СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Z-схема, или схема нециклического транспорта электронов, получила свое название из-за сходства с буквой Z. Её принцип впервые был предложен в 1960 г. Р. Хиллом и Ф. Бендаллом и в 1961 г. был подтвержден работами Л. Дюйзенса.

Конечным этапом световых стадий фотосинтеза является восстановление NADP+, которое осуществляет ФС-1. При возбуждении П700 в реакционном центре ФС-1 энергией, эквивалентной 1 кванту длинноволнового красного света, электрон захватывается мономерной формой хлорофилла a (A1; акцептор электрона) и затем последовательно передается переносчикам электронов А2 и Ав (железосерные белки FeS), ферредоксину (водорастворимый FeS-белок) и ферредоксин - NADP-оксидоредуктазе с FAD в качестве кофактора. Наконец, редуктаза восстанавливает NADP+. Именно в ФС-2 происходит фотоиндуцированное окисление воды. П700 является сильным окислителем. Донором электронов для него является ФС-2. Электроны от ФС-2 переходят на ФС-1 посредствам мобильных переносчиков и цитохромом b6f-комплексов.Исходным донором электронов для ФС-2 является вода.Энергия, освобождающаяся при движении электронов от П680 до П700, используется для синтеза АТФ из AДФ и неорганического фосфата (фотофосфорилирование). (Холл Д., Рао К., 1983)

Фотохимический реакционный центр ФС-2П680 поглощает энергию, эквивалентную 1 кванту коротковолнового красного света, и переходит в синглетное возбужденное состояние, отдает электрон феофетину (Фео). От Фео электроны, теряя энергию, последовательно передаются на пластохиноны - QA и QB, в пул липидорастворимых молекул пластохинона (PQ), переносящих через липидную фазу мембраны электроны и протоны в цитохромный b6f комплекс, который затем восстанавливает Cu-содержащий белок пластоцианин (Пц). Электроны с Пц переходят на вакантное место в П700.

Вакантное место («дырка») в П680 заполняется двумя электроном из содержащего Мn - неорганического ядра водоокисляющего комплекса. Этот комплекс связывает воду и восстанавливается за счет её электронов. Для осуществления этой реакции в белковом комплексе необходимы Мn и С1-, а также Са2+. Таким образом, основным источником электронов для восстановления NADP+ является вода, разложение которой происходит в ФС-2.

1.3 Фотосистема 2

ФС-2 (Рис. 4) содержит более 20 различных белков и пигмент-белковых комплексов, ее состав зависит от условий окружающей среды. Полипептиды ФС-2 выполняют ряд важных функций: часть поглощают энергию света и передают энергию возбуждения, участвуют в разделении зарядов и окислении воды, стабилизируют структуру димеров ФС-2, участвуют в сборке мономера и образовании димера, связывают и ориентируют молекулы хлорофилла а и b, а также каротиноиды. В ФС-2 условно выделяют части, выполняющих разные функции: 1) реакционный центр , 2) светособирающий комплекс, 3) водоокисляющий комплекс.

Реакционный центр

Реакционный центр обеспечивает фотосинтетическое разделениезарядов - первый этап преобразования солнечной энергии в энергию химических связей. Он содержит интегральные белки D1 (PsbA) и D2 (PsbD), каждый из которых образован пятью трансмембранными б-спиралями, расположенными в мембране пррактически параллельно друг другу (Barberetal., 1987). В состав РЦ ФС-2 также входит третий интегральный белок - цитохром b559,количество молекул которого на один РЦ точно не установлено (предполагается 1-2 молекулы).

На белках D1 и D2 расположены кофакторы переноса электрона в ФС-2 - фотоактивная А-цепь: TyrZ, П680, ChlD1, PheoD1, QA и QB. Энергия света, поглощенная пигментами светособирающего комплекса ФС-2, переносится к первичному донору электрона P680 - специализированному димеру хлорофиллов а (Renger, 1992).Разделение зарядов в реакционном центре происходит за счет перехода молекулы P680в возбужденное синглетное состояние, за счет энергии поглощенного кванта света. В первой стадии разделения зарядов принимает участие молекула хлорофилла a (ChlD1), которая располагается между П680 и PheoD1 (рис. 5.). Энергия возбуждения возможно делокализуется между четырьмя молекулами хлорофилла(специальная пара PD1PD2 и вспомогательными ChlD1 и ChlD2). (Barber, 2002)

Рис. 5. Схема расположения кофакторов переноса электрона в ФС-2 (Guskovetal., 2009). Красные стрелки - этапы переноса электронов с указанием времени переноса электрона. Голубые - возможные пути переноса электрона (Muh et al., 2012).

РЦ входит в состав более крупного белкового комплекса, называемого «ядерным» В его состав у высших растений, кроме белков D1, D2, цитохром b-559 входят белкиCP43, CP47, PsbO; могут входить белки PsbP, PsbQ.

Структура ядерного комплекса высших растений крайне близка к структуре цианобактерий: для цианобактерии Thermosynechococcus elongatus показано наличие 35 молекул хлорофилла а, 2 молекул феофитина, 3-х пластохинонов и 12 в-каротинов в расчёте на один мономер, а также марганцевого кластера и других кофакторов. Для «ядерных» комплексов из высших растений (шпината) показано наличие от 35 до 80 молекул хлорофилла, одной молекулы QA и марганцевого кластера в расчете на один РЦ.

