Систематика бактерий и микроорганизмов

Среди обширного мира прокариот известны микроорганизмы, способные расти как в аэробных, так и в анаэробных условиях, и переключать свой энергетический метаболизм с одного способа получения энергии на другой. Такие микроорганизмы получили название факультативных аэробов или факультативных анаэробов. Примером факультативных анаэробов являются денитрифицирующие и десульфофицирующие бактерии, а также обширная группа энтеробактерий.

Таким образом, молекулярный кислород для прокариот, с одной стороны, является жизненно необходимым, с другой стороны, нередко оказывает токсичное действие на активность ряда ферментов прокариотной клетки. Так, от парциального давления молекулярного кислорода зависит активность рибулозодифосфаткарбоксилазы, катализирующей фиксацию СО2 в клетке большинства автотрофных бактерий, чувствительность по отношению к О2 проявляют нитрогена-зы и гидрогеназы.

11. Взаимоотношения микроорганизмов

В естественной среде обитания в процессе эволюции сформировались весьма сложные и многообразные взаимоотношения между определенными видами и группами микроорганизмов. Совместное существование различных организмов получило название симбиоза, в широком смысле слова -- сожительства. Симбиотические отношения можно подразделить на конкурентные и ассоциативные (взаимно благоприятствующие).

Ассоциативные взаимоотношения. Ассоциативные взаимоотношения микроорганизмов в природе встречаются очень часто. Среди них можно выделить несколько еще более узких смысловых форм.

Метабиоз -- взаимоотношения, при которых один микроорганизм своей жизнедеятельностью создает условия для развития другого, как правило, продолжающего процесс, начатый первым. Например, аммонифицирующие бактерии разлагают органические азотсодержащие соединения с образованием аммиака, создавая тем самым субстрат для развития нитрификаторов. Последние окисляют аммиак до нитритов и нитратов, служащих акцепторами электронов при нитратном дыхании денитрифицирующих бактерий. Клетчаткоразрушающие бактерии, разлагая целлюлозу, накапливают в среде различные сахара и органические кислоты, необходимые в качестве источника углерода для развития азотобактера. Именно метабиотические отношения микроорганизмов лежат в основе круговорота основных биогенных элементов в природе.

Симбиоз в узком смысле слова подразумевает тесные ассоциативные взаимоотношения микроорганизмов, стимулирующих и поддерживающих развитие друг друга. Симбионты совместно всегда развиваются лучше, чем каждый из них в отдельности. Иногда симбиоз становится настолько глубоким, что организмы утрачивают способность развиваться самостоятельно, например молочнокислые бактерии и дрожжи, образующие кефирные зерна. Молочнокислые бактерии, образуя молочную кислоту, подкисляют среду и тем самым стимулируют развитие дрожжей. Последние синтезируют аминокислоты и витамины, необходимые для питания молочнокислых бактерий. Типичным примером симбиотических отношений являются ассоциации аэробных и анаэробных микроорганизмов, например свободноживущих азотфиксирующих бактерий рода Azotobacter (облигатные аэробы) и бактерий рода Clostridium (облигатные анаэробы). Симбиоз в природе распространен не только среди низших организмов. Симбиотические отношения нередко возникают между микроорганизмами и высшими растениями.

Разновидностью ассоциативных отношений является комменсализм, при котором взаимная польза совместно существующих микроорганизмов не выражена отчетливо, но они и не причиняют вреда друг другу. Примером комменсалов может служить нормальная микрофлора кишечника человека и животного.

Сателлизм -- разновидность ассоциативных взаимоотношений, предусматривающая стимуляцию одного микроорганизма другим. Так, дрожжевые грибы и сарцины, продуцирующие различные аминокислоты и витамины, очень часто способствуют росту и размножению других, более требовательных к питательному субстрату бактерий, молочнокислых или уксуснокислых.

Конкурентные взаимоотношения. Конкурентные взаимоотношения микроорганизмов проявляются в разной форме и возникают вследствие разных причин. Это прежде всего отношения антагонизма, при котором один микроорганизм своей жизнедеятельностью подавляет развитие другого. Антагонистические отношения между микроорганизмами возникают в борьбе за вещества питательного субстрата, за использование молекулярного кислорода, за экологическую нишу и встречаются в природе повсюду: в почве, в водоемах, в организмах животных и человека.

Открытие явления антагонизма принадлежит Л. Пастеру (1877), описавшему гибель возбудителя сибирской язвы в совместной культуре его с синегнойной палочкой. Идею использования антагонизма микробов на благо медицины впервые высказал И. И. Мечников. Он усиленно пропагандировал использование молочнокислых бактерий (болгарской палочки) для нормализации микрофлоры кишечника и подавления гнилостных микробов.

Характерные антагонистические взаимоотношения между молочнокислыми и гнилостными бактериями можно наблюдать в молоке. Парное молоко содержит 94--96% гнилостных бактерий и только 4--6% молочнокислых. Однако через 24--36 ч картина изменяется. Молочнокислые бактерии, продуцирующие молочную кислоту, подавляют развитие гнилостной микрофлоры и сводят ее содержание до минимума (около 4%).

