Размещено на http://www.allbest.ru/

ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ І ВІРУСОЛОГІЇ

ІМ. Д.К. ЗАБОЛОТНОГО

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

03.00.07 - мікробіологія

УДК 57.083.18:579.264

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

ТАКСОНОМІЧНЕ ПОЛОЖЕННЯ І БІОЛОГІЧНА АКТИВНІСТЬ ЕНТЕРОКОКІВ

ГАРМАШЕВА ІННА

ЛЕОНТІЇВНА

Київ - 2009

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у відділі фізіології промислових мікроорганізмів Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного Національної Академії Наук України

Науковий керівник: доктор біологічних наук, проф., член-кор. НАН України Коваленко Надія Костянтинівна, Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, провідний науковий співробітник відділу фізіології промислових мікроорганізмів.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор Федоровська Олена Олексіївна, Державна установа «Інститут гематології та трансфузіології АМН України», завідувач лабораторії мікробіології та проблем антиінфекційного імунітету доктор медичних наук, старший науковий співробітник Авдєєва Лілія Василівна, Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, завідувач відділу антибіотиків

Захист відбудеться “18” листопада 2009 р. о 1000 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.233.01 Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України за адресою:

Україна, Д 03680, м. Київ, ДСП, вул. Заболотного, 154.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України за адресою: Д 03680, м. Київ, ДСП, вул. Заболотного, 154.

Автореферат розісланий “14____“ жовтня 2009 р.

Вчений секретарспеціалізованої вченої ради, кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник Пуріш Л. М.

1. ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Молочнокислі бактерії розповсюджені у оточуючому середовищі й мають велике практичне значення у життєдіяльності людини. Одним з родів, що відносять до даної групи мікроорганізмів, є рід Enterococcus, який на даний час об'єднує 35 видів. Ентерококи гетерогенні за фенотиповими ознаками, що ускладнює їх видову ідентифікацію, особливо диференціацію близькоспоріднених видів. Тому вкрай актуальним є використання молекулярно-генетичних методів для підтвердження мікробіологічної ідентифікації ентерококів. Представники цього роду мають широке практичне використання завдяки своїй біологічній активності. Особливу увагу привертає вивчення бактеріоциногенних властивостей ентерококів. Переважна більшість робіт спрямована на пошук і виділення бактеріоцинів - ентероцинів, що пригнічують ріст патогенних мікроорганізмів, які спричиняють псування харчових продуктів. Але ще й досі недостатньо вивчено антагоністичну активність ентерококів щодо умовно патогенних мікроорганізмів - збудників інфекційних хвороб людини, майже не вивчено вплив компонентів поживного середовища на прояв антагонізму. Бактерії роду Enterococcus також привертають до себе увагу і як збудники внутрішньо лікарняних інфекцій. Через це є актуальним визначення рівня їх антибіотикорезистентності, оскільки стійкість до антибіотиків є одним з факторів вірулентності ентерококів. Практично відсутні дані стосовно властивостей ентерококів, що ізольовані від людей похилого віку, що проживають у екологічно чистих регіонах. В останні роки увагу дослідників привертають пробіотичні властивості ентерококів. Цей напрямок потребує чіткої ідентифікації штамів-пробіотиків, визначення їх антагоністичних, адгезивних властивостей та антибіотикорезистентності.

Зв'язок роботи з науковими програмами. Робота виконана у відповідності з напрямом науково-дослідних робіт Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України в межах бюджетних тематик відділу фізіології промислових мікроорганізмів «Систематика і біосинтетичні можливості бактерій і дріжджів. Розробка наукових основ створення за їх допомогою нових біотехнологічних препаратів і процесів» номер 0104U003000 (2004-2008 рр.), «Вивчення геноміки і протеоміки мікроорганізмів для створення штамів - пробіотиків, продуцентів лікарських засобів, агробіопрепаратів; дослідження структурно-функціональної організації вірусних геномів та автономних генетичних елементів» номер 0107U011129 (2004-2008 рр.), «Роль мікроорганізмів у функціонуванні живих систем: фундаментальні проблеми та біоінженерні рішення. Пробіотична активність молочнокислих бактерій: фундаментальні аспекти і створення препарату» відповідно конкурсу спільних проектів учених НАН України та Сибірського відділення Російської академії наук, оголошеного розпорядженням Президії НАН України № 173 від 21.03.2006 р. номер 0106U009464 (2006-2008 рр.)

Мета та завдання досліджень. Метою роботи було визначення таксономічного положення колекційних штамів ентерококів у відповідності зі сучасною систематикою й вивчення їх біологічної активності для оцінки перспективності подальшого практичного використання.

У відповідності з поставленою метою були сформульовані наступні завдання:

· вивчити морфолого-культуральні й фізіолого-біохімічні властивості колекційних штамів ентерококів після довготривалого зберігання;

· визначити таксономічне положення штамів ентерококів з позиції сучасної систематики з використанням мікробіологічних, молекулярно-генетичних і хемотаксономічних методів;

· вивчити антагоністичні властивості ентерококів по відношенню до референс-штамів умовно патогенних мікроорганізмів людини;

· визначити наявність структурних генів найпоширеніших бактеріоцинів ентерококів - ентероцинів А, В, Р, з використанням молекулярно-генетичних методів;

· дослідити адгезивні властивості ентерококів на клітинах букального епітелію людини;

· вивчити антибіотикостійкість досліджуваних штамів ентерококів;

· провести відбір штамів ентерококів, перспективних для практичного використання.

Об'єктом дослідження були штами ентерококів, що зберігаються у колекції культур молочнокислих бактерій відділу фізіології промислових мікроорганізмів Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України.

Предметом дослідження були: морфолого-культуральні та фізіолого-біохімічні властивості ентерококів, визначення їх таксономічного положення, вивчення біологічної активності ентерококів, зокрема антагоністичної дії щодо референс-штамів умовно патогенних мікроорганізмів, адгезивність до букальних клітин людини, стійкість до антибіотиків.

Методи досліджень. Мікробіологічні, молекулярно-генетичні, хемотаксономічні методи, загальноприйняті методи статистичної обробки даних.

