Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ПРОБЛЕМ КРІОБІОЛОГІЇ І КРІОМЕДИЦИНИ

УДК: 57.043.085.2:577.12

03.00.19 - кріобіологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

ЕНЕРГЕТИЧНИЙ ТА ПРООКСИДАНТНО-АНТИОКСИДАНТНИЙ СТАН ПЕЧІНКИ ЩУРІВ ПІСЛЯ ГІПОТЕРМІЧНОГО ЗБЕРІГАННЯ ТА РЕПЕРФУЗІЇ

ТКАЧОВА ОЛЕНА МИКОЛАЇВНА

Харків - 2008

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України

Науковий керівник:

доктор біологічних наук, професор Петренко Олександр Юрійович, Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, завідувач відділу кріобіохімії, м. Харків

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, професор Субота Ніна Павлівна, Харківський національний педагогічний університет ім. Г.С. Сковороди, завідувач кафедри валеології, м. Харків

доктор біологічних наук, професор Перський Євген Ефроїмович, Харківський національний університет ім. В.Н. Каразіна, завідувач кафедри біохімії, м. Харків

Захист дисертації відбудеться 20.05. 2008 р. о 13-30 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.242.01 в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України за адресою 61015, Харків-15, вул. Переяславська, 23

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, за адресою: 61015, Харків-15, вул. Переяславська, 23

Автореферат розісланий 16.04. 2008 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, член-кореспондент НАН України Гольцев А.М.

Анотації

Ткачова О.М. "Енергетичний та прооксидантно-антиоксидантний стан печінки щурів при гіпотермічному зберіганні та реперфузії." - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.19 - кріобіологія. - Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, Харків, 2008.

Дисертаційна робота присвячена проблемі підвищення ступеня збереженості ізольованої печінки щурів під час гіпотермічного зберігання (ГЗ) та наступної нормотермічної реперфузії (НР) шляхом підтримки енергетичного метаболізму та прооксидантно-антиоксидантного статусу за допомогою попередньої обробки тварин цитозолем фетальних тканин (ЦФТ) та модифікації консервуючого розчину.

Встановлено, що попереднє уведення тваринам ЦФТ запобігає зниженню вмісту АТФ і стимулює обмін вуглеводів у цитоплазмі клітин печінки, що проявляється у накопиченні субстратів і збільшенні швидкості їх окислення у дихальному ланцюзі мітохондрій після ГЗ органа. Показано, що модифікація сахарозо-вміщуючого розчину шляхом заміни альбуміну на ПЕГ-8000 дозволяє тією ж мірою зберігати енергетичний і прооксидантно-антиоксидантний стан печінки щурів при ГЗ/НР, а заміна трис-HCl буфера на фосфатний не впливає на збереженість органа. Зворотне роз'єднання окислювального фосфорилювання при ГЗ ізольованої печінки щурів за рахунок уведення до складу консервуючого розчину 2,4-динітрофенолу (ДНФ) запобігає порушенню прооксидантно-антиоксидантного стану печінки, що дозволяє зберегти рівень АТФ при НР. Комбіноване використання попередньої обробки тварин ЦФТ і доповнення консервуючого розчину ДНФ призводить до адитивного ефекту, який проявляється у нормалізації прооксидантно-антиоксидантної рівноваги та поліпшенні показників енергетичного стану печінки після ГЗ/НР.

Ключові слова: гіпотермічне зберігання, нормотермічна реперфузія, енергетичний стан, прооксидантно-антиоксидантний баланс, цитозоль фетальних тканин, динітрофенол, ПЕГ-8000.

Ткачёва Е.Н. "Энергетическое и прооксидантно-антиоксидантное состояние печени крыс при гипотермическом хранении и последующей реперфузии." - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.19 - криобиология. - Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, Харьков, 2008.

Диссертационная работа посвящена проблеме, касающейся повышения степени сохранности изолированной печени крыс при гипотермическом хранении (ГХ) и последующей нормотермической реперфузии (НР) путем поддержания энергетического метаболизма и прооксидантно-антиоксидантного статуса при помощи предварительной обработки животных in vivo цитозолем фетальных тканей и модификации консервирующего раствора. антиоксидантний метаболізм гіпотермічний

В результате проведения экспериментальных исследований установлено, что предварительное введение животным цитозоля фетальных тканей (ЦФТ) вызывает повышение скорости окисления сукцината митохондриями в состоянии 3 и 4 и предотвращает снижение уровня АТФ в печени после краткосрочного, в течение 1 ч, ГХ органа. Данный эффект реализуется, в частности, благодаря стимуляции обмена углеводов в цитоплазме клеток печени, а именно, активации гликолиза и негликолитических редокс-ферментов, а также вследствие повышения активности малатдегидрогеназы и глицеролкиназы, принимающих участие в переносе восстановительных эквивалентов в митохондрии. Выявленное в работе действие ЦФТ на метаболизм углеводов и энергетическое состояние может быть использовано при разработке новых методов ГХ органов.