Наибольшее число микробов-антагонистов содержится в почве. Как правило, в почве в роли сильных антагонистов выступают актиномицеты и спорообразующие бактерии.

Разновидностью активных антагонистических отношений является антибиоз, в основе которого лежит выделение одним микроорганизмом вещества, токсичного для другого. Именно на этом свойстве микроорганизмов основано применение арсенала современных антибиотических препаратов.

Одними из первых явление антибиоза наблюдали и использовали на практике русские врачи В. А. Манассеин и А. Г. По-лотебнов (1868), применявшие споры "зеленой плесени" (споры плесневого гриба рода Penicillium) для лечения варикозных и сифилитических язв.

Крайним проявлением конкурентных взаимоотношений микроорганизмов выступает паразитизм. При паразитизме один микроорганизм использует другой как источник питательного субстрата, что нередко сопровождается гибелью жертвы. До недавнего времени в качестве типичнейшего примера паразитизма в мире прокариот приводили взаимоотношения фагов с бактериями. Однако в 1963 г. Г. Штольп и М. Старр впервые описали бактерию-паразита Bdellovibrio bacteriovorum. Этот микроб паразитирует на многих грамположительных и грамотрицательных бактериях. Настигнув бактерию-жертву, Bdellovibrio пробуравливает клеточную стенку и внедряется в клетку, через 3--5 ч в клетке бактерии-жертвы образуется 20--50 клеток-паразитов. Клетка бактерии-жертвы лизируется, выпуская поколение паразита в среду. Бактерии рода Bdellovibrio широко распространены в природе -- в почве, в морских и пресноводных водоемах. Не следует думать, что паразитизм всегда сопровождается непосредственным контактом микроба-паразита и его жертвы. Так, миксобактерии, выделяющие литические ферменты в среду, нередко вызывают лизис мицелия грибов, а далее интенсивно развиваются за счет питательных компонентов разрушенного мицелия.

12. Экология микроорганизмов

Экология (от греч. oikos -- дом, место обитания) микроорганизмов изучает их взаимоотношения друг с другом и с окружающей средой. Как известно, микроорганизмы обнаруживаются в почве, воде, воздухе, на растениях, в организме человека и животных.

Микрофлора почвы

Микрофлора почвы характеризуется большим разнообразием микроорганизмов, которые принимают участие в процессах почвообразования и самоочищения почвы, кругооборота в природе азота, углерода и других элементов. В почве обитают бактерии, грибы, лишайники (симбиоз грибов с цианобактериями) и простейшие.

На поверхности почвы микроорганизмов относительно мало, на них губительно действуют УФ-лучи, высушивание и т. д.

Наибольшее число микроорганизмов содержится в верхнем слое почвы толщиной до 10 см. По мере углубления в почву количество микроорганизмов уменьшается и на глубине 3--4 м они практически отсутствуют;

Состав микрофлоры почвы меняется в зависимости от и состояния почвы, состава растительности, температуры, влажности и т.д. Большинство микроорганизмов почвы способны развиваться при нейтральном рН, высокой относительной влажности, при температуре от 25 до 45 °С.

В почве живут бактерии, способные усваивать молекулярный азот (азотфиксирующие), относящиеся к родам Azotobacter, Azomonas, Mycobacterium и др. Азотфиксирующие разновидности цианобактерий, или сине-зеленых водорослей, применяют для повышения плодородия рисовых полей. Такие бактерии, как псевдомонады, активно участвуют в минерализации органических веществ, а также восстановлении нитратов до молекулярного азота. Кишечные бактерии (сем. Enterobacteriaceae) -- кишечная палочка, возбудители брюшного тифа, сальмонеллезов, дизентерии -- могут попадать в почву с фекалиями. Однако в почве отсутствуют условия для их размножения, и они постепенно отмирают. В чистых почвах кишечная палочка и протей встречаются редко; обнаружение их в значительных количествах является показателем загрязнения почвы фекалиями человека и животных и свидетельствует о ее санитарно-эпидемиологическом неблагополучии (возможность передачи возбудителей инфекционных заболеваний).

Почва служит местом обитания спорообразующих палочек родов Васillus и Clostridium. Непатогенные бациллы (Вас. megatherium, Вас. subtiles и др.) наряду с псевдомонадами, протеем и некоторыми другими бактериями являются аммонифицирующими, составляя фуппу гнилостных бактерий, осуществляющих минерализацию белков. Патогенные палочки (возбудитель сибирской язвы, ботулизма, столбняка, газовой ганфены) способны длительно сохраняться в почве.

В почве находятся также многочисленные представители фибов. Грибы участвуют в почвообразовательных процессах, превращениях соединений азота, выделяют биологически активные вещества, в том числе антибиотики и токсины. Токсинообразующие грибы, попадая в продукты питания человека, вызывают интоксикации -- микотоксикозы и афлатоксикозы.

Микрофауна почвы представлена простейшими, количество которых колеблется от 500 до 500 000 на 1 г почвы. Питаясь бактериями и органическими остатками, простейшие вызывают изменения в составе органических веществ почвы.

