Роль деяких вуглеводзв'язувальних білків у спонтанному та індукованому мутагенезі соматичних клітин ссавців in vitro

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЇ БІОЛОГІЇ ТА ГЕНЕТИКИ

УДК 575.113:575.224 + 557.21

РОЛЬ ДЕЯКИХ ВУГЛЕВОДЗВ'ЯЗУВАЛЬНИХ БІЛКІВ У СПОНТАННОМУ ТА ІНДУКОВАНОМУ МУТАГЕНЕЗІ СОМАТИЧНИХ КЛІТИН ССАВЦІВ IN VITRO

03.00.22 - молекулярна генетика

А в т о р е ф е р а т дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

ПІВЕНЬ ОКСАНА ОЛЕКСАНДРІВНА

Київ 2008

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано у відділі генетики людини Інституту молекулярної біології та генетики НАН України.

Науковий керівник: доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Лукаш Любов Леонідівна, Інститут молекулярної біології та генетики НАН України, завідувач відділу генетики людини.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Дубровна Оксана Василівна, Інститут фізіології рослин та генетики НАН України, старший науковий співробітник відділу генетичних основ гетерозису;

доктор медичних наук, професор Бариляк Ігор Романович, Науковий Центр радіаційної медицини АМН України, завідувач відділу медичної генетики.

Захист відбудеться “28“ жовтня 2008 року о годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.237.01 Інституту молекулярної біології та генетики НАН України за адресою: 03680, м. Київ, вул. Заболотного, 150.

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту молекулярної біології та генетики НАН України.

Автореферат розіслано __ вересня 2008 року.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук О.В. Підпала

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Актуальність даної роботи визначається загальнобіологічним значенням досліджень генетичних наслідків взаємодії екзогенних білків із клітиною. На сьогоднішній день описано сотні мутагенів та канцерогенів хімічної природи, детально досліджено шляхи і механізми їхньої взаємодії з геномом. У той же час потенційні біологічні мутагени, такі як функціонально активні макромолекули, які є невід'ємними компонентами внутрішнього і зовнішнього середовища клітини, досліджені недостатньо. Тому експериментальні дослідження впливу екзогенних білків на індукований мутагенез у клітинних популяціях можуть надати важливий фактичний матеріал для розвитку теорії “біологічного мутагенезу” як одного з напрямку генетики.

Серед біологічних факторів, що локалізовано діють на геном еукаріотів виокремлюються екзогенні нуклеїнові кислоти (Гершензон, Александров, Малюта, 1975), мобільні генетичні елементи (McClintock, 1980; Хесин, 1984), онкогенні та інфекційні віруси (Шапиро, Варшавер, Маршак, 1984; Лукаш и др., 1980; Бужиевская, 1984; Гершензон и др., 1999). Особливий вклад у розуміння механізмів впливу екзогенних макромолекул на мутагенез у клітинах ссавців внесли дослідження з використання фрагментів геному вірусного та клітинного походження як зовнішніх факторів (Лукаш и др., 1985; Durnam et al., 1986; Das, Zhang, Shillitoe, 1994; Бобрышева, Варшавер, 1995). Показано, що первинним чинником мутагенезу у системі онковірус - клітина є експресія ранніх регуляторних генів, що відповідають за стимуляцію реплікації та злоякісної трансформації, а вторинним чинником - перепрограмування клітинного геному під впливом експресії вірусних генів та їхньої інтеграції з хромосомною ДНК. Ці дані вказували на можливу роль екзогенних білків із регуляторними функціями в індукції мутаційного процесу.

Ще в 60-х роках минулого сторіччя O. Фахмі та M. Фахмі (Fahmy, Fahmy, 1965) відкрили здатність окремих білків та синтетичних полімерів спричиняти мутації у дрозофіли. Мутагенні властивості виявлено для дезоксирибонуклеази I та II, для ДНК-полімерази та зворотної транскриптази, тобто стосувались білків, що мали ензиматичні активності та завдяки цьому брали участь у перебігу основних матричних процесів. Однак у подальшому з'ясувалось, що не лише білки-ферменти, а й деякі гормони пептидної природи (Тимченко, 1991; Лукаш и др. 1999), цитокіни (Lazutka, 1996) та інші біологічні фактори (Дурнев, Середенин, 1996) також здатні модулювати мутаційний процес.

Серед білків із потенційними мутагенними та антимутагенними властивостями особливої уваги заслуговують лектини, глікопротеїни неімунної природи, які здатні специфічно та зворотно взаємодіяти із вуглеводними групами біополімерів. Реакції за участю лектинів умовно поділяють на два основні типи: безпосередній контакт із вуглеводними групами та сигнальний вплив, опосередкований рецепторами клітинної мембрани, що індукує складний ланцюг внутрішньоклітинних процесів.

На сьогодні є лише поодинокі повідомлення про вплив лектинів на мутаційний процес у популяціях клітин еукаріотного походження. Так, виявлено антимутагенну та протипухлинну дію фітогемаглютеніну із насіння квасолі звичайної в системі in vivo (Лалчев, 1987); показано вплив галактозоспецифічного лектину із суцвіть бузини чорної на частоту спонтанних та індукованих алкілувальним агентом мутацій у клітинах ссавців in vitro (Лукаш и др., 1997). На відміну від еукаріотних моделей у прокаріотів генетичну активність лектинів досліджено детальніше (Карпова та ін., 2003; Карпова, Корецкая, 2004). Показано, що функціонально активні лектини здатні впливати на мутаційний процес у популяціях бактеріальних клітин не залежно від їхньої вуглеводної специфічності. Проведення досліджень із використанням колекції мутантних за різними системами репарації штамів дало змогу авторам висловити припущення, що лектини, ймовірно, впливають на процеси мутагенезу через порушення роботи певних репаративних механізмів клітини.

