Размещено на http://www.allbest.ru/

Національна академія наук України

Інститут проблем кріобіології і кріомедицини

УДК: 611.631:615.014.41

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Морфофункціональні характеристики клітин інтерстицію сім'яників статевозрілих щурів при кріоконсервуванні

03.00.19 - кріобіологія

Пахомов Олександр Віталійович

Харків 2008

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Розвиток низькотемпературних технологій обумовив можливість створення банку біологічного матеріалу, в тому числі чоловічих статевих залоз. На теперішній час є достатньо робіт, в яких описані способи кріоконсервування різного матеріалу сім'яників (Грищенко В.И. и др., 1993; Shinohara T. et al., 2002; Yin Hang et al., 2004). Функціональні властивості біологічного матеріалу статевих залоз (сперматогенез і стероїдогенез) були оцінені in vitro та in vivo в умовах трансплантації.

Одержані результати, які підтвердили успішне клінічне використання органотипової культури сім'яників новонароджених поросят (Турчин І.С., 1996; Кобяков С.К. и др., 1999) і кріоконсервованого матеріалу фетальних тестикулярних тканин (Керос В.А. и др., 2001). Була встановлена висока стероїдогенна здатність кріоконсервованого матеріалу. Показана можливість зниження імуногенності трансплантатів за рахунок елімінації антигенпрезентуючих клітин в процесі кріоконсервування (Taylor M.J. et al., 1994). Розроблені режими кріоконсервування фрагментів сім'яників забезпечують збереженість морфологічної структури тканин і певної кількості клітин, які відповідають за синтез андрогенів і сперматогенез.

Однак в літературі не існує достатньої кількості даних щодо кріоконсервування клітин Лейдига, які відповідають за синтез тестостерону в сім'яниках. У зв'язку з цим актуальною є розробка режимів кріоконсервування ендокриноцитів сім'яників, які забезпечували б не тільки високу збереженість їх морфофункціональних властивостей in vitro, але й сприяли створенню гормонально-активного клітинного депо in vivo при трансплантації.

Існують дані з кріоконсервування фрагментів тканин сім'яників (Салех Дж. М. Абу Жаяб, 2004) та клітин Лейдига (Tai J. et al., 1994; Chen G.R et аl., 2007), в яких говориться про використання швидкості охолодження 1-2°С/хв до температури -40°С для фрагментів і -70°С для клітин Лейдига з подальшим зануренням зразків у рідкий азот. Використання швидкості охолодження 1-2°С/хв для фрагментів тканин виправдано і пов'язано з необхідністю збереження структури тканин. Але використання цієї швидкості охолодження може призводити до значного переохолодження системи. Результати кріоконсервування клітин підтвердили, що наслідки переохолодження і швидкості охолодження в різних температурних інтервалах можуть значно впливати на збереженість клітин (Гуріна Т.М. и др., 2007). Тому охолодження з постійною швидкістю (1єС/хв) в широкому діапазоні температур, яке було використано при кріоконсервуванні клітин Лейдига (Tai J. et al., 1994, Chen G.R et аl., 2007), потребує більш детального вивчення і аналізу. У зв'язку з цим дослідження впливу швидкостей охолодження в різних температурних інтервалах на біологічні об'єкти і створення режиму кріоконсервування стероїдогенних клітин робить очевидним актуальність робіт.

Щорічне зростання кількості захворювань чоловічої статевої сфери, пов'язаних з недостатністю андрогенів (Кирпатовский И.Д. и др., 2004), обумовило актуальність досліджень, які спрямовані на пошук альтернативних способів лікування андроген дефіцитного стану, серед яких трансплантація кріоконсервованих фрагментів і клітин сім'яників є перспективною.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота була виконана у рамках науково-дослідних тем Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України № 3 “Дослідження механізмів функціонування кріоконсервованих органних культур ендокринних тканин” (шифр - 2.2.6.03, №0101U003478) і № 32 “Властивості ендокринних тканин в умовах кріоконсервування і трансплантації експериментальним тваринам” (шифр - 2.2.6.32, № 0106U002163).

Мета і задачі дослідження. Мета роботи - дослідити вплив умов кріоконсервування на морфофункціональні властивості клітин інтерстицію сім'яників та визначити оптимальні умови кріоконсервування стероїдогенних клітин, які забезпечували б високу гормонопродукуючу здатність in vitro і in vivo.

Відповідно до встановленої мети передбачалося вирішити наступні задачі:

1. Вивчити в порівняльному аспекті морфофункціональні властивості суспензій клітин інтерстицію сім'яників (продукція тестостерону, активність 3в-гідроксістероїддегідрогенази, наявність ліпідних включень), які були отримані при розподілі в градієнтах щільності сахарози і фіколу, на основі чого розробити оптимальний метод отримання даного біологічного матеріалу.

2. Провести порівняльний аналіз морфофункціональних властивостей суспензії інтерстиціальних клітин і фрагментів сім'яників, кріоконсервованих зі швидкостями охолодження, які використались раніше для кріоконсервування фрагментів сім'яників і клітин Лейдига.

3. Оцінити вплив різних концентрацій кріопротектора ДМСО, переохолодження і швидкості охолодження в різних температурних інтервалах на збереженість і морфофункціональні властивості суспензії клітин інтерстицію сім'яників і на підставі цих даних розробити оптимальні умови кріоконсервування суспензії.

4. Вивчити в порівняльному аспекті морфофункціональні властивості суспензії клітин інтерстицію сім'яників, кріоконсервованої за режимом, який було розроблено в процесі роботи, з фрагментами сім'яників in vitro.

5. Дослідити гормонопродукуючу здатність нативних і кріоконсервованих суспензії клітин інтерстицію та фрагментів сім'яників (вміст тестостерону в крові тварин, маса додаткових статевих залоз, гістологічний аналіз) при алотрансплантації тваринам з експериментальним андроген-дефіцитним станом.

Об'єкт дослідження - стероїдпродукуюча функція нативних і кріоконсервованих клітин інтерстицію і фрагментів сім'яників in vitro та in vivo при алотрансплантації.

Предмет дослідження - нативні і кріоконсервовані суспензії клітин інтерстицію та фрагменти сім'яників статевозрілих щурів.

Методи дослідження. У роботі використано методи органотипового культивування фрагментів сім'яників, метод клітинного культивування, метод кріоконсервування з різними швидкостями охолодження, радіоімунологічний метод визначення гормонів, гістохімічний аналіз, світлова і флуоресцентна мікроскопія, гістологічний аналіз.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше проведена порівняльна характеристика нативного і кріоконсервованого матеріалу сім'яників статевозрілих тварин, яка виявила принципову можливість і переваги використання для трансплантації такого біологічного матеріалу, як кріоконсервована суспензія клітин інтерстицію (СКІ) сім'яників. Досліджено вплив переохолодження та швидкості охолодження в різних температурних інтервалах на збереженість і морфофункціональні властивості стероїдогенних клітин сім'яника. За умов випробування різних способів трансплантації СКІ в різних моделях експериментального андроген-дефіцітного стану, в тому числі інтратестикулярної трансплантації, встановлено, що вона не тільки компенсує гормональну недостатність, але й сприяє відновленню власної популяції стероїдогенних клітин організму. Показано, що кріоконсервований матеріал зберігає значний стероїдогенний потенціал in vitro та in vivo.