Микрофлора воды

Микрофлора воды, являясь естественной средой обитания микроорганизмов, отражает микробный пейзаж почвы, так как микроорганизмы попадают в воду с частичками почвы. Вместе с тем в воде формируются определенные биоценозы с преобладанием микроорганизмов, адаптировавшихся к условиям местонахождения, т. е. физико-химическим условиям, освещенности, степени растворимости кислорода и диоксида углерода, содержания органических и минеральных веществ и т.д.

В водах пресных водоемов обнаруживаются палочковидные (псевдомонады, аэромонады и др.), кокковидные (микрококки) и извитые бактерии. Зафязнение воды органическими веществами сопровождается увеличением анаэробных и аэробных бактерий, а также грибов. Особенно много анаэробов в иле, на дне водоемов. Микрофлора воды выполняет роль активного фактора в процессе самоочищения ее от органических отходов, которые утилизируются микроорганизмами. Вместе с зафязненными ливневыми, талыми и сточными водами в озера и реки попадают представители нормальной микрофлоры человека и животных (кишечная палочка, цитробактер, энтеробактер, энтерококки, клостридии) и возбудители кишечных инфекций -- брюшного тифа, паратифов, дизентерии, холеры, лептоспироза, энтерови-русных инфекций и др. Поэтому вода является фактором передачи возбудителей многих инфекционных заболеваний. Некоторые возбудители могут даже размножаться в воде (холерный вибрион, легионеллы).

Вода артезианских скважин практически не содержит микроорганизмов, обычно задерживающихся более верхними слоями почвы. Микрофлора воды океанов и морей также содержит различные микроорганизмы, в том числе светящиеся и галофильные (солелюбивые), например галофильные вибрионы, поражающие моллюски и некоторые виды рыбы, при употреблении которых в пищу развивается пищевая токсикоинфекция.

Микрофлора воздуха

Микрофлора воздуха взаимосвязана с микрофлорой почвы и воды. В воздух также попадают микроорганизмы из дыхательных путей и с каплями слюны человека и животных. Солнечные лучи, и другие факторы способствуют гибели микрофлоры воздуха. Большее количество микроорганизмов присутствует в воздухе крупных городов, меньшее -- в воздухе сельской местности. Особенно мало микроорганизмов в воздухе над лесами, горами и морями. В воздухе обнаруживаются кокковидные и палочковидные бактерии, бациллы и клостридии, актиномицеты, грибы и вирусы. Много микроорганизмов содержится в воздухе закрытых помещений, микробная обсемененность которых зависит от степени уборки помещения, уровня освещенности, количества людей в помещении, частоты проветривания и др. Количество микроорганизмов, в 1 м3 воздуха (так называемое микробное число, или обсемененность воздуха) отражает санитарно-гигиеническое состояние воздуха, особенно в больничных и детских учреждениях. Косвенно о выделении патогенных микроорганизмов (возбудителей туберкулеза, дифтерии, коклюша, скарлатины, кори, гриппа и др.)

при разговоре, кашле, чиханье больных и носителей можно судить по наличию санитарно-показательных бактерий (золотистого стафилококка и стрептококков), так как последние являются представителями микрофлоры верхних дыхательных путей и имеют общий путь выделения с патогенными микроорганизмами, передающимися воздушно-капельным путем.

С целью снижения микробной обсемененности воздуха проводят влажную уборку помещения в сочетании с вентиляцией и очисткой (фильтрацией) поступающего воздуха; применяют обработку помещений лампами ультрафиолетового излучения.

Роль микроорганизмов в круговороте веществ в природе

С помощью микроорганизмов органические соединения растительного и животного происхождения минерализуются до углерода, азота, серы, фосфора, железа и др.

Круговорот углерода. В круговороте углерода активное участие принимают растения, водоросли и цианобактерии, фиксирующие СО2 в процессе фотосинтеза, а также микроорганизмы, разлагающие органические вещества отмерших растений и животных с выделением СО2. При аэробном разложении органических веществ образуются СО2 и вода, а при анаэробном брожении -- кислоты, спирты, СО2. Так, при спиртовом брожении микроорганизмы (дрожжи и др.) расщепляют углеводы до этилового спирта и диоксида углерода. Молочнокислое брожение, вызываемое молочнокислыми бактериями, характеризуется выделением молочной и уксусной кислот и диоксида углерода. Процессы пропионовокислого (вызываемого пропионибактериями), масля-нокислого, ацетонобутилового (вызываемых клостридиями) и других видов брожения сопровождаются образованием различных кислот и диоксида углерода.