Показано, что модификация сахарозо-содержащего раствора путем замены бычьего сывороточного альбумина на ПЭГ-8000 позволяет в той же степени сохранять энергетическое и прооксидантно-антиоксидантное состояние печени крыс как при краткосрочном (1 ч), так и долгосрочном (18 ч) ГХ и последующей НР, при этом замена трис-HCl буфера на фосфатный не влияет на степень сохранности органа. Данные результаты могут являться обоснованием для использования ПЭГ-8000 в качестве компонента консервирующих сред.

Установлено, что обратимое разобщение окислительного фосфорилирования при ГХ изолированной печени крыс за счёт введения в состав раствора хранения 2,4-динитрофенола (ДНФ) в значительной степени снижает базальный уровень ТБК-активных продуктов, а также предотвращает угнетение системы антиоксидантной защиты в клетках печени путем повышения активности каталазы и глутатиопероксидазы. После НР положительный эффект ДНФ в отношении прооксидантно-антиоксидантной системы сохраняется, при этом дополнительно наблюдается снижение ионной проницаемости внутренней мембраны митохондрий (скорости дыхания в состоянии 4), что позволяет сохранить уровень АТФ в печени. Выявленное предотвращение нарушения энергетического и прооксидантно-антиоксидантного состояния в условиях дополнения консервирующего раствора разобщителем окислительного фосфорилирования может служить предпосылкой для исследования влияния соединений с аналогичным механизмом действия при патологиях печени, в развитии которых участвуют свободнорадикальные процессы.

При сочетании предварительной обработки животных in vivo ЦФТ и дополнения консервирующего раствора ДНФ наблюдается аддитивный эффект, который проявляется в улучшении прооксидантно-антиоксидантного состояния печени, а именно, в дополнительном снижении базального уровня ТБК-активных продуктов и значительном повышении содержания восстановленного глутатиона, а также в улучшении показателей энергетического обмена в органе после 18 ч ГХ и последующей реперфузии.

Ключевые слова: гипотермическое хранение, нормотермическая реперфузия, энергетическое состояние, прооксидантно-антиоксидантный баланс, цитозоль фетальных тканей, динитрофенол, ПЭГ-8000.

Tkachova O.M. "Rat liver energy and prooxidant-antioxidant state under hypothermic storage and following reperfusion." - Manuscript.

The dissertation for the candidate of biological sciences degree (PhD equivalent) in specialty 03.00.19 - cryobiology. - Institute for problems of cryobiology and cryomedicine of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, 2008.

The thesis is dedicated to the problem of liver hypothermic storage (HS). The aim of the study was to improve the preservation protocol using in vivo pretreatment of animals with biological active substances and modification of the preservation solution.

It was shown that animal pretreatment with fetal tissue cytosol (FTC) sustained ATP level in liver and stimulated the carbohydrates turnover in cytoplasm. It resulted in substrate accumulation and increase in mitochondrial respiratory rates after liver HS. This work demonstrates that FTC pretreatment is a promising approach for organ preservation.

Substitution of albumin for PEG-8000 and tris-HCl buffer for phosphate buffer had equally protective effect on the energetic and prooxidant-antioxidant state during liver HS and normothermic reperfusion (NR). Thus PEG-8000 and phosphate buffer may be recommended as alternative compounds of preservation media. It was established that reversible uncoupling of oxidative phosphorylation caused by DNP presence in the preservation solution decreased TBAR-product formation and delayed impairment of antioxidant defense system. This was accompanied by ATP level maintenance during HS and subsequent NR.

Combination of animal pretreatment with FTC and supplementation of preservation solution with DNP had additive effect.

Key words: hypothermic storage, normothermic reperfusion, energetic state, prooxidant-antioxidant balance, fetal tissue cytosol, uncoupling of oxidative-phosphorylation, PEG-8000.

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Наразі гіпотермія є головним способом зберігання печінки з метою її подальшої трансплантації (Padbury R. T. et al., 1994; Porte R. J. et al., 1998). У процесі гіпотермічного зберігання (ГЗ) в органі відбуваються різні метаболічні порушення, котрі виявляються не стільки безпосередньо після зберігання, скільки після наступної трансплантації або реперфузії, що її моделює (Taniagawa K. et al., 2000). Головним шляхом вирішення проблеми ішемічно-реперфузійних ушкоджень печінки є розробка нових і вдосконалення існуючих консервуючих розчинів. На цей час найбільш поширеним та ефективним є середовище Університету Вісконсин (UW), використання якого дозволило значно збільшити термін безпечної консервації печінки та досягти найбільш високого рівня виживаності реципієнтів (Jamieson N. V. et al., 1988). Однак, незважаючи на високу ефективність сучасних розчинів, безпечна межа холодової ішемії печінки не перевищує 10 - 16 годин (Padbury R. T. et al., 1994). У нашій лабораторії був розроблений сахарозо-вміщуючий розчин (СВР), який достатньою мірою підтримував життєздатність і морфофункціональні властивості ізольованих гепатоцитів у процесі ГЗ протягом 3 діб (Kravchenko L. P. et al., 2001). Дослідження енергетичного стану печінки при ГЗ у СВР дозволили зробити висновок про те, що він за своєю ефективністю не поступається розчину UW (Сомов А.Ю., 2005). Це свідчить про перспективність застосування СВР у трансплантології. Разом із тим, обмеження терміну зберігання органа потребує вдосконалення композиційного складу розчинів для ГЗ печінки і залишається актуальною проблемою кріобіології.