Таким чином, аналіз літературних даних свідчить про реальну можливість впливу екзогенних вуглеводзв'язувальних білків на мутаційний процес у клітинах різного походження, однак лишаються не вивченими особливості їхньої біологічної дії в популяціях еукаріотних клітин, залежність мутагенних ефектів від структурно-функціональної організації самих білків як діючих факторів, закономірності прояву їхньої генетичної активності. Тож серед багатьох питань ми сконцентрували увагу на таких: чи притаманна лектинам різного походження здатність до мутагенної/антимутагенної дії у популяціях клітин ссавців in vitro, чи залежить прояв генетичної активності цих білків від їхньої вуглеводної специфічності, концентрації, цитотоксичності та інших умов експерименту. Проведення експериментальних досліджень для з'ясування особливостей мутагенезу у системі екзогенний білок - клітина є важливим як для розвитку фундаментальної генетики, так і для практичного використання лектинів у медицині та фармакології. Захист геному людини за допомогою чинників природного походження передбачає дослідження закономірностей і механізмів їхнього впливу на мутаційний процес.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Роботу виконано в рамках наукових проектів відділу генетики людини Інституту молекулярної біології та генетики НАН України "Дослідження ролі репарації ДНК в прояві мутагенної та антимутагенної активності деяких білків” (НДР НАНУ, № державної реєстрації - 0101U000359, 2001-2004 рр.) і “Дослідження можливостей регуляції мутаційної мінливості в популяціях клітин ссавців при їхній диференціації та злоякісній трансформації in vitro” (НДР НАНУ, № державної реєстрації - 0105U003262, 2005-2008 рр).

Мета та завдання дослідження. Метою даної роботи було дослідження особливостей впливу різних за походженням та вуглеводною специфічністю вуглеводзв'язувальних білків на індукований мутагенез у популяціях соматичних клітин ссавців in vitro. З'ясувати особливості комбінованої дії білків та алкілувального агента з відомим механізмом дії.

Для досягнення цієї мети необхідно було вирішити такі завдання:

1. Вивчити можливість індукції генних мутацій під впливом деяких вуглеводзв'язувальних білків (лектини, цитокін EMAPII) у популяціях клітин китайського хом'ячка in vitro та встановити характер мутагенного ефекту від концентрації білка.

2. З'ясувати особливості комбінованого впливу досліджуваних лектинів різного походження та нітрозогуанідину на мутаційний процес, а саме залежність зміни мутагенного ефекту від типу білка і порядку внесення діючих речовин у клітинну систему.

3. Дослідити вплив рослинних та тваринних лектинів на проліферацію та виживання соматичних клітин людини і китайського хом'ячка в культурі та з'ясувати залежність їхньої біологічної дії від концентрації білка.

4. Перевірити можливість індукції апоптичних змін досліджуваними лектинами у соматичних клітинах людини і китайського хом'ячка in vitro і вивчити можливу кореляцію їхньої цитотоксичної та мутагенної дії.

5. Проаналізувати перехресну резистентність одержаних під впливом досліджуваних білків клонів клітин, стійких до дії 6-меркаптопурину.

Об'єкт дослідження: спонтанний та індукований факторами різної природи мутаційний процес у популяціях клітин ссавців in vitro.

Предмет дослідження: вплив різних за походженням та вуглеводною специфічністю лектинів на процеси мутагенезу, проліферацію та виживання клітин ссавців у культурі. вуглеводзв'язувальний генний мутація хом'ячок

Методи дослідження - молекулярно-генетичні: індукція генних мутацій за локусом гіпоксантин-гуанін-фосфорибозил-трансферази (hprt), перехресна селекція мутантних клонів клітин у культуральних середовищах, що містять аналоги пуринових основ та інші селективні агенти, виділення та електрофорез білків, Вестерн-блот аналіз; методи клітинної біології (культивування клітин ссавців in vitro, визначення ефективності клонування, мікрокультуральний тест для виявлення впливу різних за природою факторів на проліферацію та виживання клітин, аналіз морфології ядер клітин, забарвлених специфічним барвником Hoechst № 33258); математична обробка даних і статистичні методи аналізу.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше показано індукцію генних мутацій за локусом hprt під впливом низки вуглеводзв'язувальних білків різного походження (лектини і цитокін ЕМАРП) і встановлено деякі особливості їхньої дії в популяціях соматичних клітин ссавців in vitro. Так, мутагенний ефект виявлено на 3-4 добу після обробки і встановлено пряму залежність частоти індукованих мутацій від концентрації білка в певному діапазоні доз. Математичне моделювання мутаційного процесу, індукованого лектинами, у співставленні з цитокіном ЕМАРП, показало, що біологічна дія перших білків має менш складний характер і її можна описати нелінійним рівнянням другого ступеня. Вперше виявлено кореляцію між проявом мутагенної та цитотоксичної активності досліджуваних лектинів у популяціях клітин ссавців за даних умов експерименту. При цьому зменшення кількості клітин супроводжувалось морфологічними змінами, характерними для апоптозу. Показано, що цитотоксичний ефект досліджуваних лектинів сильніший в популяціях клітин китайського хом'ячка порівняно з клітинами людини. Вперше детально досліджено біологічну активність тваринного лектину, виділеного з ікри окуня.

Показано, що при комбінованій обробці клітин лектинами різного походження і алкілувальним агентом нітрозогуанідином експериментально отримана частота індукованих мутацій достовірно нижча теоретично очікуваної величини, розрахованої за умови їхньої незалежної сумарної дії. Виявлений антимутагенний ефект виявляється не залежно від порядку введення досліджуваних речовин у клітинну систему і свідчить про наявність спільних клітинних мішеней, за які конкурують молекули різних за природою речовин.

Сукупність отриманих результатів - наявність схожих тенденцій індукції генних мутацій і зниження кількості метаболічно активних клітин при дії кожного із досліджуваних лектинів окремо, а також у комбінації з нітрозогуанідином, пряма залежність від концентрації і збіг у часі мутагенного і цитотоксичного ефектів - не суперечать уявленню про те, що мутагенність і цитотоксичність цих білків можуть визначатись спільними молекулярними механізмами.