Круговорот азота. Атмосферный азот связывают только клубеньковые бактерии и свободноживущие микроорганизмы почвы. Органические соединения растительных, животных и микробных остатков подвергаются в почве минерализации микроорганизма-; ми, превращаясь в соединения аммония. Процесс образования аммиака при разрушении белка микроорганизмами получил название аммонификации, или минерализации азота. Активно разрушают белок такие бактерии, как псевдомонады, протей, бациллы, клостридии. При аэробном распаде белков образуется диоксид углерода, аммиак, сульфаты и вода; при анаэробном -- аммиак, амины, диоксид углерода, органические кислоты, индол, скатол, сероводород. Разложение мочевины, выделяющейся с мочой, осуществляют уробактерии, расщепляющие ее до аммиака, диоксида углерода и воды. Образующиеся аммонийные соли в результате ферментации бактериями органических соединений могут использоваться высшими зелеными растениями. Но наиболее усвояемыми для растений являются нитраты -- азотнокислые соли. Эти соли появляются при распаде органических веществ в процессе окисления аммиака до азотистой, а затем азотной кислоты. Данный процесс называется нитрификацией, а микроорганизмы, его вызывающие, -- нитрифицирующими. Нитрифицирующие бактерии выделил и описал русский ученый С. Н. Виноградский (1890--1892). Нитрификация проходит в две фазы: первую фазу осуществляют бактерии рода нитрозомонас и др., при этом аммиак окисляется до азотистой кислоты, образуются нитриты; во второй фазе участвуют бактерии рода нитробактер и др., при этом азотистая кислота окисляется до азотной и превращается в нитраты. Две фазы нитрификации являются примером метабиоза -- взаимоотношений микроорганизмов, при которых один микроорганизм размножается, используя продукты жизнедеятельности другого микроорганизма.

Нитраты повышают плодородие почвы, однако существует и обратный процесс: нитраты могут восстанавливаться в результате процесса денитрификации до выделения свободного азота, что обедняет его запас в виде солей в почве, приводя к снижению ее плодородия.

13. Основы биотехнологии

Понятие о биотехнологии, цели и задачи

Биотехнология представляет собой область знаний, которая возникла и оформилась на стыке микробиологии, молекулярной биологии, генетической инженерии, химической технологии и ряда других наук. Рождение биотехнологии обусловлено потребностями общества в новых, более дешевых продуктах для народного хозяйства, в том числе медицины и ветеринарии, а также в принципиально новых технологиях. Биотехнология (от греч. bios -- жизнь, teken -- искусство, мастерство, logos -- наука, умение, мастерство) -- это получение продуктов из биологических объектов или с применением биологических объектов. В качестве биологических объектов могут быть использованы организмы животных и человека (например, получение иммуноглобулинов из сывороток вакцинированных лошадей или людей; получение препаратов крови доноров), отдельные органы (получение гормона инсулина из поджелудочных желез крупного рогатого скота и свиней) или культуры тканей (получение лекарственных препаратов). Однако в качестве биологических объектов чаще всего используют одноклеточные микроорганизмы, а также животные и растительные клетки. Выбор этих объектов обусловлен следующими причинами:

клетки являются своего рода "биофабриками", вырабатываю щими в процессе жизнедеятельности разнообразные ценные продукты (белки, жиры, углеводы, витамины, аминокислоты, антибиотики, гормоны, антитела, антигены, ферменты, спирты и пр.). Эти продукты, крайне необходимые в жизни человека, пока недоступны для получения "небиотехнологическими" способами из-за сложности технологии процессов или экономической нецелесообразности, особенно в условиях крупномасштабного производства;

клетки чрезвычайно быстро воспроизводятся, что позволяет за относительно короткое время искусственно нарастить на сравнительно дешевых и недефицитных питательных средах в промышленных масштабах огромные количества биомассы микробных, животных или растительных клеток;

биосинтез сложных веществ (белков, антибиотиков, антигенов, антител и др.) значительно экономичнее и технологически доступнее, чем химический синтез. Коэффициент полезного действия "работы" клетки равен 70 %, а самого совершенного технологического процесса -- значительно ниже;

возможность проведения биотехнологического процесса в промышленных масштабах, т.е. наличие соответствующего технологического оборудования и аппаратуры, доступность сырья, технологии переработки и др.

Клетки животных и растений, микробные клетки в процессе жизнедеятельности (ассимиляции и диссимиляции) образуют новые продукты и выделяют метаболиты, обладающие разнообразными физико-химическими свойствами и биологическим действием. Обычно продукты жизнедеятельности одноклеточных делят на 4 категории:

сами клетки как источник целевого продукта. Например, выращенные бактерии или вирусы используют для получения живой или убитой корпускулярной вакцины; дрожжи -- как кормовой белок или основу для получения гидролизатов питательных сред и т.д.;

крупные молекулы (макромолекулы), которые синтезируются клетками в процессе выращивания: ферменты, токсины, антигены, антитела, пептидогликаны и др.;

первичные метаболиты -- низкомолекулярные вещества, необходимые для роста клеток (аминокислоты, витамины, нук-леотиды, органические кислоты);

вторичные метаболиты (идиолиты) -- низкомолекулярные соединения, не требующиеся для роста клеток (антибиотики, алкалоиды, токсины, гормоны).