Енергетичний метаболізм характеризується високою чутливістю до пошкоджуючої дії охолодження та гіпоксії. У той же час, при різкому підвищенні мембранного потенціалу, в мітохондріях утворюються активні форми кисню (АФК), здатні пошкоджувати клітини при різних патологічних станах і, зокрема, в ході постішемічної нормотермічної реперфузії (НР) (Скулачёв В. П., 1999; Ohkohchi N. et al., 1999). Можна припустити, що зворотне роз'єднання окислювального фосфорилювання при ішемії зменшить утворення АФК в мітохондріях, що, у свою чергу, позитивно впливатиме на їхній функціональний стан при реоксигенації. Проте досліджень впливу роз'єднувачів окислювального фосфорилювання на енергетичний і прооксидантно-антиоксидантний стан ізольованої печінки щурів при ГЗ і реперфузії дотепер не проводилось.

Разом із удосконаленням композиційного складу консервуючих розчинів, протягом останніх десятиріч сформувався новий підхід, спрямований на збільшення термінів зберігання органів. Суть такого підходу полягає у підвищенні стійкості органів і тканин до пошкоджуючої дії ГЗ шляхом попередньої підготовки організму донора за допомогою біологічно активних речовин. Багатим джерелом таких речовин є фетальні тканини (Sewerynek E. et al., 1996; Yoshidome H. et al., 1999; Ke B. et al., 2003). У нашій лабораторії встановлено, що попереднє уведення тваринам цитозоля фетальних тканин (ЦФТ) попереджає пошкодження печінки та нормалізує прооксидантно-антиоксидантну рівновагу при ії ГЗ та НР (Cherkashina D. V. et al., 2005). Проте досліджень впливу попереднього уведення тваринам ЦФТ на енергетичний метаболізм і функціональний стан мітохондрій дотепер не проводилось.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана у відділі кріобіохімії у рамках планових тем НДР ІПКіК НАН України: № 7 "Вивчення морфофункціональних особливостей регіональних стовбурових клітин ембріонів, їхньої кріочутливості та механізмів реалізації біологічної активності в умовах культивування і на моделях деяких патологічних станів", № ДР 0102U002026; № 19 "Біорегулятори стовбурових клітин", № ДР 0104U006440; а також за підтримки гранта "Wellcome Trust" № 069472 (UK).

Мета і задачі дослідження: Мета роботи - оцінити особливості енергетичного та прооксидантно-антиоксидантного стану ізольованої печінки щурів при гіпотермічному зберіганні та нормотермічній реперфузії за умов попереднього уведення тваринам цитозоля фетальних тканин і модифікації консервуючого розчину.

Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити наступні задачі:

1. Вивчити вплив попередньої обробки тварин цитозолем фетальних тканин на рівень АТФ, дихальну активність ізольованих мітохондрій і активність ферментів, які беруть участь в обміні відновлювальних еквівалентів при гіпотермічному зберіганні ізольованої печінки щурів.

2. Оцінити вплив високомолекулярного поліетиленгліколю (ПЕГ-8000) у складі сахарозо-вміщуючого розчину на енергетичний і прооксидантно-антиоксидантний стан ізольованої печінки щурів при гіпотермічному зберіганні та нормотермічній реперфузії.

3. Вивчити вплив роз'єднувача окислювального фосфорилювання 2,4-динітрофенолу (ДНФ) у складі консервуючого середовища на енергетичний і прооксидантно-антиоксидантний стан ізольованої печінки щурів при гіпотермічному зберіганні та нормотермічній реперфузії.

4. Вивчити комбіновану дію попередньої обробки тварин цитозолем фетальних тканин і внесення до модифікованого середовища роз'єднувача окислювального фосфорилювання 2,4-динітрофенолу на енергетичний та прооксидантно-антиоксидантний стан ізольованої печінки щурів після гіпотермічного зберігання та нормотермічної реперфузії.

Об'єкт дослідження. Енергетичний і прооксидантно-антиоксидантний стан ізольованої печінки щурів після гіпотермічного зберігання у розчинах різного складу, а також за умов попередньої обробки.

Предмет дослідження. Вплив окремої та комбінованої дії попередньої обробки цитозолем фетальних тканин і модифікації консервуючого розчину на енергетичний і прооксидантно-антиоксидантний стан ізольованої печінки щурів при гіпотермічному зберіганні та реперфузії.

