Стан системи ліпоперекисного гомеостазу і антиоксидантного захисту в парієтальних клітинах за умов розвитку хронічного атрофічного гастриту щурів

Размещено на http://www.allbest.ru/

КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

імені ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

УДК 577.152.193:616.3-002.27

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

СТАН СИСТЕМИ ЛІПОПЕРЕКИСНОГО ГОМЕОСТАЗУ І АНТИОКСИДАНТНОГО ЗАХИСТУ В ПАРІЄТАЛЬНИХ КЛІТИНАХ ЗА УМОВ РОЗВИТКУ ХРОНІЧНОГО АТРОФІЧНОГО ГАСТРИТУ ЩУРІВ

03.00.04 - біохімія

ГАЙДА ЛЮДМИЛА МИКОЛАЇВНА

Київ - 2009

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано у науково-дослідній лабораторії «Фізико-хімічної біології» біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка.

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор

Остапченко Людмила Іванівна,

Київський національний університет

імені Тараса Шевченка,

декан біологічного факультету.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Цудзевич Борис Олександрович,

Київський національний університет

імені Тараса Шевченка,

професор-консультант біологічного факультету;

доктор біологічних наук, професор

Великий Микола Миколайович,

Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна

НАН України,

провідний науковий співробітник

лабораторії медичної біохімії .

Захист дисертації відбудеться ”23” березня 2009 року о 14⁰⁰ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.001.24 Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою: м. Київ, просп. академіка Глушкова, 2, корпус 12, біологічний факультет, ауд. 434.

Поштова адреса: 01033, м. Київ, вул. Володимирська, 64, Київський національний університет імені Тараса Шевченка, біологічний факультет, спеціалізована вчена рада Д 26.001.24.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою: м. Київ, вул. Володимирська, 58.

Автореферат розіслано ”20” лютого 2009 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Т.Р. Андрійчук

АНОТАЦІЯ

Гайда Л.М. Стан системи ліпоперекисного гомеостазу і антиоксидантного захисту в парієтальних клітинах за умов розвитку хронічного атрофічного гастриту щурів. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 - біохімія. - Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Київ, 2009.

Досліджено стан системи перекисного окислення ліпідів та функціонування системи антиоксидантного захисту та виявлено їх взаємозв'язок з іншими ланками клітинного метаболізму (апоптотичними білками Вах і Bcl-2, протеїнкіназою А, протеїнкіназою С) в парієтальних клітинах за умов розвитку хронічного атрофічного гастриту щурів. Виявлене нами компенсаторне підвищення активності СОД та каталази не впливало на процеси ліпопероксидації, що призводило до накопичення ТБК-активних продуктів, дієнових кон'югатів та шиффових основ протягом всіх етапів розвитку експериментальної патології. Показано, що резервна потужність глутатіонової антиоксидантної системи в парієтальних клітинах є достатньою для того, щоб забезпечити адаптивну відповідь у гострий період захворювання за рахунок підвищення внутрішньоклітинного пулу відновленого глутатіону, проте є недостатньою для того, щоб у період виявлених атрофічних змін слизової оболонки шлунка попередити його зниження в динаміці розвитку хронічного атрофічного гастриту щурів. Зміни в функціонуванні глутатіонової ланки антиоксидантного захисту в гепатоцитах, направлені на підтримання компенсаторно-адаптивних реакцій в умовах розвитку ХАГ. Зростання активності протеїнкіназ А та С свідчить про посилення секреції парієтальними клітинами соляної кислоти, яка виступає додатковим патогенетичним фактором в період гострих запальних процесів слизової оболонки шлунка. Продемонстровано переважання вмісту проапоптотичного білка Вах над антиапоптотичним Bcl-2 при одночасному виснаженні глутатіонової ланки антиоксидантного захисту та наростанні атрофічних змін слизової оболонці шлунка.

Отримані результати свідчать про суттєві порушення функціонування систем перекисного окислення ліпідів та антиоксидантного захисту і залучення їх до процесів розвитку хронічного атрофічного гастриту щурів.

Ключові слова: Хронічний атрофічний гастрит, парієтальні клітини, перекисне окислення ліпідів, глутатіон, глутатіонзалежні ферменти, глюкозо-6-фосфатдегідрогеназа, протеїнкіназа С, протеїнкіназа А, білки ВсІ-2, Вах.

АННОТАЦИЯ

Гайда Л.Н. Состояние системы липоперекисного гомеостаза и антиоксидантной защиты в париетальных клетках в условиях развития хронического атрофического гастрита крыс. - Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04 - биохимия. - Киевский национальный университет имени Тараса Шевченко, Киев, 2009.

Работа посвящена исследованию состояния процессов перекисного окисления липидов и функционирования антиоксидантной защиты, а также выявлению их взаимосвязи с другими звеньями клеточного метаболизма (активностью цАМФ- та Са²⁺-фосфолипидзависимых протеинкиназ, содержанием апоптотических белков Вах и Bcl-2) в париетальных клетках в условиях развития хронического атрофического гастрита крыс.

Выявленное нами компенсаторное увеличение супероксиддисмутазной и каталазной активности не влияло на процессы пероксидации, что привело к накоплению ТБК-активных продуктов, шиффовых оснований и диеновых конъюгатов в динамике развития хронического атрофического гастрита.

Ключевая роль в защите клеток от окислительного стресса принадлежит системе глутатиона. Показано, что через 1, 2, 3 недели развития ХАГ уровень восстановленного глутатиона увеличивался, что свидетельствует об активации глутатионовой антиоксидантной системы в период острого воспаления. Снижение содержания глутатиона через 4 и 5 недель развития патологии сопровождалось наростанием морфолого-гистологических признаков атрофии слизистой оболочки желудка.