Практичне значення одержаних результатів. Результати експериментальних досліджень особливостей впливу різних за походженням та вуглеводною специфічністю лектинів на основні процеси клітини, такі як мутаційна мінливість, проліферація, програмована гибель, в цілому розширюють наші знання про генетичні наслідки взаємодії екзогенних білків та еукаріотних клітин, наближають до розуміння процесів, які впливають на спонтанний та індукований мутагенез в еукаріотних клітинах. Тому результати та висновки, що наведені в даній дисертаційній роботі, є певним внеском у розвиток теорії мутагенезу і можуть бути використані при викладанні відповідних спецкурсів для студентів вищих навчальних закладів.

На основі одержаних даних можна зробити висновок про придатність використаної тест-системи з індукції прямих мутацій за локусом hprt не тільки для досліджень індукованого мутагенезу, а й для експериментів із вивчення модулюючого впливу на процеси мутагенезу екзогенних макромолекул різного походження. Цю тест-систему можна буде використовувати у подальших пошуках нових природних антимутагенів та модуляторів мутаційного процесу в клітинах ссавців. Мутантні клони клітин, які стійкі до 6-меркаптопурину, можуть бути використані для проведення різноманітних експериментальних досліджень, в тому числі для вивчення молекулярних механізмів мутаційних процесів.

Особистий внесок здобувача. Результати викладені у дисертації отримано особисто або за безпосередньої участі у виконанні експериментів. Планування досліджень, обговорення, аналіз, інтерпретацію отриманих даних і публікацій до друку здійснювали разом із науковим керівником. Здобувачем особисто проведено серію дослідів із індукції генних мутацій під впливом досліджуваних біологічних та хімічних чинників, із вивчення їхньої спільної мутагенної дії, одержано та проаналізовано колекцію клонів клітин, резистентних до 6-меркаптопурину. Також виконано експерименти з дослідження впливу лектинів на проліферацію й апоптоз у популяціях клітин людини та китайського хом'ячка.

Частину експериментальної роботи та теoретичний аналіз результатів було виконано спільно зі співробітниками відділу генетики людини Інституту молекулярної біології та генетики НАН України К.В. Костецькою, Л.Л. Мацевич, О.М. Сухорадою, С.І. Лукаш, з якими автор має спільні публікації.

Дисертантка вдячна за препарат нітрозогуанідину, синтезований та люб'язно наданий у розпорядження відділу генетики людини к.б.н., с.н.с. А.Г. Терентьєвим та препарат цитокіну EMAPII, який був люб'язно наданий у наше розпорядження д.б.н., проф. член-кор. НАНУ О.І. Корнелюком.

Апробація результатів дисертації. Загальні положення роботи доповідались на наукових семінарах Інституту молекулярної біології та генетики НАН України та наукових конференціях: Установчому з'їзді Українського товариства клітинної біології (Львів, Україна, 2004); І Міжнародній конференції “Фактори експериментальної еволюції організмів” (Алушта, Україна, 2003); ІІІ Міжнародній конференції “Фактори експериментальної еволюції організмів” (Алушта, Україна, 2006); EMBO/FEBS conference “Protein Transport Systems: Protein Targeting and Translocation” (Gdansk, Poland, 2006); Конференції молодих науковців Інституту молекулярної біології та генетики (Київ, Україна, 2007); Conference for Young Scientists, PhD Students on Molecular Biology and Genetics, Dedicated to 120th anniversary of M.I.Vavilov (Kyiv, Ukraine, 2007); VIII З'їзді Українського товариства генетиків і селекціонерів ім. М.І. Вавилова (Алушта, Україна, 2007).

Публікації. Основні положення дисертаційної роботи висвітлено у 10 наукових працях, із них 4 у наукових фахових виданнях, 6 - у матеріалах і тезах конференцій та інших наукових виданнях.

Структура та обсяг. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, матеріалів та методів, експериментальної частини, яка має два розділи, аналізу i узагальнення результатів досліджень, висновків та списку використаних джерел, який налічує 144 найменувань. Дисертацію викладено на 147 сторінках стандартного машинопису. Вона містить 14 таблиць та 14 рисунків.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

Матеріали та методи. У роботі використовували лінію клітин китайського хом'ячка Blld-ii-FAF28Cl237 та лінію клітин людини А-102. Стандартна лінія клітин китайського хом'ячка Blld-ii-FAF28Cl237, яку широко використовували для вивчення генетичної (індукція прямих рецесивних мутацій за локусом hprt) та інших біологічних активностей досліджуваних вуглеводзв'язувальних білків, детально описана раніше (Лукаш, Бужиевская, 1986). Лінію клітин людини А-102, люб'язно надану у розпорядження відділу генетики людини Інституту молекулярної біології та генетики НАНУ професором МакКорміком (Мічиганський Державний Університет, США), використовували для вивчення впливу досліджуваних лектинів на проліферацію та апоптоз. Окрім того, в окремих експериментах для проведення Вестерн-блот аналізу використовували стандартну лінію клітин людини Hep-2 (рак гортані) та первинні клітини людини, одержані зі шкіри.

Для культивування та клонування клітин ссавців використовували стандартне мінімальне середовище Ігла (МЕМ) із додаванням 5 - 10 % ембріональної сироватки великої рогатої худоби, антибіотиків та відповідних селективних агентів. Досліджували вплив на мутагенез комерційних препаратів лектинів (НВК “ЛЕКТИНОТЕСТ”, Львів) із відомою структурою, два з них - рослинного походження, кори бузини чорної S. nigra (ЛБЧ) та насіння сочевиці L. culinaris (ЛНС), і один лектин тваринного походження, виділений з ікри окуня звичайного P.fluviatilis (ЛІО).

Для індукції генних мутацій було залучено хімічний мутаген із відомим механізмом дії, а саме: простий метилувальний агент N - метил - N' - нітро - N - нітрозогуанідин (нітрозогуанідин або МННГ). У дослідах із вивчення цитотоксичної дії лектинів як позитивний контроль використовували мітоміцин С (ММС, Sigma, США) - складний алкілувальний агент, що спричиняє зшивки ДНК-білок (у медицині використовується як цитостатик із протипухлинною дією).

