Размещено на http://www.allbest.ru/

Національна академія наук України інститут ботаніки ім. М.Г. Холодного

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

03.00.21 - мікологія

Участь мікроміцетів у процесах синтезу та деструкції хітину

Харкевич Олена Сигізмундівна

Київ 2009

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у відділі фізіології та систематики мікроміцетів Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор Жданова Неллі Миколаївна, Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, провідний науковий співробітник відділу фізіології та систематики мікроміцетів

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор, лауреат державної премії України в галузі науки і техніки, Бухало Ася Сергіївна, Інститут ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України, головний науковий співробітник відділу мікології

кандидат біологічних наук, Трутнєва Ірина Анатоліївна, Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України, старший науковий співробітник лабораторії клітинної біології та біотехнології грибів

Захист відбудеться «23» листопада 2009 р. о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.211.01 при Інституті ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України

за адресою: 01601, м. Київ, вул. Терещенківська, 2

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту ботаніки

ім. М.Г. Холодного НАН України за адресою: 01025, м. Київ, вул. Велика

Житомирська, 28

Автореферат розісланий «10» жовтня 2009 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради кандидат біологічних наук О.М. Виноградова

1. Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Хітин - одна з найрозповсюдженіших в природі сполук вуглецю та азоту; це єдиний азотвмісний поліцукрид [Deshpande, 1986; Stankiewicz et al., 1997]. Суттєва частина органічної речовини ґрунту поряд з целлюлозовмісними субстратами представлена хітинвмісними речовинами, що включають хітин грибів та членистоногих [Феофилова, 1983; Билай и др., 1982; Jeuniaux , 1963; Anderson et al., 1995].

Роль мікроміцетів у процесах синтезу та деструкції хітину у біосфері дуже важлива [Pel, Gottschal, 1986; Poulichek et al., 1986; Cairney, 1992; Dighton, 2003]. Гриби превалюють за біомасою майже у всіх ґрунтах та відіграють основну роль в деструкції органічних речовин [Звягинцев, 1987; Мирчинк, 1988; Великанов, 1997]. Розповсюдження мікроскопічних грибів у різних компонентах наземних екосистем корелює з їх функціональними можливостями. Їм належить провідна роль у іммобілізації та довготривалому закріпленні азоту у ґрунтах за рахунок синтезу стійких до деградації азотвмісних сполук, а саме - хітину, меланінів та їх комплксів [Кураков, 2003]. В той же час вони є основними продуцентами та споживачами пулу вуглецю у ґрунті [Lange et al., 1998; Dighton, 2003]. Вважають, що розвиток грибів, насамперед, створює умови для запуску процесів утилізації хітину і цей процес надбудовується над основним у ґрунті - над утилізацією целюлози [Полянская, 1987].

Останнім часом питання деструкції хітину в ґрунті все більше привертають увагу дослідників [Манучарова и др., 2005; Воробьев и др., 2007] в зв'язку з практичним застосуванням хітину і його похідних та створенню новітніх біотехнологій у різних галузях - медицині, сільському господарстві, косметичній, фармацевтичній та харчовій промисловості, що з кожним роком зростає [Феофилова и др., 1996; 2001; Хитин и хитозан. Получение, свойства, применение, 2002; Chitin in nature and technology, 1986; Wainwright, 1990; Schepherd et al., 1997].

Цілком закономірним є й виникнення питання наскільки можуть підлягати біопошкодженню хітинвмісні матеріали. Дані про видовий склад та шкодочинність грибів, що контамінують хітин та його похідні, досить малочисельні, стандартного методу їх випробувань не існує [Смирнов, 2000; Максимова и др., 2002]. Саме тому вивчення хітинолітичних угруповань в природних та виробничих умовах, відбір культур для використання при визначенні грибостійкості поряд з встановленням критеріїв грибостійкості є одними з першочергових завдань мікології та біотехнології.

Перспективним напрямом, що швидко розвивається, є створення та впровадження нових біотехнологій з використанням мікроміцетів [Пат. 26091 Україна, 1999; Григораш и др., 2006; Wainwright, 1990; Patent WO 97/22686 GB, 1997]. Отже, регуляція кількості хітину в біомасі мікроміцетів та розробка критеріїв її оцінки залишаються актуальними.

Таким чином, дослідження процесів синтезу та деструкції хітину, мікроміцетами зокрема, в природних, лабораторних та виробничих умовах є перспективним та актуальним. В Україні ці питання наразі не досліджені.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана у відділі фізіології та систематики мікроміцетів Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України у відповідності до напрямку науково-дослідних робіт Інституту згідно з темами: „Вивчення еколого-фізіологічних особливостей та видового складу мікроміцетів, що трансформують полі- та мономерні субстрати з метою одержання нових біологічно активних метаболітів” (01.88.0052917), „Вивчити мікроміцети еконіш антропогенного походження, їх видовий склад, еколого-фізіологічні особливості, біологічну активність при трансформуванні важкодоступних субстратів з метою одержання нових високоактивних штамів та їх метаболітів” (0196U021674), „Еколого-систематичне та фізіологічне вивчення мікроміцетів як основа створення перспективних біотехнологій” (0196U018115) та угодами про творчу співдружність (Далекосхідний державний технічний рибогосподарський університет, м. Владивосток; Інститут біохімії НАНУ, м. Київ; Інститут ботаніки НАНУ, м. Київ).

Мета і завдання дослідження. Метою роботи є вивчення видової різноманітності та еколого-фізіологічна характеристика мікроміцетів, що беруть участь у синтезі та деструкції хітину.

Для досягнення мети необхідно було вирішити такі завдання:

1. Встановити видовий склад мікроміцетів-деструкторів хітину в природних умовах (ділянки з різним рослинним покривом).

2. Дослідити особливості угруповань мікроміцетів у виробничих умовах (технологічний процес одержання хітину та хітозану).

3. Визначити грибостійкість хітину, хітозану та хітозанвмісних композитних субстратів.

4. Дослідити динаміку вмісту хітину у мікроміцетів за умов культивування на природних та синтетичних середовищах.

Об'єкт дослідження - мікроміцети, що синтезують хітин та мікроміцети-деструктори хітину та його похідних.

Предмет дослідження - таксономічна структура та еколого-фізіологічна характеристика мікроміцетів, що беруть участь у процесах синтезу та деструкції хітину в природних, лабораторних та виробничих умовах.

Методи дослідження - класичні методи експериментальної мікології, мікробіологічні, біохімічні та електронно-мікроскопічні методи дослідження. Отримані експериментальні дані були проаналізовані з використанням методів кількісної екології, математичних статистики та моделювання.