Светособирающий комплекс (ССК)

2. КАРБОАНГИДРАЗНАЯ АКТИВНОСТЬ ФОТОСИСТЕМЫ 2

Кромеионов Mn2+,Са2+ иCl- важное значение для функционирования ФС-2 имеют ионы бикарбоната. В обеспечении ФС-2 ионами бикарбоната может быть нужен специальный фермент - карбоангидраза.

Карбоангидраза (карбонатгидролиаза, К.Ф.4.2.1.1.) - фермент, катализирующий обратимую гидратацию углекислого газа (СО2 + Н2О ? Н2СО3 ? Н+ + НСО3), присутствует во всех живых организмах: растениях, животных, бактериях, грибах. Карбоангидразы делят на 6 основных классов - б, в, г, д, е и ж, представители которых имеют незначительные сходства в аминокислотных последовательностях. В одном организме могут находиться представители различных классов карбоангидраз (Moroney etal., 2001; Куприянова и Пронина, 2011). Карбоангидразы играют важную роль в фотосинтезе многих организмов, как цианобактерий, так водорослей и высших растений (Moroneyetal., 2011). В ФС-2 высших растений и некоторых одноклеточных водорослей обнаружена карбоангидразная активность.

2.1 Карбоангидразная активность ФС-2 высших растений и её свойства

Он входит в состав фотосинтетического пигмента - хлорофила и участвует в аккумуляции солнечной энергии в ходе фотосинтеза (Якушкина И.И., 2004). Также магний принимает участие в передвижении фосфора и в углеводном обмене, влияет на активность окислительно-восстановительных процессов.

При недостаточности магния снижается содержание хлорофилла в зеленых частях растений Поскольку хлорофилл поглощает солнечную энергию и с ее помощью углекислый газ и вода превращаются в сложные органические вещества: сахара, крахмал и др., само существование зеленых растений невозможно без магния. (Полевой В.В., 1989)

Ионы марганца

Марганец, как и медь, играет важную роль в окислительно - восстановительных реакциях (он характеризуется высоким показателем окислительно-восстановительного потенциала), протекающих в растении. Он входит в состав ферментов, с помощью которых происходят данные процессы. Марганец непосредственно участвует в фотосинтезе, дыхании, в углеводном и белковом обменах. В растения марганец находится в разной степени окисления (Мn2+, Мn3+, Мn4+), но поступает в растение в виде ионов Мn2+. Среднее содержание данного элемента в растениях 0,001 %.

Ионы марганца необходимы для нормального протекания фотосинтеза, так как входят в состав активного центра водоокисляющего комплекса ФС-2. Кроме того, марганец участвует в восстановлении С02, играет значимую роль в поддержании структуры хлоропластов. При недостатке марганца хлорофилл незамедлительно начинает разрушаться при освещениирастений. (Якушкина И.И., 2004)

Ионы кальция

Кальций поступает в растение в течение всей его жизни в виде катионов Са2+ (Полевой В.В., 1989). Часть кальция находится в клеточном соке. Здесь он поддерживает определенное физиологическое равновесие ионов в клетке, главным образом нейтрализуя избыточно образующиеся органические кислоты; влияет на вязкость и проницаемость протоплазмы.(Малиновский В.И., 2004)

Помимо прочего кальций участвует в углеводном и белковом обмене растений, образовании и росте хлоропластов. От кальция в большей степени зависит построение нормальных клеточных оболочек. Кальций также как и марганец как входит в состав активного центра ВОК ФС-2.

Ионы цинка

Поступает в растение в виде ионов Zn2+. Среднее содержание цинка в растениях 0,002%. В растениях цинк не участвует в окислительно-восстановительных реакциях, поскольку не обладает переменной валентностью. Он входит в состав более 30 ферментов, в т. ч. фосфатазы, карбоангидразы, алкогольдегидрогеназы, РНК-полимеразы и др. Кроме того, цинк участвует в синтезе аминокислоты триптофана, являющеся предшественником ростовых веществ (ауксинов) в растении. (Полевой В.В., 1989). Фермент КА важен для многих этапов процесса фотосинтеза. Например, углекислый газ, поступая в клетку, растворяется в воде, образуя Н2СO3: СO2 + Н2O<-> НСO3 + Н+. Фермент карбоангидраза, катализируя высвобождение С02 из гидрата окиси углерода, способствует его быстрой фиксации в цикле Кальвина-Бенсона.. (Якушкина И.И., 2004)

Цинк благоприятен для процесса синтеза хлорофилла. Вызываемое недостатком цинка нарушение процессов синтеза хлорофилла приводит к появлению на листьях хлоротичных пятен светло-зеленого, желтого и даже почти белого цвета. Однако, избыток цинка токсичен для растения, связан недостатком меди, железа и редких случаях приводит к гибели растения. (Полевой В.В., 1989)

Ионы меди

Медь является переходным и тяжелым металлом, для которого доказано токсическое действие. При взаимодействии с НАДФН-оксидазой он вызывает образование Н2О2. В митохондриях и хлоропластах ионы тяжёлых металлов могут являться акцептором при переносе электронов или неправильно направляют перенос электрона (в зависимости от окислительно-восстановительного статуса металла), что вызывает образование свободных радикалов. Кроме того, ионы тяжёлых металлов могут быть причиной мутаций. (ArunK. Shanker, 2008).

