Генетична структура та гібридизація диплоїдно-поліплоїдних щипівок роду Cobitis (Cypriniformes, Cobitidae) в Україні

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ КЛІТИННОЇ БІОЛОГІЇ І ГЕНЕТИЧНОЇ ІНЖЕНЕРІЇ

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Генетична структура та гібридизація диплоїдно-поліплоїдних щипівок роду Cobitis (Cypriniformes, Cobitidae) в Україні

03.00.15 - генетика

Павленко Людмила Іванівна

Київ - 2008

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у відділі еволюційно-генетичних основ систематики Інституту зоології ім. І. І. Шмальгаузена НАН України, м. Київ

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор

Межжерін Сергій Віталійович,

завідуючий відділом еволюційно-генетичних основ систематики Інституту зоології ім. І. І. Шмальгаузена НАН України

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Терновська Тамара Костянтинівна,

завідуюча кафедрою біології

Національного університету „Києво-Могилянська академія”

кандидат біологічних наук

Безруков Володимир Федорович,

доцент кафедри загальної та молекулярної генетики Київського національного університету імені Тараса Шевченка

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Структура й обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, семи розділів, висновків, списку літератури. Вона викладена на 148 сторінках, ілюстрована 16 малюнками й містить 41 таблицю. Список літератури налічує 190 джерел, 130 з яких надруковані латиницею.

Подяки. Особлива подяка науковому керівнику доктору біологічних наук, професору С. В. Межжеріну. Висловлюю також глибоку вдячність співробітникам Відділу еволюційно-генетичних основ систематики Інституту зоології ім. І. І. Шмальгаузена НАНУ за цінні поради, консультації та постійну методичну підтримку, персонально Алексєєвій Г.І. за допомогу в освоєнні методу електрофорезу, Л. В. Федоренко, Ф.Ф. Куртяку, Н.В. Роженко, Д.Б. Верлатому за допомогу при зборі матеріалу.

Огляд літератури

Явище гібридизації і поліплоїдії та їх значення у видоутворенні. Приведено класифікацію явища природної гібридизації (Майр, 1967). Підкреслюється, що на відміну від вищих хребетних явище гібридизації у кісткових риб досить поширене і саме тут знайдено більшість диплоїдно-поліплоїдних комплексів. Приводиться детальний огляд публікацій з генетичних досліджень, особливо тих, що спрямовані на вивчення структури природних поселень риб на підставі аналізу біохімічних генних маркерів.

Проблеми систематики та невирішені питання еволюції і формоутворення щипівок роду Сobitis. Завдяки застосуванню генетичних підходів тільки зараз у Європі доведено існування кількох десятків видів роду Cobitis замість єдиного виду С. taenia, що в середині ХХ століття вважався поширеним по всій території Палеарктики. На підставі існуючих генетичних даних (Васильев, Васильева, 1998; Межжерин, Лисецкая, 2004; Janko et al. 2005, 2007) для території України наводиться існування п'яти видів цього роду. Надійно встановлено, що триплоїдні особини у щипівок утворюються за стандартною для апоміктичних поліплоїдів схемою: шляхом беккросування алодиплоїдів з батьківськими видами (Васильев, 1985). До особливостей комплексу слід віднести значну частку тетраплоїдів, які взагалі не характерні для неоарктичних диплоїдно-поліплоїдних комплексів.

Підкреслюється, що незважаючи на численні публікації залишається низка проблемних питань, які стосуються систематики, філогеографії і механізмів розмноження. Так, дослідження останніх років довели, що гіногенетичне розмноження у риб Ї це не є типове клонове відтворення, оскільки при цьому відбувається інкорпорація генетичного матеріалу самця і таким чином нащадки однієї самки генетично не ідентичні.

Зазначається, що генетичні дослідження щипівок ґрунтуються на трьох методичних підходах: каріолого-цитологічному, біохіміко-генетичному і молекулярно-генетичному, які зазвичай доповнюються біологічним і в деяких випадках морфологічним аналізами. При аналізі великих за об'ємом вибірок найбільш ефективним є поєднання біохімічного генного маркування з цитометрією. Результати таких досліджень дають повну картину генетичної структури особин Ї ступінь їх плоїдності і співвідношення геномів батьківських видів.

Матеріал і методи досліджень

Матеріал. Основою дослідження стали 20 вибірок щипівок, зібрані протягом 2003/07 рр., в кількості 1313 особин з водойм Дунайського, Дністровського, Дніпровського і Західно-Бузького басейнів (рис. 1).

Крім того для порів-няльного аналізу, по-будови геногеографіч-них карт та обгово-рення еволюційно-генетичних процесів в роді Cobitis вико-ристовували матеріали з генного маркування популяцій щипівок, які зберігаються в базі даних Відділу еволю-ційно-генетичних основ систематики Інституту зоології НАНУ ім. І. І. Шмальгаузена, а також опубліковані дані (Межжерин, Чудакорова, 2002; Межжерин, Лисецкая, 2004; Лисецкая, Межжерин, 2004) по інших регіонах України.