Наукова новизна отриманих результатів. На підставі даних мікробіологічних і молекулярно-генетичних методів визначено таксономічне положення і біологічні властивості колекційних штамів ентерококів, а також обґрунтовано вибір штамів перспективних для подальшого практичного використання. Вперше проведено комплексну ідентифікацію штамів ентерококів колекції культур молочнокислих бактерій Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України з використанням мікробіологічних, молекулярно-генетичних і хемотаксономічних методів. Визначено таксономічне положення штамів ентерококів у відповідності зі сучасною систематикою. Проведено порівняльний аналіз даних зброджування вуглеводних субстратів при первинному виділенні штамів і після довготривалого зберігання у ліофілізованому стані. Визначена ефективність мікробіологічної й хемотаксономічної ідентифікації порівняно з молекулярно-генетичною.

Вперше показано, що штами ентерококів, які ізольовані з кишкового тракту людей похилого віку, після тривалого зберігання виявляють антагоністичну активність по відношенню до референс-штамів умовно патогенних мікроорганізмів. Виявлена видова залежність у спектрах антагоністичної активності й наявності структурних генів ентероцинів А, В і Р.

Встановлено, що антаногістичні властивості ентерококів щодо умовно патогенних тест-культур штамоспецифічні і залежать від складу поживного середовища. Визначено адгезивність ентерококів до клітин букального епітелію людини, а також антибіотикочутливість штамів після тривалого зберігання.

Практичне значення одержаних результатів. Проведено відбір штамів ентерококів з антагоністичною активністю щодо Pseudomonas aeruginosa, Proteus vulgaris, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Salmonella enterica, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, S. epidermidis. Відібрані штами ентерококів, чутливі до антибіотиків, які використовуються при лікуванні ентерококових інфекцій. Вони є перспективними для використання у складі пробіотиків та заквасок. Штами ентерококів, що є стійкими до антибіотиків, можуть бути використані як продуценти біологічно активних метаболітів з антимікробною дією.

Особистий внесок здобувача. Основні експериментальні дані були одержані здобувачем особисто: визначено морфолого-культуральні й фізіолого-біохімічні властивості, проведено ідентифікацію виділених штамів з використанням мікробіологічних методів, АРІ-тестування, виділення ДНК штамів ентерококів, підготовку зразків метилових ефірів жирних кислот, досліджено антагоністичні, адгезивні властивості й стійкість до антибіотиків. Хроматомасспектометричний аналіз проведено сумісно з к.б.н. Остапчуком А.М. (Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України). Полімеразну ланцюгову реакцію проводили сумісно з к.б.н. Зеленою Л.Б. (Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України). Сиквенування продуктів ампліфікації проводили сумісно з к.б.н. Скрипкіною І.Я. (Інститут молекулярної біології і генетики НАН України). Планування головних напрямків роботи, аналіз результатів, їхнє узагальнення й інтерпретацію та формулювання основних положень і висновків дисертації, підготовку до друку наукових статей здобувачем проведено під керівництвом наукового керівника дисертаційної роботи д.б.н., професором, член-кор. НАН України Коваленко Н.К.

Апробація результатів дисертації. Основні результати досліджень та положення дисертації доповідались та обговорювались на конкурсі експериментальних робіт молодих дослідників ІМВ НАНУ (Київ, 2006); на Міжнародній науковій конференції молодих вчених і студентів «Сучасні проблеми мікробіології та біотехнології» (Одеса, 2007), на науково-практичній конференції «Актуальні проблеми екології мікроорганізмів» (Тернопіль, 2007), на ІV Міжнародній науковій конференції студентів і аспірантів «Молодь і поступ біології» (Львів, 2008); на конкурсі експериментальних робіт молодих дослідників ІМВ НАНУ (Київ, 2007); на 12-й Пущинській школі-конференції молодих вчених «Биология - наука ХХІ века» (Пущино, Росія, 2008), на ІІІ Міжнародній конференції молодих науковців «Біологія: від молекули до біосфери» (Харків, 2008), на конкурсі експериментальних робіт молодих дослідників ІМВ НАНУ (Київ, 2008); на V Міжнародній науковій конференції студентів і аспірантів «Молодь і поступ біології» (Львів, 2009)

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 10 наукових робіт (4 статті у фахових журналах, 6- в тезах доповідей).

Структура та обсяг роботи. Дисертаційна робота викладена на 154 сторінках машинописного тексту і складається зі вступу, огляду літератури, основної частини (включає матеріали і методи досліджень, результати досліджень і їх обговорення), висновків, списку використаних джерел, що містить 246 джерел, з них 222- закордонних авторів. Робота ілюстрована 25 таблицями і 30 рисунками.

2. ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Розділ 1. Огляд літератури

Огляд літератури складається з трьох підрозділів, в яких висвітлено сучасний стан таксономії ентерококів, розглянута біологічна активність цих мікроорганізмів і їх значення у життєдіяльності людини. Велика увага приділяється сучасним методам ідентифікації ентерококів, антагоністичній активності щодо умовно патогенних мікроорганізмів, адгезії й антибіотикорезистентності. Висвітлено практичне використання представників роду Enterococcus.

Розділ 2. Об'єкти і методи дослідження

В роботі досліджено 58 штамів роду Enterococcus, які були виділені з шлунково-кишкового тракту людей-довгожителів співробітниками відділу фізіології промислових мікроорганізмів Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України під час міжнародної геронтологічної експедиції до високогірних селищ Абхазії - регіону з високим рівнем довголіття. Штами зберігалися в колекції культур молочнокислих бактерій Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАНУ.

Фізіолого-біохімічні властивості, а саме відсутність дихальних систем, утворення газу з глюкози, рухливість, ріст при різних температурах, в середовищах з рН 9,6, з 6,5% NaCl, зброджування вуглеводів, кислотність у молоці вивчали за методиками, описаними в монографії [Квасников, Нестеренко, 1975]. Продукцію каталази визначали шляхом суспендування окремої колонії у 5% розчині перекису водню [Day et al., 2001]. Відновлення 2,3,5-трифенілтетразолій хлориду (ТТХ) вивчали на середовищі «Ентерококагар» (Росія). Утворення пігменту та тип гемолізу визначали на кров'яному агарі Колумбія (BoiMerieux, Франція). Гідроліз пірувату визначали за методом [Gross, 1975]. Тести на ферментативну активність і зброджування вуглеводів проводили з використанням тест-систем АРІ 20 Strep і АРІ 50СН (BoiMerieux, Франція).

