Протонна регуляція процесів трансформації енергії в тилакоїдних мембранах

Размещено на http://www.allbest.ru/

ХАРКІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

імені В.Н. КАРАЗІНА

УДК 517.112:612.8

03.00.04 - біохімія

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук

ПРОТОННА РЕГУЛЯЦІЯ ПРОЦЕСІВ ТРАНСФОРМАЦІЇ ЕНЕРГІЇ В ТИЛАКОЇДНИХ МЕМБРАНАХ

Золотарьова Олена Костянтинівна

Харків - 2008



Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор, академік Української академії аграрних наук МУСІЄНКО Микола Миколайович Київський національний університет ім. Т.Г. Шевченка, професор кафедри фiзiологiї та екології рослин

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник МАМЕДОВ Махир Джафар огли Московський державний університет ім. М.В. Ломоносова, НДІ фізико-хімічної біології ім. О.Н. Бєлозерського, провідний науковий співробітник відділу біоенергетики доктор біологічних наук, старший науковий співробітник КУРЧІЙ Богдан Олексійович Інститут фізіології рослин і генетики НАН України, старший науковий співробітник відділу фізіології росту і розвитку

Захист відбудеться 25 червня 2008 р. о 15-15 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.051.17 Харківського національного університету імені В.Н. Каразіна Міністерства освіти і науки України за адресою: 61077, м. Харків, пл. Свободи, 4, біологічний факультет, ауд. 3-15.

З дисертацією можна ознайомитись у Центральній науковій бібліотеці Харківського національного університету імені В.Н. Каразіна Міністерства освіти і науки України (61077, м. Харків, пл. Свободи, 4).

Автореферат розісланий 23 травня 2008 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради В.М. Дзюба



ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Трансформація енергії світла в хімічну енергію стабільних продуктів “світлової” стадії фотосинтезу (ATФ і НАДФH) здійснюється в системі внутрішніх (тилакоїдних) мембран хлоропластів і є багатоступінчастим процесом, що включає міграцію енергії збудженого стану по антені світлозбирального комплексу (СЗК), розділення зарядів у реакційних центрах (РЦ) першої і другої фотосистем (ФСІ і ФСІІ), перенесення електронів по ланцюгу переносників і зв'язані з ним процеси фосфорилування.

За умов освітлення на тилакоїдній мембрані рослин формується трансмембранний електрохімічний градієнт іонів водню ???H+), який складається в основному з осмотичної компоненти (?рH) при незначному внеску електричної складової (Дш). ??H+ енергетично забезпечує синтез АТФ мультисубодиничним трансмембранним комплексом СF0F1-АТФази, який складається з мембранної частини, що транслокує протони, СF0 і зовнішньої каталітичної частини СF1 (Strotmann, Bickel-Sandkotter, 1984; Boyer, 1993; Capaldi, Aggeler, 2002). Елементарний акт каталізу протікає в активному центрі спонтанно (Boyer, 2000), а енергія ??H+ витрачається на стадії витіснення АТФ, а також для зв'язування АДФ і фосфату з активним центром ферменту. Каталітичні центри СF1 функціонують, чергуючись у певному порядку, при цьому відбувається обертання каталітичних субодиниць відносно субодиниць, що беруть участь у транслокації протонів (Hirono-Hara et al., 2001; Nishio et al., 2002; Senior et al., 2002). Функціональний зв'язок процесів сорбції-десорбції субстратів і продукту фотофосфорилування з процесом перенесення протонів крізь ATФсинтазний комплекс у загальних рисах описаний. У той же час молекулярний механізм їх внутрішньоферментного спряження і будова внутрішньоферментного “шляху” перенесення протонів вивчені фрагментарно.