Биотехнология использует эту продукцию клеток как сырье, которое в результате технологической обработки превращается в конечный продукт. С помощью биотехнологии получают множество продуктов, используемых в различных отраслях:

медицине (антибиотики, витамины, ферменты, аминокислоты, гормоны, вакцины, антитела, компоненты крови, диагностические препараты, иммуномодуляторы, алкалоиды, пищевые белки, нуклеиновые кислоты, нуклеозиды, нуклеотиды, липиды, антиметаболиты, антиоксиданты, противоглистные и противоопухолевые препараты);

ветеринарии и сельском хозяйстве (кормовой белок: кормовые антибиотики, витамины, гормоны, вакцины, биологические средства защиты растений, инсектициды);

пищевой промышленности (аминокислоты, органические кислоты, пищевые белки, ферменты, липиды, сахара, спирты, дрожжи);

химической промышленности (ацетон, этилен, бутанол);

энергетике (биогаз, этанол).

Следовательно, биотехнология направлена на создание диагностических, профилактических и лечебных медицинских и ветеринарных препаратов, на решение продовольственных вопросов (повышение урожайности, продуктивности животноводства, улучшение качества пищевых продуктов -- молочных, кондитерских, хлебобулочных, мясных, рыбных); на обеспечение многих технологических процессов в легкой, химической и других отраслях промышленности. Необходимо отметить также все возрастающую роль биотехнологии в экологии, так как очистка сточных вод, переработка отходов и побочных продуктов, их деградация (фенол, нефтепродукты и другие вредные для окружающей среды вещества) осуществляются с помощью микроорганизмов.

В настоящее время в биотехнологии выделяют медико-фармацевтическое, продовольственное, сельскохозяйственное и экологическое направления. В соответствии с этим биотехнологию можно разделить на медицинскую, сельскохозяйственную, промышленную и экологическую. Медицинская в свою очередь подразделяется на фармацевтическую и иммунобиологическую, сельскохозяйственная -- на ветеринарную и биотехнологию растений, а промышленная -- на соответствующие отраслевые направления (пищевая, легкая промышленность, энергетика и т. д.).

Биотехнологию также подразделяют на традиционную (старую) и новую. Последнюю связывают с генетической инженерией. Общепризнанное определение предмета "биотехнология" отсутствует и даже ведется дискуссия о том, наука это или производство.

Видимо, правильно будет определить биотехнологию как сферу деятельности, которая на основе изучения процессов жизнедеятельности живых организмов, главным образом клеток микроорганизмов, животных и растительных клеток, использует эти процессы и сами объекты для промышленного производства продуктов, необходимых в жизни человека, а также получения биоэффектов, ранее не встречавшихся в природе (например, получение реком-бинантных бактерий, трансгенных растений и животных).

В биотехнологии, как в никакой другой области знаний, тесно увязываются, интегрируются наука и производство.

Промышленное производство в биотехнологии по сути основано на нескольких принципах: брожении (ферментация), биоконверсии (превращение одного вещества в другое), культивировании растительных и животных клеток, бактерий и вирусов, генетических манипуляциях. Реализация этих научных принципов в производстве потребовала разработки промышленного оборудования и аппаратуры, отработки и оптимизации технологических процессов, разработки способов оценки и контроля продукции на всех ее стадиях.

Современная биотехнологическая промышленность располагает крупными заводами, опытно-конструкторскими учреждениями, научно-исследовательскими институтами. Фундаментальными проблемами биотехнологии заняты научно-исследовательские институты РАН, РАМН и ряд прикладных отраслевых институтов.

На заводах микробиологической (биотехнологической) промышленности ежегодно производятся миллионы тонн кормового белка, десятки тысяч тонн ферментов, антибиотиков, сотни диагностических и профилактических вакцинных и иммунных препаратов, набор практически всех аминокислот, витаминов, гормонов, спиртов, органических кислот и много другой продукции. Однако потребности быстро растущего народного хозяйства биотехнология удовлетворяет еще далеко не в полной мере. Поэтому развитию биотехнологии в настоящее время уделяется постоянное внимание, и эта отрасль быстро развивается.

Краткая история развития биотехнологии

Биотехнология возникла в древности (примерно 6000--5000 лет до н.э.), когда люди научились выпекать хлеб, варить пиво, приготовлять сыр и вино. Этот первый этап развития биотехнологии был сугубо эмпирический и продолжал оставаться таким, несмотря на совершенствование технологических процессов и расширение сфер использования биотехнологических приемов, вплоть до открытия Л.Пастером в XIX в. природы процесса брожения. С этого момента начался второй научный этап традиционной биотехнологии. В этот период получены и выделены ферменты, открыты многие микроорганизмы; разработаны способы их выращивания в массовых количествах; получены культуры животных и растительных клеток и разработаны способы искусственного их культивирования; в результате изучения физиологии, биохимии и генетики микробных и животных клеток получены многие продукты микробиологического синтеза, необходимые для медицины, сельского хозяйства и промышленности. Сформировалась вначале техническая микробиология, а затем биотехнология. Однако промышленное производство сводилось в основном к получению продуктов на основе природных штаммов.

На смену старой традиционной биотехнологии пришла новая биотехнология, основанная на применении искусственно получаемых штаммов -- суперпродуцентов, использовании иммобилизованных ферментов, применении культур животных и растительных клеток, широком использовании генетической инженерии для получения клеток-рекомбинантов, моноклональных антител и других биологически активных веществ.

Новая биотехнология возникла, таким образом, на основе достижений молекулярной биологии и микробиологии, генетики и генетической инженерии, иммунологии и химической технологии. Основой ее явилась генетическая инженерия, индустрия рекомбинантных ДНК.