Для виявлення впливу досліджуваних білків на мутаційний процес на генному рівні як модель використовували прямі рецесивні мутації за локусом hprt. Досліджували вплив лектинів на мутаційний процес клітин ссавців згідно описаної схеми (Шапиро, Варшавер, 1975; Лукаш, Бужиевская, 1986). Для відбору мутантних клонів як основний селективний агент використовували 6-меркаптопурин (6МП). Природу резистентності у клонів, одержаних у експериментах із мутагенезу, аналізували за допомогою різних селективних середовищ із використанням аналогів пуринових основ, аміноптерину і компонентів середовища HAТ (Волкова, Капканова, 1972; Шапиро, Варшавер, 1975).

При дослідженнях впливу лектинів на проліферацію і виживання клітин ссавців використовували модифікований метод мікрокультур (Лукаш и др., 1997). Проводили оцінку змін морфології ядра поодиноких клітин після обробки лектинами із використанням методу забарвлення ядер барвником Hoechst № 33258 (Фільченков, Стойка, 2005). При дослідженні впливу лектинів на рівень експресії репаративного ферменту 0⁶-алкілгуанін-ДНК-алкілтрансферази (АГТ) використовували стандартні методики виділення та електрофоретичного аналізу білків (Morton, Margison, 1988; Laemmli, 1970), а також метод Вестерн-блот аналізу за допомогою моноклональних антитіл anti-MGMT, виробництва “Novus biologicals, Littllton Co” (США). Статистичний аналіз отриманих даних проводили за методом Фішера, Стьюдента та методом аналізу частоти розподілу ч² (Плохинский, 1970).

Результати досліджень та їх обговорення

Індукція мутацій за локусом hprt. У результаті проведених експериментальних досліджень показано, що всі досліджувані нами лектини як рослинного (ЛБЧ, ЛНС), так і тваринного (ЛІО) походження, здатні впливати на рівень мутагенезу в популяціях клітин китайського хом'ячка in vitro. Всього проведено 8 експериментів. На рис. 1 наведено дані типових експериментів із індукції генних мутацій ЛБЧ, ЛІО та ЛНС. Мутагенний ефект у більшості дослідних варіантів був статистично достовірним. Спостерігали пряму залежність мутагенного ефекту від концентрації білка в певному діапазоні доз. У випадку лектину бузини чорної спостерігали ефект насичення при підвищенні концентрації вище 20 мкг/мл; максимальний мутагенний ефект становив 58,03 х 10^-5. При використанні лектину насіння сочевиці ефект насичення був відсутній, і спостерігали поступове підвищення частоти мутацій до концентрації 2000 мкг/мл; максимальний мутагенний ефект дорівнював 76,92 х 10^-5.

Варто зуважити, що лектин ікри окуня (ЛІО), який відрізняється від рослинних лектинів і за будовою молекули, і за вуглеводною специфічністю, також виявив мутагенну активність. Як і у випадку лектину насіння сочевиці, в діапазоні концентрацій від 0,2 до 2000 мкг/мл білка спостерігали пряму залежність появи частоти мутантних клонів від концентрації; і максимальний мутагенний ефект у цьому випадку становив 43,58 х 10^-5 при концентрації білка 2000 мкг/мл.

Ґрунтуючись на основі одержаних результатів стосовно білків іншої природи, альбуміну і цитокіну EMAPII (Коваленко та ін., 2005, 2007), можна зробити висновок про універсальність індукції генних мутацій екзогенними білками в даній клітинній системі.

Аналіз перехресної резистентності отриманих нами мутантних клонів клітин підтвердив мутаційну природу їхньої стійкості до 6МП (табл.). Практично всі клони мають мутації, що призвели до повної втрати ферментативної активності ГФРТ, а у випадку МП 31, 34 та 42 - ще й мутації резистентності до аміноптерину. Для з'ясування типу генних мутацій необхідне проведення подальших молекулярно-генетичних досліджень.

Математичне моделювання мутаційного процесу, спричиненого вуглеводзв'язувальними білками, а саме цитокіном EMAPII та досліджуваними лектинами показало, що залежність мутагенного ефекту від концентрації при дії цитокіну EMAPII має складніший характер порівняно з лектинами. Як уже зазначалось, біологічна дія лектинів характеризується поступовим підвищенням частоти резистентних до 6-МП клонів із зростанням концентрації білка, і, як виявилось, цю залежність можна описати нелінійним рівнянням другого ступеня.

Таблиця

Ефективність клонування вихідного та мутантних клонів лінії клітин китайського хом'ячка на різних селективних середовищах

На нашу думку, у реалізації мутагенної дії лектинів, які належать до різних класів білків (рибосомо-інактивувальні білки, бобові та фукозоспецифічні лектини), можуть брати участь ті ж складні механізми, що і у прояві їхньої цитотоксичності. Варто зауважити, що різними авторами експериментально показано здатність деяких білків групи RIP (рицину та шига токсину) як до індукції апоптозу, так і до блокування репарації еукаріотної ДНК (Barbieri, 2004; Sestili, 2005).

Антимутагенний ефект при комбінованій обробці клітин лектинами та нітрозогуанідином. Завданням наступного етапу було дослідити особливості комбінованого впливу лектину і алкілувального агента нітрозогуанідину на мутаційні процеси у клітинах ссавців in vitro. Відомо, що і цитотоксичний, і мутагенний ефекти останнього визначаються утворенням аддукту або первинного пошкодження ДНК: О⁶-метилгуаніну. Для виправлення цього пошкодження еволюційно сформувався специфічний репаративний ензим О⁶-алкілгуанін-ДНК-алкілтрансфераза (АГТ) (Pegg et al., 2005).