Ідея перенесення Н+ від електронтранспортних протонних помп до комплексу АТФсинтази, що здійснюється латерально, минаючи водну фазу внутрішньотилакоїдного простору (Polle, Junge, 1986; Dilley, 1986, 1991), і забезпечується за рахунок оборотного протонування іоногенних груп мембранних білків з рК 6-8 (Ewy, Dilley, 2000), не отримала достатнього обґрунтування. Необхідно відзначити також, що кількість груп з рК 6-8 у складі мембранних білків тилакоїдів невелика, вони належать різним поліпептидним комплексам і навряд чи можуть скласти єдиний ансамбль, який дозволив би здійснювати спрямоване перенесення протонів. У той же час, у тилакоїдах виявлено, щонайменше, два пули зв'язаного бікарбонату (рК ~ 6,5), котрі відрізняються за міцністю асоціації з мембранами (Stemler, 1977; Stemler, Murphy, 1983), а також численні форми карбоангідрази - ферменту, який прискорює реакцію Н2О + СО2 = НСО3- + Н+ (Игнатова и др., 2006; Иванов и др., 2007). Міцно зв'язаний бікарбонат (1 моль на 400-600 молів хлорофілу) є кофактором електронного транспорту у ФСІІ, і його видалення приводить до повного інгібування фотосинтетичного виділення кисню (Stemler, Govindjee, 1973; Klimov, Baranov, 2001), у той час як пул відносно слабко зв'язаного НСО3- (з концентрацією біля 1 моль / моль хлорофілу) може бути видалений без істотного впливу на фотохімічну активність ФСII. Незважаючи на те, що останніми роками роль мембранозв'язаного бікарбонату у фотосинтезі інтенсивно вивчається (Baranov et al., 2000; van Rensen, 2002; Stemler, 2002), роль слабко зв'язаного НСО3- в тилакоїдах усе ж не встановлена, і є підстави припускати, що цей пул може брати участь у транспорті протонів (Подорванов и др., 2005).

Концентрація вільних іонів водню в компартментах тилакоїдів, залежна від інтенсивності освітлення, температури, доступності СО2, швидкості метаболічних процесів, що споживають макроергічні продукти світлової фази фотосинтезу, відіграє важливу регуляторну і сигнальну роль (Horton, Ruban, 1992, 2005; Ma et al., 2003; Kramer et al., 2003, 2004; Hieber et al., 2004). За умов пониження рН усередині тилакоїдів знижується швидкість фотосинтетичного електронного транспорту через уповільнення окиснення пластохінолу - рухливого переносника електронів і протонів між ФСІІ і b6f-цитохромним комплексом (Witt, 1979). Перенесення електронів на цій ділянці при високих значеннях трансмембранного ДрН може бути повністю блокованим. За цих умов індукуються альтернативні шляхи електронного транспорту (Хоробрых и др., 2002), котрі забезпечують підтримку необхідного рівня фотохімічної активності ФСІІ. Останніми роками Д. Крамер зі співавт. (Kramer et al., 1999; Avenson et al., 2005; Baker et al., 2007) висловлює сумнів щодо можливості формування високих значень ДрН у хлоропластах in vivo. Розбіжності в оцінках величини транстилакоїдного ДрН in vivo та in vitro, можливо, пов'язані з відмінностями в буферній ємності () нативних та ізольованих хлоропластів. Препаративне виділення хлоропластів супроводжується, очевидно, втратою розчинних і мобільних компонентів, зокрема, СО2/НСО3-, внесок яких у може бути вельми значним у порівнянні зі зробленими раніше оцінками (Walz, 1974; Junge et al., 1979).

Таким чином, наявних у літературі даних не достатньо для повного розуміння механізмів протонної регуляції процесу фотосинтетичної трансформації енергії. У зв'язку з цим дослідження світлозалежного зв'язування і перенесення протонів у тилакоїдних мембранах є необхідним і актуальним завданням при вивченні процесу фотосинтетичної трансформації енергії. На вирішення цієї проблеми спрямована дана робота.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконувалась у відповідності з планами фундаментальних науково-дослідних робіт відділу мембранології та фітохімії Інституту ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України: “Вивчення структурно-функціональних залежностей у фотосинтетичному апараті водоростей і спрямоване регулювання його продуктивності” (1989-1995 рр., № д/р 0189.0046460); “Ідентифікація конформаційно активних пептидів у білкових комплексах фотосинтезуючих мембран” (1992-1995 рр., № д/р VA01008358PIII); “Вивчення світлозалежних процесів в енергоперетворюючих мембранах фотосинтезуючих організмів” (1992-1996 рр., № д/р VA01000059P), “Особливості еволюційного становлення систем світлозбору та синтезу АТФ у фотосинтезуючих організмів” (1997-2001 рр., № д/р 0198U003791), “Фотосинтетичний апарат світлолюбних і тіньолюбних рослин при різних умовах освітлення” (2002-2006 рр., № д/р 0103U000359).