Методи дослідження. Для вирішення поставлених задач у роботі використовувалися такі методи: полярографічний - для дослідження дихальної активності ізольованих мітохондрій; спектрофлуориметричний - для визначення ступеня відновлення АlamarВlueTM у гомогенатах і постмітохондріальних фракціях ізольованої печінки щурів; спектрофотометричні - для визначення вмісту базального рівня ТБК-активних продуктів, інтенсивності залізо-аскорбат-індукованого ПОЛ, вмісту відновленого глутатіону, каталазної, глутатіонпероксидазної, глутатіонредуктазної і глюкозо-6-фосфатдегідрогеназної активностей, вмісту АТФ, активності малатдегідрогенази і гліцеролкінази; статистичного аналізу - для обробки отриманих результатів.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проводилася порівняльна оцінка активності окислювально-відновлювальних реакцій різних метаболічних шляхів у ізольованій печінці щурів при ГЗ за допомогою AlamаrBlue-тесту. Встановлено, що попереднє уведення тваринам ЦФТ попереджає зниження рівня АТФ і стимулює обмін вуглеводів у цитоплазмі клітин печінки, що проявляється у накопиченні субстратів і збільшенні швидкості їхнього окислення у дихальному ланцюзі мітохондрій після ГЗ органа. Вперше показано, що зворотне роз'єднання окислювального фосфорилювання при ГЗ ізольованої печінки щурів за рахунок уведення до складу розчину зберігання ДНФ значною мірою гальмує утворення ТБК-активних продуктів і попереджає пригнічення системи антиоксидантного захисту в клітинах печінки. Це дозволяє зберегти високий рівень АТФ після наступної НР. При вивченні інтенсивності вільнорадикальних процесів і рівня АТФ у печінці щурів встановлено, що модифікація СВР шляхом заміни трис-HCl буфера на фосфатний буфер і бичачого сироваткового альбуміну на ПЕГ-8000 забезпечує високий ступінь збереженості органа як під час короткострокового, так і тривалого ГЗ. Новими також є отримані в роботі результати про те, що поєднання попередньої обробки тварин ЦФТ і доповнення консервуючого розчину ДНФ призводить до адитивного ефекту, який проявляється у нормалізації прооксидантно-антиоксидантної рівноваги і покращенні показників енергетичного обміну печінки після ГЗ і НР.

Практичне значення одержаних результатів. Високомолекулярний ПЕГ-8000 є адекватною альтернативою для заміни альбуміну у складі розчину зберігання, що може розглядатись як рекомендація щодо його використання в якості компонента консервуючих середовищ. Встановлене попередження порушення енергетичного та прооксидантно-антиоксидантного стану за умов доповнення консервуючого розчину роз'єднувачем окислювального фосфорилювання може слугувати підґрунтям для використання сполук із аналогічним механізмом дії при патологіях печінки, у розвиткові котрих беруть участь вільнорадикальні процеси. Позитивний вплив попередньої обробки тварин ЦФТ на функціональний стан печінки використовувався при розробці способу її гіпотермічного зберігання (патент України № 10264 UA МПК 7).

Особистий внесок здобувача. Автором дисертаційної роботи самостійно проведений аналіз наукової літератури, отримані результати експериментальних досліджень і проведена їхня статистична обробка. Автором особисто виконаний первинний аналіз результатів і зроблені попередні висновки. Разом з науковим керівником, професором Петренко О.Ю., були визначені мета, задачі роботи і способи їх вирішення, інтерпретовані отримані результати та зроблені остаточні висновки. В опублікованих спільно зі співавторами працях особистий внесок здобувача полягає:

- у роботі [1] у вивченні впливу складу консервуючих розчинів на стан печінки щурів при її ГЗ;

- у роботі [2] у вивченні дихальної активності мітохондрій, ізольованих з печінки щурів після ГЗ;

- у роботах [3, 15] у вивченні відновлення AlamarBlue ізольованими мітохондріями печінки щурів у комбінації з інгібіторним аналізом;

- у роботах [4, 18] у вивченні впливу ДНФ на прооксидантно-антиоксидантний баланс у печінці щурів після холодової ішемії та наступної реперфузії;

- у роботах [5, 12, 16 - 17] у вивченні комбінованої дії попередньої обробки тварин ЦФТ та доповнення консервуючого розчину ДНФ на дихальну активність мітохондрій печінки щурів після ГЗ та наступної реперфузії;

- у роботах [6, 14] у вивченні впливу попередньої обробки тварин ЦФТ на дихальну активність мітохондрій печінки щурів після ГЗ;

- у роботі [8] у вивченні впливу попередньої обробки тварин ЦФТ на енергетичний стан печінки щурів після ГЗ та наступної НР;

- у роботі [9] у вивченні функціонального стану мітохондрій, ізольованих з печінки після її ГЗ у розчинах різного композиційного складу;

- у роботах [10 - 11] у вивченні впливу попередньої обробки тварин ЦФТ на дихальну активність мітохондрій та вміст АТФ після короткострокового ГЗ печінки щурів;

- у роботі [13] у вивченні впливу модифікації консервуючого розчину шляхом його доповнення ПЕГ-8000 на енергетичний стан печінки щурів при ГЗ та наступній НР.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертаційної роботи були представлені на Українській науковій конференції "Проблемы биологической и медицинской физики" (м. Харків, 2004); на конференції молодих учених "Холод в биологии и медицине" ІПКіК НАН України (м. Харків, 2005); на IX "Українському біохімічному з'їзді" (м. Харків, 2006); на щорічних Міжнародних конференціях з кріобіології "Cryo-2006" (м. Гамбург, Німеччина, 2006) і "Cryo-2007" (Канада, 2007); на IV з'їзді трансплантологів України (м. Київ, 2007).

Публікації. За матеріалами дисертаційної роботи опубліковані 6 статей у наукових фахових виданнях, 11 тез доповідей, отриманий 1 патент України.