Ионы медь входят непосредственно в состав ряда ферментных систем. 75% ионов меди, содержащейся в листьях, сконцентрировано в хлоропластах. Также в хлоропластах находится маленький, водорастворимый, медьсодержащий белок синего цвета -- пластоцианин(молекулярная масса около 10,5 кДа). В пластоцианине содержание меди составляет 0,57%. Медь обладает способностью к обратимому окислению и восстановлению (Сu2+ е --> Сu+), пластоцианин участвует в переносе электронов от ФС-2 к ФС-1. При дефиците меди снижается активность ФС-1. (Якушкина И.И., 2004)

Исследования последних лет свидетельствуют, что ингибирующее действие ионов тяжелых металлов на фотосинтетические функции растений обусловлено их взаимодействием с компонентами ФС-2.

Объекты и методы исследований

Листья растения обрываются от черешков и промываются дистиллированной водой. Далее они помещаются в гомогенизатор и заливаютсях средой, состоящей из раствора 0,4 М сахарозы (обеспечивающей изотоничность по отношению к внутреннему содержимому хлоропластов), Tris-HCl (pH 7.8) - обеспечивает постоянство pH при выделении, ЭДТА образует комплексы с ионами металлов, аскорбат натрия - восстановитель, нейтрализует эндогенные клеточные оксиданты. Гомогенат фильтруют и центрифугируют (1000-2000 оборотов в минуту на центрифуге К-70 в течении 3-4 минуты) для удаления разрушенных клеточных элементов и волокон фильтра.

Супернатант центрифугируют при 5500-6000 оборотов в минуту на центрифуге К-70 в течении 20 минут. На этом этапе в осадке получают интактные хлоропласты. Супернатант отбрасывают. Далее оболочку хлоропластов надо разорвать, поместив их в гипотоническую среду. Вода в этом случае будет поступать внутрь хлоропласта и разорвет его оболочку. Осадок хлоропластов ресуспендируют в гипотонической среде : 2 mMMES

(pH 6.3), 15 mMNaCl, 5 mMMgCl2.

Центрифугируют раствор при 5500-6000 оборотов в минуту на центрифуге К-70 в течении 20 минут. В осадке получают разрушенные хлоропласты. Супернатант отбрасывают. Ресуспендируем осадок кисточкой и затем в стеклянном гомогенизаторе в среде: 20 mM МES-NaOH (pH 6,3), 15 mMNaCl, 5 mMMgCl2 ,0,33 M сахароза.

Доводим объем раствора тилакоидов до концентрации хлорофилла 2 мг/мл. Определяем концентрацию хлорофилла и функциональную активность ФС-2 в полученных тилакоидах.

2. Выделение частиц ФС-2 из тилакоидов по методу schiller и dau (2005 г)

Осаждают тилакоиды из раствора на центрифуге (6000g, 20 мин) и ресуспендируют в среде с бетаином (25 мМ HEPES (pH 6,0), 15 мМ NaCl, 10 мМ MgCl2, 1 М глицин-бетаина) до концентрации ~ 2,2 мг/мл. Оставляют раствор тилакоидов в холодильнике в темноте на 1 ч.

Добавляют к суспензии тилакоидов (2 мг хл/мл) Тритон Х-100 к хлорофиллу 20:1(20мг Тритон Х-100/1 мг хлорофилла). Для того, чтобы не происходило образование локально высокой концентрации тритона, добавление раствора Тритона Х-100 производят по капле по стенке сосуда при перемешивании суспензии на магнитной мешалке.

Инкубируют раствор при 0 С в темноте на мешалке в течении 20 мин. Центрифугируют раствор на высокоскоростной центрифуге при 47900 g в течении 22 мин. Супернатант, содержащий ФС-1 отбрасывают, а осадок ресуспендируют в среде с бетаином и повторяем центрифугирование при 47900 g в течении 15 мин. Такой цикл проводят 4 раза. На этом этапе происходит отмывание препаратов ФС-2 от Тритона Х-100.

3. Измерениеконцентрациихлорофилла

Общее содержание хлорофиллов "a" и "b" определяли по методу (Arnon, 1949). К 0,05 мл исходной суспензии добавляли 0,95 мл воды и 4 мл 80%-ного ацетона, измеряли оптическую плотность вытяжки при 652 нм и рассчитывали содержание хлорофилла в исходном образце по формуле Схл(мг/мл) = (28,9 . А652. L . K)/1000, где А - оптическая плотность образца при 652 нм, L - длина оптического пути, K - коэффициент разбавления суспензии.

4.Измерение скорости фотосинтетического выделения кислорода

Скорость фотосинтетического выделения О2 измеряли амперометрическим методом с помощью электрода типа Кларка («Hansatech» Великобритания) в среде, содержавшей: 25 мМ MES-NaOH (pH 6,5), 10 мМ NaCl, 0.3 М сахарозу. Препараты освещали светом интенсивностью 1000 мкмолей фотонов/(м2·с1) (л?590 нм). Концентрация хлорофилла в ячейке во время измерений составляла 10 мкг/мл. Все измерения выполнялись при 25°С в присутствии 0,3 мМ 2,6-дихлоро-р-бензохинона и 1 мМ феррицианида калия (K3[Fe(CN)6]) как акцепторов электронов.