Мета і завдання дослідження. Метою роботи було встановлення механізмів протонної регуляції процесів фотосинтетичної енерготрансформації, а також визначення ролі компонентів тилакоїдної мембрани хлоропластів вищих рослин у світлозалежному зв'язуванні й транспортуванні протонів.

У завдання роботи входило:

1) на підставі методу ізотопного обміну атомів водню розробити експериментальні підходи до визначення шляхів міграції протонів у ході фотосинтетичного енергоперетворення;

2) встановити вплив енергізації хлоропластів і активації процесу фотофосфорилування на характеристики ізотопного обміну водню в білкових компонентах тилакоїдних мембран та ідентифікувати функціонально-компетентну фракцію мембранозв'язаного тритію;

3) проаналізувати шляхи світлоіндукованого перенесення протонів у залежності від функціонального стану хлоропластів;

4) дослідити конформаційні перебудови АТФсинтази хлоропластів, викликані взаємодією з субстратами;

5) оцінити внесок мембранозв'язаного бікарбонату в загальну кількість протон-акцепторних груп тилакоїдної мембрани;

6) дослідити вплив екзогенного бікарбонату та інгібіторів карбоангідрази на фотофосфорилування і величину світлоіндукованого поглинання іонів водню ізольованими хлоропластами;

7) запропонувати концепцію участі мембранозв'язаного бікарбонату в механізмі спряження електронного транспорту і фотофосфорилування при фотосинтезі; енерготрансформація тилакоїдний хлоропласт протон

8) визначити умови специфічної модифікації протонного каналу АТФсинтази гідрофобним конденсуючим агентом N,N'-дициклогексилкарбодіімідом (ДЦКД-ом);

9) проаналізувати механізми, які приводять до втрати термодинамічної ефективності процесів фотосинтетичної енерготрансформації за допомогою апарату нерівноважної термодинаміки.

Об'єкт дослідження - трансформація енергії світла в хімічну енергію в процесі фотосинтезу.

Предмет дослідження - спряження електронного транспорту, трансмембранного перенесення протонів і фотофосфорилування в хлоропластах, а також конформаційна динаміка комплексів тилакоїдної мембрани в процесі енергоперетворення.

Методи дослідження. Одним з основних методів дослідження був обраний метод ізотопного заміщення водню на тритій. Для очищення і характеристики білків були використані фізико-хімічні методи (екстракція, ультрацентрифугування, гель-фільтрація, іонообмінна й афінна хроматографії). Для визначення швидкостей фотохімічних процесів використовувалися флуоресцентні, спектральні, амперометричні, потенціометричні та біолюмінесцентні методи.

Наукова новизна одержаних результатів. Запропоновано концепцію участі мембранозв'язаного бікарбонату, як основної буферної системи тилакоїдних мембран, в енергетичному спряженні процесів електронного транспорту і фотофосфорилування при фотосинтезі.

Уперше для встановлення шляхів енергозалежної міграції протонів використаний метод протон-тритієвого обміну. Показана гетерогенність розподілу мембранозв'язаного тритію, що свідчить про існування різних фондів протонів. Визначені білкові компоненти тилакоїдів, які беруть участь у світлоіндукованому протон-тритієвому обміні, а також умови, які впливають на цей процес. Показано, що в залежності від функціонального стану тилакоїдів перенесення протонів від протонгенеруючих помп до АТФсинтази відбувається різними шляхами, наявність яких підтверджена кінетичними експериментами.

Отримані нові дані про роль мембранозв'язаного бікарбонату в регуляції фотохімічних процесів при фотосинтезі. Встановлено, що пул мембранозв'язаного бікарбонату підтримується за участю карбоангідрази. Показано, що інгібування активності карбоангідрази веде до зниження буферної ємності тилакоїдних мембран, гальмування світлоіндукованого поглинання протонів і фотофосфорилування.

Уперше показано, що внесок фотосистем I і II у перенесення електронів у тилакоїдах залежить від величини трансмембранного протонного градієнта і що при зростанні ДрН індукується альтернативне перенесення електронів на рівні фотосистеми II.

Уперше проведено комплексне дослідження ефективності фотохімічних процесів у хлоропластах за допомогою апарату нерівноважної термодинаміки. Показано, що термодинамічна ефективність фотосинтетичної енерготрансформації в хлоропластах залежить від світлових умов вирощування рослин і пов'язана з процесами, що викликають інгібування фотосинтезу. Проведено порівняльне вивчення впливу синтетичних і природних ефекторів різної природи на термодинамічну ефективність трансформації світлової енергії хлоропластами і визначені критерії, які дозволяють охарактеризувати спряження енергодонорних і енергоакцепторних реакцій у тилакоїдах.