Наукова новизна одержаних результатів. Досліджено мікобіоту ряду хітинвмісних субстратів (уражені комахи, хітинові „пастки”, панцирвмісні відходи криля на різних етапах переробки) та ізольовано 607 штамів, які віднесено до 47 видів 22 родів відділів Zygomycota, Ascomycota та групи Anamorphic fungi.

Проведено порівняльний аналіз видового складу мікобіоти хітинвмісних субстратів у природних (бурякове та картопляне поля, плодовий сад, заплавна лука, дубово-сосновий ліс) та виробничих (процес одержання хітину та хітозану) умовах та показано низький ступінь її подібності за коефіцієнтом Сьоренсена-Чекановського (S 0,07-0,33). Про провідну роль ґрунтових мікроміцетів в процесах руйнування хітину свідчить високий ступінь подібності мікобіоти ґрунту досліджених ділянок та експонованих хітинових „пасток” (S 0,50-0,76). Види Penicillium expansum, P. digitatum, Aspergillus niger та Rhizopus stolonifer var. stolonifer були ізольовані з хітинвмісних субстратів та є їх постійними деструкторами.

Запропоновано до застосування коефіцієнт засвоюваності азоту (КЗN), що враховує небілковий азот хітину та дозволяє розрахувати величину засвоюваного грибного білка; розроблено та запропоновано метод визначення хітинолітичної активності ґрунту та модифіковано метод одержання колоїдного хітину.

Визначено загальну закономірність здійснення процесів деструкції хітину, а саме: грибної колонізації субстратів у виробничих умовах, деструкції хітину ентомофільними мікроміцетами у лабораторних умовах, процесів хітинолізу в ґрунті.

Показано, що грибна контамінація препаратів хітозану призводить до зниження їх в'язкості. Встановлено, що чим менша в'язкість розчинів хітозану, тим більша грибостійкість його препаратів. Це може бути використано як критерій грибостійкості хітозану.

Здійснено електронно-мікроскопічне дослідження грибів р. Fusarium за умов термоіндукованого автолізу, яке показало, що клітинна стінка досліджених видів цього роду залишалася майже не зміненою, що може бути використано для одержання грибного хітину.

На основі комплексу культур мікроміцетів Fusarium sambucinum ІМВ F-100011 та Penicillium sclerotiorum ІМВ F-100015 створено хітинвмісний грибний кормовий препарат, який захищено Патентом України.

Одержані дані розширюють існуючі уявлення щодо: деструкції хітину мікроміцетами у природних, лабораторних та виробничих умовах; синтезу хітину мікроміцетами на природних та синтетичних середовищах; грибостійкості хітину, хітозану та хітинвмісних препаратів загалом.

Практичне значення одержаних результатів. Для випробувань на грибостійкість хітину та хітинвмісних субстратів нами запропоновано введення до списку тест-культур грибів відповідних стандартів видів, що ізольовані з даних матеріалів та є їх постійними деструкторами, а саме: Aspergillus niger, Penicillium digitatum, P. expansum, Rhizopus stolonifer var. stolonifer. Рекомендовано прогнозування грибостійкості хітозану за величиною кінематичної в'язкості його 1,0% розчинів в 2,0% оцтовій кислоті.

У виробничих умовах рекомендовано спосіб обробки зразків хітозану для запобігання контамінування грибами - опромінення бактерицидними лампами БУВ-60 впродовж 60-90 хв, а для консервації панцирвмісних відходів криля - застосування 1,0-2,0 % мурашиної кислоти.

Для уточнення розрахунку білка кормової біомаси, яка одержана на основі мікроміцетів, запропоновано застосування КЗN.

Проведено випробування створеного нами хітинвмісного грибного кормового препарату на тваринах та одержано позитивні результати.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота є завершеним самостійним науковим дослідженням автора. Автором здійснювалось планування, постановка, спостереження, облік дослідів та обговорення одержаних результатів, а саме: виготовлення та розміщення „пасток”, ізолювання та ідентифікація грибів з ґрунту, уражених комах, з „пасток”, що інкубували на дослідних ділянках та з хітинвмісних субстратів у виробничих умовах, а також визначення грибостійкості хітину, хітозану та хітинвмісних субстратів. Здобувачем проводилось культивування мікроміцетів на різних середовищах та визначення кількості хітину, загального азоту, білка, вітамінів, редукуючих цукрів.

Автором було запропоновано до застосування коефіцієнт засвоюваності азоту (КЗN); розроблено метод визначення хітинолітичної активності ґрунту та модифіковано метод одержання колоїдного хітину.

Дисертантом проведено поглиблений аналіз даних наукової літератури.

Апробація результатів дисертації. Результати дисертаційної роботи були представлені, доповідалися та обговорювались на з'їздах та конференціях: Другій Всесоюзній конференції „Изучение грибов в биогеоценозах“ (Кириши, Ленинградская обл., 1982 г.); Республіканській конференції „Структура и функции микробных сообществ почв с различной антропогенной нагрузкой” (Чернигов, 1982 г.); Першій Всесоюзній науково-технічній конференції „Производство и использование хитина и хитозана из панциря криля и других ракообразных” (Владивосток, 1983 г.); III Всесоюзній науковій конференції „Микроорганизмы в сельском хозяйстве” (Москва, 1986 г.); IV Всесоюзній конференції „Изучение грибов в биогеоценозах” (Пермь, 1988 г.); Х Конгресі Європейських мікологів (Таллинн, 1989 г.); 2nd International Symposium „Overproduction of Microbial Products” (Chekhoslovakia, 1988); конференції „Антропогенная экология микромицетов, аспекты математического моделирования и охрана окружающей среды” (Київ, 1990 р.); International Regional Seminar „Environment Protection: Modern studies in ecology and microbiology” (Uzhgorod, Ukraine, 1997); Міжнародній науково-практичній школі для молодих вчених і спеціалістів „Природні екосистеми Карпат в умовах посиленого антропогенного впливу” (Ужгород, 2001 р.); Першому з'їзді мікологів Росії „Современная микология в России” (Москва, 2002 г.); ХIV Congress of European Mycologists (Ukraine: Crimea, Yalta, Katsiveli, 2003); Науково-практичній конференції „Паразитология и современность” (Севастополь, Ласпі, 2005 р.); Другому з'їзді мікологів Росії „Современная микология в России” (Москва, 2008 г.) та на засіданнях мікологічної секції УБТ (1983, 1988, 2000 рр.)

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 28 наукових праць, в тому числі 14 статей та матеріалів в збірниках (з них 9 - у наукових фахових виданнях) та 12 тез, одержано Авторське свідоцтво СРСР та Патент України.

