Механізми реалізації адаптаційно-компенсаторних реакцій організму за умов дії екопатогенних чинників

Размещено на http://www.allbest.ru/

КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ІМЕНІ ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук

МЕХАНІЗМИ РЕАЛІЗАЦІЇ АДАПТАЦІЙНО-КОМПЕНСАТОРНИХ РЕАКЦІЙ ОРГАНІЗМУ ЗА УМОВ ДІЇ ЕКОПАТОГЕННИХ ЧИННИКІВ

03.00.13 - фізіологія людини і тварин

СЕВЕРИНОВСЬКА Олена Вікторівна

КИЇВ - 2008

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Дніпропетровському національному університеті МОН України

Науковий консультант доктор біологічних наук, професор Рибальченко Володимир Корнійович, Київський університет імені Тараса Шевченка, завідуючий відділом цитофізіології НДІ фізіології імені акад. Петра Богача біологічного факультету

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор Кальниш Валентин Володимирович, професор кафедри авіаційної, морської медицини і психофізіології Військово-медичної академії Міністерства оборони України

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Весельський Станіслав Павлович, старший науковий співробітник НДІ фізіології імені акад. Петра Богача біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка

доктор біологічних наук, професор Коренюк Іван Іванович професор кафедри фізіології людини і тварин та біофізики Таврійського національного університету імені В.І.Вернадського МОН України

Захист відбудеться “5” березня 2008 року о 14⁰⁰ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.001.38 Київського національного університету імені Тараса Шевченка (49033, м. Київ-33, вул. проспект академіка Глушкова, 2, біологічний факультет, ауд. 215). Поштова адреса: 01033, Київ-33, вул. Володимирська, 64.

З дисертацією можна ознайомитись у науковій бібліотеці ім. М. Максимовича Київського національного університету імені Тараса Шевченка (49033, м. Київ-33, вул. Володимирська, 58)

Автореферат розісланий “1” лютого 2008 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, кандидат біологічних наук Цимбалюк О.В.

АНОТАЦІЯ

Севериновська О.В. Механізми реалізації адаптаційно-компенсаторних реакцій організму за умов дії екопатогенних чинників. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук за спеціальністю 03.00.13-фізіологія людини і тварин. - Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Київ, 2008.

Дисертація присвячена вивченню молекулярних і функціональних механізмів порушень і розвиту адаптаційно-компенсаторних реакцій за окремої і сумісної дії чинників радіаційно-хімічної природи і можливості використання природних препаратів Spirylina platensis і бджолиного пилку для корекції цих порушень. Встановлено, що на субхронічний вплив підвищеної у порівнянні з фоновим рівнем дози опромінення організм відповідає цілісно, залучивши всі можливі ресурси. Серед приоритетних реакцій - утримання балансу активних і пасивних потоків К⁺ на мембранах нервових клітин, а також стимуляція еритропоезу, що необхідно для збереження гомеостазу всього організму. За дії важких металів більшість показників стану еритроцитів залежить від їх кількості, адаптація відбувається всередині самої системи. Солі важких металів зумовлюють розвиток незворотних змін у іон-транспортній системі у клітинах кори головного мозку, що є причиною створення напруженого стану. Комбінований радіаційно-хімічний вплив супроводжується взаємним послабленням окремих ефектів.

Ключові слова: субхронічне опромінення, важкі метали, антиоксидантний захист, біоелектрична активність, тренсмембанний перенос іонів.

адаптаційний компенсаторний бджолиний пилок

АННОТАЦИЯ

Севериновская Е.В. Механизмы реализации адаптационно-компенсаторных реакций организма в условиях действия экопатогенных факторов. - Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени доктора биологических наук по специальности 03.00.13 ? физиология человека и животных. - Киевский национальный университет имени Тараса Шевченко, Киев, 2008.

Диссертация посвящена изучению молекулярных и функциональных механизмов нарушений и развития адаптационно-компенсаторных реакций на разных уровнях организации живого как при отдельном, так и при совместном действии факторов радиационно-химической природы, а также возможности использования природных препаратов Spirylina platensis и пчелиной пыльцы для коррекции этих нарушений. Установлено, что центральные механизмы объединяют совокупность изменений метаболизма и функций нейронов, которые связаны как с изменениями в системе антиоксидантной защиты, так и с модуляцией биоэлектрической активности головного мозга. При действии облучения в дозе 0,15 Гр отмечается повышение общей двигательной активности крыс, что является результатом развития процессов возбуждения в ЦНС и свидетельствует в пользу теории гормезиса. При действии пороговой дозы ? 0,25 Гр у животных вместе с развитием процессов возбуждения в ЦНС отмечается проявление тревоги. Установленное пространственное усложнение патерна биоэлектрических потенциалов мозга у крыс этой группы указывает на переход к нелинейным, сложным полисинаптическим взаимодействиям. Этот тип реакции, названный „корковым” проявляется в эмоциональной возбудимости животных. Также под влиянием облучения происходит уменьшение, как пассивных потоков ионов калия, так и активных. Одновременно установлена высокая эффективность активного транспорта по отношению к пассивному. Это может свидетельствовать о том, что в результате протекания адаптационно-компенсаторных процессов в нервных клетках происходит уравновешивание пассивных и активных потоков калия, что существенно для стабилизации гомеостаза в условиях характерного для облученного организма состояния гипоэргоза и может служить доказательством сохранения целостности плазматической мембраны нервных клеток в этих условиях.

Влияние смеси тяжелых металлов (свинца, кадмия, кобальта, меди, цинка) в реальной дозе для промышленно нагруженного Приднепровского региона (по 2 ПДК для поверхностных вод) приводит к развитию процессов невротизации в ЦНС с истощением нервных центров. Ослабление б-подобного ритма неокортекса свидетельствует о переходе ЦНС в режим повышенного автоматизма функционирования, что отображается в гиперактивном хаотическом передвижении животных. Соли тяжелых металлов влияют на повышение пассивных потоков калия на фоне снижения эффективности активного транспорта, что является свидетельством напряженного состояния в адаптационно-компенсаторной системе.