Охарактеризовані умови специфічного блокування протонного каналу АТФсинтази хлоропластів гідрофобним конденсуючим агентом ДЦКД і встановлено, що ДЦКД виступає як каталізатор алкілування функціональних груп білків електронтранспортного ланцюга в присутності спиртів. Встановлено також, що інгібування синтезу АТФ ДЦКД-ом за умов специфічної модифікації пов'язано з індукцією внутрішньомолекулярного протонного роз'єднування («сліпу»). Виявлено, що інгібування роз'єднаного електронного транспорту ДЦКД-ом відбувається через спиртозалежну модифікацію переносників електронтранспортного ланцюга.

Практичне значення одержаних результатів. Розроблені методичні підходи, отримані експериментальні дані та сформульовані на їх підставі висновки мають теоретичне та практичне значення в біохімії фотосинтезу, біоенергетиці, фізіології рослин.

Отримані дані сприяють розумінню природи енергізованого стану хлоропластів і становлять цінність при вирішенні проблеми спрямованої регуляції фотосинтетичної діяльності рослин з метою збільшення їх продуктивності.

Отримані в роботі факти накопичення радіоактивного ізотопу водню тритію в тилакоїдних мембранах і його ковалентне включення за вільнорадикальним механізмом у мембранні компоненти становлять практичний інтерес у зв'язку з постійним зростанням вмісту тритію в навколишньому середовищі через роботу ядерних реакторів та інших підприємств атомної промисловості, що призводить до нагромадження тритію в рослинах і наступного рознесення трофічними ланцюгами.

У роботі розроблені принципові методологічні підходи і нові прийоми, що дозволяють вивчати ізотопний обмін атомів водню на біомембранах, створена автоматизована установка для прецизійного потенціометричного титрування і визначення буферної ємності. Метод буферної ємності застосовували для аналізу протолітичних властивостей поліфенольних сполук, у результаті визначено константи іонізації великого числа природних флавоноїдів.

Інформація, отримана в результаті вивчення регуляції фотосинтетичної трансформації енергії, відкриває нові перспективи і наближає нас до розуміння механізмів спряження електронного транспорту і синтезу АТФ.

Матеріали можуть бути використані в навчальному процесі учбових закладів при викладанні окремих курсів з біоенергетики та біохімії.

Особистий внесок здобувача. Cформульовано напрямок досліджень, розроблено програму та методику експерименту, проведено аналіз літературних даних, виконано експериментальні дослідження та інтерпретовано отримані результати. Експериментальні дослідження проведено особисто, а також спільно зі співробітниками відділу мембранологiї та фiтохiмiї Інституту ботаніки iм. М.Г. Холодного НАН України, лабораторії бiоенергетики Інституту фундаментальних проблем біології РАН (м. Пущiно, Росія) та Мiжфакультетської лабораторії біоорганічної хімії Московського державного університету iм. М.В. Ломоносова. У дисертації використані власні наукові публікації, у тому числі написані у співавторстві. У дисертації не використовувалися ідеї або розробки, які належать співавторам публікацій.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації висвітлені на 8-й Європейській Біоенергетичній конференції (Валенсія, 1982); на 16-й (Москва, 1984) і 19-й (Амстердам, 1990) конференціях Федерації Європейських біохімічних товариств; на I Всесоюзному біофізичному з'їзді (Москва, 1985); на Всесоюзних нарадах “Молекулярные механизмы и регуляция энергетического обмена” (Пущіно, 1986, 1990); на міжнародному симпозіумі “Molecular organization of biological structures” (Москва, 1989); на міжнародній школі “Biophysics of Proton and Ion Transport” (Брашов, 1993); на I Українському біофізичному з'їзді (Київ, 1994); на міжнародній конференції “Биоэнергетика фотосинтеза” (Пущіно, 1996); на VII, VIIІ і ІХ Біохімічних з'їздах (Київ, 1997; Чернівці, 2002; Харків, 2006); на XI Міжнародному конгресі по фотосинтезу (Будапешт, 1998); на I Всеукраїнській науковій конференції “Екологічний стрес i адаптація в біологічних системах” (Тернопіль, 1998); на IV і V з'їздах Товариства фізіологів рослин Росії, (Москва, 1999; Пенза, 2003); на 33-му і 35-му з'їздах COSPAR (Варшава, 2000; Париж, 2004); на Х і ХІ з'їздах Українського ботанічного товариства (Харків, 2001; Одеса, 2006); на міжнародній конференції “Photosynthesis and crop production” (Київ, 2002); на Установчому з'їзді Українського товариства клітинної біології (Львів, 2004); на міжнародній конференції “Онтогенез рослин у природному та трансформованому середовищі. Фізіолого-біохімічні та екологічні аспекти” (Львів, 2004); на 6-й і 7-й Міжнародних конференціях “Eco-physiological aspects of plant responses to stress factors” (Краків, 2005, 2007); на міжнародній конференції “Photosynthesis in the post-genomic era. II: Structure and function of photosystems” (Пущіно, 2006); на семінарах і засіданнях Вченої Ради Інституту ботаніки ім. М.Г. Холодного.