Микроорганизмы, клетки и процессы, применяемые в биотехнологии

В природе существует огромное число микроорганизмов. Все они способны синтезировать продукты или осуществлять реакции, которые могут быть полезны для биотехнологии. Однако практическое применение нашли не более 100 видов микроорганизмов (бактерии, грибы, дрожжи, вирусы, водоросли), так как остальные мало изучены.

Дрожжи широко используют в хлебопечении, пивоварении, виноделии, получении соков, кормового белка, питательных сред для выращивания бактерий и культур животных клеток. Из 500 известных видов дрожжей используется только несколько видов -- Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carlsbergencis, Saccharomyces uwarum.

Среди бактерий чаще всего применяют в биотехнологии представителей следующих родов: Acetobacter, которые превращают этанол в уксусную кислоту и уксусную кислоту в углекислый газ и воду; Bacillus - для получения ферментов (В. subtilis), средств защиты растений (В. thuringiensis); Clostridium -- для сбраживания cахаров в ацетон, этанол, бутанол; молочнокислые бактерии (Lactobacillus, Leuconostoc, Streptococcus); псевдомонады -- например Р. glutamatum -- для получения витамина В12, Copynebacterium -- для получения аминокислот и др.

Для получения разнообразных антибиотиков в биотехнологии применяют актиномицеты (род Streptomyces), грибы Penicillium chrysogenum, Cephalosporium и др.

Многие микроорганизмы -- бактерии, дрожжи, вирусы -- используют в качестве реципиентов чужеродного генетического материала с целью получения рекомбинантных штаммов -- продуцентов биотехнологической продукции. Получены рекомбинантные штаммы Е. coli, продуцирующие интерфероны, инсулин, гормон роста, антигены вируса СПИДа; штаммы В. subtilis, вырабатывающие интерферон; штаммы дрожжей, продуцирующих интерлейкин-2, антиген вируса гепатита В; рекомбинантные вирусы осповакцины, синтезирующие антигены гепатита В, вируса бешенства, клещевого энцефалита и др.

Для получения вакцин и диагностических препаратов используют также патогенные микроорганизмы (брюшного тифа, коклюша, дифтерии, столбняка и др.).

Широкое применение в биотехнологии нашли культуры животных и растительных клеток. Известно, что строение, физиология и биотехнология животных и растительных клеток более сложны, чем бактериальных клеток. Из культур животных и растительных клеток можно извлечь более широкий ассортимент сложной и ценной продукции, однако процесс культивирования растительных и животных клеток более трудоемкий и дорогостоящий. Из культур тканей растений можно получать разнообразные соединения, используемые в медицине (алкалоиды, противовоспалительные вещества, противолейкозные и противоопухолевые, противобактериальные, сердечные и почечные средства, ферменты, витамины, опиаты и др.), сельском хозяйстве, химической и других отраслях промышленности. Животные клетки используют как для получения продукции, синтезируемой клетками, так и для выращивания в клетках вирусов с целью получения из них вакцин и диагностических препаратов.

Технология получения продуктов микробного или клеточного синтеза. Основным условием для успешного проведения технологического процесса является выбор или получение высокопродуктивного промышленного штамма-продуцента и поддержание его в активном состоянии. Известно, что различные штаммы по количеству и качеству продукции того или иного вещества (фермента, антибиотика, витамина, аминокислоты, антигена, алкалоида и др.) могут существенно отличаться. Естественно, что от этого в значительной мере зависят экономическая эффективность и активность целевого продукта.

Вторым важным условием является подбор питательных сред, обеспечивающих максимальное накопление биомассы или целевого продукта; питательные среды должны состоять из дешевого, недефицитного и доступного сырья, поскольку при промышленном культивировании микроорганизмов потребляются огромные их количества. В крупномасштабном производстве для приготовления питательных сред служит обычно сравнительно дешевое сырье (меласса, парафины нефти, дрожжи, уксусная кислота, природный газ). Более ограниченное применение, главным образом при получении медицинских препаратов, находят казеин, препараты крови, среды из мясных гидролизатов.

Для выращивания животных клеток применяют питательные среды, имеющие сложный состав. Они компануются из высококачественного сравнительно дорогого сырья (аминокислоты, соли, ростовые факторы). В последнее время успешно разрабатываются питательные среды для культур клеток из гидролизатов казеина, дрожжей, мяса и крови.

Для получения продукции в максимальных количествах активный штамм-продуцент выращивают на оптимальной питательной среде в оптимальных условиях культивирования (посевная доза, температура, рН, окислительно-восстановительный потенциал, аэрация, массообменные характеристики, питательные и ростовые добавки, сроки культивирования). Выращивание проводят в ферментаторах (культиваторах), вместимость которых может варьировать от 2 л до 100--400 м3 в зависимости от потребности в продукте. Для получения культур животных клеток объем ферментаторов пока не превышает 3 м3. В настоящее время биотехнологическая промышленность оснащена ферментаторами, позволяющими вести процесс в автоматическом режиме с программным управлением. Процесс культивирования ведется в асептических условиях, чтобы получить чистые культуры целевых микроорганизмов или культуры клеток.