При комплексном действии радиационно-химических факторов происходит обогащение спонтанной биоэлектрической активности высокочастотными составляющими, что свидетельствует об активации ЦНС и развитии нервного напряжения. Установлено увеличение диффузии ионов калия через плазматическую мембрану на фоне существенного снижения противоградиентного транспорта и эффективности работы Na,K-насоса в переживающих срезах коры головного мозга.

Под влиянием всех экопатогенных факторов происходит ухудшение кратковременной памяти.

Кроме существенных количественных изменений лейкоцитарной формулы крови животных под влиянием радиационно-химических факторов установлено уменьшение количества природных клеток-киллеров, а среди нейтрофильных лейкоцитов зарегистрированы гиперсегментированные атипичные формы.

Экопатогенные факторы, независимо от природы, значительно влияют на ионный кальциевый и про-/антиоксидантный балансы в плазме и эритроцитах. В условиях облучения, организм, привлекая все возможные ресурсы (в том числе и более высокие уровни регуляции) целостно отвечает стимуляцией эритропоэза, что необходимо для сохранения гомеостаза всего организма. При действии тяжелых металлов большинство показателей состояния эритроцитов зависит от их количества и состояния мембран, адаптация происходит внутри самой системы.

Комбинированное радиационно-химическое влияние, в большинстве случаев, сопровождается взаимным ослаблением отдельных эффектов.

Установлено, что пчелиная пыльца и препарат микроводоросли Spirylina platensis являются эффективными адаптогенами природного происхождения при радиационно-химической нагрузке на организм. Они, повышая антиоксидантные резервы организма, положительно влияют на системы транспорта ионов, модулируют биоэлектрическую активность, что отвечает ситуациям энергетической и информационной мобилизации. Приводят к нормализации низко- и высокочастотных составляющих биоэлектрической активности.

Ключевые слова: субхроническое облучение, тяжелые металлы, антиоксидантная защита, биоэлектрическая активность, трансмембанный перенос ионов.

АNNOTATION

Severynovs'ka O.V. The mechanism of the realization of adaptation-compensation reactions of an organism in conditions of action ecopathogenic factors. ? Manuscript.

Dissertation for scientific degree of doctor of the biological sciences on specialty 03.00.13- Human and Animals Physiology. Taras Shevchenko Kiev National University, Kiev, 2008.

The dissertation is devoted to studying of molecular and functional mechanisms of infringements and the developments of adaptation-compensation reactions at a molecular level and at the level of an organism, both at separate, and at joint action of the factors of the irradiation-chemical nature, and also an opportunity of the use of natural preparations of Spirylina platensis and beer pollen for the correction of these infringements. It has been determined that according subchronic influence of the doze of an irradiation raised in comparison with a background level an organism answers completely, involving all possible resources. Among priority reactions there is maintenance of balance of active and passive streams K⁺ on membranes of excitable cells, and also stimulation erytropoez, that is necessary for preservation of homeostasis of all an organism. At the action of heavy metals the majority of the parameters of the condition of erythrocytes depends on their quantity, adaptation occurs inside the system. The salts of heavy metals, changing osmotic resistency of membranes neurons cause development of irreversible changes in ion-transport system in the cells of a bark of a brain that is the reason of occurrence of an intense condition. The combined irradiation-chemical influence is accompanied by mutual easing of separate effects.

Key words: subchronic irradiation, heavy metals, antioxidants protection, bioelectric activity, transmembran carry of ions.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Результати багаторічного екологічного моніторингу свідчать про значні рівні забруднення території Придніпровського регіону, а також основної питної артерії України - р. Дніпра - та її притоків альтерогенами як радіаційної, так і хімічної природи, що є причиною суттєвого техногенного радіаційно-хімічного навантаження на живі організми і складає умови для прояву генетичного, канцерогенного, тератогенного, ембріотоксичного, імунопатогенного видів ризику (Дворецький А.І та ін., 1998, 2000, 2001, 2002, Грищенко С.В. та ін., 2003, Рибальченко В.К., Островська О.В., 2004). Це спонукало розпочати дослідження реалізації компенсаторно-адаптаційних можливостей в умовах комплексного впливу на організм реальних рівнів найбільш небезпечних і розповсюджених у поверхневих водах важких металів на фоні природного радіаційного навантаження (Дворецький А.І. та ін. 2001, 2003, Рибальченко В.К. та ін., 2004, 2006,), що є характерним для мешканців більшості територій України.

За комбінованої дії іонізуючої радіації та важких металів у організмі відбувається інтенсифікація процесів вільнорадикального окиснення, що призводить до поступового накопичення продуктів пероксидації і виснаження системи антиоксидантного захисту (Чекман І. та ін., 2000, Ананьева Т.В. та ін., 2001). Порушення структури плазматичної мембрани, викликане іонізуючим опроміненням (Барабой В.А. 1991), сприяє інтенсивнішому проникненню токсикантів у клітину та формуванню розладів у організмі на клітинному рівні (Руднев М.И. и др., 1994). Реалізація багатьох токсичних ефектів здійснюється на рівні центральної нервової системи (ЦНС), інтегративна роль якої обумовлює здатність до адаптації, а рівень її функціонування значною мірою визначає стан здоров'я всього організму (Walsh J. W., 2005).

Особливого значення набуває встановлення найбільш ранніх функціональних змін на молекулярному, клітинному рівнях та на рівні всього організму. Вплив комплексу екопатогенних чинників має стійкий, а у ряді випадків прогресуючий характер, що може викликати значні, а іноді незворотні зміни функцій основних ферментних систем та внутрішньоклітинних структур і, внаслідок цього, - зниження загальної резистентності організму. А також призводити до вичерпання адаптивних можливостей організму і розвитку функціональних порушень.

Відомостей про ефекти сумісної дії радіації та інших шкідливих факторів довкілля на організм недостатньо, а питанням встановлення і розкриття механізмів їх комбінованого токсичного впливу приділяється незначна увага. Виходячи з викладеного актуальність та доцільність проведення дослідження в цих напрямках не викликає сумнівів. Зважаючи на значну кількість осіб, що постраждали у результаті аварії на ЧАЕС, розкриття молекулярних та функціональних механізмів порушень і відновлення адаптивних можливостей організму має значне медико-соціальне значення (Нягу А. И., Нощенко А. Г. и др. 1992, Логановский К. Н., 2002). Крім того, такі дослідження необхідні для створення і використання фармакологічних захисних препаратів і заходів мінімізації радіаційно-хімічних уражень організму людей, що мешкають на забруднених територіях. Вибір вірної стратегії лікування та розробка його нових способів потребує розуміння молекулярних механізмів виникнення функціональних розладів, з'ясування яких є актуальною проблемою фундаментальної біології.