Публікації. За матеріалами дисертації надруковано 60 наукових публікацій, у тому числі 35 статей у фахових виданнях, затверджених переліком ВАК України, та 25 тез доповідей конференцій і з'їздів.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається із вступу, восьми розділів, основних висновків, завершення та списку літератури, до якого входять 669 бiблiографiчних посилань. Дисертація має 341 сторінку, проілюстрована 34 таблицями та 52 рисунками.

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Експерименти проводили протягом 1982-2006 рр. Матеріалом для виділення хлоропластів і їх білкових компонентів було свіжозрізане листя двотижневих рослин гороху (Pisum sativum L.) сорту “Дамір-2”, насіння якого було отримане з Київського Інституту землеробства, або шпинату (Spinaciа oleracea L.) 30-40-денного віку, вирощеного в теплиці. Хлоропласти виділяли за методом М. Аврона (Avron, 1960) або за розробленою методикою (Золотарёва и др., 1997). Ступінь інтактності хлоропластів, виділених за методом Д. Волкера (Walker, 1980), оцінювали фериціанідним тестом. Тилакоїдні мембрани, позбавлені фактора спряження CF1, готували за методом (Kamienietzky, Nelson, 1975). Швидкість електронного транспорту вимірювали амперометричним методом у присутності 0,1 мМ метилвіологену (МВ) або спектрофотометрично, визначаючи світлоіндуковане відновлення фериціаніду калію за змінами оптичного поглинання суспензії хлоропластів при 420 нм. Для освітлення суспензії використовували лампу розжарювання потужністю 300 Вт, водяний фільтр і фокусуючі системи.

Швидкість фотофосфорилування визначали біолюмінесцентним методом або оцінювали потенціометрично, калібруючи світлоіндуковане залуження реакційного середовища в присутності 0,5 мМ АДФ, 5 мМ фосфату і 0,1 мМ МВ порціями (20 мкл) 10 мМ HСl.

Обробку хлоропластів ДЦКД-ом проводили згідно з роботою (Sigrist-Nelson et al., 1978). Після 20 хв. інкубації з ДЦКД-ом хлоропласти осаджували центрифугуванням і двічі промивали середовищем суспендування.

Усі операції по виділенню міченого тритієм CF1 вели згідно з роботами І. Рірьє і А. Ягендорфа (Ryrie, Jagendorf, 1971, 1972). Для повнішого відділення радіоактивної мітки гель-фільтрацію зупиняли на 10 хвилин після проходження хлоропластами половини довжини колонки.

Кількість включеного у СF1 тритію визначали на сцинтиляційному лічильнику “Beckmann LS-100”. Проби (1 мл) вміщували в сцинтиляційну рідину (8 мл), що містила тритон Х-100 і толуол в об'ємному співвідношенні 1:2, а також 0,5 % POP і 0,02 % РОРОР. Радіоактивний фон флаконів зі сцинтиляційною рідиною визначався з точністю 10 % і складав 30-40 розпадів/хв. Точність визначення радіоактивності в пробах становила 1 %. Ефективність рахування становила 29-33 %.

Проби (хлоропласти і субхлоропластні фрагменти), що містили хлорофіл, перед вимірюванням знебарвлювали хлорною водою або молекулярним хлором. Концентрацію хлорофілу визначали за методом Д. Арнона (Arnon, 1949) і З. Вернона (Vernon, Laugg, 1960); концентрацію білка - за М. Бредфорд (Bradford, 1976) і О. Лоурі (Lowry et. al., 1951).