Снижение глутатионпероксидазной активности в париетальных клетках в течениие всего периода развития атрофического гастрита свидетельствует об инициации процессов липопероксидации и накопления ее продуктов. Ингибирование глутатонтрансферазной, глутатионпероксидазной активности через 6 недель развития ХАГ на фоне снижения уровня восстановленного глутатиона свидетельствует об истощении глутатионовой системы и может быть причиной хронизации патологического процесса.

Таким образом, резервная мощность глутатионовой антиксидантной системы достаточна для того, чтобы за счет повышения уровня глутатиона обеспечить адаптивный ответ в острый период заболевания, но недостаточна, для того чтобы предупредить его истощение в париетальних клетках в период выявленых атрофических изменений слизистой оболочки желудка в динамике развития ХАГ.

Известно, что избыточная генерация активных форм кислорода и изменение уровня восстановленного глутатиона опосредовано связаны с регуляцией апоптоза. Нами изучено уровень белков-модуляторов митохондриальной составляющей вышеупомянутого процесса. Показано преобладание содержания проапоптичекого белка Вах над антиапоптическим Bcl-2 через 4 и 5 недель развития атрофического гастрита, что сопровождается параллельным снижением уровня восстановленного глутатиона и наростанием атрофических изменений в слизистой оболочке желудка. Увеличение уровня Bcl-2 через 6 недель развития патологии, наряду с гистологически зафиксированым появлением вакуолизированных видоизмененных клеток поверхностного эпителия в этот период, может свидетельствовать о метапластических изменениях слизистой оболочки желудка.

Основными ферментами, регулирующими функциональное состояние апоптотических белков и компонентов глутатионовой системы, являются цАМФ- та Са²⁺-фосфолипидзависимые протеинкиназы (ПКА, ПКС). Фосфорилирование белков хлорного канала париетальных клеток протеинкиназою А приводит к увеличению его проводимости. Исследования позволили установить возрастание активности данных ферментов в течении четырех недель развития патологии, что может приводить к усиленной секреции соляной кислоты, которая, в свою очередь, выступает дополнительным патогенетическим фактором в развитии атрофического гастрита.

Полученные результаты свидетельствуют о принципиальном значении нарушения функционирования перекисного окисления липидов и системы антиоксидантной защиты в париетальных клетках в процессах развития хронического атрофического гастрита крыс.

Ключевые слова: хронический атрофический гастрит,париетальные клетки, пероксидация липидов, глутатион, глутатионзависимые ферменты, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа, протеинкиназа С, протеинкиназа А, белки ВсІ-2, Вах.

АNNOTATION

Gayda L.М. The state of lipoperoxide homeostasis and antioxidant protection in parietal cell under rat chronic atrophic gastritis development. - The manuscript.

The dissertation for the candidate biological sciences degree in specialty 03.00.04 - biochemistry. - Kyiv National Taras Shevchenko University, Kyiv, 2009.

It was explored the lipid peroxidation state and the system functioning of antioxidant protection and discovered their correlation with individual components of other metabological components of other systems (apoptotic protein Вах and Bcl-2, cAMP- and Ca²⁺ dependent protein kinases) in parietal cells under rat chronic atrophic gastritis development. It was detected the compensatory increase of superoxide dismutase and catalase activity didn't affect on lipoperoxidation process and these led to results in accumulation of toxic TBA reactive substances, diene conjugates and sheef bases during the whole stages of the experimental pathology development.

It was shown the reserved power of the glutathione antioxidant system is sufficient to provide adoptable respond in the acute period of the disease owing to increasing intracellular fond of the reduced glutathione, but it is in sufficient to prevent its decreasing in parietal cells in case of the chronic atrophic gastritis development. It was demonstrated the predominating content of the Вах proapoptotic protein over Bcl-2 antiapoptotic in simultaneous exhaustion of the glutathione antioxidant protection and increasing atrophied changes in mucous of the stomach.

The obtained data allow us to assume that discovered antioxidant enzymes play an important role in protection of the rat gastric mucosa against toxic compounds and reactive radicals. Our findings suggest that glutathione system is involved in processes of gastric atrophy. The obtained results testify about considerable system dysfunctions of lipid peroxidation and the antioxidant protection in processes of the rat experimental atrophic gastritis development.

Key words: chronic atrophic gastritis, parietal cell, lipoperoxide homeostasis glutathione, glutathione-related enzymes, glucose-6-phosphate dehydrogenase, Bcl-2, Bax, protein kinases, аpoptosis.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Відомо, що хронічний атрофічний гастрит (ХАГ) супроводжується запально-дистрофічними змінами клітин слизової оболонки, зменшенням кількості спеціалізованих залоз одного або кількох відділів шлунка, порушенням процесів фізіологічної регенерації та апоптозу, а у разі прогресування - поступовою атрофією залозистого епітелію [Аруин Л.И., 2003; Turk J., 2003]. Наслідками цього захворювання можуть бути дисплазія, метаплазія і злоякісна трансформація клітин [Сorrea P., 2005; Fox J.G., 2007].

Надлишковій генерації активних форм кисню, яка лежить в основі багатьох патологічних станів [Букин Ю.В., 2000], протистоїть антиоксидантна система захисту, що представлена ферментативними та неферментативними ланками. Інтенсифікація процесів вільнорадикального окислення на фоні виснаження антиоксидантної системи призводить до окиснення сульфгідрильних груп мембранних білків та накопичення токсичних продуктів ПОЛ, які здатні гальмувати проліферативні процеси [Бабак О.Я., 2005], що може бути однією з причин порушення регенерації слизової оболонки шлунка, яке спостерігається за умов ХАГ. Важливу роль у реалізації антирадикального та антипероксидного захисту клітин відіграє глутатіонова система [Saez G.T., 1990]. Узгоджена робота всіх її компонентів (відновленого глутатіону, глутатіонпероксидази, глутатіон-S-трансферази, глутатіонредуктази) сприяє встановленню оптимального рівня пероксидних сполук і збереженню антиоксидантного гомеостазу [Кулинский В.И., 1990].