Об'єм і структура дисертації. Дисертаційна робота викладена на 124 сторінках, складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів, розділу результатів власних досліджень і їхнього обговорення, аналізу й узагальнення результатів дослідження, висновків; список літератури викладений на 28 сторінках і включає 251 першоджерел. Робота проілюстрована 21 рисунком і 7 таблицями.

Основний зміст роботи

Матеріали і методи дослідження

Для виконання роботи використовували білих безпорідних щурів-самиць масою 200-250 г (n = 85). Тварин утримували за стандартних умов віварію ІПКіК НАН України. Дослідження проводили згідно з вимогами Етичного комітету ІПКіК НАН України, розробленими відповідно до "Загальних принципів експериментів на тваринах", схвалених I Національним конгресом з біоетики (Київ, Україна, 2001) і погоджених з положеннями "Європейської конвенції з захисту хребетних тварин, що використовуються в експериментальних та інших дослідних цілях" (Страсбург, Франція, 1986). Всі маніпуляції з тваринами виконували під поверхневим ефірним наркозом.

Для гіпотермічного зберігання печінку відмивали від крові та насичували консервуючим розчином через портальну вену in situ. Після закінчення перфузії до портальної вени вводили катетер, печінку ізолювали і переносили до консервуючого розчину. Орган зберігали протягом 1 або 18 год при температурі 4 єС. Після холодової експозиції печінку реперфузували при 37 єС середовищем Кребс-Рінгера (120 мМ NaCl, 4,8 мМ KCl, 2,6 мМ CaCl2, 25 мМ NaHCO3, 1,2 мМ KH2PO4, 1,2 мМ MgSO4, рН 7,4), з додаванням глюкози (1 мг/мл). Середовище насичували повітрям протягом усього періоду реперфузії (60 хв). Через 30 і 60 хв відбирали аліквоти перфузата для оцінки його ферментативної активності. До та після реперфузії брали зразки тканини печінки для біохімічних досліджень.

В якості ЦФТ використовували постмікросомальну фракцію гомогенатів фетальних тканин людини 8 - 10 тижнів гестації, отриманих після штучного переривання вагітності з письмового дозволу проінформованих донорів; ЦФТ зберігали при температурі -80 єС і, безпосередньо після відігрівання, вводили щурам у стегнову вену, в дозі 0,3 мл/100 г маси за 4 год до ізоляції органа (Cherkashina D. V. et al., 2006). Контрольним групам вводили такий самий об'єм фізіологічного розчину.

Мітохондрії печінки виділяли, використовуючи метод диференціального центрифугування (Мосолова И.М., 1975).

Визначення дихальної активності мітохондрій проводили за допомогою закритого платинового електрода Кларка в термостатованій комірці об'ємом 1 мл (26 єС). Субстратами дихання слугували малат (5 мМ), глутамат (5 мМ) або сукцинат (8 мМ). Окислювальне фосфорилювання ініціювали додаванням АДФ (250 мкМ), роз'єднання дихання - внесенням 100 мкМ ДНФ.

Ступінь відновлення AlamarBlue визначали у гомогенатах і постмітохондріальних фракціях печінки щурів флуориметрично на спектрофлуориметрі Tecan GENios (Tecan inc., Австралія) при довжинах хвиль збудження 550 нм і емісії 590 нм та виражали в умовних одиницях флуоресценції (УОФ). Обробка даних проводилась за допомогою програми XFLUOR4 v. 4.50.

Рівень АТФ у печінці визначали за методом H. Adams (1963), використовуючи набір "Sigma" (США). Амінотрансферазну активність у перфузаті оцінювали кінетичним методом (Bergmeyer H. U. et al., 1978) за зменшенням кількості НАДН в реакціях трансамінування при довжині хвилі 340 нм. Базальний рівень ТБК-активних продуктів у гомогенатах печінки визначали за методом Андрєєвої Л.Н. (1988) у модифікації Арутюняна А.В. та ін. (2000) за утворенням забарвленого комплексу тіобарбітурової кислоти (ТБК) і вторинних продуктів перекисного окислення ліпідів (ПОЛ) при довжині хвилі 535 нм. Інтенсивність індукованого ПОЛ оцінювали за швидкістю накопичення ТБК-активних продуктів у прооксидантному середовищі, що містило 50 мM трис-НСl, 50 мM NaCl, 0,25 мM аскорбату та 12 мкM FeSO4 (Владимиров Ю.А., 1972). Вміст відновленого глутатіону (GSH) у печінці визначали за інтенсивністю утворення комплексу з алоксаном, який має максимум поглинання при довжині хвилі 305 нм (Путилина Ф.Е., 1982). Активність ферментів вимірювали у гомогенатах печінки кінетичними методами: каталазну - за зменшенням Н 2О 2 при 240 нм (Королюк М.А. и др., 1988); глутатіонредуктазну (ГР) - за зменшенням НАДФН при 340 нм (Чернов Н.Н., 1979); глутатіонпероксидазну (ГП) - за збільшенням вмісту окисленого глутатіону при 260 нм (Rotruck J. T. et al., 1973); глюкозо-6-фосфатдегідрогеназну (Г 6ФДГ) - за накопиченням НАДФН при 340 нм (Rudack D., 1971); малатдегідрогеназну (МДГ) і гліцеролкіназну (ГК) - у гомогенатах і постмітохондріальних фракціях печінки за зменшенням НАДН при 340 нм (Kitto Y., 1969). Концентрацію білка визначали біуретовим методом (Gornall A.G., 1949).