Видову належність штамів за фенотиповими ознаками визначали з використанням традиційних схем ідентифікації ентерококів: Facklam and Collins [Facklam and Collins, 1989], Manero and Blanch [Manero and Blanch, 1999], Knudston and Hartman [Knudston and Hartman, 1992], Klein [Klein, 2003]. Обробку даних АРІ-тестування здійснювали за допомогою програми API Lab V.6.0 (BoiMerieux, Франція).

Молекулярно-генетичну ідентифікацію проводили з використанням полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). Бактеріальну ДНК виділяли за методикою [Jackson et al., 2004]. Реакцію ампліфікації проводили на ампліфікаторі «Терцик» (Росія). Використовували набір реактивів «АмпліСенс 200-1» (Росія). Продукти ампліфікації розділяли у 1,7% агарозному гелі з 0,05% бромистого етидію й візуалізували в ультрафіолетовому світлі.

Належність штамів до роду Enterococcus визначали з використанням родоспецифічних праймерів Ent1 та Ent2, специфічних до гену фактору елонгації EF-tu (tuf) [Ke et al., 1999]. Видову ідентифікацію штамів ентерококів проводили з використанням праймерів pS1490 і Pl132 [Alves et al., 2004 ], специфічних до послідовності внутрішнього міжгенного спейсерного району 16S-23S рРНК, що транскрибується (ITS - Internal Transcribed Spacer) і за допомогою видоспецифічних пар праймерів, специфічних до послідовності гену супероксиддисмутази (sodA) E. faecium, E. faecalis, E. durans, E. hirae [Jackson et al., 2004]. Як позитивний контроль при ідентифікації були використані колекційні штами ентерококів видів E. faecium УКМ В-2520T (ATCC 19434), E. durans УКМ В-2531T (ATCC 19432), E. hirae УКМ В-915 (ATCC 10541) і E. faecalis МПМ 050000 (ATCC 29212).

Жирнокислотний склад клітинних ліпідів ентерококів досліджували методом хроматомасспектрометрії. Метилові ефіри жирних кислот отримували за методом [Жеребило, Вишталюк, 1991]. Дослідження складу метилових ефірів жирних кислот проводили на хроматомасспектометричній системі Agilent 6890N/5973 inert (Aligent Technology, USA). Обробку даних хроматомасспектрометричного аналізу проводили за допомогою комп'ютерної програми ChemStation та інтегрованої бази даних мас-спектрів NIST 02, а також стандарту метилових ефірів жирних кислот бактерій (Supelco, № 4708-U, USA).

Антагоністичні властивості ентерококів вивчали з використанням методу відстроченого антагонізму [Егоров, 1986]. Тест-культурами слугували референс-штами умовно патогенних мікроорганізмів: Pseudomonas aeruginosa УКМ B-900 (ATCC 9027), Proteus vulgaris УКМ B-905 (ATCC 6896), Escherichia coli УКМ B-906 (ATCC 25922 (F-50)), Bacillus cereus УКМ B-908 (ATCC 11778), Staphylococcus aureus УКМ B-904 (ATCC 25923(F-49)), Staphylococcus epidermidis УКМ B-919 (ATCC 12228), Klebsiella pneumoniae УКМ B-920 (ATCC 10031), Salmonella enterica УКМ B-921 (NCTC 6017).

Вплив компонентів середовища MRS на антагоністичну активність ентерококів щодо референс-штамів вивчали на модифікованих середовищах, які готували шляхом вилучення зі складу стандартного середовища MRS наступних компонентів: 1- глюкози, 2- твіну-80, 3- неорганічних солей (K2HPO4, MgSO4, MnSO4), 4- солей органічних кислот (ацетат натрію, цитрат амонію) та 5- складних джерел азоту (пептон, м'ясний, печінковий, дріжджовий екстракти).

Наявність структурних генів ентероцину А (entA), В (entB), Р (entP) визначали методом ПЛР з використанням праймерів, специфічних до послідовностей генів ентероцинів: А [Aymerich et al., 1996], В [Casaus et al., 1997], Р [Cintas et al., 1997]. Три випадково обрані продукти ампліфікації з кожною парою праймерів були сиквеновані. Визначення нуклеотидних послідовностей ПЛР-фрагментів проводили на генетичному аналізаторі ABІ PRІSM 3130 (Applіed Bіosystems, США), з використанням набору BіgDye®Termіnator v3.1, відповідно інструкції виробника. Отримані нуклеотидні послідовності порівнювали з послідовностями ДНК бази даних GenBank, використовуючи програму BLAST 2.2.17

Адгезивну активність ентерококів досліджували в експерименті «in vitro» на клітинах букального епітелію людини. Підраховували кількість бактеріальних клітин на 50 букальних клітинах і визначали індекс адгезивності (ІА) [Choo et al., 1982].

Антибіотикорезистентність визначали з використанням диско-дифузійного методу й методу серійних розведень в агарі [Наказ МОЗ України від 05.04.2007 № 167].

Статистичну обробку даних проводили за загальноприйнятими методами варіаційної статистики з використанням пакетів комп'ютерної програми «Statistika 7.0» (Stat Soft, Inc. США).

