГц і вище. Наслідки опромінювання НВЧ досліджуються недостатньо, втім є дані про можливість змін під його дією генетичного апарату клітин [Григор'єв,1996, Родіонов,1999]. Існує невизначеність щодо безпечних рівня потужності і часу дії мікрохвильового випромінювання. Дані модельних експериментів необхідно враховувати при встановленні обґрунтованих нормативів електромагнітних полів (ЕМП). При цьому доцільно досліджувати, насамперед, процеси зростання, розмноження, рухової активності, які є інтегральними реакціями цілісних організмів і знаходяться у межах їхніх функціональних можливостей.

Вибір культур мікроорганізмів для даної роботи визначався можливістю застосування у біотехнологіях: дріжджі є цінними у практичному відношенні, а мікроводорості можуть стати одним з головних об'єктів промислового фотосинтезу тому що використовують дешеві природні джерела енергії [Тамбієв, 2007]. Електромагнітні біотехнології ставлять за мету ефективніше використання мікроорганізмами поживних речовин, прискорення процесів, отримання продуктів з новими властивостями, а також знищення патогенних бактерій. Незважаючи на багаторічну історію досліджень [Залюбовська,1973, Виленська, Смолянська,1972, Гамаюрова, 2004], керування метаболічними процесами і життєздатністю клітин за допомогою ЕМП НВЧ потребує вдосконалення методик.

Зміни спонтанної рухової активності за умов дії мікрохвильового ЕМВ виявлено у одноклітинних організмів (інфузорій) [Єгорова, 2004]. Це перспективний напрям біологічного моніторингу за умов автоматизації вимірювань. Аналіз спектрів лазерного світла, розсіяного на рухомих частинках у водному середовищі, дозволяє отримати інформацію про зміни у структурі суспензії під впливом зовнішніх чинників [Лебедєв, 1987].

Загальноприйняту теорію біологічних ефектів слабких ЕМВ НВЧ до цього часу не створено. Це пов'язано з нестабільністю умов експериментів, недостатньою кількістю комплексних досліджень, упередженим ставленням до міліметрового випромінювання як «виключно корисного» або «безумовно шкідливого» для живих організмів. Для створення адекватної моделі дії слабких ЕМВ на живі клітини необхідно розглядати сприйнятливість до ЕМВ НВЧ як функцію, що залежить не тільки від частоти та потужності випромінювання, а і від інших параметрів середовища, фізіологічного стану організмів [Webb, 1984], досліджувати адаптацію і віддалені наслідки опромінювання.

Це потребує нового підходу до експериментів, спрямованих не тільки на пошуки «резонансів», а й на визначення факторів, які впливають на відносну величину біологічного ефекту.

Зв'язок роботи з науковими програмами, темами. Роботу виконано у ННЦ «Фізико-хімічне матеріалознавство» Київського університету імені Тараса Шевченка та НАН України («Механізми впливу фізичних полів та радіаційного випромінювання на структуру і властивості наноструктурованих систем», початок 2007 р., № держ. реєстрації 0107U000982. випромінювання дріжджі бактерія мікроорганізм

Мета дисертаційної роботи - дослідити дію низькоінтенсивного НВЧ-випромінювання на культури дріжджів Saccharomyces cerevisiae і рухомих мікроорганізмів - бактерій Escherichia coli і зелених водоростей Dunaliella viridis у залежності від температури і присутності в середовищі поверхнево активної речовини (додецилсульфату натрію) та L-серину, який блокує терморецептори E. сoli.

Завдання дослідження:

Дослідити дію ЕМВ міліметрового діапазону нетеплової інтенсивності на швидкість росту синхронізованих культур дріжджових клітин S. cerevisiae у залежності від частоти і тривалості дії ЕМВ НВЧ.

Дослідити вплив одноразового опромінювання ЕМВ НВЧ на зміну у життєздатності культури клітин S.cerevisiae і швидкість їхнього поділу.

Методом квазіпружно розсіяного світла дослідити вплив ЕМВ НВЧ на рухову активність бактерій Escherichia coli і зелених водоростей Dunaliella viridis.

Визначити залежність біологічних ефектів ЕМВ НВЧ від температури середовища, наявності детергенту, а також L-серину, який блокує терморецептори бактерій E. сoli.

Об'єкт дослідження - біологічна активність електромагнітного випромінювання міліметрового діапазону низької щільності потужності (10 мкВт/см2 - 10 мВт/см2 ) на культури дріжджів Saccharomyces cerevisiae, бактерій Escherichia coli і зелених водоростей Dunaliella viridis за умов різних температур та складу середовища.

Предмет дослідження - зміни швидкості росту та розмноження клітин і зміни рухової активності мікроорганізмів під дією ЕМВ НВЧ.

У роботі застосовувалися такі методи досліджень:

Визначення концентрації клітин під мікроскопом у камері Горяєва.

Дослідження життєздатності культур: забарвлення препаратів і підрахунок кількості живих та мертвих клітин; метод висівання на агар і підрахунок колоній клітин.

Лазерна кореляційна спектроскопія (ЛКС) світла, квазіпружно розсіяного частинками у водному середовищі.

Математична обробка спектрів ЛКС для визначення сумарної амплітуди спектра квазіпружно розсіяного світла (яка пропорційна концентрації клітин у досліджуваному мікроб'ємі суспензії) та півширини спектра, яка залежить як від дифузійного руху, так і від власної рухливості мікроорганізмів.

Статистичні методи обробки отриманих експериментальних даних.

Наукова новизна одержаних результатів полягає в тому, що вперше досліджено вплив короткотривалого опромінювання ЕМВ з щільністю потужності 20-50 мкВт/см2 у діапазоні 41,70-41,80 ГГц на синхронізовану охолоджену культуру дріжджів S. cerevisiae раси XII. Для цього вивчено контрольні та опромінювані культури, які потім інкубувалися в однакових (оптимальних) умовах. Експериментально визначено смугу активних частот, півширина якої становить 0.003 ГГц. Встановлено, що ефективна тривалість дії ЕМВ НВЧ на клітини S. cerevisiae становить 5-10 хв., що є значно меншим тривалості клітинного циклу. Після одноразового опромінювання культури на стимулюючій частоті збільшення швидкості зростання клітинності у порівнянні з контролем зберігається упродовж 20-100 генерацій клітин. Співвідношення живих і мертвих клітин у культурі дріжджів після опромінювання змінюється в залежності від частоти ЕМВ.