Структура і обсяг роботи. Дисертаційна робота викладена на 238 сторінках машинописного тексту та складається зі вступу, огляду літератури, експериментальної частини, заключення, висновків, списку використаних джерел (387 найменувань, з них 185 - іноземні) та 3-ох додатків (5 табл.); містить 19 рисунків та 26 таблиць.

2. Основний зміст

Розділ 1. Хітин і хітиноліз у мікроміцетів в природі та експерименті

Огляд літератури складається з 5-ти підрозділів, в яких відображено стан дослідження „полімеру ХХI сторіччя” - хітину та перспективи його використання; узагальнено та проаналізовано дані щодо синтезу та деструкції хітину у природних, лабораторних та виробничих умовах, мікроміцетами зокрема; накреслено етапи власного дослідження.

Розділ 2. Матеріали та методи досліджень

Дослідження деструкції хітину проводили на ділянках площею 1м2, що були розташовані на околицях м. Києва на буряковому та картопляному полях (Правобережне Полісся), в плодовому саду та на заливному лузі (Лівобережне Полісся), а також у дубово-хвойному лісі з підліском Rhododendron luteum Sweet (Новоград-Волинський район, Городницьке ДЛГ, Городницьке лісництво). Відбір зразків ґрунту для мікологічної характеристики та визначення хітинолітичної активності ґрунту за розробленим нами методом (Харкевич, 1984), розміщення хітинових „пасток” та відбір уражених комах здійснювали на глибині 1, 5 та 10 см впродовж 3-ох років кожні 3 місяці (травень, серпень, листопад). Ізолювання мікроміцетів проводили загальноприйнятими методами з використанням стандартних поживних середовищ, а також середовищ з хітином. В роботі дотримувались класифікаційної системи, яка наведена у 8-му виданні „Ainsworth & Bisby's Dictionary of the Fungi” (1995), для грибів р. Fusarium - системи В.Й. Білай (1977). Написання та скорочення прізвищ авторів таксонів подано згідно посібника „Authors of Fungal Names” (Kirk, Ansell, 1992). Для визначення здатності колекційних культур рр. Aspergillus та Fusarium до росту на середовищі з хітином культивування проводили поверхневим способом на рідкому середовищі Чапека без цукрози з додаванням 2% меленого комерційного хітину; ентомофільні види культивували на агаризованому та на рідкому середовищі Чапека з 1,5% колоїдним хітином та визначали утворення біомаси (Методы..., 1982), редукуючих цукрів (Miller, 1959) та зміну рН культурального середовища. Визначення грибостійкості хітинвмісних субстратів здійснювали згідно ГОСТ 9.048-89 та ГОСТ 9.049-91, а також виходячи з хімічної природи субстратів та матеріалів, для яких можливо застосування хітину та хітозану як домішок (Елинская и др., 1984; Каневская, 1984). Величину кінематичної в'язкості розчинів хітозану визначали віскозиметричним методом (ГОСТ 10028-81). Культивування видів р. Fusarium здійснювали методами глибинного культивування на середовищі Чапека та твердофазної ферментації (Бакай, 1987) на пшеничних соломі та висівках, бавовняній луззі, виноградних вичавках. В зразках визначали: вміст хітину (Johnson, 1971; Костина и др., 1978) та хітин-глюканового комплексу (Muzzarelli et al., 1980); вихід біомаси та її амінокислотний склад, вітаміни групи В (Методы..., 1982); білок („сирий протеїн”), каротиноїди (Методы..., 1987); вміст білка в культуральному фільтраті (Lowry, 1951) та редукуючі цукри (Miller, 1959). Електронну мікроскопію для встановлення структурних змін клітин грибів р. Fusarium за умов термоіндукованого автолізу (Закордонець, Лемещенко, 1974; А.с. 1271076 СССР, 1986) здійснювали на мікроскопі LEM-100 B; виявлення хітину в клітинних стінках грибів проводили в епіфлюоресцентному мікроскопі Akioskop FL (Swiatecki, 1997). Одержання хітинвмісного грибного препарату на основі F. sambucinum ІMB F -100011 та P. sclerotiorum ІMB F-100015 проводили у 2-ві стадії: напрацювання інокулюму та власне ферментація. Одержання рідкої форми препарату здійснювали за умов термоіндукованого автолізу культурального середовища з біомасою при 50-60єС впродовж 2 год. Тестування препарату проводили на гусені дубового шовкопряда Antheraeae pernyi G.-M., а також ікрі та цьоголітках коропу Ciprinus carpio L. Одержані дані були проаналізовані з використанням методів кількісної екології, математичних статистики та моделювання (Плохинский, 1961; Грейг-Смит, 1967; Фритц, Шенк, 1978; Доспехов, 1985; Лакин, 1990). Для ізольованих видів визначали частоту трапляння (Методы..., 1982) та відносну численність видів на хітинвмісних субстратах (Cогонов, 2003); порівняння видового складу мікроміцетів-деструкторів хітину здійснювали за коефіцієнтом Сьоренсена-Чекановського (Грейг-Смит, 1967).

Розділ 3. Таксономічна ТА ЕКОЛОГІЧНА ХАРАКТЕРИСТИКА ДОСЛІДЖЕНИХ ВИДІВ МІКРОМІЦЕТІВ

З різноманітних хітинвмісних субстратів: уражених комах, хітинових „пасток”, що інкубували у ґрунті ділянок з різним рослинним покривом, панцирвмісних відходів криля на різних етапах їх переробки було ізольовано 607 штамів (47 види 22 роди); з ґрунту - 155 штамів (36 видів 18 родів) мікроміцетів. Всього ізольовано 1079 штамів (64 види 23 роди) відділів Zygomycota, Ascomycota та групи Anamorphic fungi. З колекції культур грибів відділу фізіології та систематики мікроміцетів ІМВ НАН України було отримано 317 штамів (15 видів) рр. Fusarium та Aspergillus (табл.1).