Розділ 3. Ідентифікація ентерококів

Морфолого-культуральні й фізіолого-біохімічні властивості ентерококів. Досліджувані штами являли собою грампозитивні коки овальної форми діаметром близько 0,6-1,0 мкм. У мазках розташовані в коротких ланцюжках, парами чи поодинці. Всі культури каталазонегативні, не містять дихальних систем з цитохромом, не утворюють газ із глюкози. Ростуть в діапазоні температур 10єС-45єС, у середовищі з 6,5% NaCl, у середовищі з рН 9,6 і після прогрівання при 60°С протягом 30 хв. Всі ці ознаки є характерними для представників роду Enterococcus. Всі штами сквашували молоко через 24 години, утворюючи щільний згусток. Кінцева кислотність у молоці через 14 діб культивування складала від 80 до 142 градусів Тернера (°Т). Досліджені штами нерухливі. При культивуванні на кров'яному агарі Колумбія вони утворювали колонії білого кольору, не продукували жовтий пігмент. Вивчені культури добре росли на селективному для ентерококів середовищі «Ентерокок-агар» і утворювали колонії різних типів. У 2 з 58 штамів колонії мали інтенсивний темно-бордовий колір і металевий блиск, що свідчить про відновлення ТТХ. Інші штами утворювали колонії світло-рожевого кольору та світло-рожеві з темно-фіолетовим темно-бордовим центром.

Порівняльні дослідження фенотипових ознак первинно виділених культур і після їх довготривалого зберігання показало, що родові ознаки й здатність до зброджування деяких вуглеводів, а саме манози, галактози, мальтози, глюкози, інозиту є стабільними. Однак, у тестах на зброджування вуглеводів, наведених на рис. 1, виявлені розбіжності, особливо у відношенні гліцерину, арабінози, маніту й цукрози. Неспівпадання результатів тестів може бути обумовлене як зміною здатності до зброджування зазначених вище вуглеводів внаслідок неодноразової ліофілізації та довготривалого зберігання, так і бути наслідком використання різних методичних підходів при визначенні даних ознак - традиційного методу та АРІ-тестування.

Фенотипова ідентифікація. Згідно чотирьох традиційних схем видової ідентифікації, основними диференційними ознаками є зброджування маніту, сорбіту, рафінози, арабінози, цукрози, сорбози, рибози, лактози, інуліну, крохмалю, глікогену, метил-б-D-глюкопіранозиду та прояв б-галактозидазної, в-галактозидазної, піродоніларіламідазної, аргініндигідрогеназної й лужнофософотазної активностей. Крім того, на рівні виду необхідно враховувати рухливість, здатність до утворення жовтого пігменту й відновлення ТТХ.

За комплексом фенотипових ознак досліджені штами були віднесені нами до видів E. faecium (26-33 штами, в залежності від схеми ідентифікації), E. durans (9-20 штамів), E hirae (7-11 штамів), E. faecalis (2-5 штамів).

Молекулярно-генетична ідентифікація. Родова належність досліджуваних штамів була підтверджена з використанням родоспецифічних праймерів. Видову належність визначали із застосуванням видоспецифічних праймерів до внутрішнього міжгенного спейсерного району 16S-23S рРНК, що транскрибується, та гену супероксиддисмутази (sodA). За даними ПЛР-аналізу штами були віднесені до видів E. faecium (26 штамів), E. durans (18 штамів), E hirae (9 штамів), E. faecalis (2 штами).

Фенотипова ідентифікація повністю співпала з даними ПЛР-аналізу у 20 штамів E. faecium, 2 штамів E. durans і 2 штамів E. faecalis. У інших штамів виявлено розбіжності (рис. 2), а саме, штами, визначені за даними ПЛР як E. durans, чи E. hirae, були ідентифіковані мікробіологічними методами як E. faecium, штами E. hirae - як E. durans і навпаки. За даними трьох схем (Facklam and Collins, Manero and Blanch, Klein) штами E. durans визначались як E. faecalis. Штами E. faecium, E. durans, E hirae, визначені ПЛР, не були ідентифіковані до виду за фенотиповими ознаками. За схемою Klein деякі штами E. durans та Enterococcus sp. були віднесені до роду Lactococcus. Таким чином, використані чотири схеми мікробіологічної ідентифікації та тест-система АРІ 20 Strep відрізнялися за здатністю ідентифікувати різні види ентерококів.

Жирнокислотний склад клітинних ліпідів ентерококів. У літературі є поодинокі роботи, у яких використовують хемотаксономічні ознаки, зокрема жирнокислотний склад клітинних ліпідів, для видової ідентифікації ентерококів [Amstein, 1973; Седов, 1985]. Нами досліджено жирнокислотний склад штамів ентерококів з метою їх видової ідентифікації. Використовуючи метод хроматомасспектрометрії у досліджуваних штамів виявлені насичені і ненасичені жирні кислоти довжиною ланцюга від 14 до 19 атомів вуглецю. У всіх вивчених штамів виявлені гексадеканова (С16:0), циклопропанова (С19:0cyclo), цис-ізомер октадеценової (cC18:1) та октадеканова (C18:0) кислоти. Тетрадеканова (C14:0) кислота була визначена у 51 з 58 (88%) штамів ентерококів, пентадеканова (C15:0)- у 18 (31%) штамів, гексадеценова (C16:1) - у 44 (76%) штамів, транс-ізомер октадеценової (тС18:1) кислоти - у 40 (69%) штамів. Домінуючими жирними кислотами є циклопропанова та гексадеканова. Штами E. faecalis характеризувались меншим вмістом циклопропанової кислоти, порівняно з видами

E. faecium і E. hirae, та більшою кількістю цис- і транс-ізомерів октадеценової кислоти (р?0,05). Крім того, у штамів E. faecalis була відсутня пентадеканова кислота (табл. 1).