Вперше спостережено залежність руху бактерій E. coli і зелених водоростей D. viridis від градієнта ЕМВ НВЧ у середовищі. Визначено характерний час реакції рухомих клітин D. viridis і бактерій E. coli на дію ЕМВ НВЧ, який становить 4-5 хвилин. Експериментально доведено, що вплив ЕМВ НВЧ на суспензії клітин D. viridis і бактерій E. сolі не пов'язаний з термотаксисом, зміною в'язкості середовища, або конвекцією в опромінюваній зоні.

Показано, що при підвищенні температури від +(18-20)C до оптимальної для даного виду мікроорганізмів (+30C для водорості D. viridis і +37 C для бактерій E.сolі ) рухова активність клітин зростає і біологічна дія ЕМВ НВЧ поступово зменшується.

При пошкодженні мембран водорості детергентом в сублетальній концентрації таксис клітин під дією ЕМВ НВЧ послаблюється. Наявність у середовищі L-серину у концентрації 10-3 М (що блокує терморецептори E. сoli) пригнічує таксис бактерій E. сoli під дією ЕМВ НВЧ.

Теоретичне і практичне значення отриманих результатів. Запропоновано модельні системи, яки можна використовувати для створення біологічних сенсорів низькоінтенсивних ЕМВ НВЧ. Розроблено метод реєстрації спектру дії ЕМВ на культури дріжджових клітин, який відрізняється необхідністю попереднього охолодження суспензії клітин S. cerevisiae до +40С для синхронізації фаз клітинного циклу. Знайдено активні частоти ЕМВ у діапазоні 37-53 ГГц ( 41,747 ГГц, 37,5 ГГц, 42,2 ГГц ), а також ефективні експозиції ЕМВ НВЧ, що здатні спричиняти зміни у швидкості зростання клітинності S. cerevisiae і впливати на рухову активність E. coli та D. viridis, які можуть бути рекомендовані для біотехнологічних методик з використанням ЕМП.

Отримані дані про поступове зменшення чутливості живих клітин до дії ЕМВ НВЧ при зростанні температури дають можливість уточнювати теоретичні моделі механізмів дії ЕМВ НВЧ.

Результати експериментів відкривають нові можливості керування чутливістю клітин до дії ЕМВ НВЧ, вдосконалення біотехнологій із використанням мікрохвиль, розробку засобів захисту живих організмів від дії зовнішніх ЕМВ НВЧ.

Дисертантом отримано авторське свідоцтво на спосіб вирощування дріжджів (спільна робота з Національним університетом харчових технологій).

Особистий внесок автора дисертації. Дисертантом самостійно здійснено огляд експериментальних робіт стосовно дії низькоінтенсивного ЕМВ НВЧ на мікроорганізми, проаналізовано існуючи причини розбіжності результатів. Автор безпосередньо брала участь у розробці методик досліджень, виконанні біофізичної частини дослідів (пов'язаної з опромінюванням суспензій клітин). Узагальнення положень та висновків роботи здійснено спільно з науковим керівником д.б.н. О.М. Васильєвим.

Апробація результатів дисертації. Основні результати доповідалися на наукових семінарах та оприлюднені на 8 вітчизняних і міжнародних конференціях: «Фундаментальные и прикладные аспекты применения миллиметрового электромагнитного излучения в медицине. I Всесоюзный симпозиум с международным участием» (10-13 мая 1989 г., Киев, ВНК «Отклик»); Elecromagnetic Aspects of Selforganization in Biology, July 9-12, 2002, Prague, Czech Republic; ІІІ з`їзд УБФТ, Львів, 8 - 10 жовтня 2002 р.; 13-а Міжнародна Кримська конференція «СВЧ-техника и телекоммуникационные технологии.» КрыМиКо, 2003, Севастополь; V Международный симпозиум по электромагнитной совместимости и электромагнитной экологии ЭМС - 2003, С-Петербург, 16-19 сентября 2003 г.; IX Міжнародна конференція з квантової медицини. - ЗАО “Ассоциация “Темп”.-2004 г.; І Українська наукова конференція “Проблеми біологічної і медичної фізики”. 20-22 вересня 2004, Харків; “Coherence and Electromagnetic Fields in Biological Systems” Froehlih Centerary International Symposium. -July 1-4- Prague - Czech Republic.-2005.

Основні результати дисертаційної роботи О.І. Ніжельської (Караченцевої) викладено у 11 наукових працях, в тому числі - у 5 статтях в наукових фахових журналах і 6 тезах доповідей на конференціях та авторському свідоцтві на винахід.

Структура дисертації. Дисертація складається із вступу, чотирьох розділів, висновків, переліку посилань з 146 джерел, із них 12 англомовних. Загальний обсяг роботи 122 сторінки машинопису, вона містить 18 рисунків і 17 таблиць.



ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У Вступі обґрунтовано актуальність теми дисертаційної роботи, сформульовано мету і завдання досліджень, визначено наукову новизну та практичне значення отриманих результатів, викладено головні відомості про апробацію результатів і особистий внесок здобувача.

У розділі «Огляд літератури» висвітлюються актуальні проблеми взаємодії слабких надвисокочастотних полів з живими організмами. На даний час не створено теорії, яка б охоплювала усі спостережені явища. Міліметрові (f = 30-300 ГГц) електромагнітні хвилі стають глобальним фактором довкілля завдяки новітнім технологіям зв'язку. Важливими є дані, що НВЧ-випромінювання впливає на поведінку живих істот (на всіх рівнях) і на генетичну програму клітин. Це свідчить про те, що в живих організмах існують структури, які можуть сприймати НВЧ-поле. У багатьох експериментах спостерігається частотно-селективна залежність біологічного ефекту ЕМВ НВЧ. Розглянуто теоретичні моделі рецепції НВЧ біологічними системами (вплив на водну матрицю, коливання заряджених частин мембрани, когерентні осциляції макромолекул, солітонний транспорт енергії, коливання ДНК, РНК у діапазоні 1010 - 1011 Гц, вплив на активність ферментів, клітина як коливальний контур, спінові моделі, нелінійне резонансне тунелювання тощо).

У розділі «Матеріали та методи» викладено методики досліджень дії ЕМВ НВЧ на швидкість росту культури дріжджів і рухову активність джгутикових мікроорганізмів.