Практичне значення отриманих результатів. Розроблено і представлено новий спосіб отримання біологічного матеріалу сім'яників - суспензії клітин інтерстицію, який має великий стероїдогенний потенціал. Розроблено спосіб кріоконсервування даного біологічного матеріалу, який дозволяє зберегти високі стероїдогенні властивості клітин. Виявлена можливість подальшого використання суспензії клітин інтерстицію після кріоконсервування при трансплантації.

Особистий внесок здобувача. Представлені до захисту експериментальні дані отримані за безпосередньою участю дисертанта: самостійне планування дослідження, проведення серії експериментів in vitro та in vivo, інтерпретація та статистичний аналіз отриманих результатів, формулювання висновків. В опублікованих із співавторами роботах особистий внесок здобувача полягає:

-в роботах [3, 7] у розробці метода отримання суспензії інтерстиціальних клітин сім'яників, визначенні фракції клітин, яка має найвищу стероїдогенну активність;

-в роботах [2, 10, 13] у розробці способу кріоконсервування суспензії клітин інтерстицію сім'яників;

-в роботах [1, 4, 5, 6, 8, 9, 11, 12, 14] у дослідженні гормонопродукуючої здатності нативної і кріоконсервованої суспензії клітин інтерстицію і фрагментів сім'яників при алотрансплантації тваринам з експериментальним гіпогонадизмом.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи представлені на конференціях: молодих вчених ІПКіК разом з кафедрою UNESCO “Холод в біології і медицині” (Харків, 2004, 2005 р.); молодих вчених “Актуальні проблеми біохімії і біотехнології” (Київ, 2004, 2005 р.); Установчому з'їзді Українського товариства клітинної біології з міжнародним представництвом (Львів, 2004 р.); “Фундаментальні питання експериментальної і клінічної ендокринології” (Четверті Данилевські читання, Харків, 2005); 5th Parnas Conference “Molecular mechanisms of cellular signaling” (Kyiv, April 26-29, 2005); конференції з міжнародною участю “Актуальні проблеми і досягнення кріобіології і кріомедицини. Структурна і функціональна організація стовбурових клітин за умов дії низьких температур” (Харків, 2005 р.); науково-практичній конференції з участю міжнародних спеціалістів “Актуальні питання абдомінальної та судинної хірургії. Клінічні проблеми трансплантації органів” (Київ, 2006 р.); конференції з міжнародною участю “Актуальні проблеми і досягнення кріобіології і кріомедицини. Структурна і функціональна організація стовбурових клітин за умов дії низьких температур” (Харків, 2006 р.); 18th European Students' Conference (Berlin, 2007), IV з'їзді трансплантологів України (Київ, 2007).

Публікації. За матеріалами дисертації було опубліковано 14 наукових робіт, у тому числі 4 статті, 3 з яких - у фахових виданнях, 10 тез доповідей.

Обсяг і структура дисертації. Матеріал викладено на 151 сторінках друкованого тексту, з яких 127 сторінок основного змісту. Дисертаційна робота містить такі розділи: вступ, огляд літератури, матеріали і методи досліджень, результати власних досліджень та їх обговорення, узагальнення, висновки, бібліографічний список (205 джерел, в тому числі 136 іншомовних, розміщено на 22 сторінках) і додаток (на 2 сторінках). Робота ілюстрована 21 рисунками, 1 таблицею і 27 мікрофотографіями.

Основний зміст роботи

Матеріали і методи дослідження. Експерименти були проведені з використанням 4-5 місячних самців щурів масою 200 - 250 г. відповідно до “Загальних принципів експериментів на тваринах”, які схвалені І Національним конгресом по біоетиці (20.09.01р., Київ, Україна) і погоджені з положеннями “Європейської Конвенції по захисту хребетних тварин, які використовуються з експериментальною та іншою метою” (м. Страсбург, 1985).

Сім'яники після екстирпації звільняли від зовнішніх оболонок, подрібнювали на фрагменти 1-2 мм2, промивали від крові середовищем 199. Для отримання СКІ тканину додатково обробляли колагеназою (4 мг/мл) на середовищі 199 з 20 мМ Hepes (рН=7,4) при 32-34єС і безперервному перемішуванні протягом 15 хв. Розподілення здійснювали в ступінчастих градієнтах щільності сахарози та фіколу. В градієнті сахарози було отримано 3 фракції клітин: ФрАс (1,127-1,176 г/см³), ФрВс (1,081-1,127 г/см³), ФрСс (1,038-1,081 г/см³), в ступінчастому градієнті щільності фіколу - 2 фракції: ФрАф (1,06-1,08 г/см³), ФрВф (1,04-1,06 г/см³). Для подальшої роботи клітини кожної фракції відмивали середовищем 199 з 20 мМ Неpes (рН = 7,4).

Культивування СКІ та органотипове культивування фрагментів сім'яників (ФС) здійснювали у середовищі 199 з додаванням 0,1% ембріональної телячої сироватки і 20мМ Hepes (рН = 7,4), антибіотиків (100 ОД/мл пеніциліну і 75 ОД/мл канаміцину) при 32-34єС протягом 7 діб. У середовищі культивування визначали вміст тестостерону. Клітини, прикріплені до покривного скла в ході культивування СКІ, після фіксації в метанолі забарвлювали гематоксиліном і досліджували під світловим мікроскопом.

При визначенні впливу кріопротектора або кріоконсервування на збереженість і функціональну активність СКІ розчини ДМСО на середовищі 199 з 20 мМ Hepes (рН=7,4) додавали у співвідношенні 1:1 до клітин для отримання кінцевих концентрацій 5, 10, 15%. Оскільки показано зменшення токсичної дії ДМСО на живі об'єкти при близько нульових температурах (Пушкарь Н.С. и др., 1978) інкубацію клітин проводили при 2-4єС протягом 30 хв, після чого досліджували збереженість клітин і встановлювали наявність тестостерону в середовищі інкубації. Об'єм зразка, який заморожували, складав 1 мл. Охолодження зразків з СКІ проводили відразу після додавання розчину кріопротекторів, а ФС - після попередньої інкубації протягом 20 хв.

Зразки заморожували на програмному заморожувачі “Cryoson” (Німеччина) в кріоампулах “Nunс” об'ємом 1,8 мл. Реєстрацію програми заморожування проводили за допомогою встановленої в кріоампулах мідь-константанової термопари і самописця “Endim” 62201.