Враховуючи вищезазначене, проблемою сьогодення є захист населення від хронічного тиску екопатогенних чинників. У цьому плані привертає до себе увагу група природних препаратів: у першу чергу, це засоби народної медицини, які активно модулюють регуляторні системи організму та підвищують його загальну неспецифічну резистентність (Кудряшов Ю.Б., 2000, Рибальченко В.К., 1999, Гарник Т.П. та ін. 2000). Традиційно ефективність біоактивних харчових добавок, які мають адаптогенні та цитопротективні властивості, оцінюють за їх здатністю до корекції порушень, що виникли в результаті екстремальних впливів та розвитку патологічних станів.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалась у рамках державної програми “Наукові проблеми безпечної експлуатації АЕС та наслідків аварії на ЧАЕС” та координаційного плану МОН України. У рамках держбюджетних науково-дослідних тем лабораторії радіобіології та радіоекології НДІ біології Дніпропетровського національного університету: теми 01-19-97 „Вивчення молекулярних механізмів дії малих доз радіації та інших факторів навколишнього середовища на організм, зумовленої наслідками аварії на ЧАЕС та функціонуванням атомної енергетики” № 0197U000673 та теми 03-023-3 „Вивчення механізмів структурно-функціональних перебудов екосистем водойм Придніпров'я в умовах антропогенного тиску” № 0103U000553, у рамках науково-дослідних тем кафедри фізіології людини і тварин ДНУ „Дослідження центральних механізмів зв'язку управління та регуляції ЦНС” № 0195U023144 і „Фундаментальні дослідження впливу синергічних екопатогенних чинників та наукове обґрунтування нових комплексних методів діагностики, корекції та профілактики порушень стану здоров'я населення” № 0197U000655.

Мета і задачі дослідження. Мета даної роботи ? встановити основні особливості, закономірності та молекулярні і функціональні механізми порушень і розвитку адаптаційно-компенсаторних реакцій на різних рівнях організації живого за окремої і сумісної дії екопатогенних чинників радіаційно-хімічної природи.

Для досягнення мети необхідно було розв'язати наступні задачі:

Оцінити окремий та сумісний вплив низькоінтенсивного субхронічного опромінення в малих дозах (0,15 і 0,25 Гр) і важких металів (свинцю, кобальту, кадмію, міді, цинку) в реальних дозах для промислово навантаженого Придніпровського регіону на вищу нервову діяльність щурів.

Дослідити біоелектричну активність різних відділів ЦНС тварин за умов окремого і сумісного радіаційно-хімічного навантаження на організм, а також в умовах модифікації введенням у харчовий раціон щурам природних адаптогенів (Spirylina platensis і бджолиного обніжжя).

Оцінити стан системи трансмембранного переносу іонів у клітинах кори головного мозку при радіаційно-хімічному навантаженні на організм та за умов модифікації адаптогенами.

Дослідити вплив радіаційно-хімічних факторів на основні гематологічні показники і рівень іонізованого кальцію у крові.

Провести оцінку роботи системи антиоксидантного захисту у різних органах і тканинах щурів при окремому радіаційному, хімічному та сумісному радіаційно-хімічному впливах, а також за умов модифікації адаптогенами.

Об'єкт дослідження. Процеси регуляції адаптаційно-компенсаторних реакцій організму за умов дії альтерогенних чинників.

Предмет дослідження. Функціональні особливості і фізіологічні механізми розвитку адаптаційно-компенсаторних реакцій організму в умовах як окремого, так і комбінованого радіаційно-хімічного навантаження на організм.

Методи дослідження. Поведінкові реакції експериментальних тварин оцінювали у “відкритому полі”. У припіднятому радіальному 8-променевому лабіринті вивчали швидкість утворення умовного рефлексу і оцінювали короткочасну робочу пам'ять тварин. Використовуючи електрофізіологічні методи, досліджували біоелектричну активність різних структур головного мозку. На переживаючих зрізах кори головного мозку досліджували іон-транспортну функцію мембран нервових клітин. Визначення основних гематологічних показників крові проводили за загальноприйнятими методами. Для оцінки стану системи антиоксидантного захисту були використані методи визначення рівня супероксиддисмутази, каталази, церулоплазміну і загальної антиокиснювальної активності.

Наукова новизна отриманих даних. У проведених експериментах набуло подальшого розвитку встановлення закономірностей адаптаційно-компенсаторних реакцій організму за умов радіаційно-хімічного навантаження у дозах, що характерні для Придніпровського регіону. Вперше в умовах впливу екопатогенних чинників встановлені тісні зв'язки між антиоксидантною системою та транспортними властивостями мембран нервових клітин, що відбивається на змінах функцій ЦНС та у проявах вищої нервової діяльності.

Вперше встановлено, що у тварин, які підлягали дії низькоінтенсивного опромінення у малих дозах, спостерігається як підвищення спонтанної рухової активності та емоційності, так і збільшення спектральної потужності високочастотних складових біоелектричної активності. Встановлено, що під впливом суміші важких металів відбувається збільшення спектральної потужності біоелектричної активності у -діапазоні у неокортексі та дорсальному гіпокампі і зниження у області б-хвиль у обох відділах та у передній ділянці гіпоталамуса. Послаблення б-подібного ритму неокортекса може свідчити про порушення кірково-підкіркових взаємовідносин, що проявляється у привалюванні автоматизованих метушливих рухів щурів. За комплексної радіаційно-хімічної дії відбувається збагачення спонтанної біоелектричної активності більшості вивчених відділів мозку високочастотними складовими, що свідчить про активацію процесів головного мозку. У щурів цієї групи відмічені чіткі вірогідні зміни біоелектричної активності у всіх діапазонах у гіпокампі, що є чутливим до дії стрес-факторів.