Чистоту препарату білка (CF1) оцінювали електрофоретичним аналізом у поліакриламідному гелі (15 %) у присутності 0,1 % додецилсульфату натрію.

Фрагменти тилакоїдів, збагачені пігмент-білковими комплексами ФСII, отримували шляхом обробки хлоропластів дигітоніном з подальшим диференційним центрифугуванням (Anderson, Boardman, 1966) або короткочасною солюбілізацією тритоном X-100 за методом Бертольда зі співавт. (Berthold et. al., 1981). Хлоропласти відокремлювали від незв'язаної тритієвої води на колонках (155см) сефакрилу Г-25 (Угорщина), урівноваженого 20 мМ Трис-буфером (pH 7,8), 10 мМ NaСl, і 200 мМ сахарозою.

Процедуру виділення СЗКІІ виконували згідно з методикою Крупа зі співавт. (Krupa et al., 1987). Співвідношення хлорофілу а і b у СЗКІІ визначали за Ліхтенталером (Lichtenthaler, 1987).

При розрахунку кількості зв'язаного тритію виходили з відомих співвідношень: 1 мКі = 2,2·109 розп./хв., 1 мл Н2О (М.м. = 18 Д) відповідає 55,55 ммоль або 2·55,55 ммоль протонів. І якщо концентрація тритієвої води в реакційному середовищі складала X мКі/мл, то включення X мКі тритію в білок еквівалентне включенню 2·55,55 ммоль тритію (або 2·55,55·106 нмоль). М.м. СЗКII 28 кД, і таким чином 1 мкг СЗКІІ відповідає 0,036 нмоль, а включення n розп./хв. T2O в 1 мкг СЗК еквівалентне:

Потенціометричне титрування проводили за допомогою автоматизованої установки з програмованими титраторами і прецизійним рН-метром ОР-208 (Угорщина) у скляній термостатованій комірці об'ємом 5 мл при постійному продуванні аргоном (Опанасенко и др., 1986), розчинами 10 мМ КОН і 10 мМ НСl. Після віднімання кривої титрування фонового розчину від кривої титрування зразку результати представляли у вигляді диференціальної кривої - кривої буферної ємності в (pН). Концентрація інгібіторів карбоангідрази ацетазоламіду (АА) (N-[5-сульфамоїл-1,3,4-тіадіазол-2-іл]ацетамід) і етоксизоламіду (ЕА) (6-етокси-2-бензотіазол-сульфонамід) становила 1 мМ.

Дані, наведені в таблицях і на графіках, представлені у вигляді середнього арифметичного (M) зі стандартним відхиленням (у) чи стандартною похибкою (), визначеними з урахуванням усіх повторностей. Відмінності між результатами вважали вірогідними при рівні значущості p ? 0,05.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Дослідження перенесення протонів у хлоропластах методом протон-тритієвого обміну. До найбільш ефективних методів аналізу конформаційних флуктуацій біополімерів належить метод ізотопного обміну атомів водню, особливо зручний тим, що процес обміну сам по собі не вносить помітних змін у досліджувану структуру (Кантор, Шиммел, 1985). Загальна ідея методу полягає в тому, що більш експоновані ланки макромолекул швидше обмінюють хімічно ідентичні протони, ніж менш експоновані. Метод оборотного протон-тритієвого обміну був застосований у цій роботі для дослідження локалізації пулу протонів (тритію), що повільно обмінюються, а також світлоіндукованих конформаційних переходів у білкових комплексах тилакоїдних мембран.

Тритієву мітку вводили в тилакоїди в ході тривалої інкубації в середовищі, що містило 2 мКі T2O/мл, після чого надлишок тритієвої води і слабко зв'язану мітку відмивали. При кожному відмиванні (рис. 1) хлоропласти суспендували в 10-разовому об'ємі нерадіоактивного середовища так, щоб концентрація хлорофілу складала 1 мг/мл, центрифугували і вимірювали радіоактивність у надосадовій рідині після осадження хлоропластів. Після 5-6 відмивань концентрація вільної тритієвої води знижувалася в ~ 105 разів, і подальші відмивання вже не призводили до зниження радіоактивності середовища, а швидкість виходу мітки значно сповільнювалася. Видно, що внаслідок тривалої інкубації в мембрані формувався пул зв'язаного тритію, який дуже повільно обмінювався з водною фазою. Додавання граміцидину прискорювало вихід тритію з тилакоїдних мембран.