При дослідженні впливу швидкості охолодження у різних температурних інтервалах використовували наступні програми охолодження.

Програма 1: від 20 - 22 до -40єС охолодження зразків здійснювали з постійною швидкістю 1-2єС/хв з наступним їх зануренням у рідкий азот.

Програма 2: зразки охолоджували аналогічно програмі 1, але додатково проводили процедуру програмного зняття переохолодження шляхом температурної ініціації кристалоутворення, яка передбачена можливостями заморожувача “Cryoson”. інтерстицій сім'яник щур кріоконсервування

Програма 3: охолодження зразків проводили від 20 - 22єС зі швидкістю 1-2єС/хв, однак, після програмного зняття переохолодження швидкість охолодження в інтервалі температур кристалізації біологічної системи збільшували до 15 - 20єС/хв. При досягненні температури -40єС зразки занурювали у рідкий азот. При реалізації програм заморожування з температурною ініціацією кристалоутворення величина переохолодження не перевищувала 0,5 - 1єС.

Програма 4: від 20 - 22 до -40єС зразки охолоджували з постійною швидкістю 1-2єС/хв. В діапазоні температур від -40 до -70єС, зберігали швидкість - 1 - 2єС/хв, після чого зразки занурювали у рідкий азот.

Програма 5: від 20 - 22єС до -40єС зразки охолоджували зі швидкістю 1 - 2єС/хв. В діапазоні температур від -40 до -70єС, швидкість охолодження збільшували до 20-25єС/хв, після чого зразки занурювали у рідкий азот.

Програма 6: охолодження зразків проводили від 20 - 22єС зі швидкістю 1 - 2єС/хв. Після програмного зняття переохолодження швидкість охолодження збільшували до 15 - 20єС/хв, а в температурному інтервалі - -40 - -70єС до 20 - 25єС/хв, після чого зразки занурювали у рідкий азот.

Для кріоконсервування ФС дорослих щурів використовували програму 1, а при дослідженні функціональної активності кріоконсервованої СКІ при алотрансплантації - програму 6.

Зразки відігрівали на водяній бані при температурі 32 - 34єС. Видалення ДМСО проводили шляхом центрифугування клітин при поступовому зменшенні концентрації кріопротектора в середовищі.

Для виявлення активності 3в-гідроксістероїддегідрогенази (3в-ГСД) гістохімічне забарвлювання здійснювали за методом (Benton L. et al., 1995). Забарвлювання нільським червоним (НЧ) на наявність ліпідних включень проводили за методом (Yourka D.T. et al., 2003). Реєстрацію флуоресценції НЧ проводили за допомогою флуоресцентного мікроскопа “Olimpus IX 71” довжиною хвилі збудження 455 - 500 нм.

Для визначення загальної збереженості інтерстиціальних клітин в кріоконсервованих ФС, а також наявності клітин, які мають позитивну реакцію на 3в-ГСД активність (3в-ГСД(+)-клітини), кріоконсервовані ФС обробляли колагеназою і розподіляли суспензію в градієнтах щільності сахарози у такій спосіб, як і СКІ.

Загальну збереженість і збереженість ГСД(+)- і НЧ(+)-клітин після кріоконсервування оцінювали по відношенню до їх кількості в зразках до заморожування. При дослідженні базальної і стимульованої секреції СКІ інкубували в середовищі 199 з 20 мМ Hepes (рН= 7,4) протягом 1 години при 32 - 34єС. Для стимуляції стероїдогенезу використовували хоріонічний гонадотропін (ХГ) в концентрації 1 МО/мл за методом (Sharpe R.M. et al., 1987).

Вміст тестостерону в інкубаційному середовищі і сироватці крові вимірювали радіоімунологічним методом за допомогою наборів “РІА СТ-тестостерон” (Бєларусь).

Всі операції на тваринах здійснювали за допомогою комбінованого наркозу (кетамін - 2,5 мг, ксилазін - 0,5 мг на 100г маси тварини). Двосторонню орхіектомію виконували за методом (Кабак Я.М., 1945). Експериментальний токсичний гіпогонадизм викликали однократною ін'єкцією хлориду кадмію за методом (Hew K.W. et al., 1993).

Трансплантацію біологічного матеріалу виконували відповідно до особливостей роботи з клітинним і тканинним матеріалом сім'яників, які відображені в дисертаційній роботі. Тваринам з орхіектомією СКІ (1,5-2Ч107 кл) трансплантували підшкірно в задню поверхню правого вуха тварини, а ФС (50 мг) - під капсулу лівої нирки. Трансплантацію виконували через тиждень після орхіектомії. Тварини розподіляли на групи. Група 1: контрольна. Тварини з двосторонньою орхіектомією: група 2 - тварини без трансплантації; група 3 - з алотрансплантацією нативних ФС; група 4 - з алотрансплантацією кріоконсервованих ФС; група 5 - з алотрансплантацією нативної СКІ; група 6 - з алотрансплантацією кріоконсервованої СКІ.

Тваринам з моделлю токсичного гіпогонадизму трансплантацію СКІ проводили через місяць після введення хлориду кадмію. Клітини в кількості 1,5-2Ч107 вводили в сім'яники за допомогою шприца з голкою діаметром 0,6 мм. Були використані наступні групи тварин. Група 1: контрольна. Тварини, яким вводили хлорид кадмію: група 2 - без трансплантації; група 3 - з алотрансплантацією нативної СКІ; група 4 - з алотрансплантацією кріоконсервованої СКІ.

На 30 добу після трансплантації у всіх тварин експериментальних і контрольних груп визначали концентрацію тестостерону у крові, вимірювали масу додаткових статевих залоз (сім'яних пухирців із простатою), яку перераховували на грам маси тіла тварини.

Гістологічному дослідженню підлягали підшкірні трансплантати СКІ і нирки з трансплантатом ФС, а також сім'яникі контрольних та експериментальних тварин до та після трансплантації СКІ. Парафінові зрізи (5-7 мкм) готували на мікротомі і забарвлювали гематоксиліном і еозином. Гістологічні препарати досліджували під світловим мікроскопом при окулярі 10 та збільшеннях об'єктива х20, х40 і х60. Мікрофотозйомку здійснювали за допомогою мікроскопа «Olimpus IX».

Статистичну обробку результатів проводили з використанням t-критерію Стьюдента і однофакторного дисперсійного аналізу за допомогою пакета програм Excel.

Результати досліджень та їх обговорення. Розробка способу отримання СКІ статевозрілих щурів і порівняльний аналіз стероїдогенних характеристик СКІ і ФС in vitro.

Отримана в ході ферментативної обробки сім'яників колагеназою суспензія клітин вміщувала в основному клітини інтерстицію, а також дрібні залишки сім'яних канальців, клітини крові, сперматозоїди та інші клітини - похідні гермінативного епітелію, які потрапляють із судин і сім'яних канальців при подрібненні тканин сім'яників і ферментативній обробці.