Нами запропоновано методику розрахунку відносних показників, що необхідні для характеристики транспортних процесів у зрізах кори головного мозку. Так для характеристики проникності плазматичної мембрани і стану клітин в цілому враховувати відносну втрату внутрішньоклітинного калію під час преінкубації зрізів у штучному середовищі. Цей показник розраховується як відношення різниці рівнів калію у вихідних зрізах та після преінкубації до вихідного рівня калію. Відносний рівень внутрішньоклітинного калію після анаеробної інкубації зрізів характеризує транспортні функції мембрани в умовах відключення активної складової транспорту та розраховується як відношення рівня калію після анаеробної інкубації до рівня К⁺ у вихідних зрізах або після преінкубації. Для оцінки залежності пасивного транспорту від вихідного рівня внутрішньоклітинного калію або від його рівня після періоду адаптації розраховували частку пасивного транспорту - відношення величини градієнтного транспорту (зниження рівня калію при анаеробній інкубації) до рівня калію у вихідних зрізах або до рівня калію після преінкубації. Відносний рівень калію після аеробної інкубації вказує наскільки досягається вихідний рівень іонів за рахунок роботи активного транспорту, і розраховується як відношення рівня калію після аеробної інкубації до рівня калію у вихідних зрізах або до рівня калію після преінкубації. Ефективність реакумуляції внутрішньоклітинного калію по відновленню вихідного рівня іонів оцінювали як відношення рівня активного транспорту до рівня цих іонів у вихідних зрізах або після преінкубації. Ефективність роботи Na,K-насосу оцінювали як відношення величини активного транспорту до пасивного. Розрахунок та аналіз цих додаткових параметрів дозволив встановити, що під впливом низькоінтенсивного субхронічного опромінення в дозі 0,25 Гр відбувається зменшення пасивних потоків іонів калію з одночасною високою ефективністю активного транспорту на фоні його абсолютного зниження, що суттєво для стабілізації іонного гомеостазу в умовах характерного для опроміненого організму стану гіпоергозу. За дії комплексу важких металів та за сумісної радіаційно-хімічної дії відбувається підвищення пасивного транспорту іонів калію і зниження активного транспорту та його ефективності.

Теоретичне і практичне значення одержаних результатів. Проведені дослідження мають важливе теоретичне і практичне значення для клінічної практики при профілактиці і лікуванні порушень, викликаних радіаційно-хімічними факторами у ліквідаторів аварії на ЧАЕС та мешканців забруднених територій, їх реабілітації та реадаптації. Результати даної роботи можуть бути застосовані для розширення та поглиблення теоретичних основ радіаційного ефекту та для розробки заходів захисту населення від дії екопатогенних чинників в умовах техногенного забруднення промислового регіону. Встановлені закономірності мають загальнобіологічний характер, є відображенням фундаментальних механізмів забезпечення стійкості живих систем і їх адаптації до умов довкілля, що постійно змінюються. Отримані результати можуть бути використані при розробці довгострокових програм радіаційного і соціального захисту населення мегаполісів.

Особливе значення мають дані щодо корекції вище виявлених порушень препаратами природного походження, які показують, що препарат Spirylina platensis та бджолине обніжжя можуть бути запропоновані як профілактичні засоби для населення, що мешкає на техногенно-навантажених територіях.

Особистий внесок здобувача. Автором дисертації особисто розроблена програма та методологія досліджень, здійснено інформаційний пошук і узагальнення літературних даних, сформульовано положення та висновки роботи. Введено новий підхід до побудови спектрів біоелектричної активності з нівелюванням індивідуальних особливостей тварин та чутливості до введених речовин і з урахуванням співвідношень спектральної потужності низькочастотних компонентів до високочастотних. Досліди проведено сумісно з аспірантами та пошукувачами, керівником дисертаційних робіт яких є автор. В узагальненні отриманих результатів брали участь співробітники лабораторії радіобіології та радіоекології науково-дослідного інституту біології і науковий консультант. Особливу подяку виношу д.б.н., проф. Дворецькому А.І., за консультації з радіобіологічних та біохімічних питань.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи були представлені на: IV-V з'їздах з радіаційних досліджень (радіобіологія, радіоекологія, радіаційна безпека), 2001, 2006 (м. Москва, Росія), Міжнар. конф. „Биологические эффекты малых доз ионизирующей радиации и радиоактивное загрязнение среды”, 2005, 2006 (м. Сиктивкар, Республіка Комі ), the 3^rd Eurosymposium on Protection against Radon, 2001 (Бельгія), VIII українському біохімічному з'їзді, 2002 (м. Київ), ІІІ з'їзді з радіаційних досліджень (радіобіологія і радіоекологія), 2003 (м. Київ), Int. interdisciplinary congress “Progress in Neuroscience for Medicine and Phiciology”, 2005, 2006 (м. Судак), 17 з'їзді Українського фізіологічного товариства, 2006 (Чернівці).

Публікації. За результатами досліджень написано 25 статей та 46 тез доповідей, опублікованих у фахових журналах, матеріалах симпозіумів, міжнародних конференцій, з'їздів.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 320 сторінках машинописного тексту і складається із вступу, 8 основних розділів, узагальнення результатів, висновків, списку літератури, що містить 483 джерела. Робота ілюстрована 11 таблицями, 74 рисунками та 4 схемами.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

Дослідження проводили на білих лабораторних щурах масою на початку експерименту 180-220 г, яких утримували на стандартному раціоні віварію. Тварин напували водою, очищеною за допомогою побутового водоочищувача „Кулмарт” моделі СМ-101рр.

Опромінення проводили за допомогою установки РУМ-17 за таких технічних умов: потужність дози - 0,00133 Гр/хв, напруга 150 кВ, сила струму 6 мА, фільтр 2 мм Cu, фокусна відстань - 189 см, розмір вхідного поля 6х8х30 (см), час досягнення дози 0,01 Гр - 3 хв 49 с, дози 0,006 Гр - 1 хв 47 с. Тотальне опромінення тварин здійснювалось в дозі 0,15 Гр по 0,006 Гр на добу і в дозі 0,25 Гр (по 0,01 Гр на добу) протягом 25 діб, під час якого щури знаходилися у клітках-фіксаторах; одночасно опромінювали по три тварини. Досліди проводилися з 9 до 10 години ранку. Доза 0,25 Гр була обрана як порогова для біологічної дії низькоінтенсивної іонізуючої радіації в діапазоні малих доз (Кудряшов Ю.Б, 2004). Враховувалось також, що ця доза є гранично припустимою для ліквідаторів аварії на ЧАЕС за даними МАГАТЕ (Бурлакова Е.Б, 2003).