Таблиця 1 Таксономічний склад та кількість штамів досліджених мікроміцетів

Розділ 4. Мікобіота та руйнування хітину В природних умовах

Встановлено таксономічну структуру мікроміцетів-деструкторів хітину на ділянках з сільськогосподарськими культурами, заплавній луці, яка використовується для випасу худоби, дубово-сосновому лісі. Показано подібність високого ступеню мікобіоти ґрунту та хітинових „пасток” (S 0,50-0,76), що може свідчити про провідну роль ґрунтових грибів в процесах руйнування хітину. Хітинолітичні мікроорганізми, виступаючи редуцентами 2-го порядку (редуценти редуцентів), набувають функцій прямого показника інтенсивності процесів біоредукції. Деструкція хітину мікрофауни дозволяє грибним редуцентам лімітувати і зоогенний розклад детриту. В цих умовах різко зростає значення представників царства Mycota. Інтенсивність процесу деструкції хітину як важкодоступного азотвмісного поліцукриду, вочевидь, може характеризувати напрям мобілізаційних процесів та рівень забезпеченості доступними формами азоту та вуглецю. Завдяки розробленому методу прослідковано сезонну динаміку хітинолітичної активності лісового ґрунту Руйнування хітину на всіх досліджених ділянках здійснювалося за участю ґрунтових грибів, серед яких значна частина належала до ентомофілів. Найбільш частим компонентом хітинолітичних угруповань був A. niger, а процес руйнування хітину помітно зростав з часом при заселенні пасток пеніцілліями. Процес руйнування хітину продовжувався і в зимовий період. Різниця у структурі угруповань мікроорганізмів-хітинолітиків різних ґрунтів є, за даними літератури, в першу чергу, проявом комплексної дії факторів довкілля; проте спільним є участь у руйнуванні хітину різних груп мікроорганізмів, залежність процесу від глибини ґрунтового профілю та сезону, наявність домінуючих видів, виявлення на „пастках” ентомофільних видів грибів (Gray, Bell, 1963; Gray, Baxby, 1968; Williams, Robinson, 1981; Okafor, 1967).

Одержані експериментальні дані розширюють уявлення щодо процесів деструкції хітину у ґрунті за різних умов та участь у них саме мікроміцетів; вони мають значення у зв'язку з явищем фунгістазису, а також можливістю прогнозування епіфітотій та епізоотій (Шарапов, Кальвиш, 1981; Куприна и др., 2002; Okafor, 1970; Stossel et al., 1984).

Розділ 5. Колонізація мікроміцетАМИ та грибостійкість хітинвмісних субстратів у виробничих умовах

Дослідження грибної контамінації хітинвмісних субстратів у виробничих умовах впродовж технологічного процесу одержання хітину та хітозану на базі рибопромислового цеху „Анна” Бази сейнерного флоту ім. Надібаїдзе Приморрибпрому (м. Владивосток) проведено вперше. Дані щодо видового складу мікобіоти свідчать про формування сталого угруповання на хітинвмісних субстратах в умовах Приморського краю: Aspergillus niger, Eurotium herbariorum, Penicillium digitatum, P. expansum, Rhizopus stolonifer var. stolonifer, Talaromyces luteus. Вказані види, особливо представники рр. Aspergillus та Penicillium, характеризуються широким розповсюдженням та здатністю витримувати екстремальні умови існування (Билай, Коваль, 1988; Марфенина, 2005), а в нашому випадку - умови технологічного процесу одержання хітину та хітозану. Так, на виробництвах агропромислового комплексу найширше у видовому відношенні були представлені саме ці роди (Смирнова, 2000). Таким чином, формування хітинолітичних угруповань та появу представників р. Penicillium на всіх етапах технологічного процесу одержання хітину та хітозану вважаємо цілком закономірним. Види P. digitatum, P. expansum, R. stolonifer var. stolonifer, A. niger, які були ізольовані з хітинвмісних матеріалів та є їх постійними деструкторами, запропоновано внести до списку тест-культур для випробувань на грибостійкість за відповідним стандартом.

Виявлено, що в діапазоні рН 7,5-8,5 найінтенсивніше здійснюється колонізація мікроміцетами хітинвмісних субстратів у виробничих умовах. Візуальна оцінка грибостійкості досліджених зразків не є достатньою. Питання грибостійкості хітозану піднімається вперше. При мікодеструкції в'язкість препаратів хітозану знижувалась тим більше, чим більшою була її вихідна величина. Чим меншою була в'язкість розчинів хітозану, тим більшою - грибостійкість його препаратів, що може бути одним з критеріїв грибостійкості хітозану. Практичні рекомендації щодо застосування бактерицидних ламп БУВ 60 (експозиція тривалістю 60-90 хв) для одержання неконтамінованих грибами зразків хітозану та

1,0-2,0% мурашиної кислоти для консервації панцирвмісних відходів криля можуть бути впроваджені на подібних виробництвах.

Розділ 6. ДЕСТРУКЦІЯ ХІТИНУ МІКРОМІЦЕТАМИ У ЛАБОРАТОРНИХ УМОВАХ

Наявність хітинолітичних ферментів у грибів може бути адаптивною та конститутивною ознакою (Jeuniaux, 1963; Deshpande, 1986; Ильина, Варламов, 2002). Ось чому у грибів рр. Aspergillus та Fusarium була досліджена залежність їх здатності до росту на середовищі з хітином як єдиним джерелом вуглецю від джерела ізолювання штамів. Вперше досліджено 2 види 224 штами р. Aspergillus та 13 видів 88 штамів р. Fusarium з колекції відділу

Встановлена здатність переважної кількості досліджених фузаріїв до росту на середовищі з хітином як єдиним джерелом вуглецю, їм треба надати перевагу при пошуку можливих продуцентів хітинолітичних ферментів. У видів рр. Aspergillus та Fusarium не було виявлено залежності здатності до росту на середовищі з хітином від джерела ізолювання штамів.

При дослідженні ентомофільних видів рр. Aspergillus, Metarhizium та Fusarium різниця за показниками біомаси, кількості редукуючих цукрів та рН культуральної рідини, як показав дисперсійний аналіз, є несуттєвою. Виходячи з вищевказаного, дані були проаналізовані в межах дослідженої групи ентомофільних мікроміцетів. Вихід біомаси за умов росту на середовищі з хітином збільшувався паралельно з наростанням кількості редукуючих цукрів, причому максимальна кількість біомаси та редукуючих цукрів в культуральній рідині накопичувались при рН 8,0-8,2.

Розділ 7. Вміст хітину у біомасі мікроміцетів роду Fusarium за різних умов культивування

Дослідження накопичення хітину, загального азоту та біомаси видами F. moniliforme var. lactis (2801, 54264), F. sambucinum var. minus (52283, 52434) та F. solani (51371) показали, що за результатами дисперсійного аналізу відмінності між ними були несуттєвими. Це дозволило зробити висновки щодо досліджених видів р. Fusarium загалом. Співвідношення кількості азоту та хітину в біомасі змінювалось в динаміці культивування, тому кормова цінність біомаси (за засвоюваністю азоту) на різних етапах культивування грибів була різною. Враховуючи роль хітину в кормовій характеристиці грибної біомаси, найбільш повноцінною буде та, що одночасно вирізняється високим вмістом загального азоту та низьким виходом хітину. В загальному балансі азоту доля хітину, як баластної речовини, є несуттєвою на початку та в кінці періоду культивування гриба-продуцента біомаси. В інтервалі 24-36 год співвідношення загального азоту та хітину можна вважати оптимальним. Для комплексної оцінки даних параметрів запропоновано новий критерій - коефіцієнт засвоюваності азоту (КЗN) (табл.2).