5. Измерение фотоиндуцированных изменений выхода флуоресценции хлорофилла

Измерениякинетики фотоиндуцированных изменений выхода флуоресценции хлорофилла (Ф) с >660 нм (связанных с фотовосстановлением первичного акцептора электрона ФС-2, пластохинона QA) проводили с помощью прибора XE-PAMFluorometer фирмы «WALZ» (Германия) в 10 мм кювете при 20oС. Действующий свет, который получали пропусканием белого света через фильтр BG-39 («Schott», Германия), подавался через световод на кварцевую кювету, помещенную в специальную камеру ED-101US/M (Wals, Германия);Измерения осуществляли в среде, содержащей: 50 мМ MES (рН 6,5), 10 мМ NaCl. Концентрация частиц ФС-2 по хлорофиллу составляла 10мкг/мл.

6. Получениеи очистка белковPsbP и PsbQ

Для экстракции гидрофильных белков PsbQ (18 кДа) и PsbP (24 кДа) субмембранные препараты ФС-2 (конечная концентрация по хлорофиллу 0,5 мг/мл) обрабатывали 1 М NaCl в течение 30 минут при 4єC и комнатном освещении (MiyaoandMurata, 1983). Раствор белков, полученный после обработки обессаливали с помощью диализа против 20 мМ Tris-HCl-буфера, (рН 7,5), содержащего 10 мМ NaCl и 2 мМ ЭДТА.

Разделение смеси белков PsbQ и PsbP проводили с помощью ионообменной хроматографии с использованием системы ActaFPLC на колонке MonoQ («AmershamBiosciences», Швеция) (Calderoneetal., 2003). Белок PsbQ элюировали с колонки в течение 15 минут. Белок PsbР элюировали в градиенте NaCl от 0 до 500 мМ (время элюции 30 минут, выход белка наблюдался при 170 мМ NaCl).

7.Приготовление диализных трубок

1. Отрезать трубку необходимой длинны

2. Смочить и вымачивать 30 минут в большом избытке 10 мМ бикарбоната натрия

3. Вымачивать трубки 30 минут в большом избытке 10 мМ ЭДТА

4. Несколько раз сполоснуть дистиллированной водой

8. Электрофорез

Способ разделения смеси белков на фракции или индивидуальные белки. Наиболее распространенным вариантом электрофоретического анализа белков, является электрофорез белков в полиакриламидном геле (ПААГ) по Лэммли. (Остерман, 1981).

Анализ растворов отдельных белков после их очистки с помощью ионообменной хроматографии и трихлоруксусной кислоты проводили с помощью электрофореза в денатурирующих условиях в 12,5%-ном (м/о) ПААГ. (Laemmli, 1970) Образцы растворяли в 50 мМ Tris-HCl-буфере (рН 6,8), содержащем 8 М мочевину, 5% меркаптоэтанола, 3% додецилсульфата натрия, 10% сахарозы, 0,005%-ный бромфенолового синего, и нагревали в течение 1 минуты при 99оС. После электрофореза полипептиды в геле фиксировали и окрашивали по методике, описанной ранее (D. Kang, 2002), с использованием кумасси G-250.

В качестве маркеров использовали смесь белковых стандартов («Sigma», США). фотосинтетический растение эмбриофит белок

1) Окраска SDS - PAGE по методу D. Kang с соавт. (2002 г.) с помощью кумасси - G - 250.

Окраска ведется в течении двух часов в свежеприготовленном растворе.

1.1.) Фиксация белков в геле - 30 минут

Фиксирующий раствор :

30% этилового спирта

2% H3PO4

На 336 мл раствора:

122, 414 мл - 96% этанол

210, 520 мл - Н2О дист.

3 мл - 85% H3PO4

1.2.) Окраска - два часа ( на качалке или оставить на ночь без перемешивания)

Раствор для окраски:

0, 02% кумасси G - 250

2% H3PO4

5% Al2(SO4)3

10% эанол

Растворы рассчитаны на 250 мл конечного объёма

Готовят два раствора -

1.2.1.) Кумасси в спирте (раствор А)

25 мл этилового спирта

0,05 г кумасси G - 250

1.2.2.) Соль и кислота в воде (раствор Б)

3, 48 мл - H3PO4 85%

24, 34 г - Al2(SO4)3 * 18 H2O

H2Oдо 225 мл

Раствор профильтровать. После фиксации гель инкубируют некоторое время в растворе Б, а затем добавляют раствор А и перемешивают.

На окрашивание (одного или двух гелей) необходимо взять 45 мл раствора Б и 5 мл раствора А.

2.) Расчеты для электрофореза (табл. 1)

Табл. 1. SDS электрофорез в ПААГ по Laemmli

4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ ХЛОРОФИЛЛА

BBY-препараты ФС-2 были получены по методу (RobinsonandYokum, 1980; Bertholdetal., 1981; FordandEvans, 1983). Определение концентрация хлорофилла в выделенных препаратах проводили при помощи спектрофотометрического метода, описанного в «Объектах и методах исследований».