Суміш солей важких металів, які є найбільш поширеними полютантами поверхневих вод Придніпров'я, щури споживали упродовж 25 діб, їх додавали у воду для пиття у кількості: CdNO₃ - 3,1x10^-6 г/л, Pb(NO₃)₂ - 9,58 x 10^-5 г/л, CuSO₄ - 7,8x10^-3 г/л, CoSO₄ - 9,52x10^-3 г/л, ZnSO₄ - 5,0 x 10^-3 г/л, що приблизно відповідає 2 гранично припустимим концентраціям (ГПК) забруднення водойм у вищеназваному регіоні. Крім того, окремі групи тварин отримували по одному із токсикантів у вищезазначеній дозі.

Тварини окремих груп замість питної води отримували воду із водоймища, що є місцем збереження рідинних радіоактивних відходів у районі функціонування превинного ядерно-паливного циклу (хвостосховища балки Разбері - хвостосховища “Р”) та р. Жовтої, яку відбирали на початку березня, коли вона характеризувалася найнижчими бактеріологічними показниками. У лабораторних умовах її додатково обробляли бактерицидною лампою протягом 40 хвилин. Дослідна вода з р. Жовтої характеризувалася підвищеним вмістом урану і перевищенням ГПК за кількістю свинцю, кадмію, марганцю, заліза, цинку та міді, перевищення, скоріш за все, є відображенням реального стану вод в регіоні. У пробах води із хвостосховища „Р” відмічено не тільки перевищення тимчасово припустимих рівнів урану, але і приблизно у 2 рази перевищення ГПК за вмістом важких металів, ніж у пробах з попереднього джерела. Ця вода не використовується як питна для населення, що мешкає поблизу, але її застосовують для поливу городин, пасовища худоби.

Для корекції екопатогенного впливу використовували препарат синьо-зеленої водорості Spirulina platensis, що виробляється в Україні (ВПФ „Спіруліна” ЛТД, м. Миколаїв), який вводили у раціон харчування тварин у дозі 0,045 г на 100 г живої маси. Бджолине обніжжя за рекомендаціями фірми „Цвітень” вводили тваринам до щоденного харчового раціону протягом 25 діб у кількості 0,07 г на 100 г маси тварин на добу. Щури різних груп отримували вищезазначені препарати на фоні опромінення, хімічного навантаження і при сумісному радіаційно-хімічному впливі.

П'ятихвилинне тестування у „відкритому полі” проводилося згідно методичним рекомендаціям (Я. Буреша и др, 1991). У припіднятому 8-променевому радіальному лабіринті, де знаходилися тварини упродовж 15 хвилин, вивчали швидкість утворення харчового умовного рефлексу і проводили оцінку короткотривалої робочої пам'яті за показником корисної дії (ПКД), який розраховували як відношення правильно вибраних променів до загальної кількості відвіданих у радіальному лабіринті. Для прискорення вироблення умовних рефлексів всі тварини попередньо підлягали процедурі Gentling (яка є одним із методів впливу експериментатора на щурів після відняття їх від матері, тобто їхнього приручення, яка вперше була запропонована Бернштейном М.О., 1940).

На стереотаксичному приладі СЕЖ-2 конструкції Ю.М. Беленьова тваринам під “легкою анестезією” (тіопентал натрію - 50 мг/кг; кетамін - 20 мг/кг) уніполярні, стандартні стальні, з d=0,1 мм, у лаковій ізоляції електроди занурювали у дорсальний гіпокамп, гіпоталамус (suprachismatic nucleus та dorsal hypothalamic area) та проводили запис біоелектричної активності від лобово-тім'яної кори за атласом (Paxions G. and Watsons C., 1986). Заземлення тварин проводили за допомогою електрода, розташованого на хвості, індиферентні розміщували на вушних раковинах щура. Експерименти проводили на стандартному електрофізіологічному устаткуванні зі 16-розрядним аналого-цифровим перетворювачем (частота вибірки - 512 Гц).

Після появи мигального рефлексу та рефлексу відсмикування лапи (Kuwada S et al, 1989 ) починали запис біоелектричної активності. Отримані результати обробляли з використанням перетворення Фур'є (FFT під час усього експерименту). Враховуючи відомі характеристики - -ритму (1-3 Гц); -ритму (4-7 Гц); -ритму (8-12 Гц) і -ритму (13-30 Гц) - будували спектри їх потужності. Для відображення загальних закономірностей спектральної кривої, а також для нівелювання індивідуальних особливостей тварин і чутливості до введених речовин, максимальне значення спектральної потужності (визначене у квадратних мікровольтах/Гц) приймали за 100 % і будували спектри, застосовуючи пакет програм Matlab 7.0. Також підраховували питому кількість кожної складової, приймаючи за 100 % загальну кількість хвиль за 10 с.

Визначення транспортної функції мембран нейронів проводили на переживаючих зрізах кори головного мозку. Для цього після швидкої декапітації тварин діставали мозок і на холоді слайсером робили зрізи кори головного мозку товщиною 0,3-0,4 мм та масою 10-12 мг на мікротомі МНТ-84. Для інкубації використовували бікарбонатний буфер Кребса-Рінгера (рН=7,4), який врівноважували газовими сумішами О₂:СО₂ або N₂:СО₂ (у відношенні 95%:5%) в залежності від умов досліду.

Транспорт калію у зрізах досліджували за схемою (Israel J. Et al., 1966): преінкубація - 20 хвилин при 37⁰С в аеробних умовах (95% О₂ і 5% СО₂), інкубація - 10 хвилин при 37⁰С в анаеробних умовах ( 95% N₂ і 5% СО₂), аеробна інкубація - 30 хвилин. Після закінчення інкубації зрізи занурювали у 0,34 М розчин сахарози на 1-2 с для відмивання позаклітинного калію, висушували фільтром, зважували та поміщали в бюкси з 0,5 мл концентрованої HNO₃ де їх утримували при 70⁰С до повного розчинення. Вміст калію визначали на атомно-абсорбційному спектрофотометрі фірми “Hitachi”(Японія).