,

де: Nзагальний - азот біомаси; Nхітину - азот хітину

Таблиця 2 Вміст різних форм азоту у біомасі досліджених мікроміцетів за умов глибинного культивування на середовищі Чапека (3-тя доба росту)

Запропоновано КЗN 0,78 для біомаси, яка одержана за умов культивування фузаріїв на синтетичному рідкому середовищі, КЗN 0,92 - для збагачених їх біомасою рослинних субстратів. Зі збагачених рослинних субстратів максимальним вмістом білка (з урахуванням КЗN) характеризуються пшеничні висівки - 32,5 (29,9%) абсолютно сухої ваги (АСВ) відповідно. При використанні пшеничної соломи вихід білка досягав 16,25 (14,95)% АСВ при його вихідній величині 0,4%, що дає підстави пропонувати саме цей найбільш розповсюджений побічний продукт рослинництва для збагачення грибами. Одержані продукти характеризувалися підвищеним вмістом білка та відрізнялися від біомаси фузаріїв більшою засвоюваністю за рахунок зменшення вмісту хітину на одиницю сухої речовини.

Метою було зменшення кількості хітину у досліджених штамів та підвищення виходу біологічно активних речовин з міцелію в культуральну рідину. Встановлено, що зміна рН середовища може бути не лише причиною автолізу, але і його наслідком. Показано, що термоіндукований автоліз сприяв, загалом, залужуванню культуральної рідини (рН 8,0-8,5). Найбільш суттєво це проявлялося за умов індукції автолізу через 2-3-ри доби після початку культивування. Відомо, що зміна рН до лужних значень призводить до зменшення кількості хітину (Феофилова и др., 2006). Термоіндукований автоліз значною мірою сприяв підвищенню біологічної цінності біомаси грибів р. Fusarium: кількість хітину у біомасі дещо знизилась - в 1,2 рази, у 2-ва рази зріс вміст білка в культуральному фільтраті, його відносна перетравлюваність збільшилась на 60%. Проведено електронно-мікроскопічне дослідження структурних елементів клітин у грибів F. moniliforme var. lactis (2801, 54264) та F. solani (51371), причому вперше за умов термоіндукованого автолізу. За умов термоіндукованого автолізу спостерігали характерну для процесу автолізу картину, яка не залежала від причини його виникнення. У всіх досліджених штамів можна було прослідкувати зменшення електронно-щільного вмісту клітин, хоча досить часто спостерігали клітини з залишками мембран. Ділянки з порушеною та менш електронно-щільною клітинною стінкою в досліджених зрізах спостерігались дуже рідко. Не дивлячись на те, що ймовірність виявлення розриву на зрізах дуже мала, нам вдалось його зафіксувати. Процес закінчувався появою великої кількості порожніх клітин, які частіше спостерігали у зразках після 3-ої доби культивування. Таким чином, вміст клітин 3-ох досліджених штамів фузаріїв зазнавав температурного впливу (48±2°С) впродовж 24-48-ми год, але клітинна стінка не руйнувалася та залишалася майже не зміненою, загалом зберігаючи ригідність та відповідну форму. Однак кількість хітину, як ми зазначали вище, незначно зменшувалась. Таку особливість клітинних стінок можна пояснити стійкістю її полімерів, насамперед хітину, до дії температурного фактору та автолітичних ферментів (Феофилова, 1983, 2002а; Muzzarelli, 1977). Одержані результати можуть становити інтерес і в зв'язку з подальшим використанням біомаси як джерела грибного хітину.

Наявність хітину у складі клітинних стінок грибів-продуцентів, що не перетравлюється у тваринному організмі, раніше розглядали як баластну речовину для грибної кормової біомаси. Присутність хітину та його похідних у біомасі нині можна вважати корисним для тваринного організму, зважаючи на їх властивості природних сорбентів та здатність до утворення комплексів, розробку на їх основі нових лікарських засобів (Феофилова и др., 1996; Пат. 26091 Україна, 1999; Кулев, Львова, 2001). Метою було створення хітинвмісного грибного кормового препарату на основі відібраних штамів мікроміцетів. Показники ферментації як окремих штамів Fusarium sambucinum ІMB F-100011 та Penicillium sclerotiorum ІMB F-100015 на стендовій установці ВАТ „Стиролбіотех”, так і їх комплексу, дозволили зробити висновок щодо доцільності проведення сумісного культивування. Так, відмічено зростання виходу біомаси на 16-26%, на 3 год зменшився час культивування. Перевагою застосування комплексних препаратів є те, що культури взаємно доповнюють одна одну за спектром та кількістю біологічно активних речовин і, відповідно, за впливом на живий організм. Передбачено одержання гранульованого

препарату з додаванням висівок та рідкої форми (містить продукти гідролізу хітину), яку одержують за умов термоіндукованого автолізу. В дослідах на гусені шовкопряда, а також на ікрі та цьоголітках коропа випробувано рідку форму препарату. Все вищезазначене дозволяє прогнозувати ефективність використання різних форм хітинвмісного грибного кормового препарату.