Відомо, що функціонування ферментативних ланок антиоксидантної системи залежить від пулу відновлювальних еквівалентів. Внутрішньоклітинні запаси NADPН забезпечують підтримання глутатіону у відновленому стані (GSH) і, таким чином, впливають на стан глутатіонового редокс-циклу [Кулинскиий В.И., 2007].

Функціонування антиоксидантних ферментів (супероксиддисмутази, каталази) в крові хворих на хронічний атрофічний гастрит досліджували різні автори [Verhulst M.L., 2000; Поставный В.Е., 2005]. Однак питання щодо участі глутатіону, ферментів глутатіонового циклу, а також ензимів, які генерують NADPН, у адаптаційних перебудовах слизової оболонки шлунка за умов розвитку хронічного атрофічного гастриту, вивчені недостатньо.

Останнім часом значна увага приділяється дослідженню ролі GSH у редокс-регуляції клітинної проліферації, диференціації та апоптозу [Cristofanon S., 2006], які залучені до патогенезу хронічного атрофічного гастриту. Особлива роль надається виявленню зв'язків між апоптотичними білками Bcl-2 і Bax, серин-треоніновими протеїнкіназами та метаболізмом глутатіону [Ruvolo P., 1998; Anselm A., 2004]. Припускають, що білки родини Bcl-2, регулюючи активність мітохондріальних каналів і пор, здійснюють свій контроль апоптозу опосередковано через GSH [Tsujimoto Y., 2007]. Зокрема, Bcl-2 може блокувати переносники, відповідальні за транспорт GSH з мітохондрій, зберігаючи таким чином його вміст у цій органелі [Kroemer G., 2007]. В свою чергу, проапоптотичний білок Bax бере участь у формуванні мегапори, і також як і Bcl-2 пов'язаний з обміном GSH та активністю протеїнкіназ А і С. Механізми цих процесів, на сьогодні, залишаються не з'ясовані. Описане вище стало основою для формування мети та постановки задач дослідження даної дисертаційної роботи.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана у науково-дослідній лабораторії «Фізико-хімічної біології» біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка у рамках науково-дослідної теми «Визначення біохімічних, генетичних, імунологічних та цитологічних маркерів розвитку патологічних станів організму з метою розробки засобів направленої корекції і профілактики» (№ д/р 0106U005750).

Мета та завдання дослідження. Метою роботи було оцінити динаміку основних показників системи перекисного окислення ліпідів та системи антиоксидантного захисту в парієтальних клітинах шлунка за умов розвитку хронічного атрофічного гастриту щурів і виявити їх взаємозв'язок з функціонуванням інших ланок клітинного метаболізму.

Для досягнення мети досліджень було поставлено такі завдання:

1. Визначити вміст дієнових кон'югатів, ТБК-активних продуктів та шиффових основ у парієтальних клітинах в динаміці розвитку хронічного атрофічного гастриту у щурів.

2. Дослідити активність супероксиддисмутази та каталази в парієтальних клітинах щурів за умов розвитку хронічного атрофічного гастриту ліпіди метаболізм антиоксидантний

3. Дослідити активність ферментів глутатіонової антиоксидантної системи (глутатіонпероксидази, глутатіонтрансферази, глутатіонредуктази), вміст відновленого глутатіону та активність глюкозо-6-фосфатдегідрогенази в парієтальних клітинах та гепатоцитах за умов розвитку хронічного атрофічного гастриту щурів.

4. Оцінити активність цАМФ-залежної та Са²⁺-фосфоліпідзалежної протеїнкіназ в парієтальних клітинах за умов розвитку хронічного атрофічного гастриту щурів.

5. Дослідити часову динаміку змін вмісту апоптотичних білків Bax і Bcl-2 на різних етапах дослідження розвитку хронічного атрофічного гастриту щурів.

Об'єкт дослідження: процеси переокислення ліпідів та антиоксидантного захисту.

Предмет дослідження: стан процесів ліпоперексидації та функціонування системи антиоксидантного захисту в парієтальних клітинах шлунка в динаміці розвитку хронічного атрофічного гастриту щурів.

Методи дослідження: гістологічні, ультрацентрифугування (виділення та фракціонування клітин), спектрофотометричні (визначення активностей антиоксидантних ферментів та вмісту ТБК-активних продуктів тощо), спектрофлюорометричні (визначення вмісту відновленого глутатіону, шиффових основ), радіоізотопні (визначення активності протеїнкіназ), молекулярно-біологічні (методи білкового електрофорезу в денатуруючих умовах та імуноблотингу) та методи математичної статистики.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведено комплексне дослідження процесів пероксидації ліпідів та функціонування різних ланок системи антиоксидантної захисту. Показано їх вплив на окремі компоненти метаболічних шляхів в парієтальних клітинах слизової оболонки шлунка в динаміці розвитку експериментального хронічного атрофічного гастриту. Компенсаторне підвищення активності супероксиддисмутази (СОД) та каталази не впливало на процеси ліпопероксидації, що призводило до накопичення ТБК-активних продуктів, шиффових основ та дієнових кон'югатів. Встановлено підвищення вмісту відновленого глутатіону в парієтальних клітинах на початкових термінах формування атрофічного гастриту та зниження його рівня у період виявлення атрофічних змін залозистого епітелію, що може бути причиною хронізації патологічного процесу. Показано зміни в функціонуванні глутатіонової ланки антиоксидантного захисту в гепатоцитах, які направлені на підтримання компенсаторно-адаптивних реакцій в умовах розвитку ХАГ. Виявлено зростання активності протеїнкіназ А та С в парієтальних клітинах протягом перших чотирьох тижнів розвитку атрофічного гастриту, що свідчить про посилення секреції парієтальними клітинами соляної кислоти, яка виступає додатковим патогенетичним фактором в період гострих запальних процесів слизової оболонки шлунка. Встановлено, що за умов зниження вмісту відновленого глутатіону та при одночасному наростанні атрофічних змін в слизовій оболонці шлунка, вміст проапоптотичного білка Вах домінував над рівнем антиапоптотичного білка Bcl-2, що свідчить про індукцію апоптозу в парієтальних клітинах.