На спектрофотометре (ShimadzuUV-1800)измеряется оптическая плотность (А) раствора при определенной длине волны 654 нм(данные приведены в табл.2).

Из значений таблицы 3 вычислили среднее значение концентрации хлорофилла 2,628 мг/мл, которое затем использовали при определении количеств препаратов, необходимых для измерения фотосинтетической активности и вычислении объёмов сред для обработки препаратов ФС-2 с целью получения фракции белков PsbP и PsbQ.

Измерение скорости выделения кислорода

Скорость выделения кислорода является наиболее достоверным показателем функциональной активности ФС-2. Измерение проводили при рН 6.5. Концентрациюхлорофилла доводили до 10 мкг/мл. Скорость фотосинтетического выделения кислорода была рассчитана исходя из данныхграфика(рис.6).

Вычисление скорости выделения О2 за 1 час по формуле: V(О2) = ДU*K*60мин/СХл, где ДU- значение изменения вольтажа за 1 минуту, K- калибровочный коэффициент(мкМО2/мл*мин*В), СХл- концентрация хлорофилла(мг/мл). Значение калибровочного коэффициентавычисляется по специальному калибровочному графику (рис.7). Его значение равно665, 79 мкМО2/ мл*мин*В. За тем по графику (рис.6) нашли изменение напряжения (В) за 1 минуту после включения света (начальная скорость на прямолинейном участке).

Рис. 6. График фотосинтетического выделения кислорода ФС-2. Стрелкой вверх показан момент включения света. Стрелка вниз - момент выключения света.

Скорость выделения кислорода составила 344,7 ± 12 мкМО2/ ч *мг/мл

Для этого метода получения BBYмаксимальное значение для выделения кислорода показано порядка 600 мкМО2/ч*мг/мл, а среднее значение колеблется в пределах от 300 до 450 мкМО2/ч*мг/мл. Полученные нами данные свидетельствуют о достаточно хорошей функциональной активности ФС-2.

Рис. 7. Калибровочнаякривая для расчета скорости выделения кислорода

4.1 Измерение флуоресценции ФС-2

Ещё одним из наиболее достоверных методов определения функциональной активности ФС-2 является метод измерения флуоресценции. Пигменты фотосинтетического аппарата поглощают энергию света, часть высвечивается обратно в виде флуоресценции или рассеивается в виде тепла. При комнатной температуре в спектре флуоресценции наблюдается преимущественно полоса при 685 нм, принадлежащая антенному хлорофиллу а ФС-2. (Кизимирко Ю. В., 2006)

Молекула П680, входящая в состав реакционного центра ФС-2, в возбужденном состоянии является первичным донором электрона для акцептора Qa. Реакционный центр находится в открытом состоянии, когда молекула П680 окислена, а хиноновый акцептор Qa восстановлен. После появления первичной пары П680+Фео- происходит восстановление П680+ от вторичных доноров. В результате РЦ оказывается состоянии П680Qa, называемое закрытым (Goh, Schreiber, Hedrich et al., 1999; Renger, 1992). Эти состояния характеризуются разным выходом флуоресценции (в закрытом состоянии флуоресценция максимальна, а в открытом - минимальна).

Разность между максимальным и минимальным выходом флуоресценции называется переменной флуоресценцией. Было установлено, что под действием света происходит восстановление первичного акцептора QA и выход флуоресценции возрастает от начального уровня (Fo) до максимального уровня (Fm), т.е. возникает так называемая переменная флуоресценция (Fv = Fm -- Fo).Эта величина пропорциональна той части энергии света, которая используется в фотохимических реакциях фотосинтеза при открытых реакционных центрах ФС-2 и теряется в виде флуоресценции и тепла при закрытых реакционных центрах. Для расчета данных, полученных в ходе измерения следует брать одно из важнейших соотношений Fv/Fm, т.е. отношение интенсивностей переменной и максимальной флуоресценции. (Ланкин А.В. с соавт., 2014) Это отношение равно квантовому выходу использования энергии света открытыми РЦ ФС-2. По изменению этой величины можно судить о потенциальной эффективности первичных процессов фотосинтеза в ФС-2. Этот параметр флуоресценции, как показатель состояния и эффективности функционирования фотосинтетического аппарата, широко используется в фундаментальных и прикладных исследованиях. (Antalandal., 1998), (G. H. Krause, E. Weis, 1991).

Измерение флуоресценции проводилось для препаратов изначально адаптированных к темноте. Расчеты были проведены исходя из данных графика флуоресценции (рис.8).

Рис. 8. График флуоресценции ФС-2.

Fm- максимальный квантовый выход флуоресценции;

Fv- зачение переменной флуоресценции;

Fo- начальный уровень флуоресценции;

Отношение интенсивностей переменной и максимальной флуоресценции составило 0,744. Из других источников известно, что максимальный квантовый выход у листа растения составлял 0,83.(Лукаткин А. С. с соавт., 2009). Таким образом, полученные нами BBY частицы обладают довольно высоким показателем максимального квантового выхода фотохимии ФС-2и этот показатель, в совокупности с данными о фотосинтетическом выделении кислорода этим препаратом, свидетельствует о хорошей функциональной активности образца, достаточной для дальнейшей процедуры выделения белков PsbP и PsbQ.