Методи. Для електрофоретичного аналізу, що проводили в 7,5% поліакриламідному гелі і в трис-ЕДТА^.Na₂-боратній системі буферів (Peacock et al., 1965), брали пробу м'язів. Аналізували лише ферменти, що раніше проявили себе для досліджених видів щипівок як діагностичні (Осинов и др., 1990; Slechtova et al., 2000, 2003; Межжерин, Чудакорова, 2002; Межжерин, Лисецкая, 2004), а саме: аспартатамінотрансфераза, що кодується локусом Aat-1, глюкозофосфатізомераза (Gpi-1), лактатдегідрогеназа (Ldh-B), малатдегідро-геназа (Mdh-1A). Крім того, досліджені структурні білки м'язів, зокрема локус Pt-3, що виявився видоспецифічним. Фарбування гелів проводили за стандартними методиками (Harris, Hopkinson, 1976).

Плоїдність щипівок визначали за допомогою цитометричного аналізу - вимірювання площі еритроцитів на мазках крові. На кожному препараті промірено не менше 20 клітин. Надійність цього методу при популяційному аналізі диплоїдно-поліплоїдних комплексів риб була підтверджена багатьма дослідниками (Sezaki, Kobayashi,1977, 1978; Васильев, Васильева, 1982; Межжерин, Чудакорова, 2002; Межжерин, Лисецкая, 2004, Лисецька, 2004).

Статеву належність визначали за наявністю пластинки Канестріні Ї утворення на грудному плавці, яке присутнє лише у самців видів роду Cobitis.

База даних та статистична обробка проводилися за допомогою програмного пакету Microsoft Excel v. 9.0 та Statistica v. 6.0. Геногеографічні карти моделювались за допомогою програми MapInfo Professional v. 7.8.

Цитометричний аналіз

За допомогою цитометричного аналізу мінливості розмірів еритроцитів було досліджено 450 екземплярів дорослих щипівок з 10 популяцій. Отримані дані представлені у вигляді загального розподілу (рис. 2) числа особин за середніми розмірами їх еритроцитів.

Загальний розподіл є за своєю формою багатовершинним і представлений кількома окремими розподілами, що трансгресують і відповідають групам з різним ступенем плоїдності. Перший розподіл охоплює 28% особин і діапазон значень від 120 до 150 у. о., що відповідає середньому значенню 142. Цей діапазон мінливості, як відомо (Васильев, 1985; Межжерин, Чудакорова, 2002 та ін.), відповідає розмірам еритроцитів диплоїдних особин, що і підтверджується аналізом алозимних спектрів, а також значною кількістю самців (табл. 1). Другий розподіл охоплює інтервал значень від 160 до 210 у. о. із середнім значенням 185 (табл. 1), містить близько 67% всіх вивчених риб, які на 99% є самками. Відомо, що розміри еритроцитів у триплоїдних особин в порівнянні з диплоїдними збільшується на третину, що і спостерігається в даному випадку (табл. 1). Слід зазначити, що між першим і другим розподілами у межах класу в 150-160 у. о. спостерігається трансгресія, у яку входить близько 2% особин. Однак їх віднесення до диплоїдів чи триплоїдів однозначно здійснюється на підставі алозимних спектрів. Особини, що входять до третього розподілу, мають діапазон від 220 до 260 у. о. з середнім значенням 228 у. о., що відповідає рівню тетраплоїдів (розміри еритроцитів збільшуються на дві третини), і також на 99% самки. Частка щипівок цього розмірного класу складає 4,7%. Інтервал значень від 210 до 220 у. о. є проміжним між три- і тетраплоїдами і тут, очевидно, зустрічаються особини двох типів, розрізнити які неможливо навіть за характером спектрів, оскільки, як відомо (Васильев и др., 1991), гомологічні три- і тетраплоїдні щипівки за цими ознаками не розрізняються. Певний інтерес викликають особини з розмірами еритроцитів від 260 до 300 у. о. У порівнянні з диплоїдами, розміри еритроцитів у них збільшені в 2 рази, що теоретично відповідає рівню пентаплоїдів.

Таблиця 1.

Середні розміри (M), стандартні помилки (m), межі мінливості (Lim) розмірів еритроцитів, а також число досліджених особин (N) та частка самок (+, %) в особин різної плоїдності

Примітка. * В дужках - збільшення середніх розмірів еритроцитів у три-, тетра- і, можливо, пентаплоїдних особин по відношенню до диплоїдних.

Слід зазначити, що співвідношення між числом диплоїдних особин і особин з різним ступенем плоїдності в різних регіонах суттєво відрізняється (табл. 2).

Таблиця 2.

Частка особин різного рівня плоїдності серед цитометрично вивчених особин за дослідженими басейнами

Аналіз мінливості біохімічних генних маркерів

Аat-1. Виявлено п'ять алелів, які, як і в інших випадках, позначені в алфавітному порядку у відповідності до зменшення електрофоретичної мобільності. Проведений аналіз підтвердив високу діагностичність цього локусу: зокрема у представників C. taenia і C. tanaitica фіксований алель Aat-1^с, а у дунайської щипівки C. elongatoides - два інших алелі (табл. 3).