Досліджено 1079 штамів мікроміцетів, що належали до 64 видів 23 родів відділів Zygomycota, Ascomycota та групи Anamorphic fungi, представники якої переважали - 883 штами 51 вид 13 родів. Вперше проведено порівняльне вивчення деструкції хітину в природних (ділянки з різною рослинністю) та виробничих (технологічний процес одержання хітину та хітозану) умовах. Визначено подібність грибних угруповань, що сформувались у ґрунті, на хітинових „пастках” та на хітинвмісних субстратах у процесі виробництва хітину та хітозану. Встановлено основні види мікроміцетів-деструкторів хітинвмісних субстратів у виробничих умовах - технологічному процесі одержання хітину та хітозану. Рекомендовано введення до списку тест-культур для випробувань на грибостійкість хітинвмісних субстратів відповідного стандарту видів, що ізольовані з даних матеріалів та є їх постійними деструкторами, а саме: Penicillium digitatum, P. expansum, Aspergillus niger, Rhizopus stolonifer var. stolonifer. Кінематична в'язкість 1,0 % розчинів хітозану в 2,0 % оцтовій кислоті, як вперше запропоновано нами, є одним з додаткових критеріїв грибостійкості хітозану. Встановлено загальну закономірність проходження процесів хітинолізу в природних, лабораторних та виробничих умовах - в діапазоні рН 7,5-8,5 вони проходять найінтенсивніше. Критерієм засвоюваності азоту хітинвмісної кормової біомаси може слугувати запропонований коефіцієнт засвоюваності азоту (КЗN). Термін культивування фузаріїв на середовищі Чапека визначає цільове призначення одержаної біомаси: для максимально можливого виходу засвоюваного грибного білка період ферментації не повинен перевищувати 50 год, для одержання високого виходу біомаси без додаткових вимог її азотної повноцінності -- 60 год, а максимальний вихід хітину відмічено на 80-90 год ферментації. При індукції автолізу через 2-3 доби після початку ферментації кількість хітину зменшувалась в 1,2 рази, що сприяло підвищенню засвоюваності азоту. Вміст білка в культуральній рідині зростав удвічі, а його відносна перетравлюваність - майже на 60,0%. Електронно-мікроскопічне дослідження показало, що за умов термоіндукованого автолізу клітинна стінка грибів р. Fusarium майже не руйнувалась. Це може бути використано для одержання грибного хітину. Присутність хітину та його похідних у грибній біомасі, зважаючи на їх здатність до сорбції та утворення комплексів, можна вважати позитивним для кормових препаратів. Створено хітинвмісний грибний кормовий препарат на основі комплексної культуру мікроміцетів Fusarium sambucinum ІMB F-100011 та Penicillium sclerotiorum ІМВ F-100015, що є новим напрямом щодо білково-вітамінних препаратів. Таким чином, зі збільшенням кола похідних хітину та хітозану, а також галузей застосування цих речовин, особливо впродовж останнього десятиріччя, цілком виправданим є інтерес до синтезу та деструкції хітину в природі та експерименті. хітин природний культивування мікобіота

Висновки

1. Вперше досліджено мікобіоту ряду хітинвмісних субстратів (уражені комахи, хітинові „пастки”, панцирвмісні відходи криля на різних етапах переробки), з яких ізольовано 607 штамів 47 видів 22 роди відділів Zygomycota, Ascomycota та групи Anamorphic fungi (понад 70% штамів). З ґрунту ізольовано 155 штамів 36 видів 18 родів мікроміцетів. Всього досліджено 1079 штамів 64 видів 23 родів мікроміцетів (в тому числі з колекції відділу фізіології і систематики мікроміцетів 317 штамів 15 видів родів Aspergillus та Fusarium).

2. Порівняльний аналіз видового складу мікобіоти хітинвмісних субстратів виявив низький ступінь подібності досліджених угруповань в природних та виробничих умовах (S 0,07-0,33). Високий ступінь подібності мікобіоти хітинвмісних субстратів відмічено для ділянки бурякового поля та плодового саду, лісу та заплавної луки (S 0,50). Про провідну роль мікроскопічних ґрунтових грибів в процесах руйнування хітину свідчить високий ступінь подібності мікобіоти ґрунту досліджених ділянок та експонованих хітинових „пасток” (S 0,50-0,76).

3. Встановлено види мікроміцетів-деструкторів хітинвмісних субстратів у виробничих умовах: Penicillium digitatum, P. expansum, Rhizopus stolonifer var. stolonifer, Talaromyces luteus, Eurotium herbariorum та Aspergillus niger. Частота трапляння видів роду Penicillium досягала 100% на всіх етапах процесу одержання хітину та хітозану. Найстійкішим до агресивних середовищ у виробничих умовах був Penicillium expansum. Penicillium digitatum був найхарактернішим для початку та закінчення технологічного процесу. Наявність останнього виду можна вважати показником очистки панцирів криля від білкового забруднення та відносного зростання хітозану, як більш доступного субстрату, на кінцевих етапах виробництва.

4. Запропоновано внести до списку тест-культур для випробувань на грибостійкість хітинвмісних матеріалів за відповідним стандартом види Penicillium expansum, P. digitatum, Aspergillus niger, Rhizopus stolonifer var. stolonifer, які були ізольовані з таких матеріалів та є їх постійними деструкторами.

5. Грибна контамінація препаратів хітозану призводить до зниження їх в'язкості. Показано, що чим менша в'язкість розчинів хітозану, тим більша грибостійкість його препаратів. Одним з додаткових критеріїв грибостійкості хітозану може слугувати кінематична в'язкість його 1 % розчинів в 2% оцтовій кислоті.

6. Встановлено загальну закономірність здійснення процесів хітинолізу. Виявлено, що в діапазоні рН 7,5-8,5 найінтенсивніше здійснюється колонізація мікроміцетами хітинвмісних субстратів у виробничих умовах; проходять деструкція хітину ентомофільними мікроміцетами у лабораторних умовах; процеси хітинолізу у ґрунті та досягнення максимальних значень хітинолітичної активності ґрунту.

7. Для розрахунку кількості білка у біомасі досліджених видів роду Fusarium з урахуванням небілкового азоту хітину запропоновано коефіцієнт засвоюваності азоту КЗN, який становить 0,78 для біомаси, яка вирощена на середовищі Чапека та 0,92 - для такої з використанням рослинних субстратів (твердофазна ферментація).

8. Клітинна стінка досліджених видів роду Fusarium за умов здійснення термоіндукованого автолізу не руйнувалася та залишалася майже не зміненою, що може бути використано для одержання грибного хітину.

9. На основі відібраних нетоксичних культур грибів Fusarium sambucinum ІMB F-100011 та Penicillium sclerotiorum ІМВ F-100015 та дослідження їх фізіологічних особливостей створено хітинвмісний грибний кормовий препарат, який захищено Патентом України. Проведено тестування препарату на тваринах та одержано позитивні результати.

Список праць, що опубліковані за темою дисертації

1. Харкевич О.С. Хітин і хітиноліз у грибів / О.С. Харкевич, Е.З. Коваль // Український ботанічний журнал. - 1977. - т. 34, № 3. - С. 309-315.

2. Коваль Э.З. Участие почвенных грибов в процессах деструкции хитинсодержащих субстратов / Э.З. Коваль, В.И. Билай, Е.С. Харкевич // Микология и фитопатология. - 1983. - т. 17, вып. 3. - С. 236-242.

3. Коваль Э.З. Разрушение хитина почвенными грибами в условиях Полесья / Э.З. Коваль, Е.С. Харкевич // Микробиологический журнал. - 1983. - т. 45, № 6. - С. 57-63.