Дослідження проводили на спиртових дріжджах S. cerevisiae раси XII (культури отримані в Національному університеті харчових технологій). Біологічний матеріал представляв собою суспензію дріжджових клітин з концентрацією 1.5 - 2.0 108 клітин/см3. Клітини закругленої форми з діаметром 10-20 мкм, мають щільну оболонку і розмножувалися брунькуванням. Період між поділами даної раси дріжджів - 1 год. 20 хв. Вік культури клітин - 24-72 години. До початку опромінювання суспензію дріжджових клітин охолоджували у термостаті при t = +4C. Опромінювання проводили у чашках Петрі діаметром 7 см. Об'єм зразків -7 см3. Контрольні зразки суспензії витримували в установці при вимкненому генераторі ЕМВ НВЧ. Джерелом лінійно поляризованого ЕМВ НВЧ слугували генератори Г4-141 з робочим діапазоном частот 37-53 ГГц. Вимірювання абсолютного значення частоти ЕМВ НВЧ здійснювалося за допомогою перетворювача частоти автоматичного ЯЗЧ-72 і частотоміру електронно-лічильного Ч3-54 з точністю до 1 МГц. Нестабільність частоти ЕМВ НВЧ під час експерименту оцінювали, використовуючи аналізатор спектру. Потужність випромінювання на виході НВЧ-генератора регулювалася у межах 1-3 мВт. Випромінювання за допомогою рупорної антени подавалося на чашку Петрі знизу - середня щільність падаючої потужності становила 20-50 мкВт/см2. Для уникнення ефектів стоячих хвиль змінювалася відстань між випромінювачем та зразками, використовувалися тефлонові підставки та мішалки. Після обробки усі зразки переносили до пробірок, охолоджували до t= +4C та зберігали у термостаті. Суспензія клітин з кожної пробірки після перемішування засівалася по 5 см3 у стерильне поживне середовище (100 см3). Інкубація відбувалася у термостаті при t= +30C. Після 20-24 год інкубації колби виймали, суспензію перемішували, відбирали стерильною піпеткою проби, розводили дистильованою водою (5 см3 : 100 см3) і спостерігали під мікроскопом. Концентрація визначалася підрахунком кількості клітин у 5 великих квадратах камери Горяєва. Для зручності порівняння результати у кожній серії зразків нормувалися на середнє значення контролю.

Досліди із впливу ЕМВ НВЧ на рухову активність клітин проводилися з культурами галофільної одноклітинної зеленої водорості Dunaliella viridis Teod.42. Зразки отримані в Інституті ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України. Форма клітин є радіально-симетричою, розміри у межах: довжина 2,8 - 40 мкм, ширина 1,5-20 мкм. Клітини водорості мають лише тонку протоплазматичну мембрану, зовні покриту слизом. Поверхня клітин має негативний електричний заряд. По джгутиках на опуклому кінці клітини проходять хвилеподібні коливання, відтак клітини здатні рухатися у будь-якому напрямку. Види Dunaliella стійкі до високих та низьких температур, різких температурних перепадів. Оптимальна температура для життєдіяльності +30С.

Другим тест-об'єктом для реєстрації дії НВЧ-поля на клітини були культури Escherichia coli, серотип О26:В6 з колекції Інституту ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України. Бактерії E.coli однорідні за розміром (до 1 мкм ), за формою видовжені еліпсоїди обертання, не фототропні, оптимальна температура +37С .

Для дослідження рухової активності клітин застосовано метод квазіпружного розсіювання світла, або лазерну кореляційну спектроскопію (ЛКС). Стабільна зондуюча лазерна частота зазнає малих зсувів, які зумовлені рухами розсіювачів у розчині (допплер-ефект). Як джерело використовували гелій-неоновий лазер (довжина хвилі =632,8 нм, червоне світло) або аргоновий лазер (довжина хвилі =488 нм, зелене світло). Інтенсивність лазерного випромінювання ~ 30 мВт. Опорний промінь від лазера формувався системою лінз та діафрагм, проходив крізь циліндричну кварцову кювету з досліджуваною суспензією, де розсіювався на частинках. Концентрація клітин у зразку обиралася за умови однократного світлорозсіювання. Розсіяне світло реєструвалося фотопомножувачем, кут спостереження = 90о. Далі фотострум аналізувався багатоканальним спектральним приладом. Кожний експериментальний спектр нормувався на амплітудно-частотну характеристику приймальної апаратури, а потім проводилося обчислення його параметрів. Похибка вимірювань становила 2%.

Було перевірено дію світла на суспензію мікроорганізмів. Зелене лазерне світло нейтральне для водорості D. viridis. Бактерії кишкової палички E. coli не є фототропними, тому будь-яке світло видимого діапазону не впливає на їхні рухи і може застосовуватися як зондуюче.

Джерелом НВЧ-випромінювання слугували генератори Г4-141 і Г4-142 з діапазоном частот 37-78 ГГц. Нестабільність частоти під час досліду 0.003 ГГц, інтенсивність випромінювання на виході генератора 3 мВт. НВЧ-випромінювання за допомогою гнучкого тефлонового хвилеводу із загостреним кінцем, що пропускався через ізолюючу кришку, підводилося до поверхні суспензії клітин у кюветі.

Спектр квазіпружно розсіяного світла має вигляд розподілу Лоренца і може бути описаний чотирма параметрами [Лебедєв,1987]. Сумарна амплітуда спектра А (ум.од.) пропорційна концентрації клітин у підповерхневому шарі суспензії. За значенням середньої за розподілом півширини спектра Г0 (Гц) можна визначити коефіцієнт трансляційної дифузії частинок D= Г0 / q2 де q= 4 n / sin(/2), і за співвідношенням Стокса-Ейнштейна обчислити середній гідродинамічний діаметр частинок. Водночас величина Г0 відображає всю сукупність наявних рухів певного об'єкта і може бути застосована для оцінки рухової активності клітин.

Статистична обробка результатів експериментів мала за мету:1) визначення умов приготування тест-об'єктів (культур мікроорганізмів) для реєстрації біологічної дії слабкого ЕМВ НВЧ (варіювалися вік культур, температура, поживне середовище, синхронізація). 2) відбір оптимальних методів для реєстрації біологічної дії ЕМВ НВЧ. 3) перевірку гіпотез про дію певних частот ЕМВ міліметрового діапазону на культури S. cerevisiae, D. viridis, E. coli. Для цього насамперед досліджувалися контрольні параметри зростання і руху клітин. Порівняння вибірок здійснювалося за t-критерієм Ст'юдента [Лакин,1973]. Відмінності на рівні 0,99 вважалися достовірними, при 0,8 - 0,9 не є значущими, при рівні 0,95- 0,98 вважалося, що існує тенденція до певної зміни під впливом ЕМВ НВЧ.