Помимо суспензионного (глубинного) культивирования в ферментаторах иногда применяют поверхностное культивирование на плотных питательных средах (бактерии, грибы) или в жидком монослое (культуры животных клеток). Последний способ осуществляется в роллерных (вращающихся) установках.

Полученную биомассу микроорганизмов или культуры клеток подвергают затем переработке, сущность которой определяется технологией получения целевого продукта. Наиболее типовыми являются следующие процессы:

концентрирование биомассы (сепарированием, центрифугированием) и приготовление из него жидкого (суспензии, пасты) или сухого продукта;

высушивание, которое проводится лиофильным способом из замороженного состояния или путем распыления в потоке теплого воздуха. Для этого существуют специальные лиофильные аппараты (в том числе ленточные автоматические сушилки большой мощности) и распылительные сушилки, в том числе экологически чистые, так как процесс ведется в замкнутом цикле. Последние имеют большую мощность, однако не позволяют сушить термолабильные продукты;

сбор центрифугата после отделения биомассы и выделения из него целевого продукта, например антигенов, токсинов, инсулина и др. Иногда предварительно прибегают к дезинтеграции (разрушению) клеток механическим способом или с помощью ультразвука, осмоса, чтобы увеличить выход целевого продукта.

В тех случаях, когда из биомассы или центрифугата (культуральная жидкость) необходимо выделить активную субстанцию -- витамин, аминокислоту, антиген, антитело, фермент и пр., применяют физические или физико-химические методы очистки. Выбор их определяется свойствами выделяемого вещества (природа, молекулярная масса, лабильность к внешним воздействиям, химическое сродство и т. д.). Из физических методов чаще всего применяют на первичных стадиях сепарирование, центрифугирование (ультрацентрифугирование), а из физико-химических -- осаждение нейтральными солями, спиртом, ацетоном, а также ультрафильтрацию, хроматографию, электрофорез. Методы выделения и очистки, как правило, многоступенчатые. Чистоту получаемого продукта характеризуют наличием в нем примесей и выражают коэффициентом очистки, который представляет отношение числа активных единиц продуктов на 1 мг белка или азота (так называемая удельная активность) в очищенном препарате к удельной активности исходного (неочищенного) продукта.

Обычно в препаратах активная субстанция не всегда находится в предельно очищенном состоянии, поскольку в производственных условиях при переработке больших объемов сырья и существующих методах очистки этого добиться, пока не удается. Поэтому иммунобиологические препараты, полученные как традиционным методом, так и способом генетической инженерии, содержат, как правило, примеси питательных сред, на которых выращивали микроорганизмы, а также продукты метаболизма и неспецифические компоненты -- продукты распада микробной клетки. К примесям относятся белки, полисахариды и их комплексы, нуклеиновые кислоты, соли и другие низкомолекулярные вещества. Они не только бесполезны для препаратов, не иногда вызывают нежелательные побочные реакции организме при применении препаратов (местные реакции, повышение температуры тела, аллергические проявления). В принципе необходимо стремиться к получению препаратов, содержащих активную субстанцию в предельно очищенном состоянии.

После получения активной субстанции из нее конструируют конечный препарат. В соответствии с назначением и способом применения он может быть в жидком или сухом состоянии (раствор, суспензия, порошок) или в виде мазей. Препарат может быть предназначен для наружного, парентерального или энтерального, аэрозольного применения. В зависимости от этого препарат может быть стерильным и нестерильным.

Конечный препарат обычно содержит, помимо примесей, от которых не удалось освободиться, необходимые добавки: консервант (антисептик для поддержания стерильности препарата при хранении), стабилизатор (обычно инертные белки, аминокислоты для повышения устойчивости лабильного активного начала при хранении), активаторы (например, адъюванты и иммуномодуляторы в вакцинах). В конечной композиции препарат фасуется (ампулы, флаконы, таблетки, мази), этикетируется, снабжается инструкцией по применению.

Каждая серия препарата проходит стандартизацию в соответствии с технической документацией (технические условия, технологический регламент на изготовление) на производстве и в Государственном институте стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л. А. Тарасевича или в Фармакологическом комитете в зависимости от назначения препарата.

14. Генетическая инженерия и область ее применения в биотехнологии

бактерия микроорганизм генетика мутация

Генетическая инженерия является основой биотехнологии. Генетическая инженерия по существу сводится к генетической рекомбинации, т.е. обмену генами между двумя хромосомами, которая приводит к возникновению клеток или организмов с двумя и более наследственными детерминантами (генами), по которым родители различались между собой. Метод рекомбинации заключается в следующем:

выделение ДНК из разных видов организмов или клеток;

получение гибридных молекул ДНК;

введение рекомбинантных (гибридных) молекул в живые клетки;

создание условий для экспрессии и секреции продуктов, кодируемых генами.