Якщо досліджувані лектини, різні за походженням, діють на мутаційні процеси за одними й тими ж механізмами, то повинні спостерігатись однакові тенденції зміни мутагенного ефекту, індукованого модельним мутагеном із відомим механізмом дії. Ми припускали, що як хімічний, так і біологічний чинники можуть діяти: на одні й ті ж клітинні мішені; на різні клітинні мішені. Отже, вони можуть конкурувати за клітинні мішені, і тоді їхній спільний ефект може статистично достовірно відрізнятися від теоретично розрахованої величини за умови їхньої незалежної адитивної дії, або спільний ефект повинен наближатись до теоретично розрахованої величина за умови їхньої незалежної адитивної дії.

При вивченні спільної дії лектину кори бузини та MННГ білок використовували у концентрації 0,2 мкг/мл, враховуючи попередні дані (Лукаш и др., 1997). Нами показано, що при послідовній комбінованій обробці клітин китайського хом'ячка спочатку лектином кори бузини чорної, а потім MННГ, частота резистентних до 6МП клонів клітин була статистично достовірно нижчою порівняно з теоретично очікуваною величиною за умов їхньої незалежної сумарної дії (рис.2).

Проте ефект зниження частоти мутантів був менш вираженим порівняно із застосуванням лектину суцвіть бузини чорної, що можна пояснити як різницею в біологічній активності самих лектинів, так і їхніх препаратів, одержаних за різних умов.

Для того, щоб перевірити, чи можуть різні за походженням лектини конкурувати з MННГ за спільні клітинні мішені у подальших дослідженнях використовували як ЛБЧ, так і ЛІО з різними варіантами обробки. Виявлений антимутагенний ефект не залежав від порядку внесення в клітинну систему діючих агентів, та свідчив на користь уявлення про існування спільних клітинних мішеней, за які конкурують молекули біологічних і хімічного мутагенних факторів (рис.3).

Ми припустили, що однією з багатьох можливих клітинних мішеней для впливу досліджуваних білків на мутаційний процес може бути репаративний ензим АГТ, який індукується у відповідь на появу О⁶-метилгуаніну й утворення однониткових розривів ДНК (Fritz and Kaina, 1992). Про здатність деяких лектинів індукувати розриви ДНК експериментально показано у нашому відділі раніше (Мацевич та ін. 2003, 2004).

Таким чином, сукупність наведених даних щодо існування антимутагенного ефекту при спільній дії лектинів та нітрозогуанідину, а також результатів з індукції лектинами О⁶-алкілгуанін-ДНК-алкілтрансферази, отримані нами за допомогою Вестерн-блот аналізу у серіях експериментів із різними клітинами ссавців (Лыло и др., 2007), не суперечить цьому уявленню.

Цитотоксична дія лектинів на клітини ссавців у культурі. Виходячи з припущення, що мутагенна активність досліджуваних лектинів може бути пов'язана з проявом їхньої цитотоксичної активності, провели низку дослідів із вивчення впливу досліджуваних лектинів на проліферацію і виживання клітин ссавців у культурі.

Результати дослідів із клітинами китайського хом'ячка, свідчать про те, що усі досліджувані нами лектини в діапазоні концентрацій від 0,2 до 2000 діють на проліферацію клітин подібним чином (рис. 4).

Спостерігали значне зниження кількості клітин при більшості досліджуваних концентрацій, особливо чітко це виражено при збільшенні концентрацій від 2 до 2000 мкг/мл. При концентрації білків 0,2 мкг/мл не виявлено суттєвої різниці за кількістю клітин між дослідом і негативним контролем. При концентрації білків 2 мкг/мл спостерігали різке зниження кількості клітин щодо негативного контролю, а при концентраціях 20 та 2000 мкг/мл кількість клітин після експозиції з білками була значно нижчою, ніж у негативному контролі. Лектини при цих концентраціях спричиняли зменшення кількості клітин на рівні з мітоміцином С у концентрації 1мкг/мл. За критерієм Стьюдента, різниця між дослідними і контрольними варіантами була статистично достовірною при усіх досліджуваних концентраціях лектинів, окрім однієї - 0,2 мкг/мл. Можливо, при цій концентрації, у системі “клітина - лектин” відбувається зміна активності білка: з мітогенної на цитотоксичну, що залежить від кількості активних молекул білка у тест-системі.

Усереднені дані експериментів, одержані з використанням лінії клітин людини, наведено на рис. 5.

У системі клітин людини всі три досліджувані лектини виявили мітогенну активність при відносно малих концентраціях (особливо це стосується лектину ікри окуня), і меншою мірою - цитотоксичну дію при високих концентраціях. І ефект стимулювання клітинного поділу лектинами при малих концентраціях, і ефект зниження кількості клітин при високих концентраціях у багатьох випадках був статистично достовірним. Найменшу біологічну активність у клітинах людини виявляв ЛБЧ, найбільшу - ЛНС. У останьому випадку кількість клітин знижувалась до рівня, встановленого для мітоміцину С в концентрації 10 мкг/мл (рис. 5).

Таким чином, з'ясували, що клітини людини стійкіші до цитотоксичної дії досліджуваних лектинів, а біологічну активність лектину бузини чорної в цій клітинній системі за даних умов майже не виявляли. У випадку двох із досліджуваних лектинів: ЛНС та ЛІО зменшення кількості клітин у клітинних популяціях спостерігали при вижчих концентраціях (20 - 2000 мкг/мл) порівняно з клітинами китайського хом'ячка.

У системі клітин людини при застосуванні усіх трьох досліджуваних лектинів у відносно низьких концентраціях спостерігали тенденцію до стимулювання клітинного поділу. На нашу думку, це досить цікаве спостереження, і воно свідчить про деяку подібність біологічної дії лектинів із ростовими факторами.

Отримані нами результати узгоджується з літературними даними про наявність цитотоксичної дії для цілої низки RIP білків і деяких тваринних лектинів.