Для подальшого розподілення клітин ми застосовували ступінчастий градієнт щільності сахарози і фіколу, який широко використовується для створення градієнта щільності і розподілення клітин сім'яників (Janszen F.H. et al., 1976).

В ході розподілення загальної суспензії клітин в градієнті сахарози ми отримали 3 основні фракції клітин, які умовно позначили: ФрАс зі щільністю 1,127-1,176 г/см³, ФрВс і ФрСс зі щільностями 1,081-1,127г/см³ і 1,038-1,081г/см³ відповідно. В ступінчастому градієнті щільності фіколу було отримано 2 фракції, які позначали ФрАф та ФрВф зі щільністю 1,06-1,08 і 1,04-1,06 г/см³, відповідно. Щільності фракцій фіколу відповідають щільностям розподілення, які були описані в літературі для клітин Лейдига (Janszen F.H. et al., 1976).

Після збору і відмивання кожної фракції клітин сахарозного і фікольного градієнтів досліджували життєздатність клітин, яка показала достатньо високу їх толерантність до короткочасного перебування в гіпертонічних розчинах сахарози і фіколу. Вона складала 95 - 97%.

Встановлено, що найбільша концентрація тестостерону в середовищі інкубації була отримана для клітин ФрАс, що свідчить про кількісну і якісну перевагу в гормональній продукції клітин саме цих фракцій у порівнянні з ФрВс, ФрСс, ФрАф і ФрВф відповідно. Ці дані підтверджували те, що обрана нами для розподілення клітин сахароза не порушує фізіологію клітин Лейдига.

Важливими ознаками стероїдогенних клітин сім'яників є значна активність ферменту 3в-ГСД і наявність ліпідних включень. Тому ми вважали доцільним проведення гістохімічних досліджень для виявлення активності 3в-ГСД і наявності ліпідних включень за допомогою НЧ.

ФрАс і ФрАф мали найбільшу відносну кількість ГСД(+)-клітин - 18 і 24% від загальної кількості клітин у кожній фракції відповідно. Частина цих клітин (~ 6%) мала виражене темно-синє забарвлення, яке свідчило про наявність активності 3в-ГСД. 66% клітин даної фракції мали флуоресценцію НЧ. Клітини ФрВс і ФрСс мали значно меншу кількість забарвлених клітин і менш виявлену флуоресценцію.

Як і у випадку розподілення в градієнті сахарози, клітини фракції фіколу ФрАф були більш інтенсивно забарвлені НЧ. Близько 20% клітин ФрАф були забарвлені НЧ.

В ході культивування клітин ФрАс були встановлені активна проліферація клітин та формування колоній. Про наявність стероїдогенних клітин свідчив вміст тестостерону в середовищі інкубації клітин. Ці дані підтвердили те, що сахароза, обрана для розподілення, не порушує фізіологію стероїдогенних клітин. Далі під СКІ ми будемо розуміти головним чином клітини ФрАс.

Дослідження морфофункціональних властивостей СКІ при кріоконсервуванні. Розробка способу кріоконсервування стероїдогенних клітин. Успіх низькотемпературних технологій значною мірою визначається використаним кріопротектором. Переходячи до наступного етапу роботи, ми спробували оцінити вплив різних концентрацій розчину ДМСО на збереженість і стероїдогенні властивості СКІ. Успішне використання ДМСО як кріопротектора було показано в багатьох роботах при кріоконсервуванні сім'яників (Божок Г.А. и др., 2007; Keros V. et al., 2007). СКІ інкубували протягом 30 хв при 2-4єС, після чого кріопротектор відмивали. В ході дослідження ми показали ефект зниження збереженості клітин інтерстицію сім'яників після інкубації з розчинами ДМСО, який зростав при збільшенні концентрації кріопротектора. Секреція тестостерону після інкубації з розчинами ДМСО була різко знижена в суспензії клітин, що інкубувались з 15% ДМСО.

Встановлено ефект значного зростання базальної секреції для клітин, які інкубувались з 5% ДМСО. Подібний вплив ДМСО на гормональну секрецію показано у роботах (Салех Дж. М. Абу Жаяб, 2004). Найменше відхилення від рівня секреції клітин, які інкубувались без кріопротектора, спостерігалось при використанні 10% концентрації ДМСО.

Враховуючи ці дані, на наступних етапах роботи ми звели до мінімуму експозицію клітин з ДМСО при заморожуванні клітинної суспензії.

В роботі (Салех Дж. М. Абу Жаяб, 2004) з кріоконсервування тестисів дорослих щурів була запропонована програма зі швидкістю охолодження зразків 1-2єС/хв від 20 - 22 до -40єС з подальшим їх зануренням в рідкий азот, позначена нами як програма 1. Ми провели порівняльний аналіз кріоконсервування СКІ з концентраціями ДМСО 5, 10 и 15% (рис. 3), який показав найкращу збереженість клітин у випадку використання 10% концентрації ДМСО, це свідчить про здатність саме цієї концентрації здійснювати кріопротекторний ефект. При використанні інших концентрацій ДМСО збереженість клітин була значно нижчою: при 5% ДМСО - 21%, 27% при 15% ДМСО.

Враховуючи ці дані, при використанні інших програм заморожування ми використовували 10% концентрацію ДМСО.

При вивченні морфофункціональних характеристик СКІ і ФС, які були кріоконсервовані за програмою 1 з використанням ДМСО в концентрації 10%, встановлено, що загальна збереженість клітин, збереженість ГСД(+)-клітин і клітин, які мають флуоресценцію НЧ, різко знижувалась. Практично до 30% зменшувалась кількість ГСД(+)-клітин, а збереженість НЧ(+)-клітин не перевищувала 10% у ФС і СКІ.

Здатність до базального і стимульованого стероїдогенезу матеріалу сім'яників, кріоконсервованих за програмою 1, також знижувалась. Так, кількість тестостерону в середовищі інкубації ФС після стимуляції ХГ складала 23±0,33 нмоль/1012 кл, що більш ніж в 2 рази нижче за ФС до заморожування (49±0,5 нмоль/1012 кл). Вміст тестостерону в середовищі інкубації СКІ після стимуляції ХГ був близько 48±5 нмоль/1012 кл, що також в 2 рази нижче концентрації тестостерону в середовищі клітин до заморожування (97±6 нмоль/1012 кл). Ці дані свідчать про значне кріопошкодження стероїдогенних клітин при кріоконсервуванні за програмою 1.

Використання клітинного матеріалу сім'яників порівняно з фрагментами тканини дає можливість змінювати швидкості охолодження відповідно до збільшення збереженості функціонально активних клітин. У зв'язку з цим ми вважали за необхідне оцінити вплив швидкості охолодження в різних температурних інтервалах на збереженість стероїдогенних клітин і їх здатність до гормонопродукції.