У поліплоїдних гібридів відповідно зустрічаються гетерозиготи з ефектом дози гена або вкрай рідко без ефекту дози гена, що вказує на їх рекомбінантну природу. Алелі Aat-1^d і Aat-1^e траплялися винятково у поліплоїдних особин у вигляді гетерозиготних сполучень.

Gpi-1. У особин С. taenia фіксований алельний варіант Gpi-1^с, у C. elongatoides Ї два алелі Gpi-1^а і Gpi-1^b (табл. 3). За гетерозиготними спектрами і присутністю в них ефекту дози гена можна чітко визначити гібридів, встановити, диплоїдні вони чи поліплоїдні, а в останньому випадку визначити, який з геномів представлений більшим числом копій.

Ldh-B. Альтернативні алелі фіксовані у представників С. (superspecies taenia): у C. taenia і C. tanaitica Ї Ldh-B^b, а у C. species, який зустрічається в озерах Північно-Західної

України, Ї Ldh-B^a (табл. 3). У деяких місцевостях траплялися поліплоїдні особини досі невідомого біотиопу, який, вочевидь, утворився без участі C. elongatoides, на що вказує наявність унікального алелю Ldh-B^с в гетерозиготному сполученні Ldh-B^bb/с.

Mdh-1A. У дослідженнях щипівок виявлено тільки два алелі Mdh-1А^а і Mdh-1А^b. Оскільки у особин C. elongatoides зустрічаються обидва алелі (табл. 3), то цей локус має обмежену діагностичну здатність.

Структурні білки м'язів (Pt). На електрофореграмі представлені цілим комплексом білків, що можуть бути продуктами не менш ніж 5 локусів. Інтерес викликає локус Pt-3, що має два алелі (табл. 3). Його мінливість не відзначалася для центральноєвропейських щипівок C. elongatoides і C. tanaitica, у яких фіксований алель Pt-3^b, тоді як для С. taenia характерний алель Pt-3^а.

Генетична мінливість і гібридизація диплоїдних видів

Різноманіття диплоїдних видів. На дослідженій території за характером розподілу біохімічних генних маркерів було виявлено чотири види, що при гібридизації утворюють диплоїдно-поліплоїдні комплекси та відрізняються один від одного фіксацією альтернативних алелів ферментних і білкових локусів (табл. 3): щипівка дунайська Cobitis elongatoides (басейн Дунаю), щипівка звичайна C. taеnia (басейн Дніпра та Південного Бугу), щипівка донська С. tanaitica (басейн Дунаю) та неописаний вид С. species з озер Північно-Західної України. Слід зазначити, що види мають різний ступінь генетичної диференціації. Найбільше відрізняються C. elongatoides и C. taenia (три діагностичних локуси з п'яти задіяних), найменше Ї C. taenia и C. species (один локус). Вид C. tanaitica займає проміжне положення між C. taenia і С. elongatoides (за двома локусами він відрізняється від обох видів). Види C. elongatoides і С. tanaitica на території України є симпатричними і зустрічаються в низов'ях Дунаю, а представники надвиду C. (superspecies taenia): C. taenia, C. tanaitica і С. species є вікарними Ї аловидами.

Гібридизація. Інтрогресивна гібридизація відбувається між трьома вікарними видами, що утворюють єдиний надвидовий комплекс C. (superspecies taenia). Так, на Півдні України встановлена зона генних інтрогресій між звичайною та донською щипівками за діагностичним для цих видів локусом Pt-3 (рис. 3), а на Півночі має місце інтрогресія гену, характерного C. species (Ldh-B^a), в популяції C. taenia Середнього Дніпра (рис. 4). Інтрогресивний характер гібридизації доводиться фактом співпадіння емпіричних та теоретичних розподілів генотипів у гібридних популяціях.

Випадкова гібридизація з утворенням алодиплоїдних особин встановлена лише в низов'ях Дунаю, де близько 5% особин склали гібриди C. elongatoides Ч C. tanaitica. Очевидно, що такий вид гібридизації у щипівок є явищем досить поширеним, оскільки в літературі неодноразово згадувалися знахідки алодиплоїдних форм: C. melanoleuca Ч C. taenia в Сіверському Донці (Межжерин, Чудакорова, 2004) і C. elongatoides Ч C. taenia в Одері та Рейні (Boroс, 2003; Janko et al., 2007) й навіть міжродових гібридів C. taenia Ч Sabanejewia aurata в Десні (Межжерин, Чудакорова, 2004).

Різноманіття поліплоїдних біотипів. Аналіз генетичної структури поліплоїдних особин за допомогою генних маркерів і цитометрії, а також дані літературних джерел (Rab, Raboba, 2000; Slechtova et al., 2000; Janko et al., 2005; Janko et al., 2005) свідчать, що в басейнах Дніпра, Дунаю, Дністра, річок басейнів Балтійського та Північного морів мешкають лише біотипи, в утворенні яких брали участь з одного боку щипівка дунайська С. elongatoides, а з іншого Ї представники надвиду C. (superspecies taenia), а саме: C. taenia, C. tanaitica, C. species. В такому випадку можливе утворення дев'яти триплоїдних і 19 тетраплоїдних біотипів. Усе це різноманіття триплоїдів можна звести до двох головних типів: або з переважанням геномів C. elongatoides (EET-тип), або С. taenia s. lato (ETT-тип), а у тетраплоїдів до трьох випадків: або переважання геномів C. elongatoides (EEET-тип), або С. taenia s. lato (ETTT-тип), або рівне їх співвідношення (EETT-тип).