Виникало питання: за рахунок чого відбувається зменшення кількості клітин порівняно з контролем, чи за рахунок “арешту” поділу клітин, так званої цитостатичної дії, чи за рахунок цитотоксичної дії? Зважаючи на те, що є дані про індукцію апоптозу деякими представниками RIP білків (Boettner et al., 2002), а також про індукцію однониткових розривів ДНК лектинами кори та суцвіть бузини чорної, що, у свою чергу, може бути причиною апоптозу (Мацевич та ін., 2003, 2004; Sestili, 2005), ми припустили можливість участі лектинів у активації запрограмованої загибелі клітин.

Використовуючи метод забарвлення, Hoechst № 33258 показано, що усі досліджені нами лектини при концентрації 20 мкг/мл спричиняли підвищення характерних змін морфології ядер (рис.6) у культурі клітин китайського хом'ячка. Такий ефект був статистично достовірним через дві доби після обробки усіма досліджуваними білками за критерієм ² (P<0,001 ), і його можна порівняти з дією мітоміцину С.

Підвищення частоти апоптичних змін спостерігали і відразу після обробки клітин лектинами, але лише у випадку лектину ікри окуня цей вплив був статистично достовірним (P<0,001). Спостерігали утворення розривів та хроматинових тілець (рис. 6,б, 6,в), компактизацію хроматину (рис. 6,г). У контролі такі зміни не спостерігали (рис. 6,а).

Отримані дані узгоджуються з попередніми результатами, де при дослідженні впливу лектинів на виживання із використанням культури клітин китайського хом'ячка, спостерігали статистично достовірне зменшення кількості метаболічно активних клітин після їхньої обробки білками у високих концентраціях. В той же час, при концентрації лектинів 0,2 мкг/мл індукції апоптичних змін ядер клітин китайського хом'ячка не спостерігали. Частота випадків апоптичних клітин при цій концентрації суттєво не відрізнялась від контролю як відразу, так і через 2 доби після обробки клітин лектинами. При використанні культури клітин людини як моделі для індукції апоптозу досліджувані лектини діяли по-різному. Показано, що ЛІО та ЛНС у концентрації 20 мкг/мл статистично достовірно підвищували частоту апоптичних клітин у культурі як відразу, так і через дві доби після обробки (P<0,001). Причому, ЛНС був найактивнішим: 30,2 % апоптичних клітин у популяції проти 23,94 % для лектину ікри окуня вже відразу після обробки.

При концентрації 0,2 мкг/мл обидва вказані вище лектини не впливали на частоту апоптичних клітин у популяції клітин людини відразу після обробки. Через дві доби частота апоптичних клітин після обробки клітин ЛНС також була на рівні контролю. Однак несподіваним був ефект лектину ікри окуня: у цьому дослідному варіанті спостерігали статистично достовірне (P<0,001) зменшення частоти апоптичних клітин у дослідній культурі 8,8 % проти 13,72 % у контролі.

Ймовірно, лектини здатні впливати на процеси мутагенезу і виживання клітин ссавців опосередковано через чисельні сигнально-регуляторні механізми клітини. Крім того, можливо, що біологічна дія деяких лектинів реалізується через їхні специфічні ферментативні активності, такі як, наприклад, N-глікозидазна, яка призводить до утворення апуринових сайтів у ДНК (Barbieri et al., 2004).

Таким чином, можна зробити висновок, що досліджувані лектини виявили здатність впливати на мутаційний процес і виживання клітин ссавців у культурі, при цьому спостерігали пряму залежність мутагенної і цитотоксичної активності від концентрації у одному й тому ж діапазоні доз. Результати проведених досліджень розширюють уявлення про мутагенез, та дають змогу використовувати вивчені білки як модулятори мутаційного процесу еукаріотів.

ВИСНОВКИ

Виявлено індукцію генних мутацій під впливом різних за походженням вуглеводзв'язувальних білків (лектини, цитокін ЕМАРII) у соматичних клітинах ссавців in vitro, що поряд із літературними даними стосовно інших екзогенних білків свідчить про універсальний характер даного явища. На основі одержаних результатів висловлено гіпотезу про те, що мутагенез, індукований досліджуваними лектинами і прояв їхньої цитотоксичної активності зумовлені деякими спільними молекулярними механізмами.

Вперше з'ясовано деякі особливості мутаційного процесу під впливом екзогенних білків із різною вуглеводною специфічністю в культурі клітин китайського хом'ячка: пряму залежність частоти мутацій за локусом hprt від концентрації білка, спричинення такого ж високого мутагенного ефекту, як і при дії алкілувального агента нітрозогуанідину за даних умов експерименту.

Вперше виявлено схожий антимутагенний ефект при комбінованій обробці клітин китайського хом'ячка лектинами різної природи (ЛБЧ або ЛІО) і нітрозогуанідином, при цьому експериментальна частота появи індукованих мутантних клонів, яка характеризує спільний мутагенний ефект, статистично вірогідно нижча, ніж теоретично очікувана величина за умови незалежної адитивної дії двох факторів.

Показано значне зниження кількості метаболічно активних клітин китайського хом'ячка і людини під впливом усіх досліджуваних лектинів, що особливо чітко виявлено у популяціях клітин китайського хом'ячка при підвищенні концентрації білка від 2 до 2000 мкг/мл і збігається з проявом статистично вірогідного мутагенного ефекту.

Встановлено підвищення частоти апоптичних клітин внаслідок дії досліджуваних лектинів у концентрації 20 мкг/мл через дві доби після обробки, тобто в той же час, коли індукуються пошкодження ДНК, які реалізуються у генні мутації.

Вперше показано, що порівняно з рослинними лектинами, лектин ікри окуня у низьких концентраціях (0,002-0,2 мкг/мл) виявляє здатність стимулювати клітинний поділ у популяціях клітин ссавців in vitro.

Підтверджено мутаційну природу резистентності до 6-меркаптопурину клонів, що були отримані при дії лектинів та цитокіну ЕМАРII на клітини китайського хом'ячка. Мутантні клони клітин можуть бути використані для подальшого молекулярно-генетичного аналізу мутацій за локусом hprt.