4.2 Электрофорез

Ещё одним методом, позволяющем судить о целостности препаратов является денатурирующий электрофорез. Электрофорез проводили в полиакриламидном геле для идентификации ФС-2. (рис.9). Результаты электрофореза свидетельствуют о наличии в препаратах ФС-2 всех необходимых нам для дальнейшей работы белков.

Исходя из экспериментальных данных о фотохимической активности и электрофореза можно судить о функциональной активности субмембранных препаратов ФС-2 и её целостности, позволяющей проводить с этими препаратами дальнейшие обработки.

Получение и очистка белковРsbР и РsbQ

NaCl обработка

Субмембранные препараты ФС-2 обрабатывали 1М раствором NaCl для экстракции гидрофильных белков PsbP (18 кДа) и PsbQ (24 кДа) при температуре +4оС при комнатном освещении в течение 30 минут. ссылка на статью

Диализ

Обессоливание белков проводилось методом диализа в присутствии 20 мМ HEPES-KOH-буфера (рН 7,5), содержащего 10 мМ NaCl и 2 мМ ЭДТА. ЭДТА использовалось в качестве комлексообразователя, то есть препараты таким образом были избавлены от металлов.

Разделение белков методом ионнообменной хромотографии

Ионообменная хроматография позволяет разделять молекулы, основываясь на ионных взаимодействиях. Чаще всего ионообменная хроматография является первым шагом к дальнейшей очистке белков.

Для разделения белков использовалась анионная ионообменная хроматография. Она характеризуется неподвижной фазой с положительно заряженными функциональными группами и задержкой отрицательно заряженных анионов.

Изначально система хроматографа (ActaFPLCc колонкойMonoQ) промывается этиловым спиртом и деионизованной водой. Разделение смеси белков PsbQ и PsbP проводилось в присутствии буфера HEPES (рН 7.5). Cкорость нанесения белка на колонку выбиралась в зависимости от давления и варьировала от 0,2 до 0,5 мл/мин.

После нанесения белковой смеси на колонку наблюдалось возрастание показателя поглощения в ультрафиолетовой области, что свидетельствовало о выходе белка из колонки(рис.10). Длина волны при поглощении в УФ области составляет 280 нм. Первым из колонки выходил белок PsbQ (он был собран во фракцию, обозначенную номером 1). Его выход был связан с тем, что он имеет изoэлектрическую точку (рI) равную 8.3, а белок PsbР - 6.5. Общий заряд белка определяется величиной рН. Если значение pH ниже изоэлектрической точки - заряд белковой молекулы является положительным, при pH выше - отрицательный. Таким образом при рН 7,5, белок РsbQ (заряженный положительно) выходит из колонки, а PsbР (заряженный отрицательно) задерживается на ней. Белок PsbР элюировали в градиенте NaCl от 0 до 500 мМ (время элюации 58 минут, выход белка наблюдался при 165-260 мМ NaCl). По мере элюции выходящий раствор собирали в различные фракции. Исходя из данных поглощения в ультрафиолетовой области, белки предположительно должны содержаться во фракциях 1, 6, 7 и 11. Эти фракции взяли для анализа на содержание белков. Для этого использовали электрофорез в денатурирующих условиях. Так как ряд фракций содержал высокую концентрацию NaCl, которая мешает проведению электрофореза, белки предварительно осадили с помощью трихлоруксусной кислоты (надосадочную жидкость с высоким содержанием соли слили), а затем перевели осадок в буфер для нанесения образцов для электрофореза.

Электрофорез

Электрофорез проводился в 12,5% ПААГ (рис.9). Растворы для нанесения на гель готовились по табл. 4. Ячейки геля заполнялись в соответствии со схемой (табл. 5).

Табл. 4. Растворы для нанесения на гель

Экспериментов по разделению белков было два, и нам удалось собрать фракцию 1 дважды. В таблицах отражены обе фракции под номерами 1.14 и 1.19 (номера после точки соответствуют дате выделения).

Табл. 5.Схема заполнения геля

Рис. 9. Электрофорез в ПААГ

1) Буфер для нанесения (контроль)

2) МаркерыAmershamECLRainbow - FullRange (Рис.11)концентрация белка приблизительно 2 мг / мл, спектр определения молекулярной массы 12-225 кДа.

3) BBY - препараты ФС-2 (описание в разделе "Получение и характеристика препаратов ФС-2")

4) ФР6 - Обнаружен белок PsbP с молекулярной массой 23 кДа

5) ФР7 - Белка не обнаружено

6) ФР11 - примеси белков

7,8) ФР 1.14 и 1.19 - Обнаружен белок PsbQ (17 кДа) c примесями других белков.