Аналіз генетичної структури певних угруповань

Нижній Дунай. Знайдено два диплоїдних види С. elongatoides і C. tanaitica, алодиплоїд C. elongatoides Ч C. tanaitica, алотриплоїди C. 2 elongatoides - tanaitica, C. elongatoides - 2 tanaitica і відповідні алотетраплоїди. Останні були представлені поодинокими особинами. Крім того, знайдені два поліплоїдних біотипи з незвичайними типами спектрів Aat: з типом спектру Aat-1^aad -- триплоїдний і Aat-1^acce -- тетраплоїдний. Присутність особин з такими спектрами може бути підставою для припущення про їх походження від невідомих диплоїдних видів, або ж про наявність рідкісних алелів у одного з батьківських видів. Особливу увагу привертають особини з рекомбінантними генотипами. Найбільш масовою триплоїдною формою як русла Дунаю, так і єриків виявився гібрид C. 2 elongatoides - tanaitica, загальна частка якого склала 66%.

Нижній Дністер. Особливість вибірки Ї відсутність диплоїдів. За структурою поліплоїдів подібна до такої з Дунаю. Оскільки цитометричний аналіз не проводився, то найбільш масовий біотип Ї C. 2(3) elongatoides - tanaitica, другий за чисельністю Ї C. elongatoides - 2 (3) tanaitica.

Нижній Дніпро. В угрупованні домінують диплоїди, які за генним пулом є представниками C. (superspecies taenia), але назвати цей диплоїдний вид „чистим” C. (taeniа) taenia не можна, оскільки його популяції насичені як генами C. tanaitica, що становлять від 3% (по Мdh-1A) до 46% (по Pt-3), так і алелями, характерними для C. species (1,7%). Саме тому вважати нижньодніпровських щипівок окремим видом, як це стверджують деякі дослідники (Janko et al., 2005 b), немає жодних підстав, бо їх каріологічна унікальність обумовлена гібридизацією 48- і 50-хромосомних форм. Частка поліплоїдів тут незначна Ї 12%. Найбільш численним є дунайський біотип C. 2(3) elongatoides - tanaitica, біотипи C. elongatoides - 2(3) taenia, що домінують на Середньому Дніпрі, представлені одинично.

Басейн Південного Бугу. У вибірці з невеличкої річки Собок домінують диплоїди. Інтрогресії генів тут не спостерігаються, тому всі диплоїди були ідентифіковані як С. taenia. Поліплоїди виявлені в незначній кількості (18%), переважна більшість Ї триплоїди, які чітко діляться на дві групи. Перша Ї звичайний для басейну Середнього Дніпра поліплоїдний біотип C. elongatoides - 2 taenia, друга Ї гібриди С. tanaitica з невідомим видом, що має алель Ldh-B^c, імовірніше за все, зі щипівкою сибірською С. melanoleuca, і який за характером спектрів може бути класифікований як С. 2 tanaitica - aff. melanoleuca.

Ріки Закарпаття. У закарпатських вибірках переважають диплоїди C. elongatoides, серед гібридів представлені у більшості поліплоїди дунайського типу C. 2 (3) elongatoides - tanaitica і C. elongatoides - 2 (3) tanaitica, представлений незначною кількістю особин, у яких спостерігаються незвичайні спектри Aat-1. Також тут зустрічаються гібриди, генетична структура яких відповідає рекомбінантним особинам.

Середній Дніпро. У вибірці з Бабиного озера 54% склали диплоїди С. (taenia) taenia. Поліплоїди були представлені одним біотипом Ї C. elongatoides - 2 (3) С. (taenia) taenia, серед них чотири особини були тетраплоїдами з площею еритроцитів 220-255 у. о., а одна особина, імовірно, й пентаплоїдом, бо мала площу еритроцитів 303 у. о.

Вибірка з р. Снов була типовою для басейну Середнього Дніпра, де звичайно переважають біотипи ЕТТ. З 13 особин три є диплоїдами С. taenia, сім особин Ї C. elongatoides - 2 (3) taenia і три Ї C. elongatoides - taenia - species, що випливало з генотипів локусу Ldh-B.