Отримані результати обробляли на персональному комп'ютері за допомогою спеціалізованих програм "Origin 6.0" і "GraphPad Prism 4.0". Для визначення достовірності даних використовували параметричний t-критерій Ст'юдента і непараметричний - Манна-Уітні. Достовірно відмінними вважали результати при р < 0,05.

Матеріали і методи, що використовувалися в дисертаційній роботі, розглянуто і схвалено комісією з біоетики ІПКіК НАН України.

Результати власних досліджень та їх обговорення

Вплив попереднього уведення тваринам цитозоля фетальних тканин на енергетичний стан печінки при короткостроковому гіпотермічному зберіганні. Рівень АТФ у печінці після її насичення консервуючим розчином (контроль) становив 5,38 ± 0,5 мкмоль АТФ/г тканини і після 1 год ГЗ знижувався на 40 % (р < 0,05) Уведення ЦФТ (дослід) не впливало на вихідний рівень АТФ, але попереджало його зниження після ГЗ. При цьому досліджуваний показник був у 2,3 рази вищий, ніж у контролі. Ці дані свідчать про позитивний вплив попередньої обробки щурів на активність систем, які беруть участь у енергетичному обміні. Дія ЦФТ може зумовлюватися низкою причин: пригніченням систем, які споживають АТФ, збереженням функціональної активності мітохондрій за умов гіпотермії, активацією шляхів утворення енергії, незалежних від мітохондрій.

Показники функціональної активності мітохондрій, ізольованих із печінки контрольних і дослідних тварин до та після ГЗ, наведені у табл. 1. З таблиці видно, що до холодової ішемії печінки показники дихальної активності мітохондрій контрольної та дослідної груп при окисленні малату і глутамату, а також сукцинату були у межах фізіологічних значень. У той же час у дослідній групі відзначалося достовірне збільшення швидкості поглинання кисню у стані 3 (V3) при використанні в якості субстрату сукцинату. Після 1 год ГЗ печінки в обох експериментальних групах спостерігалось достовірне підвищення швидкості дихання мітохондрій у стані 3 при окисленні як НАД-залежних субстратів, так і сукцинату. Разом із тим встановлено, що попередня обробка тварин ЦФТ, не впливаючи на ДК, призводила до різкого зростання швидкостей окислення сукцинату у станах 3 і 4 (V4).

Таблиця 1 Вплив попередньої обробки тварин ЦФТ на дихальну активність ізольованих мітохондрій до та після ГЗ печінки, нмоль O2/мг білка/хв (M ± m; n = 7 - 9)

Примітки:

* - р 0,05 відносно контролю;

^ - р 0,05 відносно значень до ГЗ.

Для з'ясування причин, які сприяють підвищенню швидкості окислення сукцинату, здійснювалася спроба оцінити внесок різних шляхів вуглеводного обміну у підтримку енергетичного метаболізму печінки за умов попередньої обробки ЦФТ. Для цього гомогенати і постмітохондріальні фракції (ПМФ) печінки контрольних і дослідних тварин інкубували у присутності барвника AlamarBlueТМ (АВ), здатного відновлюватись окислювально-відновлювальними ферментами (Springer J. E. et al., 1998). Ми припустили, що за відсутності екзогенних субстратів ступінь відновлення АВ буде відбивати інтенсивність метаболічних шляхів відповідних фракцій за реальних умов. При цьому інтенсивність флуоресценції АВ у гомогенатах дорівнюватиме сумарній активності мітохондріальних і цитоплазматичних окислювально-відновних ферментів, а в ПМФ - гліколітичних, мікросомальних та інших.

Так, у контрольній групі, до ГЗ печінки, інтенсивність флуоресценції редокс-індикатора у ПМФ становила лише 10 % від загальної. Попередня обробка тварин ЦФТ не впливала на мітохондріальну складову відновлення АВ, але у 2,6 рази збільшувала флуоресценцію барвника у ПМФ (р 0,05). Після ГЗ рівень флуоресценції редокс-індикатора у досліджуваних фракціях печінки контрольних щурів не змінювався. У дослідній групі на тлі незначного зниження ступеня відновлення АВ у мітохондріях підвищений рівень відновленості АВ у ПМФ зберігався.

Для виявлення внеску гліколізу до ступеня відновлення АВ окремо вивчалась інтенсивність його флуоресценції у ПМФ печінки у присутності інгібітору гліколізу - монойодацетату.

Попередня обробка тварин ЦФТ призводила до збільшення інтенсивності гліколізу більш, ніж у 2 рази, а негліколітична частина збільшувалася майже у 4 рази порівняно з контролем. ГЗ печінки не впливало на швидкість гліколізу в контрольній групі, у той час як у дослідній цей показник, хоч і знижувався, але залишався у 1,5 рази вищий порівняно зі значеннями контролю. Ці результати дозволяють припустити, що збереження рівня АТФ після попередньої обробки ЦФТ обумовлюється підтримкою гліколізу в ході ГЗ. На користь цього свідчать відомості про збільшення активності одного з ключових гліколітичних ферментів - піруваткінази (Cherkashina D. V. et al., 2006).