У розділі «Результати та їх обговорення» наведено залежності біологічної дії НВЧ-поля від його частоти та експозиції.

Для синхронізації клітин S. cerevisiae зразки охолоджували до t=+4C. Вимірювали концентрацію клітин N після опромінення та інкубації. В цьому відмінність наших експериментів від робіт інших авторів, коли культури дріжджів опромінювали під час росту, в активному стані, і одночасно вивчали їхнє розмноження. Експериментально визначена смуга стимулюючих частот ЕМВ НВЧ 41,75-41,76 ГГц (рис.1).

Рис. 1. Відносна концентрація клітин N/N0 у культурах S. cerevisiae після опромінення протягом 5 хвилин та інкубації 24 години у порівнянні з контролем

Для визначення впливу тривалості дії ЕМВ НВЧ на ріст клітин зразки суспензії опромінювали на «активній» частоті за вищенаведеною методикою. Залежність відносної концентрації клітин S. cerevisiae від тривалості опромінення на стимулюючий частоті має нелінійний характер. Оптимальна тривалість дії на клітину становить 8-10 хвилин, що на порядок менше тривалості клітинного циклу. Збільшення часу експозиції може призвести до зменшення ефекту опромінення. Встановлена залежність з насиченням свідчить про специфічну (нетеплову) дію ЕМВ НВЧ.

Ріст культур вивчався у динаміці. Зразки після опромінення з експозицією 8 хвилин зберігали у холодильнику при t= +4C на протязі 13 годин, далі вони були висіяні у стерильне поживне середовище та росли у термостаті при t= +30C. З інтервалом у 2-3 години відбирали проби і визначали концентрацію клітин у зразках. Різниця у швидкості зростання контрольних і опромінюваних культур виявилася вже через 2 години та досягла максимуму через 15 годин. В інтервалі від 2 до 10 годин залежність кількості клітин N від часу t описується експонентою: N=N0 ekt. Показники k1 і k2 для контрольної і опромінюваної культур такі: k1 = 0,25 0,03 год-1, k2 = 0,32 0,04 год-1. Призупинення росту обумовлене вичерпанням запасу поживних речовин у обмеженому об'ємі суспензії. При тривалих дослідах, щоб зняти обмеження за поживними речовинами, зростаючі культури дріжджів пересівали у свіже стерильне середовище. Початкові концентрації клітин у зразках були вирівняні. Встановлено різницю у швидкості росту однократно опромінених і контрольних культур, яка зберігалася при інкубуванні на протязі принаймні 8 діб з трьома пересіваннями культур, що відповідає більше, ніж 100 генераціям.

Після підрахунку клітин під мікроскопом, забарвлюючи зразок метиленовим синім, перевіряли наявність мертвих клітин. У контрольних зразках суспензії 1-2% мертвих клітин є звичайним співвідношенням. В культурах, які опромінювалися на стимулюючих частотах, та після 20 годин інкубації дали максимальне (у 1,6 - 2,3 разів) збільшення клітинності, були присутні лише живі клітини або 1 мертва на 250-300 живих. Важливо, що цей вплив визначався не на безпосередньо опромінюваних зразках S. cerevisiae, а приблизно на двадцятому поколінні клітин. Деякі частоти ЕМВ НВЧ, не змінюючи загальної концентрації клітин у культурі після опромінювання та інкубації, збільшували частку мертвих клітин до 7-13%. Різниця зі стимулюючою частотою становила ~ 20 МГц або ~7 МГц.

Ефект стимулюючого впливу однократного опромінення ЕМВ НВЧ визначено із використанням методу підрахунку колоній. Контрольні і експоновані по 5 хвилин зразки суспензії послідовно розводилися стерильним фізіологічним розчином (1 : 9), проба з шостого розведення висівалася на поверхню густого сусло-агару у чашці Петрі. Після інкубування у термостаті при +37С протягом 24 годин підраховувалася загальна кількість колоній клітин N у кожній чашці Петрі. Встановлено «резонансну залежність» біологічного ефекту від частоти ЕМВ (рис.2). Півширина лінії ~ 3 МГц. Добротність резонансу становить 3 МГц / 41747 МГц ? 7 •10-4.

Рис.2. Кількість колоній N після опромінення культур S. cerevisiae ЕМВ протягом 5 хвилин та наступного інкубування у термостаті протягом 24 годин

ЕМВ НВЧ взаємодіє з клітинами не однаково. Опромінювання не може прискорити темп ділення молодих, активно зростаючих клітин, оскільки він обмежений швидкістю біосинтезу. Імовірно, що сприйнятливими до ЕМВ НВЧ є клітини з уповільненим або порушеним перебігом біосинтетичних реакцій: дія ЕМВ стимулюючої частоти повертає їх до нормального темпу ділення.

Досліджуючи зміни у русі мікроорганізмів під дією певного зовнішнього чинника, можна зробити висновки щодо біологічного значення цього чинника.

Зазвичай вимірювання методом ЛКС проводяться усередині об'єму зразка, щоб уникнути граничних ефектів різної природи [Лебедєв, 1987]. Для вивчення дії ЕМВ НВЧ необхідно створити дуже тонкий (~ 0,1 мм) шар суспензії між поверхнею рідини та лазерним променем. На такий установці в Інституті біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України проводили вимірювання коефіцієнту трансляційної дифузії, але зміни під впливом міліметрового випромінювання були незначними, тому їх було важко інтерпретувати. В процесі досліджень вперше встановлено значні зміни сумарної амплітуди спектра А при дії НВЧ- поля на суспензію рухомих клітин.

Седиментація суспензії клітин Dunaliella viridis у стаціонарній фазі росту при +20С без опромінювання ЕМВ НВЧ завжди є монотонною (переважним є пасивний рух клітин під дією сили тяжіння). Під дією ЕМВ НВЧ осідання клітин порушується: в підповерхневому шарі суспензії виникають колективні рухи клітин у напрямку до джерела впливу та від нього.