Великий інтерес викликала популяція річки Ірпінь, де була знайдена значна частка особин біотипу C. 2 elongatoides - tanaitica, який в басейні Середнього Дніпра дуже рідкісний, і звичайно його представленість варіює в межах 0-2%. Так, якщо в 2001/02 рр. в Ірпені на такі поліплоїди припадало 20% (Лисецька, 2004), то в 2004/06 рр. їх відсоток в середньому збільшився більш ніж в 3 рази і склав 72% (табл. 3). Причому у всіх особин цього біотипу, починаючи з 2004 р., замість типового Aat-1^aa/c спостерігався спектр, що відповідає генотипу Aat-1^aa/d. Крім того, внаслідок беккросування самок цього біотипу з самцями C. taenia з'явилися тетра- і триплоїдні рекомбінанти з симетричними спектрами за генотипами Aat-1^aa/bc або Aat-1^aa/dd та асиметричними за іншими локусами. В 2006 р. знайдені особини (10%), яких за генотипами слід вважати беккросами між C. 2 elongatoides - tanaitica з модифікованими спектрами і C. taenia. На це вказує властивий лише їм генотип Aat-1^aa/cd.

Таблиця 4.

Співвідношення біотипів щипівок комплексу C. elongatoides - С. taenia в р. Ірпінь

Примітка. ТТ Ї C. taenia, ЕТТ Ї C. elongatoides - 2 (superspecies taenia), ЕЕТ(Aat-1^c) Ї особини стандартного біотипу C. elongatoides - 2 (superspecies taenia), ЕЕТ(Aat-1^d) Ї той же біотип, але з модифікованим спектром Aat-1, R Ї поліплоїди-рекомбінанти з генотипами Aat-1^aa/cc або Aat-1^aa/dd, B Ї тетраплоїди-беккроси з генотипами Aat-1^aa/cd.

Північно-Західна Україна. Сім досліджених особин оз. Піщане, що входить до складу Шацьких озер, виявилися диплоїдами, яких слід відносити до неописаного виду Cobitis species, на що вказує фіксація алелю Ldh-B^a. Тоді як у вибірці з 13 особин, взятій неподалік спрямленого русла р. Капаївка, усі щипівки виявилися поліплоїдами Ї представниками біотипу C. elongatoides - 2 (3) species. У вибірці з р. Верещиця (басейн Верхнього Дністра) всі п'ять особин були представниками поліплоїдного біотипу C. elongatoides - taenia - species.

У значній за розміром вибірці з р. Стир (90 екз.) частка диплоїдів була 4,4%, і вони ідентифікувалися як C. (taeniа) taenia. Поліплоїди представлені трьома групами біотипів. Перша Ї C. 2 elongatoides - tanaitica (3,3%), друга Ї біотип C. elongatoides - 2 (3) (superspecies taenia), до складу якого могли входити в різних комбінаціях геноми трьох видів - С. taenia, C. tanaitica, С. species, тут домінував (81%). Третя група Ї триплоїдні і зрідка тетраплоїдні гібриди C. aff. melanoleuca - 2 (3) tanaitica, на які припало 11% особин, що були також знайдені в р. Собок (басейн Південного Бугу).

ОБГОВОРЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ

Різноманіття поліплоїдних біотипів. За результатами генного маркування щипівок дослідженого регіону встановлено явне домінування поліплоїдних біотипів щипівок над диплоїдними батьківськими видами. Так, з 1313 промаркованих особин 74% слід віднести до поліплоїдів. Причому за даними цитометрії 69% від загальної чисельності становили триплоїди і тільки 5% Ї гібриди більш високого ступеня плоїдності. Всього було ідентифіковано 16 поліплоїдних біотипів, 14 з яких утворилися за участі C. elongatoides і представників С. (superspecies taenia). Серед них один нечисленний тетраплоїдний біотип з басейну Нижнього Дунаю, який утворився внаслідок послідовної гібридизації С. elongatoides - 2 tanaitica з третім невстановленим видом цього роду. Крім того, знайдені два біотипи (три- і тетраплоїдний), що утворилися без участі C. elongatoides, імовірніше за все, при гібридизації С. aff. melanoleuca і C. tanaitica.

З дев'яти триплоїдних біотипів, що могли утворитися при гібридизації C. elongatoides з одного боку і трьох представників С. (superspecies taenia) з іншого, виявлено сім. Не знайдено особин біотипів C. 2 elongatoides - taenia і C. 2 elongatoides - species. Найбільш імовірно, особини цього біотипу в Україні відсутні взагалі. З 19 тетраплоїдних біотипів, що мали б утворитися, ідентифіковано шість. Це викликано тим, що без цитометричного аналізу за ізоферментними спектрами можливо діагностувати лише 10 біотипів, а дев'ять Ї тільки з урахуванням цитометрії. Оскільки цитометрично було досліджено близько третини особин, а кількість тетраплоїдів у водоймах України не перевищує 5-10%, то можливість ідентифікації імовірних тетраплоїдних біотипів, навіть при дослідженні більше тисячі особин, незначна. Саме тому слід вважати, що рідкісні варіанти тетраплоїдів не були знайдені в силу статистичних обставин. Тоді як відсутність теоретично звичайних біотипів амфідиплоїдів з рівним співвідношенням батьківських геномів на кшталт C. 2 elongatoides - 2 tanaitica, які повинні спостерігатися в деяких поселеннях, пов'язана або з неможливістю їх виникнення, або, імовірніше за все, з низькою життєздатністю, що призводить до їх елімінації на ранніх етапах онтогенезу. Симетричний розподіл продуктів видоспецифічних алелів в гібридних ізоферментних спектрах не спостерігався ні в цьому, ні в попередніх дослідженнях (Лисецька, 2004, Janko et al., 2007). Єдине виключення Ї популяція р. Ірпінь, де з'явилися окремі риби, що мали симетричний спектр за Aat-1, але були асиметричними за іншими діагностичними локусами, тобто особини-рекомбінанти, які також не мали чіткого розподілу геномів у співвідношенні 2:2.