Таблиця 1 Жирнокислотний склад клітинних ліпідів ентерококів

Жирна кислота	Вид, вміст жирних кислот, М ± m (%)
	E. faecium	E. durans	E. hirae	E. faecalis	Enterococcus sp
С14:0	2,3±0,24	2,29±0,49	1,88±0,33	2,77±1,36	3,27±1,13
С15:0	0,28±0,07	0,17±0,08	0,36±0,18	0	0,23±0,23
С16:0	32,07±1,54	31,44±1,71	33,07±1,53	22,56±0,66	32,53±1,05
С16:1	1,69±0,28	1,51±0,42	2,06±0,56	2,31±1,38	2,08±1,19
С18:0	2,59±0,17	2,74±0,34	2,76±0,21	2,08±0,61	2,40±0,30
сС18:1	15,39±1,27	15,97±1,42	14,61±1,09	28,12±6,24	14,11±1,53
тС18:1	1,14±0,19	1,28±0,21	1,54±0,43	3,4±0,37	1,52±0,16
С19:0cyclo	38,49±0,82	37,29±2,87	39,52±083	26,98±6,49	37,65±1,14

На рис. 3 наведена дендрограма подібності досліджених штамів ентерококів за жирнокислотним складом клітинних ліпідів. Нами не отримано чіткого об'єднання в окремі кластери штамів ентерококів однієї видової належності. Отже, не дивлячись на певні відмінності у жирнокислотному складі між штамами ентерококів різних видів, кількісний та якісний вміст жирних кислот не дав змоги диференціювати досліджені штами за видовою належністю. штам ентерокок клітина епітелій

Таким чином, нами була визначена видова належність колекційних штамів ентерококів у відповідності зі сучасною таксономією з використанням різних методів ідентифікації Оптимальною схемою є використання фенотипових ознак з обов'язковим підтвердженням молекулярно-генетичною ідентифікацією.

Розділ 4. Біологічна Активність Ентерококів

Антагоністичні властивості ентерококів. Ентерококи проявляють антагоністичні властивості щодо референс-штамів умовно патогенних мікроорганізмів. Досліджувані штами виявили активність по відношенню до грампозитивних і грамнегативних умовно патогенних мікроорганізмів. Більшість з них пригнічувала ріст P. aeruginosa, S. epidermidis та P. vulgaris (рис. 4).

Антагоністична дія залежала від видової належності штамів. Зокрема, активність по відношенню до S. aureus, P. aeruginosa та P. vulgaris виявили переважно штами E. faecium, тоді як по відношенню до інших тест-культур - штами E. durans. Штами E. hirae не виявляли антагоністичної дії щодо K. pneumoniae (рис. 4).

Половина штамів, переважно виду E. faecium, виявляли вузький спектр дії, обмежений в основному активністю щодо P. aeruginosa, P. vulgaris, B. cereus, S. epidermidis. Інша частина досліджуваних штамів, серед них більшість складали штами виду E. durans, виявила широкий спектр антагоністичної дії.

Вплив компонентів поживного середовища на антагоністичну активність ентерококів. Поодинокі літературні дані [Todorov and Dicks, 2005] свідчать, що склад поживного середовища може впливати на антагоністичну активність молочнокислих бактерій. Нами показано, що відсутність окремих компонентів у середовищі MRS впливала на прояв антагонізму ентерококів щодо умовно патогенних мікроорганізмів (рис. 5). Антагоністична активність щодо E. coli була відсутня на середовищі без глюкози, твіну-80 чи органічних солей, щодо K. pneumoniae і S. enterica - на середовищі без глюкози, щодо S. aureus - за відсутності твіну-80. По відношенню до інших тест-культур не всі досліджувані штами ентерококів втрачали антагоністичну дію при вирощуванні на середовищі без глюкози, твіну-80, неорганічних, органічних солей чи складних джерел азоту.

Таким чином, відсутність окремих компонентів середовища в меншій мірі впливала на антагоністичну активність ентерококів щодо P. aeruginosa, P. vulgaris, B. cereus, на відміну від інших тест-культур, що свідчить про різну природу антагоністичної дії.

Визначення структурних генів ентероцинів методом полімерної ланцюгової реакції. Відомо, що основним чинником антагонізму молочнокислих бактерій є молочна кислота - кінцевий продукт зброджування вуглеводів. Але дані літератури свідчать, що антагоністична дія щодо умовно патогенних мікроорганізмів може бути обумовлена дією бактеріоцинів [Theppangna et al., 2007]. Нами було досліджено наявність генів найпоширеніших бактеріоцинів ентерококів - ентероцинів А, В і Р з використанням методу полімеразної ланцюгової реакції. В результаті проведення ПЛР-аналізу, у 64% штамів ентерококів був отриманий позитивний результат з 1-3 парами праймерів. Оскільки позитивний контроль не використовували, було проведено секвенування довільно обраних продуктів, отриманих в результаті ампліфікації з кожною парою праймерів. Нуклеотидні послідовності ампліконів виявили гомологію з відповідними послідовностями генів ентероцинів А, В і Р, депонованими в базі даних GenBank.

Найпоширенішим серед досліджених штамів є ген ентероцину Р. Він виявлений у 44% штамів, переважно виду E. durans. Ген ентероцину А, комбінація генів А/В і А/В/Р була виявлена виключно у штамів E. faecium.

На рис. 6 наведено дендрограму подібності досліджуваних штамів за спектром активності по відношенню до умовно патогенних мікроорганізмів та наявності генів ентероцинів. Нами не виявлено залежності між наявністю структурних генів ентероцинів А, В, Р та спектром антагоністичної активності ентерококів. Гени ентероцинів виявлені у 2 з 3 штамів без антагоністичної дії. Штами з вузьким спектром містили до 3 генів ентероцинів, тоді як у штамів з широким спектром активності гени ентероцинів А, В і Р були відсутні, або виявлено лише один ген. Штами ентерококів, що містили однакові гени, мали різний спектр активності (рис. 6).

Адгезивні властивості ентерококів. Нами показано, що всі досліджені штами були здатні до адгезії на клітинах букального епітелію в експерименті in vitro. За значенням індексу адгезивності (ІА), ентерококи були розділені на групи (рис. 7). Більшість досліджених штамів мали індекс адгезивності від 5 до 10 бактеріальних клітин на букальну клітину. Для штамів виду E. hirae і штамів Enterococcus sp. індекс адгезивності не перевищував 10, для штамів видів E. durans і E. faecalis - 20, тоді як 3 штами виду E. faecium мали більш високий індекс адгезивності.

Значення індексу адгезивності не залежало від виду ентерококів, а носило лише штамоспецифічний характер, про що свідчить відсутність статистично достовірної різниці (р>0,05) між середніми показниками ІА (рис. 8).