Зміна сумарної амплітуди спектра А під дією ЕМВ частотою 37,5 ГГц на клітини D. viridis показана у табл.1. А -- амплітуда спектра (концентрація клітин, ум.од.) при дії ЕМВ НВЧ. Початкова концентрація клітин у досліджуваних зразках суспензії була різною. Для оцінки впливу ЕМВ НВЧ на даний зразок суспензії водорості розглядається відношення сумарної амплітуди спектру А при дії НВЧ і контрольної сумарної амплітуди спектру А. Це дає можливість в подальшому автоматизувати весь процес тестування біологічної дії ЕМВ НВЧ на активний рух клітин.



Таблиця 1 - Дія ЕМВ 37.5 ГГц на зразки D. viridis за даними квазіпружного розсіювання світла

Сумарна амплітуда спектра А (НВЧ- поле відсутнє)	Сумарна амплітуда спектра А (НВЧ- поле 37,5 ГГц)	Відношення А/ А
1503 34	369 7	0,24*
676 14	67,2 4	0,10*
258 5	19,3 2,5	0,07*
442 9	34 3,2	0,08*
375 8,4	66 4	0,18*
1717 22	1245 23	0,73
575 13	343 9	0,60
523 12	382 10	0,73
322 8	175 5,5 ; 113 4,3	0,54*; 0,35*
101 3,2	71 2,0	0,70
276 7,5	74 1,9	0,27*
398 9	212 5	0,53*
200 4,4	124 2,2	0,62

* p < 0,01 зміни концентрації у порівнянні з контролем

Обробка даних по сумарній амплітуді спектрів у присутності ЕМВ НВЧ (А) та у його відсутності (А) за критерієм Ст'юдента свідчить про відмінність даних на рівні 99,9%. Таким чином, t-статистика, і просте відношення А/ А надають той же самий результат щодо впливу ЕМВ певної частоти на клітини.

У табл. 2. наведені зміни сумарної амплітуди спектра А під дією ЕМВ частотою 41,76 ГГц на суспензію водорості D. viridis. Частота 41,76 ГГц обрана тому, що вона стимулює ріст культури дріжджів S.cerevisiae.

Таблиця 2 - Дія ЕМВ 41,76 ГГц на зразки D. viridis за даними квазіпружного розсіювання світла

Сумарна амплітуда спектра А (НВЧ- поле відсутнє)	Сумарна амплітуда спектра А (НВЧ- поле 41,76 ГГц)	А/ А
637 14	812 12,5	1,27
694 15,5	986 20	1,42
758 14	883 23	1,16
683 13	671 15	0,98
991 24	473 11	0,48
940 21	828 18	0,88
355 7,5	663 13,5	1.87
426 5	657 7	1,54
526 9	1130 24	2,15
425 7,5	545 11	1,28
600 13	617 14	1,03

Відмінність концентрації на рівні p < 0,1, існує тенденція до позитивного таксису клітин до джерела ЕМВ з частотою 41,76 ГГц.

Дія на водорості D. viridis додецилсульфату натрію (ДСН) та ЕМВ НВЧ. Перевірялося, чи впливають пошкодження мембран клітин поверхнево- активною речовиною на чутливість водоростей до ЕМВ НВЧ. Для визначення цього зразки суспензії, контрольні, та оброблені ДСН в концентраціях 0,1, 1,0, 10,0 та 50,0 мг/л опромінювали на «активних» частотах за тією ж самою методикою. Відношення кількості клітин під впливом ЕМВ НВЧ А до вихідної кількості клітин водорості А в більшості дослідів значно відрізнялося від одиниці, що вказує на колективний рух клітин під дією НВЧ. В порівнянні з контролем (клітини, не пошкоджені ДСН) таксис послаблювався, причому це спостерігалося вже при 0,1 мг/л ДСН, і не залежало істотним чином від концентрацій детергенту в середовищі. Те, що водорості продовжують реагувати на ЕМВ тої ж самої «активної» частоти, може свідчити про механізм сприйняття НВЧ-поля не на рівні мембрани як цілого, а на рівні її окремих компонентів (зокрема мембранних інтегральних білків).

Оскільки зі зміною температури змінюється стан клітин водорості, швидкість їхніх власних рухів та метаболічних процесів [Громов, 1977], то важливо простежити, як температура впливає на сприйняття клітинами ЕМВ НВЧ. Із підвищенням температури до +30С зростає активність клітин водорості, крім збільшення півширини спектра Г0 зростають флуктуації сумарної амплітуди А. Седиментація порушується власною рухомістю клітин і стає немонотонною, на цьому фоні зміни концентрації клітин під впливом ЕМВ НВЧ важко відокремити. Знизити рівень власних флуктуацій у тест-об'єкті можна, знижуючи температуру та обираючи культури з уповільненими процесами (в стаціонарній фазі росту).

Заміри температурних полів дали значення компонент температурного градієнта, що виник під дією ЕМП: вертикальна складова 0,3 С/мм, горизонтальна 0,02 С/мм. Це нагрівання було у межах коливання температури суспензії в кюветі під час досліду. Для визначення теплового впливу на суспензію методом ЛКС перевірялася реакція рухомих клітин при температурі +20С на джерело тепла (інфрачервоне випромінювання). При потужності нагрівача у межах 3-10 мВт сумарна амплітуда спектра не змінювалася. При збільшенні потужності нагрівача до 20-35 мВт сумарна амплітуда спектра зростала, клітини виявляли позитивний термотаксис. Таким чином, підвищення температури води при поглинанні НВЧ-випромінювання не могло спричинити негативний таксис клітин.

Для перевірки термокапілярних ефектів (пасивного руху частинок під впливом НВЧ-поля на середовище) досліджувалися спектри квазіпружного розсіювання світла на суспензіях вірусу тютюнової мозаїки, а також бактерій і водоростей, до яких додавалася крапля формаліну. Клітині, позбавлені активного руху, не реагували ні на джерело тепла, а ні на ЕМВ НВЧ.

Перевірки методом ЛКС показали, що суспензія клітин E. coli є стійкою до осідання завдяки малим розмірам бактерій. Після встановлення контрольного рівня амплітуди спектра А вмикали генератор ЕМВ НВЧ (рис.3). Як видно, бактерії швидко починали реагувати на появу ЕМВ НВЧ, залишаючи зону опромінювання.

Діючі частоти вибрані тому, що ЕМВ з частотою 37,5 ГГц виявило вплив на водорості, а частота 42,2 ГГц викликала синтез коліцину та летальний ефект для бактерій E. сoli [Віленська, Смолянська, 1973, Беляєв, 1993].