Філогеографічний аналіз: поширення, походження та тенденції просування поліплоїдних біотипів. Якщо об'єднати все різноманіття поліплоїдних щипівок у три групи: з домінуванням генома C. elongatoides, альтернативну Ї з перевагою хромосомних наборів С. taenia і таких, що утворені за участю передбачуваної C. aff. melanoleuca, то можна відзначити певні тенденції в їх географічному розподілі.

Біотипи C. 2 (3) elongatoides - (superspecies taenia), а саме C. 2 (3) elongatoides - tanaitica, домінують в басейні Дунаю, де відповідно серед диплоїдів переважає C. elongatoides. Цей же біотип переважає у вибірках з низов'я Дністра і в середній течії Південного Бугу (Лисецька, 2004) (рис. 5). Відносно переважає цей біотип на Нижньому Дніпрі Ї серед поліплоїдів він зустрічається найчастіше, хоча загалом поліплоїдних щипівок тут небагато. Тоді як в басейні Середнього Дніпра, Північно-Західній Україні і на Сіверському Донці цей біотип або взагалі не зустрічається, або представлений лише 1-2% особин. Несподівано багато щипівок цього біотипу виявлено тільки у р. Ірпінь, але тут вони мають модифікації спектрів і, очевидно, їх поява Ї наслідок ненавмисної інтродукції.

Щипівки альтернативних біотипів (C. elongatoides - 2 (3) (superspecies taenia) мають тенденцію вікарування з вищеозначеними біотипами. Вони чисельно домінують (рис. 5) Ї в басейні Середнього Дніпра, у водоймах і річках Північного Заходу України, на Сіверському Донці, а також у притоках середнього Південного Бугу. У всіх цих місцях серед диплоїдів представлені винятково C. taenia s. str. Значно в меншій кількості такі щипівки, причому представлені виключно біотипом С. elongatoides - 2 (3) tanaitica, зустрічаються в басейні Дунаю і Нижнього Дністра, а у водоймах Центральної, Північної і Східної України, де мешкає номінативний вид, ніколи не трапляються.

Біотип С. aff. melanoleuca - tanaitica відзначений у західних і північно-західних регіонах (рис. 5): Волинській (р. Стир), Вінницькій (р. Собок) і, за архівними даними, Львівській (оз. Глинна-Наварія) областях. У перших двох випадках зустрічається разом з номінативною C. taenia, в останньому Ї із C. species. поліплоїдний гібрид біотип щипівка

Вочевидь, місцями утворення гібридних біотипів є акваторії сумісного існування C. elongatoides і представників С. (superspecies taenia), зокрема в Центральній Європі це басейн Дунаю, а також верхів'я Одеру й Рейну. Причому можливо виділити два полюси утворення поліплоїдних біотипів. Південний полюс - нижня течія Дунаю, де спільно живуть C. elongatoides і C. tanaitica і відповідно утворюються алотриплоїди C. 2 elongatoides - tanaitica або C. elongatoides - 2 tanaitica. Тоді як на північному полюсі, що розміщений у верхів'ях Дунаю, Рейну й Одеру, де сумісно мешкають C. elongatoides, С. tanaitica, C. taenia і, можливо, С. species (хоча більш імовірно присутня інтрогресія генів цього виду), утворюються біотипи, в яких обов'язково присутні один чи два геноми C. taenia.

Остаточно визначитися з місцем утворення С. aff. melanoleuca - tanaitica на сучасному рівні знань неможливо. Є всі підстави вважати, що саме такий триплоїд раніше був знайдений у Східній Польщі і визначений за каріотипом (Boroс, 2003) як гібрид C. taenia з невідомим видом. Можна припустити, що цей біотип утворився в Східній Європі, наприклад в басейні Дону, де сумісно живуть C. melanoleuca і С. tanaitica (Лебедева, 2007).

Таким чином, у водоймах України, за виключенням Нижнього Дунаю, поліплоїдні щипівки є інвазійними формами. Відомо, що зокрема в басейні Дніпра експансія поліплоїдів відбулася в 60-70-х рр. ХХ століття (Межжерин, Чудакорова, 2001). Слід відзначити, що інвазійна здатність біотипів з північного полюсу, в яких домінують геноми C. (superspecies taenia), значно більша. Саме вони оволоділи річними системами України (за виключенням басейну Дунаю, Нижнього Дніпра, Дністра), тоді як біотипи з південного полюсу практично не просунулися територією України. При цьому звертає на себе увагу той факт, що біотипи C. 2 elongatoides - tanaitica превалюють у тих водоймах, де масово зустрічаються диплоїдні особини C. elongatoides, а альтернативні біотипи C. elongatoides - 2 (superspecies taenia) - у тих, де існує номінативний вид C. taenia, тобто, відповідно, в південно-західних і центрально-північно-східних регіонах.