Практичне значення одержаних результатів. Результати досліджень мають фундаментальне значення для розуміння біохімічних та молекулярно-біологічних механізмів функціонування систем перекисного окислення ліпідів та антиоксидантного захисту, а також їх участі у процесах розвитку хронічного атрофічного гастриту. Отримані результати можуть бути використані для впровадження в медичну практику з метою розширення спектру біохімічних маркерів диспластичних змін слизової оболонки та застосування їх для вдосконалення адекватної діагностики та лікування передракових станів шлунка. Розробка та впровадження нетоксичних специфічних активаторів синтезу глутатіону може виступати одним із напрямків у профілактиці і лікуванні хронічного атрофічного гастриту. Отримані результати можуть у подальшому знайти застосування у практичній гастроентерології, а також бути використаними у навчальному процесі при підготовці студентів біологів та медиків.

Особистий внесок здобувача. Планування напрямків досліджень та розробка методичних підходів, обговорення результатів та формулювання висновків проведено спільно з науковим керівником. Пошук та аналіз літературних джерел, проведення експерименту, зведення, обробка та теоретичне обґрунтування первинних результатів досліджень виконані дисертантом особисто. Гістолого-морфологічні дослідження проведено сумісно з к.б.н. Бузинською Н.О. науковим співробітником кафедри цитології, гістології та біології розвитку Київського національного університету імені Тараса Шевченка.

Апробація результатів дисертації. Основні теоретичні положення та результати досліджень було представлено на VI Парнасівській конференції «Molecular Mechanism of Cellular Signalling» ( Краків, 2007); ІІІ-й міжнародній конференції «Neuro-humoral and cellular regulatory mechanism of digestion processes» (Львів, 2007); 2-у з'їзді Товариства клітинної біології (Київ, 2007), ІХ Міжнародній конференції молодих онкологів України «Сучасні проблеми експериментальної і клінічної онкології» (Київ 2008), IV міжнародній конференції студентів та аспірантів “Молодь і поступ в біології” (Львів, 2008); ІІІ міжнародній конференції молодих вчених «Біологія: від молекули до біосфери» (Харків, 2008) 5 -th International symposium on cell/tissue injury and cytoprotection/organoprotection (Yalta, 2008).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 13 наукових праць, з яких: 5 статей у фахових виданнях, затверджених переліком ВАК України, 8 тез у матеріалах наукових конференцій та з'їздів.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається із вступу, огляду літератури, матеріалів і методів та трьох розділів результатів власних досліджень з їх обговоренням, заключення, висновків, списку використаних літературних джерел (197 посилань). Дисертація викладена на 157 сторінках і проілюстрована 20 рисунками та 1 таблицею.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи досліджень

В дослідах використовували білих нелінійних щурів-самців з початковою масою 150-200г. Розвиток експериментального хронічного атрофічного гастриту індукували згідно з методом [Wang J. G., 2004] щоденним інтрагастральним введенням тваринам протягом 6 тижнів 2% саліцилату натрію, при цьому повністю замінювали питну воду на 20 мМ дезоксихолат натрію. Ступінь уражень слизової оболонки шлунка оцінювали при аутопсії візуально та гістологічно.

Дослідження проводили через один, два, три, чотири, п'ять, шість тижнів введення саліцилату та дезоксихолату натрію. Парієтальні клітини слизової оболонки шлунка та гепатоцити щурів виділяли за модифікованими методами [Таіров М.М.,1983; Петренко А.Ю., 1991]. Фракцію цитозолю отримували за рекомендаціями [Прохоровой М.И.,1982].

ТБК-активні продукти визначали спектрофотометрично [Стальная И.Д., 1977], їх вміст розраховували на основі значення молярного коефіцієнта екстинції комплексу малонового диальдегіду з 2-тіобарбітуровою кислотою у перерахунку на 1 мг білка. Екстракцію шиффових основ та дієнових кон'югатів ненасичених жирних кислот з клітинного лізату проводили сумішшю гептан/ізопропіловий спирт у співвідношенні 1:1. Гептанову фазу відбирали для визначення вмісту шиффових основ на спектрофлуориметрі RF-1501 (Shimadzu, Японія) за умов л_збуд= 360 нм і л_еміс = 420 нм [Колесова О.Е., 1984]. Дієнові кон'югати визначали за методом [Гаврилов В.Б., 1988]. Активність супероксиддисмутази (далі СОД) у клітинах визначали згідно методу [Чеварі С.В., 1985] і виражали в умовних одиницях на хвилину на мг білка. Активність каталази в клітинах визначали за методом [Королюк М.А., 1988] і виражали у перерахунку на 1 мкмоль Н₂О₂ за хвилину на мг білка. Вміст відновленого глутатіону визначали використовуючи, флуориметричну мітку - ортофталевий альдегід за методом [Lewis C., 1984] і виражали в нмоль GSH на мг білка. Активність глутатіонзалежних ферментів визначали відповідно до рекомендацій [Власова С.Н., 1990]. Глюкозо-6-фосфатдегідрогеназну активність визначали за методом [Прохорова М.И., 1982].

Визначення активності Са²⁺- фосфоліпідзалежної протеїнкінази проводили за методом [Parames S., 1998]; активність циклонуклеотидзалежної кінази А - відповідно до рекомендацій [Gill G.N., 1979]. Активність досліджуваних протеїнкіназ визначали за включенням ³²Р від г-³²Р-АТФ до відповідних специфічних білкових субстратів внаслідок фосфотрансферазної реакції. Радіоактивність визначали в толуольному сцинтиляторі ЖС-107. Питому активність ферментів виражали в пмоль ³²Р за 1 хвилину на 1 мг білка.