На зразках із однієї культури E. colі досліджувався вплив різних частот ЕМВ (табл.3.). Потужність випромінювання 3 мВт. Зразки готувалися на профільтрованому живильному середовищі. Температура +(23-24)С.

Таблиця 3 - Дія ЕМВ на клітини E. сoli за даними квазіпружного розсіювання світла

Частота ЕМВ НВЧ	Середня сумарна амплітуда спектра А п-1, ум.од.	А/А	Середня півширина спектра Г0 п-1 , Гц
--	401 ± 32	1,17	166 ± 8
40,0 ГГц	471 ± 20		178 ± 2
--	413 ± 32	1,51*	183 ± 10
46,0 ГГц	623 ± 47		190 ± 3
--	110 ± 8	0,62*	155 ± 9
50,0 ГГц	68 ± 6		175 ± 10

* p < 0,005

Мікробіологічні дані свідчать, що швидкість процесу адаптації бактерій E. coli зростає з температурою. У табл. 4. наведено параметри спектрів квазіпружно розсіяного світла без високочастотного поля та під впливом ЕМВ НВЧ на один і той же зразок суспензії E. coli за різних температур. Вік культури 4 доби. При температурі +24С клітини E. coli залишають опромінюваний об'єм (відносна зміна сумарної амплітуди спектра А/А 0,73). При цьому значення середньої півширини спектра Г0 не відрізняються. При температурі +30С, яка є сприятливішою для бактерій, концентрація клітин під дією ЕМВ НВЧ не змінюється (А/А 1,02), але рухливість опромінених бактерій (Г0, Гц ) дещо зменшується.



Таблиця 4 - Залежність реакції клітин E. coli на ЕМВ НВЧ від температури за даними квазіпружного розсіювання світла

t ,o С	ЕМВ НВЧ	Середня сумарна амплітуда спектра А п-1, ум.од.	Середня півширина спектра Г0 п-1, Гц
+24С	--	654 ± 60	167 ± 13
	46,03 ГГц	473,8 25*	162,6 2
+30С	--	544,8 55	204,3 6
	46,03 ГГц	553,08 79	187,0 12

* відмінність від контролю на рівні p < 0,05

Вік культури E. coli 1 доба. Частота ЕМВ 37,5 ГГц, потужність випромінювання генератора 3 мВт. Кювета термостатована (табл.5).

Таблиця 5 - Залежність чутливості клітин E. coli до дії ЕМВ 37,5 ГГц від температури за даними квазіпружного розсіювання світла

t ,o С	ЕМВ НВЧ	Середня сумарна амплітуда спектра А п-1, ум.од.	Середня півширина спектра Г0 п-1, Гц
+24С	--	241,4 23	185,2 1,4
	37,5 ГГц	167,2 15*	178.3 1,2
+28С	--	301,7 34,8	322.6 15,2
	37,5 ГГц	267,5 42,6	316.1 3,7

* відмінність від контролю на рівні p < 0,05

З підвищенням температури реакція бактерій на ЕМВ НВЧ зменшується: при +24С А/А 0,69 та 0,73; при +28С А/А 0,89; при +30С А/А 1,02. Як і для водорості D. viridis, сумарна амплітуда спектра квазіпружного розсіювання світла є придатнішим параметром для оцінки дії ЕМВ НВЧ на суспензію клітин, ніж півширина спектра. Біологічна дія ЕМВ НВЧ оцінена кількісно як відношення концентрацій рухомих клітин при опроміненні фіксованого об'єму і за відсутності НВЧ-поля. Ця величина відтворюється при заданих параметрах експерименту (частота ЕМВ НВЧ, вік культури клітин, склад середовища, температура).

L-серин є потенційним інгібітором термочутливості Escherichia coli [Maeda K., Imae Y. 1979]. На середовищі для E.сoli був приготовлений розчин L-серину (молекулярна вага 105,09) концентрації 10-3 М. Суспензію бактерій опромінювали ЕМВ НВЧ при різних температурах. Результати наведені у табл.6. L-серин у концентрації 10-3 М пригнічує чутливість бактерій E. сoli до ЕМВ НВЧ з активною частотою 37,5 ГГц.

Таблиця 6 - Вплив температури та L-серину на сприйняття бактеріями ЕМВ НВЧ за даними квазіпружного розсіювання світла

t,o С	Концетрація L-серину	ЕМВ НВЧ	А п-1	А/А	Г0 п-1 , Гц
+24С	0	--	235,8 38,7	0,65*	208,6 6,4
		37,5 ГГц	153,4 14,9		188,1 4,5
+30С		--	240,3 31,2	1,02	299,4 6,7
		37,5 ГГц	246,1 6,2		294,5 5,4
+24С	10-3 М	--	297,3 43,2	0,99	204,7 8,4
		37,5 ГГц	295,9 8,8		198,6 0,9
+30С		--	278,8 56,5	1,04	216,4 5,0
		37,5 ГГц	290,9 23,8		199,8 21,7

* p < 0,05

В розділі 4 подано методичні рекомендації щодо оптимізації експериментальних досліджень реакції культур клітин на слабке ЕМВ НВЧ. Обґрунтовано необхідність опромінювання клітин при температурі нижче за оптимальну для даного виду мікроорганізмів.

Зовнішні поля, в яких формується система, сприяють відбору таких її станів, які є найбільш стійкими в даних умовах. При цьому створюються молекулярні структури-рецептори, здатні сприймати сигнал та його зміни у часі і просторі, вдосконалюються зв'язані з ними системи реагування: в найпростішому вигляді це рух від шкідливого для клітини місця до сприятливого. Просторові заряджені структури, які здатні сприймати електромагнітне НВЧ-випромінювання, можливо не є стабільними, а виникають в живій клітині на певний час.

Вплив на структуровану воду в біологічному об'єкті утруднений [Семихіна, 2006] і потребує не збільшення потужності діючого поля, а підбору додаткових умов опромінювання для отримання резонансу. В такому аспекті можна пояснити і залежність біоефектів від частоти. Біологічне значення окремих частотних смуг ЕМВ НВЧ імовірно пов'язано зі змінами (колективними) конформації макромолекул, причому резонансна частота зміни конформації визначається як властивостями молекули (домену, ділянки ліпідної мембрани), так і її гідратних оболонок.



ВИСНОВКИ

В роботі вперше досліджено післядію короткотривалого опромінювання ЕМВ НВЧ з щільністю потужності 20-50 мкВт/см2 на охолоджені синхронізовані культури дріжджів Saccharomyces cerevisiae раси XII. Встановлено частотну залежність дії ЕМВ у діапазоні 41,70-41,80 ГГц на досліджувану культуру клітин після одноразового опромінення та інкубації.