Розподіл диплоїдних і поліплоїдних особин у поселеннях щипівок. Розподіл частки особин з поліплоїдною структурою генома в популяції є невипадковим і різко відрізняється від нормального розподілу, який мав би бути при його стохастичному характері. При чому розподіл має чітко виражену U-подібну форму, тобто має два полюси концентрації подій (рис. 6). Перший полюс концентрує випадки явного домінування поліплоїдних біотипів у популяціях (65-85%). Такі ситуації зустрічаються найчастіше. Причому популяції, що складаються тільки з гібридів, вкрай нечисленні Ї з усіх досліджених вибірок такою виявилася лише нижньодністровська. Другий полюс, утворений угрупованнями, в яких домінують диплоїдні щипівки, поліплоїди тут становлять не більше 20%. Популяції, що складаються винятково з диплоїдних особин, теж дуже нечисленні. Однак, найрідше зустрічаються вибірки з проміжними значеннями Ї із вмістом поліплоїдів від 30 до 60%. Слід зазначити, що вибірки, в яких домінують диплоїди, були взяті з невеликих річок та ізольованих водойм, тоді як у великих річках, за виключенням Нижнього Дніпра, домінують поліплоїди.

Таким чином, для поселень щипівок властивий антагонізм диплоїдних і поліплоїдних особин, прагнення утворювати популяції, що у своїй більшості складаються з диплоїдних або поліплоїдних особин. Проміжний стан з приблизно рівним співвідношенням диплоїдів і поліплоїдів є нестабільним. Пояснюється ця альтернативність поселень диплоїдних та поліплоїдних особин досить просто. З одного боку, поліплоїди порівняно з диплоїдами мають більш потужний репродуктивний потенціал, бо вони крупніші й плодючіші, що призводить зрештою до чисельного їх переважання. З іншого Ї поліплоїдні щипівки репродуктивно несамодостатні. Вони не можуть повноцінно розмножуватися без участі диплоїдних самців батьківських видів, що вимагає хоча б мінімальної їх присутності в популяції, саме тому оптимальним для них стає співвідношення, коли на 10 поліплоїдів припадає один-два диплоїди.

Генетична нестабільність і рекомбінація. Поява аномальних спектрів у поліплоїдних особин зафіксована в спектрах ферменту Aat-1, що кодується відповідним локусом. Типовим випадком є поява біотипу C. 2 elongatoides - tanaitica, у якого замість алеля Aat-1^c, специфічного для C. tanaiticа, знайдений варіант Aat-1^d з меншою електрофоретичною рухливістю. Носії цього алеля виявлені виключно в популяціях, де переважав біотип C. 2 elongatoides - tanaitica: масово в Ірпені, одиничні випадки спостерігалися на Нижньому Дунаї і, за архівними даними, середній течії Південного Бугу. Проведений аналіз популяції р. Ірпінь показав, що поява таких особин Ї це наслідок зміни в ряді поколінь нормального спектра, викликаний генетичною нестабільністю, причиною якої, у свою чергу, є інтрогресії генетичного матеріалу від самців С. taenia до геному самок C. 2 elongatoides - tanaitica. Доказом саме цієї природи появи модифікацій є та обставина, що в Ірпені особини біотипу C. 2 elongatoides - tanaitica з модифікованими спектрами Aat-1^aa/d, буквально за одне-два покоління повністю замінили особин з нормальними спектрами. Дослідження останнього часу (Zhou еt al., 2000; Tуth еt al., 2005; Fan, Liu, 1990; Fan, Shen, 1990; Yi еt al., 2003) довели, що при гіногенетичному контакті у риб дійсно має місце інкорпорація певної частини генетичного матеріалу самця в геном нащадків. Тому можна припустити, що в конкретному випадку зі щипівками, коли > С. taenia ініціює дробіння яйцеклітин + C. 2 elongatoides - tanaitica, частина генетичного матеріалу самців, що проникає в яйцеклітину, не знаходячи видоспецифічних ділянок геному, взаємодіє з негомологічними, тим самим викликаючи зміни у функціонуванні генних систем. Внаслідок цього спостерігаються зміни ізозимних спектрів певних локусів Ї у конкретному випадку Aat-1. З цього факту випливає, що саме незбалансований характер гіногенетичних схрещувань між > С. taenia і + C. 2elongatoides - tanaitica, став причиною того, що в східних популяціях, де диплоїди лише C. taenia, майже не зустрічаються біотипи C. 2 (3) elongatoides - tanaitica.

Друга ситуація генетичних аномалій у популяціях щипівок - поява особин з рекомбінантними генотипами, що серед організмів, які розмножуються апоміктично, є несподіванкою. Рекомбінанти виявлені в популяціях, де домінували біотипи C. 2 elongatoides - tanaitica: в Ірпені, на Нижньому Дунаї, в Закарпатті та на Нижньому Дністрі, тобто там, де були знайдені і носії аномальних спектрів. Генетична структура рекомбінантних особин досить різноманітна: до їх числа відносяться особини з симетричними гібридними спектрами одних локусів, що припускає рівне співвідношення генних продуктів батьківських видів, і асиметричними за іншими. Їх представленість у популяціях невисока: десь у межах 1-5%.