Визначення концентрації білка проводили згідно з методом Bradford M.M., 1976. Електрофорез отриманих зразків проводили в денатуруючих умовах згідно з методом [Laemmli U.K., 1970]. Імуноблот-аналіз досліджуваних препаратів здійснювали згідно з методикою [Bollag D.M., 1996]. Кількісну обробку результатів імуноблот-аналізу здійснювали з використанням комп'ютерної програми ImageJ.

Статистичну обробку результатів досліджень проводили загальноприйнятими методами варіаційної статистики, на основі 9 - 12 повторів (Mm, n = 9 - 12) [Брандт Т.А., 1975]. Для розрахунку результатів досліджень та побудови графіків використовували пакет статистичних програм ,,Origin 7.0” та “Microsoft Excel 2007”. Достовірність різниці показників оцінювали за допомогою t-критерію Ст'юдента.

Результати досліджень та їх обговорення

За умов введення саліцилату натрію (інгібітора циклооксигенази) у щурів спостерігалося ураження слизової шлунка, що посилювалось введенням дезоксихолату натрію, який, розчиняючи захисний поверхневий шар слизу, стимулював рефлюкс жовчі із дванадцятипалої кишки. Поряд із саліцилатом та шлунковим соком дезоксихолат виконує роль додаткового патогенетичного фактору в індукції пошкодження слизової оболонки шлунка.

Проведені нами морфо-гістологічні спостереження дозволили виявити, що на початкових етапах розвитку атрофічного гастриту спостерігалося потовщення слизової оболонки, яке можна пояснити гіперпроліферацією клітин у відповідь на дію пошкоджуючих чинників. На подальших етапах розвитку патологічного процесу було відмічено зменшення товщини слизового та збільшення підслизового шару (рис. 1), проростання сполучної тканини в основу залоз (рис. 1В), розгладження макроскопічних складок шлунка, нейтрофільну інфільтрацію (рис. 1С) та появу видозмінених вакуолізованих клітин (рис. 1В). Згідно літературних даних описані зміни слизової оболонки є стійкими ознаками хронічного атрофічного гастриту [Dixon M.F., 2001, Букин Ю.В., 2000].

В останні роки увагу вчених привертає вивчення вільнорадикального окислення ліпідів мембран як регулятора фізіологічних процесів. За сучасними уявленнями, одним з універсальних типів ураження і причиною загибелі клітин різних органів є інтенсифікація процесів перекисного окислення ліпідів (ПОЛ) і пошкодження ними біологічних мембран [Farinati F., 1996; Сарапук О.В., 2002]. Порушення цих процесів може бути причиною цілого комплексу патологічних змін, що зумовлюють метаболічні розлади на рівні клітини.

На сьогоднішній день в літературі відсутні дані щодо дослідження стану системи перекисного окислення ліпідів в слизовій оболонці шлунка за умов розвитку хронічного атрофічного гастриту. В результаті проведених досліджень нами встановлено зростання вмісту дієнових кон'югатів, ТБК-активних продуктів та шиффових основ протягом усіх етапів розвитку патології, порівняно з контролем (табл.1). Надмірний вміст продуктів ПОЛ свідчить про інтенсифікацію вільноракальних процесів, що спряжено з підвищенням рівня АФК і може спричинювати ураження як парієтальних клітин, так і бути однією з причин зниження регенерації слизової оболонки шлунка, що і було нами показано за допомогою гістолого-морфологічних досліджень.

Посилення процесів ПОЛ є ранньою неспецифічною ознакою патогенезу хронічного атрофічного гастриту. За умов фізіологічної норми між механізмами процесів ПОЛ, цитопротекції та антиоксидантним захистом клітин існують складні взаємозв'язки, які можуть порушуватись за умов розвитку різних патологій шлунка [Мазо В. К., 1998].

СОД та каталаза є основними ферменти антиоксидантного захисту клітини, активність яких визначає резистентність клітин до окисного стресу [Fridovich I., 1995]. У ході досліджень активність СОД зростала в 1,5 раза вже через два тижні розвитку патології, досягаючи максимуму через 6 тижнів, коли перевищувала контрольні показники в 2 рази (рис. 2А).

Підвищення активності СОД відображає процес мобілізації антиоксидантної системи, що спрямовано на знешкодження надмірної кількості супероксидного аніон-радикалу в парієтальних клітинах. Виявлене нами зростання СОД відбувалося одночасно із накопиченням вмісту продуктів перекисного окислення ліпідів: дієнових кон'югатів, ТБК-активних продуктів та шиффових основ, яке спостерігається в парієтальних клітинах протягом усіх етапів розвитку експериментального атрофічного гастриту (табл.1).

Активність каталази в парієтальних клітинах зазнавала коливань: зростала через 1, 2, 4, 5, 6 тижнів та знижувалась через 3 тижні розвитку ХАГ (рис. 2Б). Виявлені нами зміни супероксиддисмутазної та каталазної активностей за умов розвитку хронічного атрофічного гастриту щурів є наслідком прискорення реакцій вільнорадикального окиснення з утворенням супероксиду, а також підвищення внутрішньоклітинного вмісту пероксиду водню [Владимиров Ю.А., 2000].

Біологічні ефекти вищезазначених інтермедіатів кисню реалізуються опосередковано - через посилення процесів ПОЛ та накопичення відповідних радикалів і гідропероксидів у товщі мембран клітин [Владимиров Ю.А., 1978].

Ключова роль у функціонуванні антиоксидантної системи та в захисті клітин від оксидативного стресу належить системі глутатіону. Тому нами досліджено стан глутатіонзалежної антиоксидантної системи в парієтальних клітинах шлунка в динаміці розвитку атрофічного гастриту.