Експериментально визначено частоту максимуму (41,747 ГГц) та півширину (0,003 ГГц) резонансної лінії у спектрі дії ЕМВ НВЧ на культури S. cerevisiae. Прискорення швидкості росту клітинності дріжджів виявляються не лише у безпосередньо опромінених клітин, а у їхніх наступних 20-100 генераціях.

Встановлено, що ефективний час експозиції ЕМВ НВЧ на клітини Saccharomyces cerevisiae значно менше тривалості клітинного циклу даної культури.

Запропоновано і експериментально апробовано методику дослідження дії ЕМВ НВЧ на рухову активність джгутикових мікроорганізмів за допомогою методу квазіпружного розсіювання світла. Біологічна дія ЕМВ НВЧ оцінена кількісно як відношення концентрацій рухомих клітин при опроміненні фіксованого об'єму і за відсутності НВЧ-поля. У діапазоні 37-65 ГГц не спостерігалося вузьких «резонансів», але існує певна частотна залежність: знайдено «аттрактивні» (41,76 ГГц, 46,0 ГГц), нейтральні (55,0 ГГц та 61,3 ГГц) і «негативні» (37,5 ГГц, 42,2 ГГц та 50 ГГц) частоти НВЧ для водоростей і бактерій.

Методом квазіпружного розсіювання світла показано, що при підвищенні температури від +(18-20)C до оптимальної для даного виду мікроорганізмів (+30C для водорості Dunaliella viridis і +37 C для бактерій E.сolі ) рухова активність клітин зростає, і біологічна дія ЕМВ НВЧ зменшується.

При експериментальному пошкодженні мембран водорості D. viridis поверхнево активною речовиною ДСН у концентраціях 0,1 - 50,0 мг/л таксис клітин під дією ЕМВ НВЧ послаблюється.

Блокування терморецепторів E.сoli L-серином у концентрації 10-3 М пригнічує таксис бактерій E. сoli під дією ЕМВ НВЧ.



ПЕРЕЛІК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Левчук Ю.Н. Радиорецепция высокочастотного электромагнитного поля клетками Escherichia coli / Левчук Ю.Н., Караченцева А.И. // Доклады Академии наук УССР. - Сер.Б. - 1989. - № 5. - С. 65-69 (здобувачем проведено експериментальні дослідження, статистичну обробку даних, разом із співавтором зроблено аналіз результатів і висновки).

2. Караченцева А.И. Подвижные микроорганизмы как сенсоры высокочастотного электромагнитного и биологического поля / Караченцева А.И. // Биополимеры и клетка. - 1989. - Т.5, № 4. - С.76-83. (здобувач брала участь у виконанні експериментальної частини роботи. Узагальнення результатів зроблено разом з співавтором).

3. Нижельская А.И. Оптимизация экспериментальных исследований резонансной реакции Saccharomyces cerevisiae на воздействие ЭМИ миллиметрового диапазона / Нижельская А.И., Якунов А.В.// Фізика живого.- 2004.- Т.12,№1.- С.53-62. (здобувачем здійснено огляд і аналіз літературних даних з проблеми, поставлено завдання дослідження, взята безпосередня участь в експериментах. Разом з співавтором здійснено обробку результатів і висновки).

4. Ніжельська О.І. Дослідження сприйнятливості популяцій рухомих бактерій Escherichia coli та зелених водоростей Dunaliella viridis до дії електромагнітного випромінювання мм діапазону / Ніжельська О.І., Косицький М.М. // Фізика живого. - 2005.- Т.13, №2.- С.61-7. (здобувачем сформульовано завдання дослідження і виконано біофізичну частину експериментів. Узагальнення результатів здійснено разом з співавтором).

5. Kositsky N.N. Influence of High-frequency Electromagnetic Radiation at non-thermal Intensities on the Human Body (a review of work by Russian and Ukrainian researchers) / Kositsky N.N., Nizhelska A.I., Ponezha G.V. // No Place to Hide. - 2001. - Vol.3, No 1- Р. 1-31. (здобувачем виконано огляд і аналіз літературних даних з впливу надвисокочастотних електромагнітних випромінювань на мікроорганізми, рослини, тварини і людей. Разом з співавторами проведено узагальнення і запропоновано подальші дослідження).

6. Способ выращивания дрожжей: А.с. 1564189 СССР / Кислая Л.В., Караченцева А.И., Маринченко В.А., Белый М.У., Андреев Е.А., Маринченко Л. В., Якунов А.В. ; Заявл. 05.07.1988г. Опубл.15.05.90. - Бюл. № 18.- 4 с. (здобувач приймала участь у проведенні експериментів. Обробку результатів здійснено разом з співавторами).

7. Нижельская А.И. Экологические аспекты низкоинтенсивного микроволнового электромагнитного излучения / Нижельская А.И., Косицкий Н.Н., Понежа Г. В., Понежа С.Г. : матеріали V міжнар. симп. [«Электромагнитная совместимость и электромагнитная экология ЭМС-2003»], (С.-Петербург, 16-19 вер. 2003р.). - С.-Петербург, 2003р. -С.422-426. (здобувачем зроблено огляд сучасних медичних, біофізичних, епідеміологічних даних у зв'язку з підвищенням мікрохвильового фону. Висновки здійснено разом з співавторами).

8. Нижельская А.И. Возможные экологические последствия широкого внедрения новой системы беспроводной цифровой связи ultra wide band (UWB) / Нижельская А.И., Хохлов В.В. : матеріали V міжнар. симп. [«Электромагнитная совместимость и электромагнитная экология ЭМС-2003»], (С.-Петербург, 16-19 вер. 2003р.). - С.-Петербург, 2003 р. -С.418-422. (за участю здобувача показана можливість застосування методу ЛКС для експрес-оцінки несприятливого екологічного впливу цифрового шуму).

9. Косицкий Н.Н. Электромагнитное излучение миллиметрового диапазона как экологический фактор на примере поведения клеток Saccharomyces cerevisiae, Escherichia coli и Dunaliella viridis / Косицкий Н.Н., Нижельская А.И. : матеріали IX міжнар. конф. [«Квантовая медицина»],-ЗАО “Ассоциация “Темп”, Донецьк, 2004.-С.67-69

10. Нижельская А.И. Реакция одноклеточных микроорганизмов на электромагнитное излучение миллиметрового диапазона. / Нижельская А.И.: матеріали І Української наук. конф. [«Проблеми біологічної і медичної фізики»], (Харків, 20-22 вересня 2004 р.). - Харків, 2004. - С.131.