ПЕРЕЛІК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1 Коваленко О.О. (Півень О.О.) Вплив лектинів різного походження на мутаційний процес у популяціях соматичних клітин ссавців /О.О. Коваленко (О.О. Півень), К.В. Костецька, Л.Л. Лукаш // Біополімери і клітина. 2006. Т. 22, № 1. С. 33 - 38.

Особистий внесок здобувача - проведення експериментів з вивчення впливу лектинів рослинного та тваринного походження на проліферацію клітин китайського хом'ячка та впливу лектину кори бузини чорної на мутаційний процес, власноруч написано основну частину статті.

2. Коваленко О.О.(Півень О.О.) Індукція генних мутацій цитокіном EMAPII та лектинами різного походження в соматичних клітинах ссавців in vitro / О.О.Коваленко (О.О. Півень), Л.Л. Лукаш, С.І. Лукаш // Біополімери і клітина. 2007. Т. 23, № 5. С. 410 - 415.

Особистий внесок здобувача - виділено колекцію клонів клітин китайського хом'ячка резистентних до 6-МП та проаналізовано їхню перехресну резистентність до інших аналогів азотистих основ, аналіз наукових даних та написання статті проводилось за безпосередньої участі дисертантки.

3. Коваленко О.О. (Півень О.О.) Індукція апоптозу у популяціях клітин ссавців in vitro під впливом лектинів/ О.О. Коваленко (О.О. Півень), Л.Л. Лукаш // Цитология и генетика. 2007. Т. 41, № 5. С. 48 - 53.

Особистий внесок здобувача - проведено досліди з індукції апоптозу у культурі клітин людини та китайського хом'ячка під впливом лектинів різного походження, статистичний аналіз даних.

4. Коваленко О.О. (Півень О.О.) Антимутагенний ефект при спільній дії лектину та N-метил-Nнітро-N-нітрозогуанідину на мутагенез в клітинах ссавців in vitro / О.О. Коваленко (О.О. Півень), Л.Л. Лукаш // Цитология и генетика. 2007. Т. 41, № 6. С. 62 - 66.

Особистий внесок здобувача - виконано дослідження антимутагенного ефекту при спільній дії лектинів та хімічного мутагену, аналіз наукових даних та написання статті проводились за безпосередньої участі дисертантки.

5. The study of the influence of proteins on genetic variability of cell populations in vitro / L. Macewicz, O. Kovalenko (O.Piven), O. Sushorada [et al.] // Фактори експериментальної еволюції організмів: [зб. наук. пр.]. К: Аграрна наука, 2003. 464 с.

Особистий внесок здобувача - досліджено вплив лектинів кори та суцвіть бузини чорної на проліферацію культур клітин ссавців, аналіз наукових даних та написання статті проводились за безпосередньої участі дисертантки.

6. Коваленко О.О. (Півень О.О.) Дослідження цитотоксичної дії рослинних та тваринних лектинів з різною вуглеводною специфічністю / О.О. Коваленко (О.О. Півень), Л.Л. Лукаш // Фактори експериментальної еволюції організмів: [зб. наук. пр.]. К: ЛОГОС. 2006. Т. 3. 436 с.

Особистий внесок здобувача - виконано порівняльне дослідження впливу лектинів різного походження на проліферацію та індукцію апоптозу у культурі клітин китайського хом'ячка, статистичний аналіз даних, власноруч написано основну частину статті.

7. Коваленко О.О. (Півень О.О.) Дослідження сумісного впливу лектинів та МННГ на генетичну стабільність клітин ссавців in vitro /О.О. Коваленко (О.О.Півень) // Досягнення і проблеми генетики, селекції та біотехнології: [зб. наук. пр.]. К: ЛОГОС, 2007. Т. 2. 628 с.

8. Дослідження впливу лектину кори бузини чорної (S. nigra) на генетичну стабільність клітин ссавців в умовах in vitro: Матеріали установчого з'їзду Українського товариства клітинної біології, (Львів, 25-28 квітня 2004 р.) / Інститут клітинної біології НАН України. Львів: Інститут клітинної біології НАН України, 2004. 392 с.

Особистий внесок здобувача - досліджено вплив лектинів на проліферацію культури клітин китайського хом'ячка та вплив лектину кори бузини чорної на генетичну стабільність клітин ссавців із використанням hprt-моделі.

9. The influence of plant and animal lectins on mutagenic process of mammalian somatic sell population in vitro: The materials of the EMBO/FEBS conference [Protein Transport Systems: Protein Targeting and Translocation], (Gdansk, Sept. 30 - Oct. 5 2006). Р-36.

Особистий внесок здобувача - проведення експериментів з вивчення впливу лектинів рослинного та тваринного походження на проліферацію та апоптоз культур клітин китайського хом'ячка і людини, вивчення впливу досліджуваних білків а також їхньої спільної та комбінованої дії з МННГ на генетичну стабільність клітин ссавців із використанням hprt-моделі.

10. Induction of gene mutations by lectins of different origin and cytokine EMAP in mammalian cells in vitro: The materials of the Conference for young scientists, PhD students and student on molecular biology and genetics, (Kyiv, 20-22 Sept. 2007) / Інститут молекулярної біології та генетики НАН України. К.: Інститут молекулярної біології та генетики НАН України, 2007. 206 р.

Особистий внесок здобувача - проведення досліджень впливу лектинів на генетичну стабільність клітин за локусом hprt, селекція та виділення колекції клонів клітин китайського хом'ячка резистентних до 6-МП та аналіз їхньої перехресної резистентності до інших аналогів азотистих основ.

АНОТАЦІЯ

Півень О.О. Роль деяких вуглеводзв'язувальних білків у спонтанному та індукованому мутагенезі соматичних клітин ссавців in vitro. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.22 - молекулярна генетика. - Інститут молекулярної біології та генетики НАН України, Київ, 2008.