Для оцінки загального стану антиоксидантної системи парієтальних клітин шлунка за умов розвитку ХАГ щурів було досліджено вміст GSH (рис. 3А). Через 1, 2, 3 тижні розвитку ХАГ рівень GSH зростав на 44%, 27% та 35%, відповідно. Такий ефект ймовірно спричинений активацією процесів антиоксидантного захисту, сприяючи компенсаторному гіперсинтезу глутатіону, індукцію всіх внутрішньоклітинних процесів, спрямованих на елімінацію впливу пошкоджуючих агентів, а також оксидативного стресу.

Підвищений вміст глутатіону в парієтальних клітинах може свідчити про гострий період захворювання, активацію процесів запалення та цитолізу. Так, через тиждень розвитку експериментального атрофічного гастриту, згідно з гістологічними дослідженнями, спостерігається потовщення слизової оболонки на 10 - 15%, що можна пояснити гіперпроліферацією стовбурових клітин у відповідь на дію пошкоджуючих агентів (дезоксихолату та саліцилату натрію). Зниження вмісту GSH через чотири тижні розвитку гастриту супроводжується наростанням морфолого-гістологічних ознак атрофії.

Було досліджено активність глутатіонредуктази, яка відповідає за підтримання достатнього рівня GSH. Це відбувається за рахунок реакції, де донором протонів є NADPН, відновлення якого проходить в цитозолі за участю глюкозо-6-фосфатдегідрогенази (Г6ФДГ). Нами встановлено, що у парієтальних клітинах активність Г6ФДГ та глутатіонредуктази поступово знижувались протягом розвитку патології, відновлюючись лише через 6 тижнів, що може свідчити про збалансоване функціонування цих ферментів на етапі проявів хронічних процесів в слизовій оболонці.

Отримані дані вказують, що виснаження пулу відновленого глутатіону при дефіциті NADPН, яке підтверджується зниженням активності Г6ФДГ, може призводити до суттєвих порушень у функціонуванні глутатіонзалежної антиоксидантної системи, роль якої в гальмуванні процесів перекисного окислення ліпідів біологічних мембран. Глутатіонзалежні ферменти, такі як глутатіонпероксидаза та глутатіонтрансфераза, є ключовими в механізмах захисту клітин від екзогенних та ендогенних токсичних сполук та вільних радикалів, які виникають у відповідь на пошкодження слизової оболонки шлунка [Барабой В.А., 2006]. Встановлене нами зниження глутатіонпероксидазної активності в парієтальних клітинах протягом усіх етапів розвитку ХАГ може бути причиною ініціації процесів ліпопероксидації та накопичення її продуктів (рис. 5А).

Нами показано підвищення активності глутатіонтрансферази (рис. 5А) через два тижні розвитку атрофічного гастриту, що може свідчити про активацію процесів детоксикації продуктів перекисного окислення ліпідів (табл. 1). На подальших етапах розвитку ХАГ активність глутатіонтрансферази залишилась в межах контрольних величин. Суттєве її зниження зафіксовано через 6 тижнів при одночасному зменшенні активності глутатіонпероксидази та рівня відновленого глутатіону, що може свідчити про виснаження глутатіонової ланки антиоксидантного захисту.

Таким чином, на підставі виявленої динаміки змін досліджуваних показників можна зробити висновок, що резервна потужність глутатіонової антиоксидантної системи є достатньою для того, щоб забезпечити адаптивну відповідь у гострий період захворювання за рахунок підвищення внутрішньоклітинного вмісту GSH, проте є недостатньою для того, щоб у період виявлених атрофічних змін слизової оболонки шлунка попередити зниження вмісту GSH у парієтальних клітинах за умов розвитку хронічного атрофічного гастриту щурів.

Оскільки GSH синтезується клітинами печінки, де відбувається знешкодження ендо- та екзогенних токсичних сполук, а також катаболізм дезоксихолату (похідного жовчної кислоти, детергенту поверхневого шару слизової оболонки шлунка), нами було паралельно досліджено функціонування глутатіонзалежної антиоксидантної системи в гепатоцитах щурів.

Нами показано, що за умов розвитку атрофічного гастриту в клітинах печінки рівень GSH та активність глюкозо-6-фосфатдегідрогенази зростає на фоні зниження глутатіонредуктазної активності (табл. 2). Отримані дані дозволяють зробити висновок, що пул цитоплазматичного глутатіону гепатоцитів поповнюється не лише шляхом його регенерації в глутатіонредуктазній реакції, а ймовірно, за допомогою його синтезу de novo.

Нами встановлено, що глутатіонтрансферазна активність в гепатоцитах на ранніх та пізніх етапах розвитку атрофічного гастриту знижувалась, а через 3 та 4 тижні зростала на фоні підвищення вмісту GSH. Водночас в цей період виявлено

зниження активності глутатіонпероксидази (табл. 2). Такі зміни в функціонуванні досліджуваних ферментів направлені на підтримання компенсаторно-адаптивних реакцій в гепатоцитах в умовах розвитку експериментального хронічного атрофічного гастриту.

Сучасне діагностування ХАГ включає переважно морфолого-гістологічні дослідження слизової оболонки шлунка. Серед клітин цього шару на особливу увагу заслуговують парієтальні клітини, які за цієї патології набувають найбільш виражених змін, що відбуваються внаслідок активації процесів апоптозу [Zavros Е., 2005].

Відомо, що альтернативним механізмом редокс-регуляції апоптозу може бути вплив глутатіону на тіолчутливий канал мітохондрій, проникність якого регулюють апоптотичні білки Вах та Bcl-2 [Cristofanon S., 2006; Voehringer D.W., 1999]. В зв'язку з цим з'ясування ролі цих білків займає центральне місце у вивченні регуляції процесу апоптозу. Білки родини з Bcl-2 знаходяться в постійній динамічній рівновазі, утворюючи гомо- і гетеродимери, що в кінцевому рахунку впливає на розвиток апоптозу клітин. Тому вважається, що співвідношення активних форм цих білків визначає реостат життя та смерті [Белушкина Н.Н., 2001].