Відомо, на збереженість клітинних суспензій при заморожуванні впливають умови і швидкість утворення кристалоподібної структури (Белоус А.М. и др., 1987). Результат кристалізації буде залежати від взаємозв'язку швидкості формування нових центрів кристалізації і швидкості росту утворених кристалів. Кожен з цих факторів може по-різному впливати на збереженість тих чи інших клітин в суспензії. Існують дані і про те, що зменшення величини переохолодження може сприяти збільшенню збереженості клітин після заморожування.

При дослідженні збереженості клітин під час кріоконсервування в температурному інтервалі 0 - -40єС, в якому відбувається кристалізація переважної кількості води в системі, ми показали, що зняття переохолодження, яке передбачене програмним охолоджувачем (програма 2), приводило до збільшення як загальної збереженості клітин до 64%, так і збереженості ГСД(+)-клітин до 47%. Збільшення швидкості охолодження після зняття переохолодження до 15-20єС/хв (програма 3) приводило до збереженості 71% ГСД(+)-клітин. Використання програм 2 і 3 приводило до збільшення секреції тестостерону клітинами з 48±5 до 65±5 нмоль/1012 кл по відношенню до програми 1.

Таким чином, використання після зняття переохолодження більш високих швидкостей охолодження дало можливість зберегти 71% стероїдогенних клітин.

Існують дані, що свідчать про утворення мікрокристалів льоду в субевтектичному діапазоні температур розчинів кріопротекторів (Гуріна Т.М. и др., 2007; Осецкий А.И. и др., 2007). Було зроблено припущення, що процеси, які пов'язані зі структурною зміною зразків в даному температурному інтервалі можуть значним чином знижувати збереженість клітин. Окрім цього, утворення недобудованих кристалів льоду в цих температурних інтервалах приводить до високої вірогідності розвитку різноманітних рекристалізаційних процесів, які можуть знижувати збереженість клітин, особливо на етапі відігріву. Тому подальшим етапом дослідження було вивчення впливу швидкості охолодження в температурному діапазоні від -40 до -70єС, до якого належить і точка евтектикі ДМСО (-66,7єС) на збереженість клітин.

В літературі описано режим кріоконсервування клітин Лейдига зі швидкістю 1єС/хв до -70єС із наступним зануренням зразків у рідкий азот (Tai J. et al., 1994, Chen G.R et аl., 2007). Використання швидкості охолодження 1єС/хв до -70єС в програмі 4 не призводило до значного збільшення як загальної збереженості СКІ по відношенню до програми 1 (51 і 55% відповідно), так і збереженості ГСД(+)-клітин (35% і 36% відповідно до програми 1). Здатність до базального і стимульованого стероїдогенезу була також на рівні програми 1 (45±6 нмоль/1012 кл).

Однак збільшення швидкості охолодження до 20 - 25єС/хв в інтервалі температур від -40 до -70єС сприяло збільшенню збереженості ГСД(+)-клітин до 61%, що свідчить про позитивний ефект даних швидкостей охолодження в діапазоні від -40 до -70єС порівняно зі швидкістю 1-2єС/хв, яка була використана в програмі 4, і швидким неконтрольованим охолодженням при програмі 1 в цих температурних інтервалах.

Ефект збільшення збереженості стероїдогенних клітин в програмі 3 був вище, ніж в програмі 5, але низькі значення вмісту гормону в середовищі інкубації в програмі 5 (46±5 нмоль/1012 кл) ще раз свідчать про пошкоджуючу дію швидкості охолодження 1єС/хв, оскільки охолодження до температури -40єС в цій програмі, як і в програмах 1 і 4, також відбувалося саме з цією швидкістю.

Аналізуючи ці дані та враховуючи переваги кріоконсервування за програмами 3 і 5 важливо було б розробити універсальний режим (програму 6), який включав зняття переохолодження і наступне збільшення швидкості охолодження при охолодженні до температури -40єС (15 - 20єС/хв) і в інтервалі температур від -40 до -70єС (20 - 25єС/хв), з подальшим зануренням зразків у рідкий азот. Використання програми 6 призвело до зростання збереженості ГСД(+)-клітин до 83% і здатності до стимульованого стероїдогенезу від 48±5 до 75±8 нмоль/1012 кл порівняно з програмою 1.

Сумуючи результати дослідження впливу швидкостей охолодження, слід відзначити, що використання швидкостей охолодження - 1-2єС/хв саме для фрагментів є доречним. Це обумовлено необхідністю збереженості структури тканини, однак пов'язано зі значною загибеллю стероїдогенних клітин та зниженню здатності продукувати гормони. Тому, використання в якості джерела чоловічих статевих гормонів кріоконсервованої за програмою 6 СКІ представляється більш доцільним.

Трансплантація нативних і кріоконсервованих СКІ і ФС статевозрілих щурів в експерименті. Порівняльний аналіз трансплантацій СКІ і ФС в умовах in vivo.

Метою наступного етапу роботи було: 1) дослідження можливості та доцільності використання для трансплантації нативної і кріоконсервованої суспензії клітин інтерстицію сім'яників; 2) проведення порівняльного аналізу нативного і кріоконсервованого біологічного матеріалу, який був трансплантований у вигляді ФС і СКІ.

Для вирішення цих питань ми провели алотрансплантацію нативних і кріоконсервованих СКІ і ФС дорослим щурам з орхіектомією та токсичним гіпогонадизмом. На різних моделях алотрансплантації порівнювали здатність нативних і кріоконсервованих СКІ і ФС до підтримки рівня тестостерону в крові і відновлення маси додаткових статевих залоз у щурів з гіпогонадизмом. Кріоконсервований матеріал СКІ отримували при використанні програми 6, матеріал ФС - програми 1 (див. “Матеріали і методи досліджень”).

В задачі представленої роботи не входило дослідження конкретних реакцій і механізмів імунологічного відторгнення і толерантності, однак на основі стратегій, які спрямовані на зниження імуногенності транспланта і збільшення термінів його функціонування в роботі були відображені наступні:

1) використати в якості трансплантаційного матеріалу СКІ, яка має здатність до синтезу андрогенів і не має високо імуногенного компонента - сім'яних канальців.

2) використати матеріал, який був кріоконсервований зі швидкостями, які є достатніми для елімінації значної кількості антигенпрезентуючих клітин із СКІ. Саме такий підхід був використан в роботі (Whitmore W.F. et al., 1978, Head J.R. et al., 1985).

3) використати в якості місця трансплантації СКІ сім'яники реципієнтів. Остання задача була обумовлена тим, що в ряді робіт було показано збільшення термінів функціонування трансплантатів у випадку інтратестикулярної трансплантації для різних видів трансплантованих клітин и тканин (Taylor M.J. et al., 1994).