9) Препараты ФС-2 после NaCl-обработки

10) МаркерыFermentasPagerulerUnstainedProteinLadder (рис. 11)Спектр определения белка от 10 кДа до 200 кДa

Рис. 11. Маркеры Amersham ECL Rainbow - Full Range (слева), маркерыPageRuler Unstained Protein Ladder (справа)

Из результатов электрофореза видно (рис. 9; полосы геля 3 и 9), что нам удалось полностью удалить белки PsbP и PsbQ из препаратов ФС-2 с помощью обработки NaCl. Кроме того, нам удалось отделить белки PsbP и PsbQ друг от друга при помощи ионообменной хроматографии (рис. 9 полосы геля 4, 7 и 8). Таким образом, полученные фракции белков можно использовать для исследования их карбоангидразоподобной активности. К сожалению, фракции изолированных белков PsbP и PsbQ содержат примеси: во фракции белка PsbP по-видимому присутствует белок PsbS; а фракция белка PsbQ содержит некоторые белки ССК-2.Для дальнейшей идентификации примесных белков необходимы другие методы и подходы, но это не входило в цели данной работы. Кроме того, известно, что белки ССК-2 не обладают карбоангидразной активностью (Шитов с соавт., 2009) и, следовательно, не могут помешать исследованию карбоангидразоподобной активности белка PsbQ.

Итак, нам удалось разделить белки PsbP и PsbQ и мы могли производить на них по отдельности дальнейшие исследования.

4.3 Определение концентрации белка по методу Брэдфорд

Рис.12. Калибровочная кривая

Табл.7.Конечная концентрация белка во фракциях

4.4 Измерение карбоангидразоподобной активности белков PsbP и PsbQ

Как было сказано выше, КА-активность внешних белков ВОК (PsbP, PsbOи PsbQ) не подавлялась ингибиторами карбоангидраз и поэтому активность обозначили как карбоангидразоподобную (КП-активность).

Исходя из данных концентрации белка, полученных при помощи метода Брэдфорд рассчитываем количество образца для измерения карбоангидразной активности (табл. 8 и 9).

Измерение КП-активности для белка РsbР проводим по схеме описанной в табл.8, для белка РsbQ - в табл. 9. Также измеряем КА-активность для ФС-2, чтобы сравнить её с активностью белков. Результаты измерения КП-активности отражены на рис.13.

Табл. 8. Схема измерения КП-активности белка PsbP

	Вероналовый буфер, мкл	HEPES (рН 7.5), мкл	PsbP, мкл	Раствор ионов металла (200 мкМ), мкл	Деионизованная вода, насыщенная СО2, мкл
1	1472,8	27,2			750
2	1472,8		27,2
3	1450,3		27,2	22,5 (MnSO4)
4	1450,3		27,2	22,5 (ZnSO4)
6	1472,8	27,2
7	1450,3		27,2	22,5 (MgSO4) ...

Страница:

•  1 
•  2 

дипломная работа "Влияние ионов металлов на карбоангидразоподобную активность внешних водорастворимых белков PsbP и PsbQ фотосистемы 2" скачать

Подобные документы

• Влияние ионов металлов на карбоангидразоподобную активность внешних водорастворимых белков PsbP и PsbQ фотосистемы 2

  Строение и функционирование фотосинтетического аппарата высших растений. Измерение концентрации хлорофилла, скорости фотосинтетического выделения кислорода, фотоиндуцированных изменений выхода флуоресценции хлорофилла. Приготовление диализных трубок.
  
  дипломная работа [2,4 M], добавлен 02.08.2015
  

• Влияние гипотермии на содержание белков в тканях растений

  Определение влияния гипотермии на содержание водорастворимых белков в тканях высших растений, бактерий и водорослей. Применение электрофореза для разделения растительных белков. Влияние развития морозоустойчивости на синтез белков, изменение экспрессии.
  
  реферат [22,1 K], добавлен 11.08.2009
  

• Транспорт и распределение тяжелых металлов и поливалентных катионов в высших растениях

  Причины токсичности тяжелых металлов и поливалентных катионов. Строение высшего растения, особенности корневой системы и надземной части растений. Роль различных тканей растения в транспорте и распределении тяжелых металлов и поливалентных катионов.
  
  курсовая работа [2,1 M], добавлен 27.05.2012
  

• Влияние тяжелых металлов на растения

  Влияние основных тяжелых металлов на растения: кобальт; молибден; никель; марганец; медь; цинк. Химические элементы, которые, входя в состав организмов растений, животных и человека, принимают участие в процессах обмена веществ.
  
  курсовая работа [502,2 K], добавлен 25.05.2004
  

• Влияние кортизола на обмен белка

  История открытия и изучения белков. Строение молекулы белка, ее пространственная организация и свойства, роль в строении и жизнеобеспечении клетки. Совокупность реакций биологического синтеза. Всасывание аминокислот. Влияние кортизола на обмен белка.
  
  контрольная работа [471,6 K], добавлен 28.04.2014
  

• Свойства и роль в биохимических процессах аминокислот, входящих в состав белковых молекул

  Аминокислоты – это класс органических соединений, содержащих одновременно карбоксильные и аминогруппы. Свойства аминокисллот. Роль в структуре и свойствах белков. Роль в метаболизме (заменимая незаменимая).
  
  реферат [7,4 K], добавлен 17.10.2004
  

• Участие митохондриального АТФ-ингибируемого калиевого канала в адаптации животного к гипоксическому состоянию

  Системы транспорта ионов калия в митохондриях. Структура митохондриального АТФ-зависимого калиевого канала. Экстрагирование белков из митопластов. Определение проводимости бислойных липидных мембран. Выделение белка с молекулярной массой.
  