Стійкість ентерококів до антибіотиків. Нами визначено стійкість ентерококів до антибіотиків, що відносяться до різних класів за механізмом дії. Досліджені штами в переважній більшості були стійкими до налідиксової кислоти, оксациліну, низьких концентрацій аміноглікозидів, оксациліну, деяких цефалоспоринів і фторхінолів (рис. 9). За даними літератури [Marothi et al., 2005] резистентність до даних антибактеріальних препаратів є природною, характерною для представників роду Enterococcus. Більшість штамів були чутливі до антибіотиків пеніцилінового ряду, карбапенемів, ванкоміцину, тетрациклінів, хлорамфеніколу.

Резистентність до окремих препаратів залежала від видової належності штамів. Так, до карбеніциліну і хлорамфеніколу стійкість виявили тільки штами E. faecium, до доксицикліну - тільки штами E. hirae, до більшості інгібіторів синтезу клітинної стінки - штами E. faecium і E. durans.

Мінімальні інгібуючі концентрації (МІК) стрептоміцину і гентаміцину не перевищували 500 мкг/мл і не носили видоспецифічного характеру (рис. 10). МІК канаміцину залежала від видової належності досліджуваних штамів: МІК для штамів E. durans, E. faecalis, Enterococcus sp. не перевищувала 1000 мкг/мл, тоді як штами E. faecium витримували більш високі концентрації - до 8000 мкг/мл.

Скринінг штамів ентерококів, перспективних для практичного використання. Враховуючи факт, що представники роду Enterococcus є одними зі збудників внутрішньо лікарняних інфекцій, особливе значення має виявлення набутої стійкості, оскільки вона вважається одним з факторів вірулентності ентерококів. Тому нами було проаналізовано стійкість досліджених штамів до антибіотиків, що використовуються для лікування ентерококових інфекцій, а саме: ванкоміцину, бензилпеніциліну, ампіциліну, еритроміцину, тетрацикліну, доксицикліну, хлорамфеніколу, норфлоксацину, ципрофлоксацину, фурадоніну і високим концентраціям гентаміцину (МІК ?500 мг/л) і стрептоміцину (МІК ?2000 мг/л) (рис. 11). У переважної більшості штамів ентерококів виявлено стійкість хоча б до одного з зазначених антибіотиків. 9 (15%) штамів були помірно стійкими, переважно до ципрофлоксацину.

Штами, що є стійкими до зазначених антибактеріальних препаратів, не придатні для використання у вигляді живих клітин у складі пробіотиків та заквасок. Але вони можуть бути використані для отримання біологічно активних речовин з антимікробною дією.

Виявлено, що тільки 3 штами E. durans були чутливими до таких антибіотиків. З точки зору безпечності вони є задовільними для практичного використання. Два з них, E. durans 98Д і 167Д проявляють широкий спектр антагоністичної активності щодо умовно патогенних мікроорганізмів (пригнічують ріст 5 і 8 тест культур, відповідно). Штам E. durans 146Д був активним тільки щодо S. epidermidis (табл. 2). Штам E. durans 167Д проявляв антагоністичну активність щодо P. aeruginosa не залежно від складу середовища, тоді як його антагонізм щодо інших тест-культур залежала від наявності окремих компонентів середовища MRS. Штами E. durans 98Д і E. durans 146Д пригнічували ріст умовно патогенних мікроорганізмів тільки на повноцінному середовищі MRS.

ПЛР-аналіз з праймерами, специфічними до відповідних структурних генів ентероцинів, виявив ген ентероцину Р у штаму E. durans 98Д, гени ентероцинів А і Р у штаму E. durans 146Д, гени ентероцинів В і Р у штаму E. durans 167Д. Дані штами здатні до адгезії на букальних клітинах людини в досліді in vitro. Індекси адгезивності штамів E. durans 98Д, 146Д і 167Д складали 5,16±0,53, 6,46±0,28 і 4,81±0,18, відповідно.

Таблица 2 Вплив компонентів середовища на антагоністичну активність штамів E. durans щодо умовно патогенних мікроорганізмів

штам	Тест-культура	базовеMRS	середовище МRS без
			глюкоза	твін-80	неорганічні солі	ацетат і цитрат	складні джерела азоту
E. durans 98Д	P. aeruginosa	+	-	-	-	-	-
	S. enterica	+	-	-	-	-	-
	K. pneumoniae	+	-	-	-	-	-
	B. cereus	+	-	-	-	-	-
	S. epidermidis	+	-	-	-	-	-
E. durans 167Д	P. aeruginosa	++	+	+	+	+	+
	P. vulgaris	+	+	-	+	+	+
	E. coli	++	-	-	-	-	-
	K. pneumoniae	+	-	-	+	-	-
	S. enterica	+	-	-	+	-	-
	B. cereus	++	-	-	+	-	+
	S. epidermidis	++	-	-	-	-	-
	S. aureus	++	+	-	-	-	+
E. durans 146Д S. epidermidis	+	-	-	-	-	-
Примітка: «+» - помірна активність, зона затримки росту 5-10 мм; «++» - сильна активність, зона затримки росту ?11 мм; «-»- активність відсутня, зона затримки росту 0-4 мм

ВИСНОВКИ

В роботі вивчено морфолого-культуральні й фізіолого-біохімічні властивості штамів ентерококів, ізольованих з шлунково-кишкового тракту людей похилого віку. Визначено таксономічне положення у відповідності зі сучасною систематикою та досліджена їх біологічна активність. Отримані дані дали змогу зробити наступні висновки.

1. Вперше проведена комплексна ідентифікація штамів ентерококів колекції культур молочнокислих бактерій Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАНУ з використанням мікробіологічних, молекулярно-генетичних і хемотаксономічних методів. Показано, що досліджені штами відносяться до видів: E. faecium (45% штамів), E. durans (31%), E. hirae (16%) та E. faecalis (3%).

2. Виявлені розбіжності фенотипових ознак на зброджування вуглеводів, що проводились традиційними методами й з застосуванням стандартизованих тест-систем. Вперше проаналізовано ефективність видової ідентифікації з використанням чотирьох схем диференціації та тест-системи АРІ 20 Strep порівняно з молекулярно-генетичною ідентифікацією. Найбільше традиційні схеми відрізнялися за точністю ідентифікації видів E. durans і E. hirae, найменшу ефективність мала тест-система АРІ 20 Strep. Показано, що аналіз жирнокислотного складу клітинних ліпідів не є ефективним для диференціації близькоспоріднених видів.