Згідно з нашими даними, рівень тестостерону в крові щурів залежав від ступеня зрілості тварини і складав близько 4,33±1,37 нмоль/л. Двостороння орхіектомія вже через тиждень призводила до різкого падіння рівня тестостерону в крові у всіх тварин до 0,33±0,06 нмоль/л. Маса додаткових статевих залоз при цьому складала близько 0,57±0,13 мг/г маси тварини, що в 5-6 разів нижче контрольної.

У подальшому ці зміни супроводжувались редукцією полового апарату. Саме через тиждень після орхіектомії було проведено трансплантацію нативних і кріоконсервованих СКІ і ФС.

Залозистий епітелій додаткових статевих залоз (комплексу простати і сім'яних пухирців) має на собі значну кількість рецепторів до статевих гормонів, тобто він є високочутливими до рівня андрогенів в крові. Наслідком падіння рівня андрогенів є згасання статевої поведінки тварини і деградація статевих органів, в тому числі додаткових статевих залоз.

При трансплантації кріоконсервовані ФС і СКІ сприяють відновленню рівня тестостерону. Більш цього, трансплантація СКІ покращувала загальний баланс андрогенів в організмі, про що свідчить збільшення додаткових статевих залоз, маса яких чітко корелює з рівнем андрогенів крові. Також можливо трансплантація біологічного матеріалу сім'яників активує репараційні і компенсаторні процеси організму. Можливість такої дії біологічних препаратів була показана в роботах (Бызов В.В. та ін., 2001, Гальченко С.Є. та ін., 2004).

Гістологічні дослідження трансплантатів показали наявність ділянок некрозу, лімфоцитарної інфільтрації і формування сполучної тканини тільки у випадку використання ФС в якості трансплантата.

Після отримання значного збільшення маси додаткових статевих залоз у орхіектомованих тварин за умов трансплантації СКІ ми спробували дослідити здатність СКІ відновлювати баланс статевих гормонів в організмі тварин з токсичним гіпогонадизмом, який був викликаний введенням хлориду кадмія.

Сполуки кадмія мають виражену гонадотоксичну дію, яка на біохімічному рівні пов'язана з порушенням активності багатьох ферментних систем, метаболізму мікроелементів, порушенням фосфорно-кальцієвого обміну, збільшенням вільнорадікальних процесів і, як наслідок, порушенням взаємодії клітин, які відповідають за цілісність гемотестикулярного бар'єру і синтез статевих гормонів.

На відміну від орхіектомії після введення хлориду кадмію в тестикулярній тканини, незважаючи на її активну деструкцію, зберігається деяка кількість стовбурових клітин Лейдига. Ми показали, що через 2 - 3 місяці після введення кадмію вони можуть відновлювати значну частину популяції зрілих клітин, що виражається у збільшенні рівня тестостерону крові і маси додаткових статевих залоз тварин з гіпогонадизмом. Ми дослідили здатність СКІ сприяти процесу відновлення.

Через місяць після трансплантації спостерігався підвищення рівня тестостерону і значне збільшення маси додаткових статевих залоз по відношенню до тварин без трансплантації, що говорить про здатність СКІ не тільки компенсувати гормональну недостатність, але й сприяти відновленню власної ендокринної функції організму.

Порівнюючи швидкості самостійного відновлення рівня тестостерону крові та його відновлення після трансплантації СКІ, ми дійшли висновку, що самостійне відновлення через місяць призводить до незначного збільшення рівня тестостерону приблизно на 0,15 нмоль/л, тоді як при трансплантації нативної і кріоконсервованої СКІ - на 0,45 та 0,63 нмоль/л відповідно. Тобто, ці дані підтверджують те, що при трансплантації СКІ компенсація рівня тестостерону в крові тварин проходить в 3 - 4 рази ефективніше.

При самостійному відновленні додаткових статевих залоз їх маса була 1,49±0,2 мг/г маси тварини, що більш ніж в 3 рази вище, ніж у тварин через місяць після введення хлориду кадмія (0,42±0,08 мг/г маси тварини). При трансплантації СКІ відновлення додаткових залоз проходило в 2 рази швидше. Маса додаткових залоз тварин із трансплантатами СКІ складала 2,22±0,33 мг/г маси тварини.

Гістологічне дослідження тестисів із трансплантатами нативної і кріоконсервованої СКІ показало наявність масивного розростання інтерстиціальної тканини в місці трансплантації. В сім'яних канальцях залишалися осередки кальцифікованого клітинного детриту. Лімфоцитарний інфільтрат не спостерігався.

Використання в якості трансплантаційного матеріала СКІ, що була кріоконсервована за програмою 6, яка була запропонована в цій роботі, показало збереженість стероїдогенних властивостей in vivo.

Таким чином, в цій частині дослідження була продемонстрована принципова можливість використання СКІ, отриманої і кріоконсервованої в ході представленої роботи.

Висновки

Дисертаційна робота містить теоретичне і експериментальне обґрунтування нового рішення проблеми довгострокового зберігання біологічного матеріалу сім'яників та його використання у якості трансплантата. Отримані результати свідчать про значний вплив концентрацій кріопротектора, переохолодження і швидкостей охолодження в різних температурних інтервалах на збереженість і морфофункціональні властивості клітин інтерстицію сім'яників. Розроблено спосіб кріоконсервування біологічного матеріалу суспензії клітин інтерстицію сім'яників.

1. Використання сахарози як градієнтного носія в умовах розподілення за щільністю дозволяє отримати суспензію клітин інтерстицію сім'яників, яка має високу стероїдогенну здатність і не поступається за своїми морфофункціональними показниками клітинам, які були отримані за допомогою фіколу.

2. ДМСО у концентрації 10% забезпечує максимальну збереженість морфофункціональних властивостей клітин інтерстицію сім'яників при кріоконсервуванні, тоді як використання 5 і 15% ДМСО призводить до різкого зниження збереженості клітин і здатності їх до гормонопродукції.

3. Використання повільної швидкості охолодження (1-2єС/хв) для заморожування суспензії клітин інтерстицію і фрагментів сім'яників пов'язано зі зниженням їх гормонопродукції і загибеллю значної кількості клітин інтерстицію.

4. Використання процедури програмного зняття переохолодження при заморожуванні зразків до -40єС з постійною швидкістю 1-2єС/хв з наступним зануренням у рідкий азот (програма 2) призводить до збільшення збереженості стероїдогенних клітин на 14%.