4. Билай В.И. Экологические и методические аспекты изучения разрушения хитина микромицетами / В.И. Билай, Э.З. Коваль, Е.С. Харкевич // Микробиологический журнал. - 1984. - т. 46, № 1. - С. 97-108.

5. Коваль Э.З. Изменение содержания хитина в мицелии гифомицетов, перспективных для биоконверсии растительных субстратов / Э.З. Коваль, Е.С. Харкевич, Л.А. Закордонец // Микробиологический журнал. - 1987. - т. 49, № 1. - С. 93-96.

6. Харкевич Е.С. Физиолого-биохимическая характеристика селектированных штаммов рода Fusarium Lk: Fr., культивируемых на различных средах / Е.С. Харкевич, Л.А. Закордонец, Э.З. Коваль // Микология и фитопатология. - 1989. - т. 23, вып. 3. - С. 264-269.

7. Харкевич Е.С. Грибостойкость хитина и хитозана, критерии ее оценки / Е.С. Харкевич, Т.А. Москаленко, Т.Г. Сахарова, В.А. Федченко, Н.Н. Жданова // Микология и фитопатология. - 2002. - т. 36, вып. 1. - С. 48-54.

8. Weichert D. Protein Enrichment in Plant by Fusaria / D. Weichert, L. Zakordonets, G. Klappach, E. Kharkevich, E.Z. Koval // Acta Biotechnologica. - 1991. - v. 11, № 2. - P. 115-119.

9. А. с. 1271076 СССР МКИ С 12 Р 1/02 С 12 R 1:645. Способ получения кормового белково-витаминного продукта / В.С. Иванов, С.М. Супрун, В.А. Анистратенко, Л.А. Закордонец, В.И. Тонконог, В.Л. Айзенберг, П.А. Любенко, Л.И. Пустовалова, Е.С. Харкевич (СССР). - №3763913 ; заявл. 25.04.84, опубл. 15.07.86.

10. Пат. 49548 Україна, С 12Р39/00 А01К67/04. Спосіб одержання хітинвмісного кормового вітамінного препарату грибного походження / Т.Б. Аретинська, Г.В. Донченко, Ю.М. Пархоменко, С.М. Супрун, В.О. Трокоз, І.О. Кириченко, О.С. Харкевич; заявник та патентовласник Нац. аграрн. ун-т. - №2001129032 ; заявл. 25.12.2001 ; опубл. 15.12.2004, Бюл. №12.

11. Супрун С.М. Біологічна дія вітамінно-коферментних препаратів грибного походження на шовкопрядів Bombyx mori L. та Antheraeae pernyi G.-M. / С.М. Супрун, Т.Б. Аретинська, І.О. Кириченко, Ю.М. Пархоменко, М.Л. Алексеніцер, О.С. Харкевич // Шовківництво : міжвідомч. темат. наук. зб., вип. 23. - Київ : Аграрна наука, 2001. -- С. 62-69.

12. Коваль Э.З. Аспекты исследования и применения способности мицелиальных грибов к синтезу и деструкции хитина / Э.З. Коваль, Е.С. Харкевич // Производство и использование хитина и хитозана из панциря криля и других ракообразных : первая всес. науч.-техн. конф., 13-15 сент. 1983 г. : материалы конф. - Владивосток: Полиграфкомбинат, 1985. - С. 87-96.

13. Супрун С.М. Биопрепарат как средство оздоровления животных / С.М. Супрун, Ю.М. Пархоменко, Г.В. Донченко, Н.М. Исаева, Е.С. Харкевич // Паразитология и современность : науч.-практ. конф., 19-24 сент. 2005 г. : материалы. - Вестник зоологии. - 2005. - 19, ч. 2. - С. 333-335.

14. Харкевич Е.С. Разложение хитина как возможный показатель интенсивности процессов биоредукции в лесных экосистемах / Е.С. Харкевич // Микробиология и научно-технический прогресс : IV конф. мол. уч., 20-23 мая, 1980 г. : тезисы докл. - К. : Наук. думка, 1980. - С. 163.

15. Харкевич Е.С. Метод определения хитинолитической активности почвы / Е.С. Харкевич // Микробиологический журнал. - 1984. -т. 46, № 2. - С. 87-88.

16. Коваль Э.З. Деструкция хитина энтомофильными грибами в различных агробиоценозах / Э.З. Коваль, Е.С. Харкевич // Структура и функции микробных сообществ почв с различной антропогенной нагрузкой : респ. конф., 17-21 мая 1982 г. : тезисы докл. - К. : Наук. думка, 1982. - С. 123-127.

17. Харкевич Е.С. Хитинолитическая активность почв в биоценозах / Е.С. Харкевич, Р.Е. Пашкевич // Микроорганизмы в сельском хозяйстве : III всес. науч. конф., 23-25 дек. 1986 г. : тезисы докл. - М. : Изд-во МГУ, 1986. - С. 64.

18. Закордонец Л.А. Фузарии - источник кормового, пищевого белка и аминокислот / Л.А. Закордонец, Л.И. Пустовалова, Е.С. Харкевич // IV симпозиум социалистических стран по биотехнологии, 26-30 мая 1986 : тезисы докл. - Варна, 1986. - С. 144.

19. Коваль Э.З. Динамика деструкции хитина грибами в лесных биогеоценозах / Э.З. Коваль, Е.С. Харкевич // Изучение грибов в биогеоценозах : IV всес. конф., 12-16 сент. 1988 г. : тезисы докл. - Свердловск, 1988. - С. 19.

20. Закордонец Л.А. Направленный термоиндуцированный автолиз биомассы фузариев / Л.А. Закордонец, Э.З. Коваль, Е.С.Харкевич, Н.В. Нестерова // VII съезд УМО, часть 1, сент. 1989 г. : тезисы докл. - Киев-Черновцы: Чернов. мед. ин-т, 1989. - С. 55-56.

21. Харкевич Е.С. Микромицеты, контаминирующие хитин в экстремальных условиях технологических процессов / Е.С. Харкевич, Т.М. Москаленко, Т.Г. Сахарова // Антропогенная экология микромицетов, аспекты математического моделирования и охрана окружающей среды, 20-25 апр. 1990 г. : тезисы докл. - Киев, 1990. - С. 48-49.

22. Харкевич О.С. Біологічно-активні комплекси на основі мітоспорових грибів та перспективи їх застосування / О.С. Харкевич, С.М. Супрун, Ю.М. Пархоменко, Н.М. Жданова, Г.В. Донченко // Природні екосистеми Карпат в умовах посиленного антропогенного впливу : міжн. наук.-практ. школа для молод. вчених і спец., 4-7 жовт. 2001 р. : Наук. Вісн. Ужгород. ун-ту, Сер. біол., № 9. - Ужгород: Уж. нац. ун-т. 2001. - С. 136-137.