Пасивний транспорт іонів калію розраховували як різницю між рівнями К⁺ після преінкубації та анаеробної інкубації. Активний транспорт іонів калію оцінювали за здатністю зрізів до протиградієнтної реакумуляції К⁺ із розчину, яка визначалася як різниця вмісту калію у зрізах після анаеробної і аеробної інкубації і виражали у мекв К⁺/ кг вологої маси.

Дослідження кількості еритроцитів і лейкоцитарної формули крові проводили за загально прийнятими методами (Камышников В.С., 2004). Вміст гемоглобіну у крові визначали згідно з інструкцією до набору для визначення вмісту гемоглобіну у крові людини в клініко-діагностичних і біохімічних лабораторіях та науково-дослідній практиці ("Філісит діагностика", Дніпропетровськ). Розраховували кольоровий показник. Визначення рівня іонізованого кальцію у крові проводили за допомогою аналізатора іонізованого кальцію ORION BIOMEDICAL Space-stat 20.

Активність каталази визначали за методом (Чевари С. та ін., 1991). Принцип якого полягає в тому, що частина перекису водню яка залишилася, взаємодіючи з молибдатом натрію, утворює перекисні сполуки Na₂Mo₆, жовтого кольору. Активність супероксиддисмутази визначали за методом (Переслегиної І.А., 1989) за ступенем інгібування відновлення нітросинього тетразолія у присутності NADH та феназинметасульфата. Активність церулоплазміну визначали за модифікованим методом Ревіна (Камышников В.С., 2004). Принцип методу базується на окисненні парафенілендіаміну за участю церулоплазміну. Визначення перекисного гемолізу еритроцитів проводили за методом (Горячковський А.М., 1994). Загальну антиокислювальну активність гомегенатів тканин і компонентів крові оцінювали за методом (Клебанов Г.И. и др., 1998) з використанням суспензії жовточних ліпопротеїдів.

Всі експерименти були проведені згідно вимогам Європейської конвенції щодо використання лабораторних тварин у медико-фізіологічних дослідженнях. Отриманий числовий матеріал оброблявся за допомогою стандартних методів математичної статистики з визначенням середніх величин, їх стандартних помилок та інтервалів вірогідності за t-критерієм Стьюдента. Відмінності, отримані за методом парних порівнянь, вважали вірогідними при Р<0,05. Математичні розрахунки та побудову графіків здійснювали з використанням пакетів програм “Statistica” та “Origin 6.0”.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕННЯ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Зміни стану вищої нервової діяльності за показниками поведінкових реакцій тварин, що зазнали радіаційно-хімічного впливу.

Нами було встановлено, що у тварини які вживали воду з р. Жовтої підвищувалася рухливість, яка при тестуванні у „відкритому полі” виражалася у тенденції до зростання загальної горизонтальної активності та у зменшенні тривалості завмирання на одному місці.

У тварин, що вживали воду з місць збереження радіоактивних відходів (хвостосховища „Р”) психоемоційний патерн поведінкових реакцій проявлявся у: вірогідному зменшенні кількості та частоти відвідування внутрішніх квадратів, збільшенні кількості стійок та грумінгів, підвищенні тривалості останніх. Оскільки ця вода не має повної характеристики, складно судити про вплив на організм тих, чи інших її токсичних компонентів. Тому доцільно було дослідити окремо вплив фізичних та хімічних чинників на показники поведінкових реакцій. Після низькоінтенсивного субхронічного опромінення в дозі 0,15 Гр: підвищилася як горизонтальна (за рахунок кількості відвідувань зовнішнього і внутрішнього поля), так і вертикальна (за рахунок збільшення кількості стійок та грумінгів) рухова активність тварин, що проявлялося у 1,5 разовому зростанні загальної локомоторної активності.

Результати тестування контрольних тварин (А, І), а також тих, що вживали: ІІ - воду з р. Жовтої; ІІІ - з хвостосховища „Р”; тих, що були опромінені у дозі 0, 15 Гр (Б, IV); у дозі 0, 25 Гр (V); що вживали суміш солей важких металів (Б, VI); що знаходилися під дією радіаційно-хімічних факторів (Б, VII); 1, 2 - кількість відвіданих зовнішніх та внутрішніх квадратів, 2 - кількість відвіданих внутрішніх квадратів, 3 - загальна горизонтальна активність, 4 - частота відвідування внутрішніх квадратів, 5 - кількість стійок, 6 - кількість актів грумінгу, 7 - загальна вертикальна активність, 8 - загальна рухова активність, 9 - тривалість актів грумінгу, у с; 10 - кількість нірок, 11 - тривалість завмирання тварини, у с.

Разом із збільшенням кількості зросла і частота відвідувань щурами внутрішнього поля, підвищилася кількість відвіданих нірок. Отримані дані наводять на думку про розвиток активації процесів у ЦНС тварин, що підлягали опроміненню у дозі 0,15 Гр і свідчать на користь теорії гормезису.

Дослідження поведінкових реакцій тварин після субхронічного опромінення у більш значній дозі - 0,25 Гр показало, що у цих щурів відмічається: вірогідне зменшення кількості та частоти відвідування внутрішніх квадратів, вертикальної активності та кількості відвіданих нірок. Тобто у цілому картина була дуже подібною тої, що спостерігали у тварин, які вживали воду з хвостосховища.

Як відомо, збільшення вертикальної активності та кількості відвіданих нірок характеризує підвищену чутливість опромінених тварин до фактору новизни. Але, якщо це одночасно супроводжується зменшенням кількості і частоти відвідування внутрішнього поля та збільшенням кількості та тривалості актів грумінгу, то отримані результати свідчать про підвищення рівня тривожності у експериментальних тварин. Додатково звертає на себе увагу факт суттєвого збільшення тривалості актів грумінгу, що свідчить про нестабільний емоційний стан тварин.