Враховуючи збільшення швидкості окислення сукцинату після ГЗ печінки під дією попередньої обробки (див. табл. 1), ми припустили, що уведення тваринам ЦФТ може призводити до активації ферментів, які приймають участь у переносі відновлювальних еквівалентів із цитоплазми до мітохондрій. У зв'язку з цим оцінювався вплив попередньої обробки тварин ЦФТ на активність цитозольної та мітохондріальної форм малатдегідрогенази і гліцеролкінази. Показано, що після ГЗ активність гліцеролкінази у гомогенаті, а малатдегідрогенази - у гомогенаті і ПМФ були значно вищі у печінці дослідних тварин, аніж контрольних.

Таким чином, наведені результати свідчать про те, що попереднє уведення тваринам ЦФТ призводить до стимуляції вуглеводного обміну у печінці. Збільшення активності гліколізу забезпечує синтез АТФ і підтримку його рівня протягом ГЗ, а стимуляція негліколітичних ферментів спричиняє утворення субстратів, здатних окислюватися електрон-транспортним ланцюгом мітохондрій на рівні комплексу II. Виявлені в цій роботі активація утворення відновлювальних еквівалентів і стимуляція сукцинатоксидазного шляху окислення під дією ЦФТ можуть розглядатись як шляхи реалізації одного з відомих механізмів термінової адаптації клітин печінки до холодової ішемії (Маевский Е.И. и др., 2000).

Висновки

В дисертаційній роботі наведено теоретичне й експериментальне узагальнення, а також нове розв'язання наукової проблеми, що стосується підвищення ступеня збереженості ізольованої печінки у ході гіпотермічного зберігання і реперфузії шляхом підтримки її енергетичного метаболізму і прооксидантно-антиоксидантного статусу за допомогою попередньої обробки тварин цитозолем фетальних тканин і модифікації консервуючого розчину.

1. Попереднє уведення тваринам цитозоля фетальних тканин призводить до збільшення швидкості окислення мітохондріями сукцинату у стані 3 і 4 та вмісту АТФ після короткострокового гіпотермічного зберігання печінки протягом 1 год.

2. Попередня обробка тварин цитозолем фетальних тканин стимулює у цитоплазмі клітин гліколіз і негліколітичні редокс-ферменти, про що свідчить активність окислювально-відновних ферментів, визначена за допомогою АlamarВlue-тесту в різних фракціях печінки у поєднанні з інгібіторним аналізом. Показано збільшення активності малатдегідрогенази і гліцеролкінази - ферментів, що приймають участь у переносі відновних еквівалентів у мітохондрії.

3. Порівняльний аналіз енергетичного і прооксидантно-антиоксидантного стану печінки засвідчив, що модифікація сахарозо-вміщуючого розчину шляхом заміни трис-HCl буфера на фосфатний буфер, а бичачого сироваткового альбуміну на ПЕГ-8000 забезпечує високий ступінь збереженості органа як при короткостроковому (1 год), так і тривалому (18 год) ГЗ.

4. Присутність у середовищі зберігання роз'єднувача окислювального фосфорилювання ДНФ на етапі тривалого ГЗ печінки спричиняє зниження базального рівня ТБК-активних продуктів, а також збільшення активності каталази і глутатіонпероксидази.

5. Після НР позитивний ефект ДНФ на прооксидантно-антиоксидантний стан печінки зберігається та додатково проявляється у зниженні іонної проникності внутрішньої мембрани мітохондрій (швидкості дихання V4) і збільшенні ДК, що сприяє підвищенню рівня АТФ.

6. Комбіноване застосування попередньої обробки тварин ЦФТ і доповнення консервуючого розчину ДНФ спричиняє адитивний ефект, який проявляється у додатковому зниженні рівня ТБК-активних продуктів, підвищенні рівня GSH і АТФ у печінці як на етапі ГЗ, так і після НР.

Перелік робіт, опублікованих за темою дисертації

1. Петренко О.Ю., Черкашина Д.В., Сомов О.Ю., Семенченко О.А., Ткачова О.М., Фуллер Б.Д. Експериментальне обґрунтування застосування консервуючих розчинів при трансплантації печінки // Трансплантологія. - 2004. - Т. 7, № 4. - С. 167 - 169.

2. Черкашина Д.В., Ткачёва Е. Н., Сомов А.Ю., Семенченко О.А., Петренко А.Ю., Фуллер Б. Дж. Перспективы применения биорегуляторов стволовых клеток при трансплантации печени // Проблемы криобиологии. - 2005. - Т. 15, № 3. - С. 389 - 392.

3. Petrenko Yu. A., Gorokhova N. A., Tkachova E. N., Petrenko A. Yu. The reduction of Alamar Blue by peripheral blood lymphocytes and isolated mitochondria // Укр. Біохім. журн. - 2005. - Vol. 77, № 5. - P. 100 - 105.

4. Черкашина Д.В., Ткачова О.М., Сомов О.Ю., Лебединський О.С., Семенченко О.А., Грищенко В. І., Петренко О.Ю. Прооксидантно-антиоксидантний баланс у печінці щурів після холодової ішемії в присутності 2,4-динітрофенолу та наступної реперфузії // Доповіді НАН України. - 2007. - № 10. - С. 168 - 173.