23. Супрун С.М. Митоспоровые грибы перспективные в биотехнологии для получения витаминно-коферментных пищевых и кормовых добавок и витаминов / С.М. Супрун, Ю.М. Пархоменко, Г.В. Донченко, Е.С. Харкевич, М.И. Цибульская, П.Н. Королев // Современная микология в России : первый съезд микологов России, 11-13 апр. 2002 г. : тезисы докл., р. 12. - М. : Национальная Академия Микологии, 2002. - С. 304.

24. Супрун С.М. Белково-витаминный препарат на основе микромицетов: получение, характеристика и аспекты применения / С.М. Супрун, Е.С. Харкевич, Г.В. Донченко, Ю.М. Пархоменко, Т.М. Кучмеровская // Современная микология в России : второй съезд микологов России, 16-18 апр. 2008 г. : тезисы докл., т. 2. - М. : Национальная Академия микологии, 2008. - С. 341-342.

25. Zakordonets L.А. Criteria for the estimation of cultured fungal biomass / L.А. Zakordonets, E.S. Kharkevich, E.Z. Koval // Х Конгресс Европейских микологов, 20-25 авг. 1989 г. : тезисы докл. - Таллинн, 1989. - P. 140.

26. Zakordonets L.А. Growth, biosynthesis of protein, amino acids and other physiologically active substances by fusaria, perspective for industrial cultivation / L.А. Zakordonets, E.Z. Koval, E.S. Kharkevich, L.A. Bogomolova // Overproduction of Microbial Products : 2nd Intern. Symp., July 3-9, 1988 : Abstract Book. - Ceske Budejovice, 1988. - P. 173.

27. Parchomenko Yu. Obtaining aspects of application of the fungal vitamin-coenzyme complexes / Yu. Parchomenko, G. Donchenko, M. Aleksenitser, S. Suprun, E. Kharkevich // Environment Protection: Modern studies in ecology and microbiology : Intern. Reg. Sem., May 13-16, 1997 : рroceed. - Uzhgorod: ВАТ “Патент”, 1997. - P. 78-80.

28. Kharkevich E.S. Chitincontaining preparations based on micromycetes / E.S. Kharkevich, N.N. Zhdanova, G.V. Donchenko, S.M. Suprun // ХIV Congress of European Mycologists, 22-27 Sept. 2003. : Abstracts. - 2003. - P. 22.

Анотація

Харкевич О.С. Участь мікроміцетів у процесах синтезу та деструкції хітину/ - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.21 - мікологія. - Інститут ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України, Київ, 2009.

Досліджено мікобіоту ряду хітинвмісних субстратів у природних, лабораторних та виробничих умовах (уражені комахи, хітинові „пастки”, панцирвмісні відходи криля на різних етапах переробки, комерційний хітин) та ізольовано 607 штамів 47 видів 22 родів мікроміцетів. З ґрунту ізольовано 155 штамів 36 видів 18 родів мікроміцетів. Всього досліджено 1079 штамів 64 види 23 роди відділів Zygomycota, Ascomycota та групи Anamorphic fungi. Про провідну роль ґрунтових мікроміцетів в процесах руйнування хітину свідчить високий ступінь подібності мікобіоти ґрунту досліджених ділянок та експонованих хітинових „пасток” (S 0,50-0,76). Порівняльний аналіз видового складу мікобіоти хітинвмісних субстратів у природних та виробничих умовах показав низький ступінь її подібності (S 0,07-0,33). Визначено загальну закономірність здійснення процесів деструкції хітину, а саме: процесів хітинолізу в ґрунті; деструкції хітину ентомофільними мікроміцетами у лабораторних умовах, грибної колонізації субстратів у виробничих умовах. Встановлено, що чим менша в'язкість розчинів хітозану, тим більша грибостійкість його препаратів. Це може бути використано як критерій грибостійкості хітозану.

Досліджено динаміку вмісту хітину у мікроміцетів р. Fusarium за умов культивування на природних та синтетичних середовищах. Запропоновано до застосування коефіцієнт засвоюваності азоту (КЗN), що враховує небілковий азот хітину в біомасі мікроміцетів; розроблено та запропоновано метод визначення хітинолітичної активності ґрунту та модифіковано метод одержання колоїдного хітину. Для випробувань на грибостійкість хітину та хітинвмісних субстратів рекомендовано введення до списку тест-культур грибів відповідних стандартів видів, що ізольовані з даних матеріалів та є їх постійними деструкторами, а саме: Aspergillus niger, Penicillium digitatum, P. expansum, Rhizopus stolonifer var. stolonifer.

На основі комплексу культур мікроміцетів Fusarium sambucinum ІМВ F-100011 та Penicillium sclerotiorum ІМВ F-100015 створено та випробувано на тваринах хітинвмісний грибний кормовий препарат, який захищено Патентом України.

Ключові слова: мікроміцети, видовий склад, хітин, хітинвмісні субстрати, синтез, деструкція, грибостійкість, хітинолітична здатність, хітинвмісний грибний кормовий препарат.

Аннотация

Харкевич Е.С. Участие микромицетов в процессах синтеза и деструкции хитина. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.21 - микология. - Институт ботаники им. Н.Г. Холодного НАН Украины, Киев, 2009.

Исследована микобиота ряда хитинсодержащих субстратов в природных, лабораторных и производственных условиях (пораженные насекомые, хитиновые „ловушки”, панцирьсодержащие отходы криля на разных этапах переработки, коммерческий хитин) и изолированы 607 штаммов 47 видов 22 родов микромицетов. Из почвы были изолированы 155 штаммов 36 видов 18 родов микромицетов. Всего исследованы 1079 штаммов 64 вида 23 рода отделов Zygomycota, Ascomycota и группы Anamorphic fungi. Высокий уровень сходства микобиоты почвы исследованных участков и экспонированных хитиновых „ловушек” свидетельствует о ведущей роли почвенных микромицетов в процессах деструкции хитина. Сравнительный анализ видового состава микобиоты хитинсодержащих субстратов в природных и производственных условиях выявил низкий уровень ее сходства (S 0,07-0,33). Определена общая закономерность осуществления процессов деструкции хитина, а именно: процессов хитинолиза в почве; деструкции хитина энтомофильными микромицетами в лабораторных условиях, грибной колонизации субстратов в производственных условиях. Установлено, что чем меньше вязкость растворов хитозана, тем выше грибостойкость его препаратов. Это может быть использовано в качестве критерия грибостойкости хитозана.