У піднесеному 8-променевому радіальному лабіринті вивчали швидкість утворення умовного харчового рефлексу та проводили оцінку короткотривалої пам'яті за показником корисної дії (ПКД). Встановили, що при виконанні завдання тваринам контрольної групи і тваринам, що були опроміненні у дозі 0,15 Гр, знадобилося на вироблення харчового умовного рефлексу всього чотири спроби, у той час як опроміненим (у дозі 0, 25 Гр) щурам - сім, що вказує на погіршення короткочасної пам'яті у тварин під впливом низькоінтенсивного опромінення. Отже, отримані дані свідчать що при низькоінтенсивному опроміненні в дозі 0,15 Гр спостерігається стимулюючий ефект, на відміну від інгібуючого - у діапазоні більш високих доз. Взагалі отримані результати свідчать про розвиток процесів збудження та активації процесів у ЦНС тварин, що зазнали низькоінтенсивного опромінення в малих дозах.

Разом із високою загальною руховою активністю поведінка тварин, що отримали надлишок важких металів, відрізнялася також більшим часом завмирання на одному місці (рис. 1 Б). Отже, отримані результати свідчать про розвиток процесів невротизації, але при цьому внаслідок гіперактивності тварин цієї групи відбувається виснаження нервових центрів, що відображається в подовженні періодів нерухомості щурів, які необхідні для відновлення стану ЦНС.

Тваринам які вживали суміш важких металів, як і опроміненим, знадобилося сім спроб для формування позитивного харчового умовного рефлексу. Зниження рівня ПКД та його хвильовий характер, збільшення кількості помилок у щурів свідчать про відсутність у них чітко визначеної стратегії руху, яка притаманна контрольним тваринам. Це візуально спостерігається у метушливому переміщенні дослідних тварин з одного променя в інший. Отже, вплив суміші металів викликає погіршення просторової орієнтації тварин, подовження латентного періоду утворення умовного рефлексу, зниження ефективності виконання завдання. Це вказує на погіршення здатності тварин до навчання та їх короткотривалої пам'яті.

Дослідження комплексного впливу радіаційно-хімічних факторів показали, що поведінка цих щурів у незнайомому відкритому просторі характеризується підвищеною невпорядкованою, метушливою активністю (рис. 1 Б). Отримані дані є свідченням активації нервових процесів на рівні ЦНС і зниження відчуття страху у тварин, що знаходилися під комплексною дією чинників. Слід зазначити, що 40% тварин експериментальної групи при формуванні умовного рефлексу у 8-променевому радіальному лабіринті не виконали завдання. У основної маси щурів, що знаходилися під дією радіаційно-хімічних факторів даний рефлекс можна вважати сформованим на п'яту спробу, тоді як у контрольних тварин - на четверту. Велика кількість помилок (повторні заходи у лабіринти) свідчила про низьку ефективність виконання завдання і погіршення пам'яті у щурів, які знаходяться під комплексним впливом екопатогенних чинників.

Дослідження біоелектричної активності різних відділів ЦНС у щурів за умов радіаційно-хімічного навантаження та при дії природних препаратів.

У тварин, що були опромінені у дозі 0,25 Гр складно виявити домінантний ритм біоелектричної активності у всіх вивчених відділах, що свідчить про її поліморфний характер. Амплітуда всіх складових біоелектричної активності була вищою, ніж у контрольних тварин. Аналіз спектрів відносної потужності виявив відміни по всіх частотних діапазонах, при цьому практично всі складові мали виражені піки з максимальними значеннями. У щурів цієї групи достовірно збільшується відносна спектральна потужність (ВСП) у б- та в-діапазонах біоелектричної активності. Подібна картина відмічається і у тварин при вживанні води із району функціонування первинного ядерно-паливного циклу (із хвостосховища “Р” та р. Жовтої). Таким чином, проведені дослідження показали, що фракційне пролонговане низькоінтенсивне опромінення призводить до збагачення спонтанної електричної активності мозку високочастотними складовими, що свідчить про розвиток процесів активації з іритаційними проявами на рівні ЦНС. Ці електрофізіологічні показники відображають загальні зміни головного мозку, що відбуваються під дією іонізуючого опромінення, причому їх вираженість у більшому ступені залежить від дози, ніж від умов опромінення. Подібна електроенцефалографічна реакція відмічалася (Варецкий В. А. и др., 1987) за дії постійного магнітного поля як неспецифічна відповідь, що свідчить про підвищення ступеня динамічності біоелектричних процесів у ЦНС.

Особливістю запису сумарної біоелектричної активності у тварин, що вживали навантажену солями важких металів воду була наявність високоамплітудних поодиноких позитивних повільних спайків. Подібну картину спостерігали інші автори (Сазонова О.Б., Машеров Е.Л. , 1996, Waggoner D.J. et al., 1999), які пов'язували ці ефекти з порушенням мозкового кровообігу. Тим паче, що важкі метали, особливо свинець та кадмій, здатні викликати порушення судин, а надлишок міді - впливати на мозковий кровотік. Аналіз спектрів потужності різних ритмів, розрахованих для вивчених відділів мозку, показав, що хронічний вплив солей важких металів на організм проявляється на рівні неокортекса, гіпокампа та передньої ділянки гіпоталамуса у послабленні ВСП біоелектричної активності у б-діапазоні, що може свідчити про перехід діяльності мозку в цих умовах на економний режим. Посилення -ритму у неокортексі та гіпокампі дослідних тварин може бути проявом їх стресового стану, що призводить до розвитку невротизації. Можливо, ці зміни проявляються у відсутності у дослідних тварин стратегії вибору при формуванні „лабіринтного” рефлексу, а також у підсиленні загальної рухової активності та агресивності. Збільшення потужності у в-діапазоні разом із високими значеннями ВСП б-складових у ерготропній зоні гіпоталамуса та протилежні ефекти у трофотропній зоні гіпоталамуса у тварин, що вживали надлишок солей важких металів, разом із значним підвищенням їх загальної рухової (що характеризується як „метушня”) і емоційної (агресивність) активностей може бути проявом розвитку психовегетативних синдромів внаслідок підсилення симпатичних та пригнічення парасимпатичних ефектів під дією важких металів.

За комплексного радіаційно-хімічно впливу показники ВСП у неокортексі і передній зоні гіпоталамуса дослідних тварин вірогідно збільшились у -, в- і б-діапазонах, що свідчить про активацію процесів головного мозку. Особливий характер змін спостерігався у задній ділянці гіпоталамуса: підвищення загальної потужності д-хвиль та зниження ВСП у б-діапазоні. Ми вважаємо, що збільшення у електрограмі и-активності може бути пов'язано із формуванням у щурів умовно-рефлекторної діяльності і є одним з компонентів реакції орієнтації у тварин. Зміни біоелектричної активності, що відбувалися у дорсальному гіпокампі, скоріш за все, свідчать про значну чутливість цього відділу мозку до дії комплексу екопатогенних факторів.