При освітленні швидкість протон-тритієвого обміну цього пулу з водним середовищем різко зростала (рис. 2). Але, якщо в розчині були присутні субстрати фотофосфорилування, вивільнення тритію з мембранного пулу гальмувалося. За цих умов граміцидин не викликав виходу тритію з мембран. Ефекти, що спостерігалися, можуть бути наслідком конформаційних змін у мембранних структурах за умов фотофосфорилування і викликаного ними перерозподілу тритієвої мітки. Після вимкнення світла конформації релаксують до початкового стану, унаслідок чого тритій “запирається” в нових локусах тилакоїдної мембрани, де втрачає здатність транспортуватися крізь граміцидинову пору.

Таким чином, отримані дані свідчать, що

при темновій інкубації мембран хлоропластів у середовищі, що містить тритієву воду, формується повільно обмінюваний пул тритію, властивості якого (здатність до обміну з водною фазою) контролюються функціональним станом хлоропластів, а також переносником іонів водню - граміцидином.

Дослідження енергозалежного включення тритію у фактор спряження CF1 хлоропластів. Короткочасне освітлення хлоропластів у середовищі, яке містить T2O, приводить до включення у фактор спряження CF1 близько 100 атомів тритію, які повільно обмінюються з водною фазою, що, на думку І. Рірьє і

А. Ягендорфа (Ryrie, Jagendorf, 1971, 1972) свідчить про конформаційний перехід поліпептидів комплексу. Нами показано, що включення тритію відбувається внаслідок перенесення протонів крізь протонний канал АТФсинтази у фактор CF1. Дані рис. 3 показують, що якщо середовище не містило АДФ і фосфату, граміцидин у низьких концентраціях не впливав на рівень світлоіндукованого включення тритію у СF1, у той час як нециклічне фотофосфорилування вже при концентрації граміцидину 1-2 нМ інгібувалося більше, ніж на 90 % (крива 5). Після введення в реакційне середовище субстратних концентрацій АДФ і фосфату (або арсенату) світлозалежне зв'язування тритію з CF1 значно (у 3-4 рази) знижувалося. Граміцидин (10-7 М) повністю інгібував включення радіоактивної мітки у CF1. Поява чутливості до

низьких концентрацій граміцидину свідчить, що за умов фосфорилування якісно змінюється сам процес зв'язування тритію з CF1.На це ж вказує істотне зниження кількості тритію, що міцно зв'язується з CF1, після внесення в середовище АДФ і арсенату.

Перенесення мембранозв'язаного тритію в хлоропластах за умов фотофосфорилування. З метою виявлення умов, за яких включення тритію у CF1 при освітленні корелює зі швидкістю фотофосфорилування, вивчалося зв'язування тритієвої мітки з CF1 у мічених тритієм тилакоїдах, котрі освітлювалися в нерадіоактивному середовищі в присутності і за відсутності субстратів фосфорилування (табл. 1). Оскільки радіоактивність середовища була невисока, включення мітки у CF1 могло відбуватися лише за рахунок перерозподілу мітки в межах мембранних компонентів. Як видно з даних табл. 1, питома радіоактивність фактора CF1 помітно підвищувалася тільки за умов фотофосфорилування, причому при додаванні низької концентрації граміцидину в середовище включення тритієвої мітки інгібувалося.

Таблиця 1 - Світлозалежне включення тритію у фактор спряження CF1 після темнової інкубації хлоропластів протягом 14 год. у середовищі, яке містило 3,3 мКі Т2О/мл

Умови	Включення мітки, розп./хв. • мкг білка
	Без інгібіторів	ДЦКД, 0,2 мМ	Граміцидин, 1 нМ	Граміцидин, 10 нМ
Темрява	16,0 ± 1,2	15,3 ± 1,2	-	16,0 ± 1,2
Світло	16,7 ± 1,3	16,3 ± 1,3	-	16,1 ± 1,2
Темрява + АДФ, арсенат	18,0 ± 1,4	18,1 ± 1,4	-	17,9 ± 1,4
Світло + АДФ, арсенат	24,2 ± 2,1	18,3 ± 1,4	18,7 ± 1,4	18,0 ± 1,4

Примітка: результати наведені у вигляді М у (n = 6).