Гены, кодирующие те или иные структуры, выделяются (клонируются) из хромосом или плазмид, прицельно выщепляются из этих генетических образований с помощью ферментов рестрикции или синтезируются химически. Набор ферментов (известно более 500 рестриктаз), способных резать ДНК по определенным связям (сайтам), является важным инструментом генетической инженерии. В последнее время обнаружены ферменты, расщепляющие по определенным связям РНК наподобие рестрикции ДНК. Эти ферменты названы рибозимами. Их роль еще пока не выяснена.

С помощью химического синтеза могут быть получены сравнительно небольшие гены. Для этого вначале расшифровывают число и последовательность аминокислот в белковой молекуле вещества и по этим данным узнают очередность нуклеотидов в гене, поскольку каждой аминокислоте соответствуют три нуклеотида (кодон). С помощью синтезатора создают химическим путем ген, аналогичный природному гену.

Полученный целевой ген с помощью ферментов лигаз сшивают с другим геном, который используется в качестве вектора для встраивания гибридного гена в клетку. В качестве вектора могут служить плазмиды, бактериофаги, вирусы человека, животных и растений.

Количество плазмид в бактериальной клетке может колебаться от одной до нескольких сотен, причем, чем большие размеры имеет плазмида, тем меньше ее копий в клетке. С помощью ам-пфликации генов, т. е. увеличения числа копий определенного гена в клетке, можно резко повысить производство кодируемого вещества клеткой. Ампфликацией удается добиться получения до 3000 копий плазмидных генов на клетку.

Бактериофаг как вектор используется аналогично. Целевой ген встраивается в геном фага, реплицируется вместе с генами вируса при размножении последнего в бактериальной клетке. Чаще всего используется фаг ламбда, который содержит ДНК, состоящую из 50 тыс. пар нуклеотидов. Преимущество фага ламбда перед плазмидами в том, что фаговый вектор позволяет клонировать большие фрагменты чужеродной ДНК.

В случае использования в качестве векторов вирусов человека, животных и растений чужеродный ген встраивают в ДНК вируса, и он реплицируется вместе с размножением последнего в клетке. Применяют в качестве вектора космиды, представляющие собой гибрид плазмиды с фагом. Космиды используются для клонирования больших (до 45 тыс. пар нуклеотидов) фрагментов ДНК эукариот.

Для РНК-содержащих вирусов передача генетической информации возможна с помощью ревертазы (обратной транскрипта-зы), передающей информацию о структуре белка от РНК к ДНК, которая является комплементарной иРНК.

Экспрес-сируемый ген в виде рекомбинантной ДНК (плазмида, фаг, космида, вирусная ДНК) встраивается в бактериальную или животную клетку, которая приобретает новое свойство -- способность продуцировать не свойственное этой клетке вещество, кодируемое экспрессируемым геном. Для лучшего проникновения вектора через стенку бактерий иногда прибегают к воздействию на стенку (например, хлоридом кальция), чтобы увеличить ее проницаемость.

В качестве реципиентов экспрессируемого гена чаще всего используют Е. coli, В. subtilis, псевдомонады, дрожжи, вирусы. Реципиента подбирают не только с учетом возможности встройки чужеродного гена, но и уровня выраженности (экспрессии) синтеза вещества, кодируемого геном, возможности его секреции в окружающую среду, легкости и доступности массового культивирования, экологической безопасности. Некоторые штаммы рекомбинантных бактерий способны переключать на синтез чужеродного вещества, экспрессируемого геном, до 50 % своего синтетического потенциала. Такие штаммы -- суперпродуценты целевых продуктов -- уже получены и применяются в биотехнологической промышленности; они носят название промышленных штаммов. В качестве примера можно привести штаммы -- суперпродуценты интерферона, интерлейкина, белков ВИЧ и др.

Некоторые штаммы микроорганизмов хорошо экспрессируют чужеродные гены, но плохо секретируют продукт в окружающую среду. В таких случаях приходится применять дезинтеграцию (разрушение) клетки с целью высвобождения из нее синтезированного продукта.

В некоторых случаях, несмотря на наличие экспрессии и секреции, продукт не удается получить, вернее собрать, из-за разрушения в процессе синтеза или после него протеазами и другими ингибиторами. Это прежде всего относится к низкомолекулярным пептидам.

С целью повышения уровня секреции целевого белка пользуются следующим приемом: к гену целевого белка присоединяют ген белка, хорошо секретируемого клеткой реципиента. Образующийся в результате такой манипуляции химерный белок, хорошо секретируемый клеткой, собирают и от него отщепляют целевой белок. Возможно также к гену целевого белка присоединить ген-индикатор, т. е. ген, кодирующий легко узнаваемый белок, в результате чего получают химерный индикаторный белок, а из него -- целевой белок. В качестве индикатора можно использовать, например, галактозидазу.

Библиографический список

1. Микробиология М.В. Гусев., Л.А. Минеева -М.: АкадемА. 2003. 461с.

2. Микробиологиия с основами вирусологии. Лукомская К.А. -М.: Просвещение. 2007. 190с.

3. Микробиология. К.А. Мудрецова-Вис, Ф.М. Чистяков -М.: Экономика. 2009. 263с.

4. Микробиология. А.А. Воробьев, А.С. Быков. -М. Медицина. 2008.

Размещено на Allbest.ru