Протеїни Вах та Bcl-2 з молекулярною масою 20 та 26 кДа, відповідно, присутні в парієтальних клітинах слизової оболонки шлунка за фізіологічної норми (рис. 6). Було показано, що вміст проапоптотичного білка Вах був зниженим протягом перших двох тижнів розвитку атрофічного гастриту (рис. 6А). Можливо такий ефект зумовлено гострою фазою захворювання, коли клітини гинуть від стресових уражень в основному шляхом некрозу, а не апоптозу. До того ж вміст антиапоптотичного білка Bcl-2 через тиждень підвищувався (рис.6 В), що можна пояснити гіперпроліферацією клітин слизової оболонки шлунка, яке нами було підтверджено гістологічно.

Отримані дані демонструють домінування вмісту Вах над Bcl-2 через 4, 5 тижнів розвитку патології, що свідчить про індукцію процесів апоптотичної загибелі в парієтальних клітинах. Через 6 тижнів розвитку атрофічного гастриту щурів спостерігається зростання вмісту антиапоптотичного білка Bcl-2, що може бути показником метапластичних змін слизової оболонки шлунка, які гістологічно нами підтверджені і характеризуються появою не властивих для слизового шару видозмінених, вакуолізованих клітин (рис. 1С).

Основними ферментами, що регулюють функціональний стан апоптичних білків та компонентів глутатіонової системи, є протеїнкінази [Колесниченко Л., 1987, Ruvolo P., 2001]. Відомо, що фосфорилювання білків хлорного каналу протеїнкіназою А (ПКА) призводить до збільшення його провідності [Yao X., 2003]. Крім того, ПКА та протеїнкіназа С (ПКС) фосфорилюють білки цитоскелету та мембранні білки, які залучені до регуляції секреції соляної кислоти [Samuelson L., 2003; Лопина О., 1997].

Нами показано зростання активності ПКА та ПКС протягом чотирьох тижнів розвитку патології, що може призводити до посилення секреції соляної кислоти, яка, в свою чергу, виступає додатковим патогенетичним фактором у розвитку атрофічного гастриту (рис. 7).

На підставі проведених досліджень нами встановлено, що за умов розвитку хронічного атрофічного гастриту активується система перекисного окислення ліпідів та послаблюється функціонування глутатіонової ланки антиоксидантного захисту на кінцевих етапах розвитку захворювання, що супроводжувалось зниженням вмісту GSH і може бути вирішальним в процесах ініціації апоптотичної загибелі парієтальних клітин.

Порушення прооксидантно-антиоксидантної рівноваги в цей період дослідження передує морфологічним ознакам атрофічних процесів і супроводжується зниженням вмісту антиапоптотичного білка Bcl-2, зростанням рівня проапоптотичного білка Вах та зниженням до контрольних значень активності протеїнкінази А та С. Функціональна активність як інгібіторів так і активаторів апоптозу регулюється ступінню фосфорилювання/дефосфорилювання апоптотичних білків [Kroemer G., 2007]. Виявлене нами зниження активності протеїнкіназ (5, 6 тиждень) з одночасною зміною вмісту апоптотичних білків може свідчити про залучення цих ферментів до процесів регуляції активності даних протеїнів.

Таким чином, отримані нами дані свідчать, що за умов розвитку хронічного атрофічного гастриту активуються процеси перекисного окислення ліпідів, що призводить до активації глутатіонової ланки антиоксидантного захисту в період гострих запальних реакцій та виснаження вищевказаної системи в терміни виявлення атрофічних змін слизової оболонки шлунка. Усі вищезазначені зміни можуть викликати перехід гострого запального процесу в хронічний та посилення програмованої загибелі парієтальних клітин за умов розвитку хронічного атрофічного гастриту щурів.

ВИСНОВКИ

1. Досліджено стан процесів вільнорадикального окиснення й системи антиоксидантного захисту та їх зв'язок з окремими ланками клітинного метаболізму в парієтальних клітинах слизової оболонки шлунка щурів за умов розвитку експериментального атрофічного гастриту.

2. Посилення процесів перекисного окислення ліпідів в парієтальних клітинах доведено на підставі зростання вмісту ТБК-активних продуктів, дієнових кон'югатів та шиффових основ на всіх етапах (через 1, 2, 3, 4, 5, 6 тижнів) розвитку хронічного атрофічного гастриту.

3. Встановлено однонаправлене зростання супероксиддисмутазної та каталазної активності в парієтальних клітинах на всіх етапах розвитку атрофічного гастриту, що свідчить про посилення процесів вільнорадикального окислення ліпідів.

4. Показано підвищення вмісту відновленого глутатіону у гострий період захворювання (через 1, 2, 3 тижні) та його зниження у період виявлення атрофічних змін залозистого епітелію і хронізації патологічного процесу (через 5, 6 тижнів). В цей же термін спостереження спостерігається зниження активності глутатіонпероксидази та глутатіонтрансферази, що свідчить про виснаження глутатіонзалежної ланки антиоксидантного захисту в парієтальних клітинах за умов розвитку експериментального хронічного атрофічного гастриту.

5. Зміни глутатіонтрансферазної активності в гепатоцитах мали різнонаправлений характер: на ранніх та пізніх стадіях вона знижувалась, а через 3, 4 тижні зростала із одночасним зниженням активності глутатіонпероксидази. Рівень відновленого глутатіону зростав протягом чотирьох тижнів, що підтверджує його участь в підтриманні компенсаторно-адаптивних реакцій за умов розвитку хронічного атрофічного гастриту щурів.

6. В парієтальних клітинах процеси запалення з першого по четвертий тиждень розвитку атрофічного гастриту супроводжувались активацією цАМФ- та Са²⁺-фосфоліпідзалежної протеїнкіназ, тоді як в період виявлених атрофічних змін слизової оболонки шлунка (5, 6 тиждень) спостерігалося зниження їх активності до контрольних величин.