Отже, гіногенетичні схрещування в щипівок не можна розглядати як події генетично нейтральні, оскільки за деяких обставин може відбуватися інкорпорація або обмеженої частини генетичного матеріалу, або, у випадках запліднення, цілого батьківського геному. При обмежених генних інтрогресіях, які спостерігаються у гіногенетичних схрещуваннях самців одного виду з триплоїдними гібридними самками, утвореними двома іншими, у нащадків відбуваються порушення функціонування генних систем, що може бути проінтерпретоване як випадок генетичної нестабільності.

ВИСНОВКИ

Природна гібридизація щипівок роду Cobitis Ї унікальна модель еволюційно-генетичних процесів хребетних тварин. Дисертаційне дослідження суттєво доповнює знання з цієї проблеми. Ключовими є наступні моменти. В популяціях щипівок постійно відбувається гібридизація: між близькими видами Ї інтрогресивна, а між віддаленими Ї з утворенням алодиплоїдів. Не дивлячись на високу різноманітність біотипів щипівок у цьому комплексі відсутні гібриди-амфідиплоїди. Гіногенетичні схрещування супроводжуються переносом генетичного матеріалу самців, в результаті чого у потомків проявляється генетична нестабільність, що зрештою обумовлює різний потенціал біотипів до розселення.

1. Щипівки роду Сobitis басейну Дніпра, Дністра, Дунаю й Західного Бугу представлені особинами: диплоїдних видів (25%), алодиплоїдами (1,3%), алотриплоїдами (69%) і алополіплоїдами більш високого рівня плоїдності (5%).

2. Шляхом біохімічного генного маркування в дослідженому регіоні ідентифіковано наступні диплоїдні види: С. elongatoides і С. tanaitica на Нижньому Дунаї, С. taenia всюди, крім Дунаю, і неописаний вид С. species в ізольованих водоймах Північного Заходу України.

3. Між видами постійно йде гібридизація: час від часу з утворенням алодиплоїдних самок між С. elongatoides і С. tanaitica на Нижньому Дунаї; інтрогресивна Ї між С. taenia і С. tanaitica на півдні й сході України (Нижньому Дніпрі й Сіверському Донці) і С. taenia і С. species на Верхньому Дніпрі. Факт інтрогресивної гібридизації між цими трьома вікарними видами дає підставу для об'єднання їх у єдиний надвидовий комплекс С. (superspecies taenia).

4. Переважна більшість досліджених поліплоїдних біотипів утворилися при послідовній гібридизації С. elongatoides з одного боку і представників С. (superspecies taenia) з іншого, і, по суті, зводяться до двох альтернативних груп: С. 2 (3) elongatoides - taenia s. l. і С. elongatoides - 2 (3) taenia s. l., які мають неоднозначні тенденції поширення. Крім того, виявлені ще й невідомі гібридні комплекси: досить масовий С. aff. melanoleuca - 2 (3) tanaitica Ї у водоймах Північного Заходу і рідкісний С. elongatoides - 2 tanaitica - species Ї на Нижньому Дунаї.

5. Алодиплоїдні, алотриплоїдні та алотетраплоїдні особини Ї це переважно самки. Частка самців в їх загальній вибірці становить не більше 1%. Причому неможливо чітко вказати, серед яких біотипів ця частка вища.

6. У Центральній Європі виявлені два осередки утворення біотипів: південний (Нижній Дунай), де виникли біотипи за участю тільки С. elongatoides і С. tanaitica, і північний (Верхній Дунай), де утворювалися біотипи за обов'язковою участю С. taenia і можливою С. tanaitica і С. species. Біотипи з південного осередку мають обмежене поширення Ї по низов'ях Дністра й Дніпра, тоді як північні біотипи масово заселили водойми Північно-Західної України, Середнього й Верхнього Дніпра, Сіверського Донця.

7. З дев'яти апріорно можливих триплоїдних біотипів, що могли виникнути при гібридизації C. elongatoides з одного боку і представників С. (superspecies taenia) з іншого, ідентифіковано сім з дев'яти триплоїдних, а з 19 тетраплоїдних Ї шість. Не виявлені триплоїдні біотипи С. 2 elongatides - taenia і C. 2 elongatoides - species, які, мабуть, украй нечисленні, а серед тетраплоїдів Ї гібриди-парноплоїди з двома хромосомними наборами С. elongatoides і, відповідно, двома від представників C. (superspecies taenia).

8. Гіногенез щипівок не є процесом генетично нейтральним. На це вказує присутність поліплоїдних особин з різного роду аномальними спектрами, а також незначного числа поліплоїдів з рекомбінацією генетичного матеріалу, чого в принципі не може бути при нормальній псевдогамії. Характерно, що всі вони відзначені в популяціях, у яких домінують особини біотипу С. 2 elongatoides - tanaitica.