Широке розповсюдження апітерапії в Україні та у країнах СНД чітко визначило два напрямки використання продуктів бджільництва в медицині: біоактивні добавки та сировини для стандартизованих субстанцій лікарських препаратів та природних адаптогенів (Шендеров С. та ін., 1985, Дорошенко В. Е. и др., 1993, Дворецкий А.И. и др., 2002). Бджолине обніжжя відносять до адаптогену, який підвищує загальну неспецифічну опірність організму до захворювань та радіації. Воно чинить позитивний вплив на процеси обміну в клітині, збільшує її здатність до поділу та відновлення. Саме тому вивчення, розробка та застосування обніжжя займає головне місце серед продуктів бджільництва. Не з'ясованим залишається питання про його можливу опосередковану дію на ЦНС, що стало метою проведення наших подальших експериментів.

При використанні бджолиного обніжжя упродовж місяця показники ВСП кожної ритмічної складової у всіх вивчених відділах мозку дослідних тварин достовірно збільшились в усіх діапазонах, що свідчить про активацію процесів головного мозку, що, можливо, пов'язано з інтенсифікацію процесів обміну під впливом цього природного адаптогену. Взагалі вживання бджолиного продукту, призводячи до збільшення питомої ваги складових електричної активності мозку, знижує частку повільних низькочастотних компонентів та збільшує кількість швидких високочастотних. Це може бути свідченням переходу організму на новий функціональний рівень гомеостазу, що торкається і клітин головного мозку.

При використанні даного адаптогену на фоні радіаційного навантаження відмічалася тенденція до нормалізації відношень повільного та швидкого компонентів біоелектричної активності. Відмінність відповіді вивчених структур за значеннями ВСП є свідченням підвищення їхньої активності та може бути причиною зростання загальної функціональної активності мозку під дією багатокомпонентного природного препарату бджолиного обніжжя. Відмітимо, що сам по собі такий чинник як суміш важких металів незначно впливає на модуляцію біоелектричної активності різних відділів головного мозку, а при корекції цього впливу природним адаптогеном у більшому ступені проявляється ефект адаптогену. При використанні бджолиного пилку на фоні радіаційно-хімічного навантаження на рівні всіх структур відмічається тенденція до відновлення співвідношень повільних компонентів до швидких складових біоелектричної активності. Аналіз ритмічних складових у цих тварин показав, що у більшості випадків питома кількість вивчених осциляцій досягала контрольних значень.

При використанні іншого адаптогену (препарату синьо-зеленої водорості Spirylina platensis, який також володіє радіопротекторними і адаптогенними властивостями, значення ВСП у всіх вивчених відділах мозку тварин вірогідно зменшується в д-області, але збільшується у високочастотних б- та в-областях, що може свідчити про активацію процесів головного мозку під дією цього препарату.

Використання препарату Spirylina platensis на тлі низькоінтенсивного опромінення призводить до відновлення співвідношень між низько- та високочастотними складовими біоелектричної активності під дією природного препарату, які були порушені у результаті тривалої дії опромінення. Аналіз питомої кількості складових біоелектричної активності показав, що відмічені зміни відбувалися за рахунок зростання амплітуди біопотенціалів, що свідчить про підвищення процесів активації головного мозку під дією цього адаптогену. Спроба корекції адаптогеном впливу суміші солі важких металів була менш успішна, ніж за дії опромінення. Це, скоріш за все, пов'язано з тим, що солі важких металів менше впливають на біофізичні параметри головного мозку, тому ефект у цьому разі був більше подібний до ефекту самого природного фітопрепарату. Використання препарату спіруліни на фоні комбінованого радіаційно-хімічного фактору призводило до збільшення ВСП у и-, б-, і в-діапазонах тільки у ділянках гіпоталамуса, на рівні інших відділів вірогідних змін не зафіксовано.

Взагалі можна відмітити, що використання природних адаптогенів призводить до нормалізації співвідношень низько- та високочастотних складових електрограм тварин, що знаходилися під екопатогенним впливом.

Трансмембранне перенесення іонів при радіаційно-хімічному навантаженні на організм та їх корекція.

Процеси трансмембранного переносу іонів дуже чутливі до впливу різних факторів фізичної та хімічної природи (Дворецкий А.И. и др., 1998), в тому числі до антропогенних токсикантів: радіонуклідів, важких металів, пестицидів та інших класичних забруднювачів довкілля. У зв'язку з цим вивчення стану клітинної мембрани під впливом екопатогенних факторів, враховуючи реальну екологічну ситуацію на території промислово розвинутих регіонів України, має першочергове значення і наближає до розкриття механізмів адаптації організму, що знаходиться під антропогенним пресом.

За різністю між рівнем калію після анаеробної інкубації та преінкубації можна судити про рівень пасивного транспорту іонів через плазматичну мембрану. Нами встановлено, що під впливом низькоінтенсивного субхронічного опромінення в дозі 0,25 Гр відбувається вірогідне зменшення (на 30%) пасивних потоків калію у порівнянні із контролем . Суміш металів, навпаки, сприяє дифузному виходу калію із клітини, що у 1,8 разів вище за контроль. Це є свідченням різних механізмів реагування клітини у відповідь на вплив факторів фізичної та хімічної природи.

За комбінованої дії двох екопатогенних факторів спостерігається нівелювання ефектів окремих чинників і проявляється антагонізм дії радіаційних та хімічних агентів на дифузійний транспорт іонів крізь плазматичну мембрану.

Реакумуляція калію, що протікає під час аеробної інкубації, є наслідком роботи Na,K-насоса. Аналіз даних стосовно активного транспорту показав, що у випадках як окремого, так і сумісного впливу вивчених радіаційно-хімічних факторів спостерігається вірогідне пригнічення протиградієнтного транспорту калію у зрізах кори головного мозку щурів. Отже, модифікація променевого впливу важкими металами пов'язана із синергізмом негативних ефектів цих факторів.