7. Встановлено, що в парієтальних клітинах за умов розвитку хронічного атрофічного гастриту вміст проапоптотичного білка Вах домінує над рівнем антиапоптотичного Bcl-2 порівняно з контролем на фоні виснаження глутатіонової ланки антиоксидантного захисту та наростання атрофічних змін слизової оболонки шлунка.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Гайда Л.М. Активність глутатіонзалежних ферментів парієтальних клітин та гепатоцитів за умов розвитку експериментального атрофічного гастриту / Гайда Л.М., Дробінська О. В., Тимошенко М.О., Остапченко Л. І. // Фізика живого. - 2007. - Т. 16, № 1. - С. 144-148. (Особистий внесок: проведено експериментальні дослідження, їх статистична обробка, аналіз та узагальнення результатів).

2. Гайда Л.М. Активність глутатіон-S-трансферази в гепатоцитах та парієтальних клітинах шлунка щурів за умов розвитку експериментального атрофічного гастриту / Дробінська О. В., Гайда Л.М., Карпюк О.С., Остапченко Л.І. // Ученые записки Таврического национального университета им. В. И. Вернадского. Серия “Биология, химия”. - 2007. - Т. 20 (59), № 1. - С. 141-145. (Особистий внесок - отримання клітин, визначення активності глутатіон-S-трансферази, підготовка матеріалів до друку).

3. Гайда Л.М. Дослідження активності глутатіон-S-трансферази в цитозолі парієтальних клітин за умов розвитку експериментального атрофічного гастриту / Гайда Л.М., Карпюк О.С., Тимошенко М.О., Дробінська О. В., Остапченко Л. І. // Вісник Київського національного університету імені Тараса Шевченка. Серія “Біологія”. - 2007. - Вип.5. - С. 72-73. (Особистий внесок - отримання та фракціонування клітин, визначення активності глутатіон-S-трансферази та аналіз отриманих результатів).

4. Гайда Л.М. Вміст відновленого глутатіону та апоптичних білків Вcl-2 та Вax в парієтальних клітинах за умов розвитку експериментального атрофічного гастриту / Л. М. Гайда, О. В. Дробінська, Л. І. Остапченко // Медична хімія. - 2008. - Т. 10, № 4. - С. 26-31. (Особистий внесок - отримання клітин, визначення вмісту відновленого глутатіону, підготовка матеріалів до друку).

5. Гайда Л.М. Динаміка зміни вмісту білків теплового шоку в лізаті клітин слизової оболонки шлунка щурів під час розвитку експериментального атрофічного гастриту / Л.М. Гайда, С.Я. Мандрик, Л.М. Капустян [та ін.] // Біополімери і клітина. - 2008. - Т. 24, № 5. - С. 393-398. (Особистий внесок - отримання та фракціонування клітин, відтворення моделі атрофічного гастриту щурів).

6. Gayda L.M. State of glutathione system under experimental model of atrophic gastritis / Gayda L.M., Ostapchenko L.I. // 6^th Parnas Conference Molecular Mechanism of Cellular Signalling: 30^th may - 2^nd june : 2007. : аbstracts - Krakow, 2007. - Р.56.

7. Гайда Л.М. Активність глутатіон-S-трансферази гепатоцитів та парієтальних клітин в динаміці розвитку хронічного атрофічного гастриту щурів / Гайда Л.М., Карпюк О.С., Пантюх К.С. // Біологічні дослідження молодих вчених на Україні: VII студентська конференція студентів та аспірантів: 26-27 вер. 2007р.: матеріали конф. - К., 2007. - С.7-8.

8. Gayda L.M. Glutathione and GSH-depended enzymes in rat parietal cells under development of chronic atrophic gastritis / Gayda L.M., Ostapchenko L.I. // Neuro-humoral and cellular regulatory mechanism of digestion processes: ІІІ International сonference, 4^th -6^th oct. 2007 : аbstracts - Lviv, 2007. - С. 22.

9. Гайда Л.М. Активність глутатіонзалежних ферментів в парієтальних клітинах за умов розвитку атрофічного гастриту щурів / Гайда Л.М., Тимошенко М.О., Дробінська О.В. // 2-ий з'їзд Українського товариства клітинної біології : 23-26 жовт. 2007 р. : збірник тез. - К., 2007. - С. 149.

10. Gayda L. Glutathione and its related enzymes in rat parietal cells under the development of chronic atrophic gastritis / Gayda L., Karpyuk O., Ostapchenko L. // Біологія: від молекули до біосфери: ІІ міжнародна конференція молодих вчених, 19-21 лист. 2007 р. : тези доповідей. - Х., 2007. - С. 69-70.

11. Гайда Л.М. Активність глутатіонзалежних ферментів в парієтальних клітинах та гепатоцитах за умов розвитку атрофічного гастриту щурів / Гайда Л.М., Дробінська О.В., Остапченко Л.І. // Молодь і поступ в біології: IV міжнародна наукова конференція студентів та аспірантів, 7-10 квітня 2008 р. : збірник тез. - Л., 2008. - С. 22-23.

12. Гайда. Л.М. Стан системи глутатіону парієтальних клітин за умов розви-тку атрофічного гастриту щурів / Гайда Л.М., Карпюк О.С., Дробінська О.В. // Сучасні проблеми експериментальної і клінічної онкології: ІХ Міжнародна конференція молодих онкологів України, 23-24 квітня 2008 р. : збірник тез. - К., 2008. - С. 40.

13. Gayda L. Сonnection between glutathione content and apoptotic processes during chronic atrophic gastritis development / Gayda L., Karpiuk O., Ostapchenko L. // 5^th International symposium on cell/tissue injury and cytoprotection/organoprotection, 17-19 sep., 2008 y.: abstracts. - Yalta, 2008. - P.14.

Размещено на Allbest.ru

...