3. Ентерококи, ізольовані з шлунково-кишкового тракту людей похилого віку, не втрачають антагоністичної активності після довготривалого зберігання. Спектри антагоністичної дії ентерококів залежали від їх видової належності. Найбільш активними щодо P. aeruginosa, P. vulgaris і S. epidermidis були штами E. faecium, тоді як по відношенню до E. coli, K. pneumoniae, S. enterica, B. сereus - штами E. durans. Штами виду E. hirae не пригнічували ріст K. pneumoniae.

4. Встановлено, що антаногістичні властивості ентерококів щодо умовно патогенних мікроорганізмів залежать від складу поживного середовища і є штамоспецифічними.

5. Виявлено структурні гени ентероцинів А, В і Р у 64% досліджених штамів ентерококів. Вперше показана наявність генів ентероцинів Р і В у виду E. hirae та комбінацій генів А/Р, В/Р у штамів виду E. durans. Не виявлено залежності між спектром антагоністичної активності щодо умовно патогенних мікроорганізмів і наявності структурних генів ентероцинів А, В і Р.

6. Встановлено, що досліджені штами ентерококів адгезують до клітин букального епітелію людини. Індекс адгезивності коливався від 2,62±0,25 до 24,46±1,02 бактеріальних клітин/букальну клітину і не залежав від видової належності.

7. У більшості досліджених штамів ентерококів виявлено стійкість до антибіотиків, що використовуються для лікування ентерококових інфекцій. Показано, що перспективними для використання у біотерапії є три штами E. durans (98Д, 146Д і 167Д), завдяки чутливості до основних антибактеріальних препаратів.

СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Гармашева І.Л. Антибіотикочутливість ентерококів, виділених із шлунково-кишкового тракту довгожителів / І.Л. Гармашева, Н.К. Коваленко // Мікробіол. журн.- 2008.- Т. 70, № 1.- с. 45-51. (Здобувачем самостійно проведено дослідження антибіотикочутливості штамів ентерококів та підготовлена стаття до друку).

2. Гармашева І.Л. Антагоністичні властивості ентерококів, виділених із шлунково-кишкового тракту довгожителів / І.Л. Гармашева, Н.К. Коваленко // Мікробіол. журн.- 2008.- Т. 70, № 4.- с. 31-39. (Здобувачем самостійно проведено дослідження антагоністичних властивостей штамів ентерококів по відношенню до умовно патогенних мікроорганізмів та підготовлена стаття до друку).

3. Гармашева І.Л. Фізіологічні властивості ентерококів після тривалого зберігання / І.Л. Гармашева, Н.К. Коваленко // Мікробіол. журн.- 2008.- Т. 70, № 5.- С. 36-41. (Здобувачем самостійно проведено дослідження фізіологічних властивостей штамів ентерококів та підготовлена стаття до друку).

4. Гармашева І.Л. Ідентифікація ентерококів / І.Л. Гармашева, Н.К. Коваленко, Л.Б. Зелена // Мікробіол. журн.- 2009.- Т. 71, № 2.- C. 3-12. (Здобувачем самостійно проведено ідентифікація штамів ентерококів та підготовлена стаття до друку).

5. Garmasheva I. Antibiotic resistance in enterococci isolated from intestinal tract of long-livers in 1978-1981 / I. Garmasheva // Modern problems of microbiology and biotechnology: book of abstracts the young scientists' and students' international scientific conference (Odessa, 28-31, May 2007).- Odessa.- 2007.- P. 37.

6. Гармашева І. Фізіологічні та біологічні властивості ентерококів після тривалого зберігання / І. Гармашева // Актуальні проблеми екології мікроорганізмів: Матеріали науково-практичної конференції (Тернопіль, 7-8 вересня 2007 р.).- Тернопіль.- 2007.- С. 20-22.

7. Гармашева І. Визначення систематичного положення ентерококів з використанням мікробіологічних та молекулярно-генетичних методів / І. Гармашева, Л. Зелена, Н. Коваленко // Молодь і поступ біології: Збірник тез ІV Міжнародної наукової конференції студентів і аспірантів (Львів, 7-10 квітня 2008 р.). - Львів, 2008. - С. 306-307.

8. Гармашева І.Л. Антагоністичні властивості ентерококів / І.Л. Гармашева, Л.Б. Зелена // Біологія: від молекули до біосфери: Матеріали ІІІ Міжнародної конференції молодих науковців (Харків, 18-21 листопада 2008 р.).- Харків.- 2008.- С. 219-220.

9. Гармашева И.Л. Резистентность энтерококков к аминогликозидам//Биология наука XXI века: Сборник тезисов 12-й Международной пущинской школы-конференции молодых ученых (Пущино, 10-14 ноября 2008 г.).- Пущино.- 2008.- С. 257-258.

10. Гармашева І. Жирнокислотний склад бактерій роду Enterococcus / І. Гармашева, А. Остапчук // Молодь і поступ біології: Збірник тез V Міжнародної наукової конференції студентів і аспірантів (Львів, 5-12 травня 2009 р..). - Львів, 2009. - С.

АНОТАЦІЯ

Гармашева І.Л. Таксономічне положення і біологічна активність ентерококів. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.07 - мікробіологія. - Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, Київ, 2009.

Проведена ідентифікація у відповідності зі сучасною систематикою штамів ентерококів, що тривалий час зберігались в колекції. З застосуванням мікробіологічних і молекулярно-генетичних методів штами віднесені до видів Enterococcus faecium, E. durans, E. hirae, E. faecalis. Оцінена ефективність традиційних фенотипових схем диференціації ентерококів в порівнянні з молекулярно-генетичною ідентифікацією. Визначено жирнокислотний склад клітинних ліпідів ентерококів. Досліджено антагоністичні властивості ентерококів щодо референс-штамів умовно патогенних мікроорганізмів людини в залежності від складу поживного середовища. Виявлено структурні гени ентероцинів А, В, Р у 64 % штамів ентерококів. Визначена адгезивна активність на букальних клітинах людини in vitro та антибіотикорезистентність ентерококів. Відібрано три штами E. durans, що є перспективними для практичного використання в пробіотикотерапії.