5. Черкашина Д.В., Петренко А.Ю., Ткачёва Е. Н., Сомов А.Ю., Семенченко О.А., Сосимчик И.А., Лебединский А.С. Сочетание различных экспериментальных подходов к продлению сроков гипотермического хранения печени для трансплантации // Трансплантология. - 2007. - Т. 9, № 1. - С. 306 - 308.

6. Ткачёва Е. Н., Семенченко О.А., Сомов А.Ю., Петренко А.Ю. Энергетическое состояние печени крыс при краткосрочном гипотермическом хранении // Проблемы криобиологии. - 2007. - Т. 17, № 1. - С. 38 - 43.

7. Патент № 10264, Україна, МПК 7 AO1N1/02; Заявл. 01.04.2005.; Опубл. 15.11.2005. Бюл. №11. Спосіб гіпотермічного зберігання ізольованої печінки. Петренко О.Ю., Семенченко О.А., Черкашина Д.В., Сомов О.Ю., Ткачова О.М.

8. Petrenko A. Yu., Cherkashina D. V., Semenchenko O. A., Somov A. Yu., Tkacheva E. N. Fetal-specific factor pretreatment attenuates rat liver damage during organ hypothermic storage and following reperfusion // Abstracts of the 41th Annual Meeting of the Society for Cryobiology. - Beijing, 2004. - Р. 147.

9. Ткачёва Е. Н., Сомов А.Ю., Петренко А.Ю. Использование функциональных параметров митохондрий для оценки сред гипотермического хранения печени // Тези доповідей І Української наукової конференції "Проблеми біологічної і медичної фізики" (20 - 22 вересня 2004). - Харків, 2004. - С. 170.

10. Tkachеva E. N. The mechanisms of ATP generation during short-term liver hypothermic preservation after rat preconditioning with fetal-specific factors // Матеріали конференції молодих учених ІПКіК НАН України "Холод у біології та медицині". Проблеми кріобіології. - Харків. - 2005. - Т. 15, № 4. - С. 722.

11. Ткачёва Е. Н., Черкашина Д.В., Семенченко О.А., Петренко А.Ю. Влияние эмбриоспецифических факторов на энергетическое состояние печени при гипотермическом хранении // Матеріали ІХ Українського біохімічного з'їзду. - Харків. - 2006. - Т. 1. - С.185 - 186.

12. Petrenko A. Yu., Cherkashina D. V., Tkacheva E. N., Semenchenko O. A., Somov A. Yu., Lebedinsky A. S., Fuller B. J. Supplementation of medium with an uncoupler of oxidative phosphorylation reduces liver damage during hypothermic storage and reperfusion in a rat model // Abstracts of the 43rd Annual Meeting of the Society for Cryobiology and Society for Low Temperature Biology. - Hamburg, 2006. - P. 119.

13. Semenchenko O. A., Cherkashina D. V., Tkacheva E. N., Lebedinsky A. S., Fuller B. J., Petrenko A. Yu. Sucrose-based preservation solution modified by PEG-8000 for cold storage of isolated rat liver // Abstracts of the 43rd Annual Meeting of the Society for Cryobiology and Society for Low Temperature Biology. - Hamburg, 2006. - P. 121.

14. Cherkashina D. V., Tkacheva E. N., Semenchenko O. A., Somov A. Yu., Fuller B. J., Petrenko A. Yu. Pretreatment with fetal-specific factors positively affects rat liver metabolic activity after short-term cold storage // Abstracts of the 43rd Annual Meeting of the Society for Cryobiology and Society for Low Temperature Biology. - Hamburg, 2006. - P. 129.

15. Горохова Н.А., Петренко Ю.А., Ткачёва Е. Н., Петренко А.Ю. Изучение активности метаболических процессов в клетках по восстановлению ресазурина // Матеріали ІХ Українського біохімічного з'їзду. - Харків, 2006 - Т. 1. - С.117.

16. Cherkashina D. V., Somov A. Yu., Tkacheva E. N., Semenchenko O. A., Lebedinsky A. S., Petrenko A. Yu. Combined effect of pretreatment and 2,4-dinitrophenol on liver pro-oxidant/antioxidant state during cold storage/warm reperfusion // Acta Biochimica Polonica. - 2007. - Vol. 54, Suppl. 2. - P. 38.

17. Petrenko A. Yu., Cherkashina D. V., Somov A. Yu., Tkacheva E. N. Two approaches to reduce cold ischemia-reperfusion liver damage // Abstracts of the 6th Parnas conference "Molecular mechanisms of cellular signaling" (Krakow, Poland, May 30th- June 2nd // Acta Biochimica Polonica. - 2007. - Vol. 54, Suppl. 2. - P. 36.

18. Petrenko A. Yu., Cherkashina D. V., Tkacheva E. N., Somov A. Yu., Semenchenko O. A., Lebedinsky A. S., Fuller B. J. New approaches to reduce liver damage after hypothermic storage and reperfusion in rat model // Abstracts of the 44th Annual Meeting of the Society for Cryobiology. - Canada, 2007. - P. 47.

Размещено на Allbest.ru