5. Встановлено, що при використанні відносно високих швидкостей охолодження (15-20єС/хв) після зняття переохолодження при охолодженні до температури -40єС (програма 3) збереженість стероїдогенних клітин збільшувалась на 40%, а здатність до стимульованої секреції тестостерону - на 25% порівняно зі швидкістю охолодження 1-2єС/хв (програма 1). При збільшенні швидкості охолодження до 20 - 25єС/хв в температурному інтервалі -40 - -70єС (програма 5) збереженість стероїдогенних клітин була вижчою на 25% порівняно зі швидкістю охолодження 1-2єС/хв (програма 4). Швидке неконтрольоване охолодження в температурному інтервалі -40 - -70єС шляхом занурення зразків у рідкий азот (програма 1) не призводить до збільшення збереженності стероїдогенних клітин, як у випадку використання швидкості охолодження 20 - 25єС/хв (програма 5).

6. Збільшення швидкості охолодження після програмного зняття переохолодження до 15 - 20єС/хв при охолодженні до -40єС, а в діапазоні температур -40 - -70єС до 20 - 25єС/хв (програма 6) було найбільш оптимальним для кріоконсервування суспензії клітин інтерсицію сім'яників. Суспензія клітин інтерстицію, кріоконсервована за розробленим в процесі роботи режимом, має більш високу здатність до синтезу і секреції статевих гормонів in vitro по відношенню до нативних і кріоконсервованих фрагментів сім'яників.

7. Використання в якості трансплантата кріоконсервованої суспензії клітин інтерстицію, показало високу збереженість їх стероїдогенних властивостей в умовах алотрансплантації. Кріоконсервована суспензія клітин інтерстицію має більш високу здатність до компенсації гормональної недостатності і відновлення власної гормонопродукуючої системи організму орхіектомованих тварин при алотрансплантації порівняно з фрагментами сім'яників. Рівень тестостерону і маса додаткових статевих залоз відновлюються в 3 рази ефективніше в організмі тварин з токсичним андроген-дефіцитним станом при алотрансплантації кріоконсервованої суспензії клітин інтерстицію сім'яників порівняно з тваринами без трансплантації.

Перелік праць, опублікованих за темою дисертації

1. Пахомов А.В. Гормонпродуцирующая способность oрганной культуры семенников взрослых крыс при совместных культивировании и аллотранплантации / Пахомов А.В., Божок Г.А., Легач Е.И. // Проблемы криобиологии. - 2004. - №3. - С.32-38. Отримання органотипової культури, культивування фрагментів, трансплантація.

2. Пахомов А.В. Гормонопродуцирующая способность клеток интерстиция семенников и органотипической культуры семенников новорожденных поросят после криоконсервирования / Пахомов А.В., Божок Г.А., Легач Е.И., Бондаренко Т.П. // Проблемы криобиологии. - 2007. - Т.17, №2. - С.179-185. Отримання клітин інтерстицію сім'яників і органотипової культури, визначення рівня тестостерону в середовищі культивування, статистична обробка.

3. Пахомов А.В. Использование флюоресцентной микроскопии для характеристики клеток стероидогенных тканей / Божок Г.А., Боровой И.А., Погребняк Н.Л., Легач Е.И. // Проблеми ендокринної патологіїї. - 2007. - №4. - С.78-83. Отримання стероїдогенних клітин, гістохімічне дослідження, статистична обробка результатів.

4. Пахомов А.В. Восстановление добавочных половых желез крыс после поражения хлоридом кадмия / Пахомов А.В., Легач Е.И., Божок Г.А., Бондаренко Т.П. // Трансплантологія. - Т.9, №1. - 2007. - С.212 - 214. Отримання моделі гіпогонадизму, дослідження тварин, статистична обробка результатів.

5. Божок Г.А., Легач Є.І., Алабедалькарім Н.М., Пахомов О.В. Сумісне культивування та сумісна алотрансплантація надниркових залоз та сім'яників в експерименті: матеріали Установчого з'їзду Українського товариства клітинної біології, (Львів, 25-28 квітня 2004 р.). - C.90. Отримання матеріалу надниркових залоз і сім'яників для трансплантації.

6. Божок Г.А., Легач Є.І. Пахомов О.В. Секреція тестостерону органотиповою культурою сім'яників в умовах сумісного культивування та сумісної трансплантації: матеріали конференції молодих учених “Актуальні проблеми біохімії та біотехнології - 2004”, (Київ, 21-22 жовтня, 2004 р.) / Укр.біохім.журнал. - 2004. - Т.76, №4. - С.126. Отримання матеріалу для трансплантації, визначення рівню тестостерону в середовищі інкубації.

7. Пахомов А.В., Божок Г.А. Жизнеспособность различных фракций суспензии клеток семенников при инкубации в растворах ДМСО: тези доповідей конференції молодих вчених “Холод в биологии и медицине - 2005», (Харків, 17-18 травня 2005 р.) / Проблемы криобиологии. - 2005. - Т.15, №4. - С.739-740. Отримання даних щодо життєздатності клітин, статистична обробка результатів.

8. Легач Е.И., Божок Г.А., Пахомов А.В. Особенности морфофункционального состояния аллографтов органотипической культуры семенников при совместной трансплантации с фрагментами надпочечных желез: матеріали науково-практичної конференції «Фундаментальні питання експериментальної та клінічної ендокринології» (Четверті Данилевські читання), (Харків, 24-25 лютого 2005 р.). - С.26-27. Отримання матеріалу органотипової культури сім'яників і фрагментів надниркових залоз.

9. Pakhomov A.V., Legach E.I., Bozhok G.A., Gubina N.F., Bondarenko T.P. Opposite effect of steroid hormones in combined culturing and combined transplantation: 5th Parnas Conference «Molecular mechanisms of cellular signaling», (Kyiv, 26-29 April, 2005) / Укр.біохім.журнал. - Т.77, №2. - С.200. Отримання матеріалу органотипової культури для культивування і трансплантації, визначення рівня гормонів в середовищі культивування, статистична обробка результатів.

10. Пахомов О.В., Божок Г.А., Легач Є.І., Марков Б.І. Особливості базальної та стимульованої гормонопродукції нативних та кріоконсервованих органотипових культур сім'яників новонароджених поросят: матеріали конференції молодих учених “Актуальні проблеми біохімії та біотехнології - 2005”, (Київ, червень, 2005 р.) / Укр.біохім.журнал. - 2005. - Т.77, №5. - С.153. Отримання органотипових культур, кріоконсервування, визначення рівня гормонів, статистична обробка результатів.

11. Пахомов А.В., Божок Г.А., Легач Е.И., Губина Н.Ф., Марков Б.И., Бондаренко Т.П. Морфофункциональные характеристики криоконсервированной органотипической культуры семенников новорожденных поросят после ксенотрансплантации: матеріали конференції з міжнародною участю “Актуальні проблеми і досягнення кріобіології і кріомедицини. Структурна і функціональна організація стовбурових клітин за умов дії низьких температур”, (Харків, листопад, 2005 р.) / Проблемы криобиологии. - 2005. - Т.15, №3. - С.433-434. Отримання матеріалу для трансплантації, визначення рівня гормонів в середовищі, гістологічне дослідження, статистичний аналіз результатів.