Ключові слова: ентерококи, ідентифікація, антагоністична активність, адгезивність, антибіотикорезистентність, пробіотики.

Гармашева И.Л. Таксономическое положение и биологическая активность энтерококков. - Рукопись.

Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.07 - микробиология. - Институт микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного НАН Украины, Киев, 2009.

Диссертация посвящена определению таксономического положения энтерококков в соответствии с современной систематикой. Изучена биологическая активность штаммов энтерококков, выделенных из пищеварительного тракта людей пожилого возраста.

Исследованы морфолого-культуральные и физиолого-биохимические свойства штаммов энтерококков после длительного хранения в лиофилизированном виде. Выявлена нестабильность признаков сбраживания углеводов. Проведена видовая идентификация по фенотипическим свойствам с использованием классических схем дифференциации и тест-системы АРІ 20 STREP. Результаты микробиологической идентификации были проверены с применением метода ПЛР с видоспецифическими праймерами к последовательностям межгенного внутреннего транскрибируемого спейсерного региона 16S-23S и гена супероксиддисмутазы (sodA). Штаммы отнесены к видам Enterococcus faecium (26 штаммов), E. durans (18 штаммов), E. hirae (9 штаммов), E. faecalis (2 штамма).

Определен жирнокислотный состав клеточных липидов энтерококков. Доминирующими жирными кислотами являются циклопропановая и гексадекановая. Анализ жирнокислотного состава изученных штаммов энтерококков является не достаточным для четкой дифференциации близкородственных видов.

Изучена антагонистическая активность энтерококков по отношеню к референтным штаммам условно патогенных микроорганизмов человека. Штаммы энтерококков проявили активность в отношении грампозитивных и грамнегативных условно патогенных микроорганизмов при культивировании на среде MRS. Большинство из них угнетало рост P. aeruginosa, S. epidermidis и P. vulgaris Антагонистическое действие зависело от видовой принадлежности штаммов. Так, активность в отношении S. aureus, P. aeruginosa и P. vulgaris проявляли в основном штаммы E. faecium, тогда как по отношению к другим тест-культурам - штаммы E. durans. Штаммы вида E. hirae не проявляли антагонизма в отношении K. pneumoniae. Большинство штаммов E. faecium имели узкий спектр действия, ограниченный в основном активностью по отношению к P. aeruginosa, P. vulgaris, B. cereus, S. epidermidis. Другая часть исследованных штаммов, и среди них большинство штаммов E. durans, проявили широкий спектр антагонистического действия.

Выявлено влияние компонентов питательной среды на проявления антагонистичесого действия энтерококков в отношении тест-культур условно патогенных микроорганизмов. Большинство исследлованных штаммов энтерококков не проявляли антагонистического действия при выращивании на среде без глюкози, твина-80, неорганических, органических солей или сложных источников азота.

С использованием метода ПЦР с праймерами, специфическими к структурным генам энтероцинов, у 64% штаммов ентерококков получен позитивный результат. Ген энтероцина Р обнаружен у 44% штаммов, преимущественно вида E. durans. Ген энтероцина А, комбинации генов А/В и А/В/Р выявлены исключительно у штаммов E. faecium. Не обнаружено зависимости между наличием структурных генов энтероцинов А, В, Р и спектром антагонистической активности энтерококков. Гены энтероцинов выявлены у 2 из 3 штаммов без антагонистичекого действия. Штаммы с узким спектром содержали до 3 генов энтероцинов, тогда как у штаммов с широким спектром активности гены энтероцинов А, В и Р не выявлены. Энтерококки с одинаковой комбинацией данных генов, имели разный спектр активности. Энтерококки проявили адгезивную активность по отношению к буккальным клеткам человека. Среднее значение индекса адгезивности не зависело от вида энтерококков, а имело штаммоспецифический характер.

Проанализирована устойчивость к антибиотиками, которые используются при лечении энтерококковых инфекций, а именно: ванкомицину, бензилпенициллину, ампициллину, эритромицину, тетрациклину, доксициклину, хлорамфениколу, норфлоксацину, ципрофлоксацину, фурадонину и высоким концентрациям гентамицина (МИК ?500 мг/л) и стрептомицина (МИК ?2000 мг/л). У подавляющего большинства штаммов энтерококков выявлена устойчивость хотя бы к одному из этих препаратов. 9 штамів (15%) обнаруижили умеренную устойчивость, в основном к ципрофлоксацину. Штаммы, устойчивые к данным препаратам, не могут быть использованы в виде живых клеток в составе пробиотиков или заквасок. Но они могут служить продуцентами биологически активных веществ с антимикробным действием. С точки зрения безопасности для практического использования, были отобраны три штамма E. durans, чувствительные к перечисленным антибиотикам.

Ключевые слова: энтерококки, идентификация, антагонистическая активность, адгезивность, антибиотикорезистентность, пробиотики.

Garmasheva L. Inna. Taxonomic position and biological activity of enteococci. - Manuscript.

The candidate degree thesis by speciality 03.00.07 - microbiology. Zabolotny Institute of Microbiology and Virology of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2009.

Identification of collection enterococci strains according to modern systematic was carried out. Strains were identified as Enterococcus faecium, E. durans, E. hirae, E. faecalis using microbiologal and molecular-genetic methods. Fatty acid composition of cell lipids was determined. Effectiveness of traditional phenotypic differentiation schemes of enterococci in comparison with molecular-genetic identification was evaluated. Antagonistic activities of enterococci against reference strains of opportunisitc human pathogens were investigated depending on nutrient medium composition. Structural genes of enterocin A, B, P were detected in 64% strains of enterococci. Adhesive properties in vitro on human buccal cells and resistance to antibiotics were determined. Three strains of E. durans that are perspective for practical use as probiotic are selected.

Key words: enterococci, identification, antagonistic activity, adgesiveness, antibiotic resistance, probiotics.

Размещено на Allbest.ru

...