Показано індукцію генних мутацій під впливом різних за походженням вуглеводзв'язувальних білків (лектинів кори бузини чорної, насіння сочевиці, ікри окуня і цитокіну ЕМАРII) у культурі соматичних клітин ссавців, що поряд з літературними даними стосовно інших екзогенних білків свідчить про універсальний характер даного явища. Встановлено схожість прояву мутагенної і цитотоксичної дії досліджуваних лектинів; виявлено пряму залежність біологічної активності від концентрації білка в певному діапазоні концентрацій. При дослідженні комбінованого впливу на мутагенез досліджуваних лектинів і алкілувального агента, нітрозогуанідину, виявлено антимутагенний ефект не залежно від порядку їхнього введення в клітинну систему, що свідчить про існування певних клітинних мішеней, за які вони конкурують.

На основі одержаних результатів висловлено припущення про те, що і мутагенез, індукований лектинами, і прояв їхньої цитотоксичної дії зумовлені деякими спільними молекулярними механізмами.

Ключові слова: мутагенез, лектин, репарація, апоптоз, проліферація, виживання, клітини ссавців in vitro.

АННОТАЦИЯ

Пивень О.А. Роль некоторых углеводсвязывающих белков в спонтанном и индуцированном мутагенезе соматических клеток млекопитающих in vitro. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.22 - молекулярная генетика. - Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины, Киев, 2008.

Лектины относятся к широко распространенным углеводсвязывающим белкам; благодаря способности распознавать и связывать углеводные детерминанты на поверхности клеточной мембраны они вовлечны во множество биологическх процессов. Это и стимуляция митоза, и активация пролиферации, клиренс и хоуминг клеток, иммуномодуляция и многое другое. Углеводная специфичность лектинов широко используется при решении целого ряда биотехнологических, гистологических и других задач, активно идут работы по выделению, очистке и характеристике этих белков. Но, несмотря на распространненость лектинов в природе, их активное участие во многих биологических процессах, вопрос об их возможном влиянии на мутационный процесс в популяциях соматических клеток млекопитающих долгое время оставался вне внимания большинства ученых.

Целью данной работы было изучить влияние лектинов различных по происхождению и углеводной специфичности на мутационный процесс в популяциях соматических клеток млекопитающих и зависимость их мутагенного эффекта от цитотоксичности. Исследовать совместный мутагенный эффект лектина и алкилирующего агента N-метил-N'-нитро-N- нитрозогуанидина в исследуемых клеточных популяциях.

С использованием модели прямых рецессивных мутаций по локусу hprt, показана индукция генных мутаций под действием разных по происхождению углеводсвязывающих белков (лектинов коры бузины черной, семян чечевицы, икры окуня, цитокина ЕМАРII) в культуре соматических клеток млекопитающих, что наряду с литературными данными относительно других экзогенных белков свидетельствует об универсальном харктере этого явления. Выявлена прямая зависимость этих эффектов от концентрации белка, а именно с повышением концентрации изучаемого белка регистировали повышение частоты мутантных клеточных клонов. Мутагенный эффект изученных нами лектинов был статистически достоверным и его можна сравнить с действием модельного химического мутагена нитрозогуанидина.

Анализ перекрестной устойчивости полученных нами клонов на селективных средах позволил подтвердить мутационную природу признака. Более того, наблюдали клоны резистентые не только к токсическим аналогам пуринов но и к аминоптерину, что свидетельсвует о возникновении мутаций более чем по одному локусу. Полученная коллекция может быть использована для проведения дальнейших исследований молекулярных механизмов мутаций.

Математическое моделирование мутационного процесса, под воздействием углеводсвязывающих белков показало, что зависимость мутагенного эффекта лектинов от концентрации можна описать нелинейным уравнением второй степени.

Результаты исследований комбинированного влияния на процессы мутагенеза некоторых лектинов и алкилирующего агента с известным механизмом действия, нитрозогуанидина, свидетельствуют о наличии общих клеточных мишеней, за которые они конкурируют. Высказано предположение, что одной из таких мишеней может быть репаративный фермент АГТ.

Нами впервые проведено детальное исследование влияния лектинов на пролиферацию и выживаемость клеток млекопитающих в культуре; также впервые было изучено биологическое действие лектина икры окуня и показана его способность к митогенному действию при низких концентрациях (0,2 - 2 мкг/мл). С использованием метода микрокультур показано, что все исследованные нами лектины способны влиять на пролиферацию и выживаемость клеток млекопитающих в зависимоти от их концентрации и структурно-функциональных особенностей тест-системы. В популяциях клеток китайского хомячка все три изученных лектина вызывали снижение выживаемости с возрастанием концентрации белка. С использованием в качестве тест-системы клеток человека, лектины семян чечевицы и икры окуня вели себя сходным образом, в отличии от лектина бузины черной, который не влиял существенно на пролиферацию и выживаемость. Это может быть связанно со структурно-функциональными особенностями, в том числе, с отличиями гликокода, использованных клеточных культур.

При изучении цитотоксического эффекта исследуемых лектинов в клетках китайского хомячка и человека в целом прослеживалась прямая зависимость ефекта от концентрации, с тем лишь отличием, что в культуре клеток человека лектины проявляли менее выраженную цитотоксичность по сравнению с популяциями клеток китайского хомячка.

Апоптические изменения морфологии ядер регистрировали сразу после обработки клеток лектинами и на вторые сутки после обработки с помощью окрашивания красителем Hoechst № 33258. Показано, что все три лектина индуцировали повышение частоты апоптических клеток китайского хомячка при концентрации 20 мкг/мл. Данные, полученные с использованием как клеток китайского хомячка, так и клеток человека согласуются с результатами микрокультуральных тестов: лектин коры бузины черной не вызывал статистически достоверного повышения частоты апоптических изменений в отличие от двух других белков.

Показана подобная зависимость: с возрастанием концентрации наблюдали повышение мутагенной и цитотоксической активности лектинов. Основываясь на результатах проведенных исследований, высказано предположение о том, что мутагенез, индуцированный исследуемыми лектинами, как и проявление их цитотоксического действия обусловлены некоторыми общими молекулярными механизмами.

Ключевые слова: мутагенез, лектин, репарация, пролиферация, выживаемость, апоптоз, клетки млекопитающих in vitro.