  дипломная работа [516,3 K], добавлен 15.12.2008
  

• Ионный канал. Проводимость и проницаемость

  Основные факторы, влияющие на степень проводимости и проницаемости ионного канала, значение концентрации ионов калия в данном процессе. Метод определения потенциала, необходимого для уравновешивания эффекта реальной разницы концентраций ионов калия.
  
  реферат [46,7 K], добавлен 24.10.2009
  

• Классификация высших растений

  Отделы моховидных, плауновидных, хвощевидных, голосеменных и покрытосеменных. Эволюция высших растений, их морфологические и биологические особенности, распространение. Развитие специализированных тканей как важное условие для выхода растений на сушу.
  
  презентация [2,3 M], добавлен 25.10.2010
  

• Макроэлементы. Ферменты. Гликолиз

  Биологическая роль ионов натрия и калия в процессе сокращения мышц и в поддержании водного баланса организма. Влияние температуры, активаторов и ингибиторов на активность ферментов. Фаза суперкомпенсации веществ, основные причины ее возникновения.
  
  контрольная работа [95,1 K], добавлен 25.11.2014
  

• Белковый баланс организма

  История исследования белков. Белки: строение, классификация, обмен. Биосинтез белка. Функции белков в организме. Роль в жизнедеятельности организма. Высокомолекулярные органические соединения. Болезни, связанные с нарушением выработки ферментов.
  
  реферат [29,2 K], добавлен 05.10.2006
  

• Мембранные потенциалы и их ионная природа

  Уравнение электродиффузии ионов через мембрану в приближении однородного поля. Потенциал Гольдмана - Ходжкина и уравнение Нернста. Сальтаторный способ проведения нервного импульса. Влияние диффузии ионов калия, натрия, хлора на мембранный потенциал.
  
  реферат [93,9 K], добавлен 25.02.2011
  

• Элементы физиологии клетки

  Структурная матрица мембраны. Углеводы клеточных мембран. Мембранные белки как переносчики ионов. Содержание ионов в интерстиции и цитозоле. Условия и причины существования потенциала покоя. Функциональная модель натриевого потенциалзависимого канала.
  
  реферат [31,1 K], добавлен 19.11.2008
  

• Получение белка пищевого и кормового назначения при помощи высших базидиомицетов

  История получения белка с помощью микроорганизмов. использование высших базидиальных грибов для получения белка кормового, пищевого назначения. Получение белка путем глубинного культивирования на питательных средах. Сохранение и усиление грибного аромата.
  
  реферат [28,9 K], добавлен 13.03.2019
  

• Фотодинамический эффект и фотодинамическая терапия

  Клиническое применение фотодинамической терапии. Механизм действия фотосенсибилизаторов на клеточном уровне. Роль митохондрий и ионов кальция в фотодинамически индуцированном апоптозе. Участие сигнальных процессов и защитных белков в реакциях клеток.
  
  контрольная работа [1,1 M], добавлен 19.08.2015
  

• Морфология и анатомия высших растений

  Физиологически активные вещества растительной клетки. Элементы, получаемые растением из почвы через корневую систему, их роль в жизни растений. Морфологическое строение побега, расположение листьев. Элементы древесины и луба голосеменных растений.
  
  контрольная работа [665,7 K], добавлен 13.03.2019
  

• Общая характеристика рецепторов растений

  Рецепторные системы растений и животных. Становление и функционирование системы восприятия света фотосистемами. Включение энергии фотона в процессы фотосинтеза. Основные химические формулы хлорофилла. Защитная фотопротекторная функция каротиноидов.
  
  реферат [26,1 K], добавлен 17.08.2015
  

• Разделение белков по размерам с использованием DDC-Na

  Электрофоретическая подвижность белка, влияющие факторов и условия электрофореза. Сущность метода полного разделения сложной смеси белков. Извлечение белков из геля после электрофореза. Гели агарозы и их применения. Влияние вторичной структуры ДНК.
  
  реферат [37,9 K], добавлен 11.12.2009
  

• Особенности накопления флаванов в клетках высших растений (на примере культуры ткани Camellia sinensis L.)

  Флаваны в высших растениях: структура, основные представители, локализация, функциональная роль. Морфофизиологические и биохимические характеристики клеточных и каллусных культур чайных растений. Определение содержания флаванов и проантоцианидинов.
  
  дипломная работа [2,4 M], добавлен 02.02.2018
  

• Резистентность мембран эритроцитов при действии 1,1-диметилгидразина, тяжелых металлов и биологически активных веществ

  Изучение изолированного и сочетанного действия 1,1-диметилгидразина и ионов свинца и ртути на состояние мембран эритроцитов. Возможности повышения резистентности мембран с помощью биологически активных веществ (витаминов С, Е и препарата "Селевит").
  
  диссертация [2,8 M], добавлен 25.10.2013
  

Другие документы, подобные "Влияние ионов металлов на карбоангидразоподобную активность внешних водорастворимых белков PsbP и PsbQ фотосистемы 2"

• главная
• рубрики
• по алфавиту
• вернуться в начало страницы
• вернуться к началу текста
• вернуться к подобным работам