12. Пахомов А.В., Божок Г.А., Бондаренко Т.П. Интратестикулярная трансплантация клеток Лейдига при поражении семенников, вызванном введением хлорида кадмия: матеріали конференції “Актуальні питання абдомінальної та судинної хірургії. Клінічні проблеми трансплантації органів”, (Київ, травень, 2006) / Клінічна хірургія. - 2006. - №4-5. - С.105-106. Дослідження тварин із токсичним гіпогонадизмом, гістологічне дослідження, статистичний аналіз результатів.

13. Пахомов А.В., Божок Г.А., Бондаренко Т.П. Влияние диметилсульфоксида на базальную и стимулированную секрецию тестостерона клетками интерстиция семенника новорожденных поросят: матеріали ІХ з'їзду українського біохімічного товариства (Харків, 24-27 жовтня, 2006) / Укр.біохім.журнал. - 2006. - Т.2, - С.18. Отримання суспензії інтерстиціальних клітин тестисів, визначення рівня тестостерону, статистична обробка результатів.

14. Pakhomov O.V. Positive effect of allo- and xenotransplantation of rat's interstice cells on recovery of additional sexual glands after cadmium chloride-induced experimental hypogonadism: 18th European Students' Conference, (Berlin, october, 2007) / European journal of medical research. - 2007. - Vol.12, Supplement IV - P. 43.

Анотація

Пахомов О.В. Морфофункціональні характеристики клітин інтерстицію сім'яників статевозрілих щурів при кріоконсервуванні. - Рукопис.

Дисертаційна робота на здобуття вченого ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.19 - кріобіологія. - Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, Харків, 2008.

Дисертаційна робота присвячена дослідженню стероїдпродукуючої функції клітин сім'яників при кріоконсервуванні. В роботі розроблено метод отримання суспензії клітин інтерстицію (СКІ) сім'яників, які мають значний стероїдогенний потенціал.

Досліджено вплив умов кріоконсервування (концентрація кріопротектора, інкубація клітин із кріопротектором перед заморожуванням, швидкості охолодження зразків у різних температурних інтервалах) на збереженість стероїдогених клітин в СКІ. Результатом дослідження була розробка режиму кріоконсервування СКІ, який забезпечив найкращу збереженість і функціональну активність стероїдогенних клітин порівняно з режимами, які використовуються для біологічного матеріалу сім'яників.

В серіях експериментів in vivo при алотрансплантації показано, що СКІ, кріоконсервована за програмою, яка розроблена в даній роботі, має значно краще компенсувати нестачу андрогенів порівняно з фрагментами сім'яників і сприяв відновленню власної гормонопродукції в організмі тварин із орхіектомією і токсичним експериментальним гіпогонадизмом.

Ключові слова: тестостерон, клітини Лейдига, швидкість охолодження, алотрансплантація, 3в-гідроксістероїддегідрогеназа, нильський червоний, гіпогонадизм.

Аннотация

Пахомов А.В. Морфофункциональные характеристики клеток интерстиция семенников половозрелых крыс при криоконсервировании. - Рукопись.

Диссертационная работа на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.19 - криобиология. - Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, Харьков, 2008.

Диссертационная работа посвящена исследованию стероидпродуцирующей функции клеток семенников при криоконсервировании.

На сегодняшний день имеется достаточно большое количество работ, в которых описаны способы криоконсервирования различного материала семенников. Однако в литературе нет достаточного количества данных по криоконсервированию клеток Лейдига, которые отвечают за синтез тестостерона в семенниках. В связи с этим актуальным является разработка режимов криоконсервирования эндокриноцитов семенников, которые обеспечивали не только высокую сохранность их морфофункциональных свойств in vitro, но и способствовали созданию гормонально-активного клеточного депо in vivo при трансплантации.

В работе разработан метод получения суспензии клеток интерстиция (СКИ) семенников, обладающих значительным стероидогенным потенциалом, основанный на разделении клеток, полученных при ферментативной обработке ткани семенников и разделении клеток в ступенчатом градиенте плотности сахарозы. Был проведен подробный сравнительный гистохимический и функциональный анализ клеток, полученных из различных фракций сахарозы и фикола. Было показано, что фракция сахарозы плотностью 1,127-1,176 г/см³ содержит наибольшее количество клеток обладающих активностью фермента 3в-гидроксистероиддегидрогеназы, который является одним из ключевых ферментов пути синтеза тестостерона в стероидогенных клетках. Клетки данной фракции обладают наибольшим количеством липидных включений, которые также характерны для стероидогенных клеток. Данные гистохимические показатели коррелируют со способностью клеток данной фракции сахарозного градиента к синтезу тестостерона, о чем свидетельствуют показатели базальной и стимулированной секреции тестостерона в среде инкубации клеток.

При разработке режима криоконсервирования СКИ было показано, что сохранность и функциональная активность клеток снижается после 30 мин инкубации с ДМСО при 2-4єС. Криоконсервирование по программе 1, которое включало замораживание со скоростью 1єС/мин до -40єС с дальнейшим погружением образцов в жидкий азот при использовании 5, 10 и 15% концентраций ДМСО в качестве криопротектора, показало наилучшую сохранность клеток при применении 10% концентрации ДМСО.

При сравнительном морфофункциональном исследовании СКИ и фрагментов семенников (ФС), криоконсервированных по программе 1, было показано существенное уменьшение количества стероидогенных клеток в образцах. В связи с этим были исследованы скорости охлаждения образцов в различных температурных интервалах на сохранность стероидогенных клеток, результатом чего явилась разработка режима криоконсервирования СКИ. Показано, что использование в программах 2 и 3 процедуры снятия переохлаждения, предусмотренной возможностями программного замораживателя “Cryoson”, приводило к увеличению сохранности стероидогенных клеток в СКИ. При исследовании скоростей охлаждения было показано, что эффект увеличения сохранности клеток от использования отностительно высоких скоростей охлаждения при охлаждении до температуры -40°С (15 - 20°С/мин) после снятия переохлождения (программа 3) был выше, чем при увеличении скорости охлаждения до 20 - 25°С/мин в температурном интервале -40 - -70°С в котором находится точка евтектики растворов ДМСО (программа 5).Сочетание увеличения скорости охлаждения после программного снятия переохлождения до 15 - 20°С/мин при охлаждении до -40°С, а в диапазоне температур -40 - -70°С до 20 - 25°С/мин (программа 6) приводило к значительному увеличению сохранности стероидогенных клеток в сравнении с программой 1 (с 33 до 83%) и их способности к базальному и стимулированному синтезу и секреции тестостерона (с 48±5 до 75±6 нмоль/1012 кл). Данный режим показал наилучшую сохранность и функциональную активность стероидогенных клеток по сравнению с уже существующими режимами для биологического материала семенников.

...