11. Olena Nizhelska Frequency-temporal dependences of yeast cells response to nonthermal electromagnetic radiation of millimeter range / Olena Nizhelska, Mykola Kosytskyy [“Coherence and Electromagnetic Fields in Biological Systems” Froehlih Centerary International Symposium.], (Prague, July 1-4 2005). - Prague, Czech Republic.-2005.



АНОТАЦІЯ

Ніжельська О.І. Дія надвисокочастотного електромагнітного випромінювання на культури дріжджів Saccharomyces cerevisiae, бактерій Escherichia coli і водорості Dunaliella viridis - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.02- біофізика. Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Київ, 2008.

У дисертації розглянуто особливості експериментального дослідження впливу слабких електромагнітних надвисокочастотних випромінювань (ЕМВ НВЧ) на культури мікроорганізмів. Описано методи підготовки тест-культур, з використанням яких можна підвисити співвідношення сигнал/шум. При дослідженні післядії одноразового опромінювання НВЧ дріжджів S. сerevisiae виявлено зміни швидкості росту і життєздатності клітин у їхніх наступних генераціях. Методом квазіпружного розсіювання світла вперше показано, що для водорості D. viridis і бактерій E. coli дія НВЧ-поля викликає зміни рухової активності клітин, зокрема, таксис. За даними експериментів, ефективна тривалість дії ЕМВ НВЧ на мікроорганізми значно менше тривалості клітинного циклу. В роботі визначено частотні залежності (в тому числі гостро резонансні) біологічної дії ЕМВ НВЧ на культури мікроорганізмів, які узгоджуються з даними інших досліджень. Чисельне оцінювання біологічного ефекту при варіації умов експерименту дозволяє зробити висновок, що більш сприйнятливими до дії ЕМВ НВЧ є культури з уповільненими метаболічними процесами (в стаціонарній фазі росту, охолоджені, на збідненому поживному середовищі). Показано можливість регулювання біоефектів НВЧ за допомогою температури і хімічних сполук.

Ключові слова: ЕМВ НВЧ, нетеплові інтенсивності, частотна залежність, клітинний цикл, таксис.



АННОТАЦИЯ

Нижельская А.И. Действие электромагнитного излучения КВЧ-диапазона на культуры дрожжей Saccharomyces cerevisiae, бактерий Escherichia coli и водоросли Dunaliella viridis - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.02 - биофизика. Киевский национальный университет имени Тараса Шевченко, Киев, 2008.

В диссертации рассмотрены особенности экспериментального исследования влияния слабых электромагнитных излучений крайне высокой частоты (ЭМИ КВЧ) на культуры микроорганизмов. Описаны способы подготовки тест-культур, при использовании которых можно повысить соотношение сигнал/шум. При изучении последействия однократного облучения КВЧ дрожжей S. сerevisiae обнаружены изменения скорости роста и жизнеспособности клеток в последующих генерациях. С помощью метода квазиупругого рассеяния света впервые показано, что для водоросли D. viridis и бактерий E. coli КВЧ-поле вызывает изменения двигательной активности, в частности, таксис. Экспериментально установлено, что эффективная экспозиция ЭМИ КВЧ на микроорганизмы значительно меньше длительности клеточного цикла. В работе представлены частотные зависимости (в том числе острорезонансные) биологического действия ЭМП КВЧ на культуры микроорганизмов, которые согласуются с данными других исследований. Количественная оценка биологического эффекта при варьировании условий эксперимента позволяет сделать вывод, что более восприимчивы к действию КВЧ культуры с замедленными метаболическими процессами (в стационарной фазе роста, охлажденные до температур ниже оптимальной, при недостатке питательных веществ). Показана возможность регулирования биологических эффектов КВЧ с помощью температуры и химических соединений. Ключевые слова: ЭМИ КВЧ, нетепловые интенсивности, частотная зависимость, клеточный цикл, таксис. 

SUMMARY

Nizhelska O.I. Influence of microwave irradiation on the Saccharomyces cerevisiae yeast culture, bacteria Escherichia coli and green alga Dunaliella viridis - Manuscript.

Thesis for Candidate`s Degree in Biology by speciality 03.00.02 -biophysics. - Taras Shevchenko Kyiv National University, Kyiv, 2008.

Natural microwave background is very slight. The same biological subjects may give different responses (or zero reaction) after microwave exposure with certain frequency. These phenomena need more deep analysis to define the circumstances influencing a sensitivity of the cells to the weak microwaves. The different methods of registration of yeast growth under microwave exposure were looked through. The reasons of a spread of the results were discussed.The original method of yeast S. cerevisiae growing and exposing was described. The main difference from other works is that yeast culture should be cooled and synchronized before microwave irradiation. After that all samples (control and exposured) were put in a fresh medium and were grown at standart conditions. The concentration of the cells were counted by microscope through certain time. The frequency dependence of yeast growth were obtained. Time dependence of biological effect was significally non-linear. Optimal duration of the active EMR influence was about 5- 8 minutes.A dynamic of the yeast culture growth was studied. It was shown that irradiated samples had grown more quickly than the controls and reproduced this feature in the next generations of the cells. It points that genetic mechanisms were implicated here.

In the work the biological reactions of living cells were studied by quasi-elastic light scattering in real time. The suspensions of motile cells - bacteria E.coli and alga D.viridis were used. It was proved that a gradient of microwave EMF in the suspension caused a directed collective motion of bacteria E.coli and green alga. A heat effect was excepted by special checking. The new result was the active cells at their optimal conditions had a low sensitivity to microwave EMF. The cells with slow metabolic processes due to cooling and poor medium revealed a high sensitivity to microwave exposure. Thus the populations of well known cells like yeast, bacteria E.coli and green alga could be the test-subjects for estimation of biological activity of weak microwave fields. It has been shown that nonthermal millimeter EMF can influence as the informational signals for different cells. A duration of the exposure was about some minutes.It was confirmed that a sensitivity of living cells to microwaves is not a constant value but depends on an initial state of a cell, synchronization of cell culture and the surrounding factors like temperature.

Key words: microwaves, nonthermal intensities, frequency dependence, cell life cycle, taxis.

Размещено на Allbest.ru

...