Найбільш важливим фактом, виявленим у даному дослідженні, є специфічне світлозалежне перенесення мембранозв'язаного тритію в каталітичну частину АТФсинтази - фактор CF1. Цей ефект спостерігався тільки в присутності субстратів фотофосфорилування при освітленні хлоропластів, мембрани яких були мічені тритієм у темряві. Перенесення тритію у CF1 може відбуватися двома шляхами: по компонентам мембрани або безпосередньо з водної фази. За умов фотофосфорилування найбільш вірогідним видається перший шлях. На користь цього можна привести наступні аргументи:

1) мембрана тилакоїду проникна для води, тому викид тритію в позатилакоїдний простір приведе до його швидкого розведення в усьому об'ємі суспензії і, відповідно, до багаторазового зниження питомої радіоактивності. При цьому вірогідність потрапляння тритію у CF1 стає дуже низькою;

2) при освітленні мічених тритієм тилакоїдів у присутності АДФ і арсенату кількість перенесеної у CF1 мітки істотно не залежить від концентрації тритієвої води у водній фазі;

3) низькі концентрації граміцидину, які не впливають на трансмембранне перенесення протонів, гальмують включення мембранозв'язаного тритію у CF1 у хлоропластах, які здійснюють фосфорилування. Надзвичайно важливим є вирішення питання про те, чи існує зв'язок (і який саме) між двома процесами - міграцією мембранозв'язаного тритію у CF1 і перенесенням іонів водню від електронтранспортних помп до АТФсинтази (фактора CF1).

На існування зв'язку між цими процесами вказують наступні дані:

1) згідно з (Englander, Kallenbach, 1983), конформаційні флуктуації є одним з істотних чинників, які активують Н-Т обмін у гідрофобних ділянках білкових структур. У зонах білково-ліпідних мембран з низькими значеннями діелектричної сталої заряд протона повинен викликати сильну поляризацію оточення, тобто в широкому сенсі змінювати конформацію білок-ліпідних комплексів. Підвищення активності іонів Н+ у мембранах тилакоїдів при освітленні само по собі може прискорювати процес Н-Т обміну в білках;

2) ефективне перенесення мембранозв'язаного тритію у CF1 спостерігається тільки за умов синтезу АТФ, тобто коли в (або крізь) АТФсинтазу йде потік іонів водню. Інгібування цього потоку ДЦКД-ом гальмує перенесення тритію у CF1;

3) граміцидин у низьких концентраціях, які не впливають на трансмембранні потоки протонів, гальмує одночасно і перенесення мембранозв'язаного тритію у CF1, і синтез АТФ, зв'язаний з процесом міграції іонів водню до АТФсинтази.

На підставі вищесказаного дійшли висновку, що міграція тритію в ході фотофосфорилування в мічених тритієм хлоропластах повторює шляхи міграції протонів у цьому процесі. Таким чином, один із шляхів перенесення енергізованих протонів від світлозалежних протонних помп до АТФсинтази повинен бути локалізованим не у водній фазі, а в мембрані тилакоїдів.

Аналіз отриманих даних дозволяє виявити якісну відмінність процесів включення тритію у CF1 за умов фотофосфорилування і при освітленні хлоропластів у середовищі без АДФ і фосфату, що вказує на залежність напряму міграції тритію від функціонального стану хлоропластів. Раніше К. Ундервуд і Дж. Гоулд (Underwood, Gould, 1980) на підставі відмінностей у дії SH-отрут на pH-залежність виходу протонів з освітлених хлоропластів за відсутності і в присутності АДФ і фосфату постулювали існування двох функціонально різних шляхів перенесення протонів крізь комплекс CF1 - “фосфорилуючого” і “нефосфорилуючого”.

У наших дослідах показані наступні принципові відмінності в перенесенні тритію у CF1: 1) за “нефосфорилуючих” умов тритій, що зв'язався з мембранами тилакоїдів у темряві, не переноситься у фактор CF1 при освітленні, у той час як після активації фотофосфорилування реєструється значне зростання вмісту тритієвої мітки у CF1; 2) низькі концентрації граміцидину не впливають на рівень світлоіндукованого включення у CF1 і, у той же час, ці ж концентрації протонофору гальмують фотофосфорилування і перенесення мембранозв'язаного тритію у CF1. З іншого боку, у “фосфорилуючих” тилакоїдах світлоіндуковане підвищення вмісту тритію у CF1 за рахунок перенесення мембранозв'язаної мітки слабко залежить від концентрації тритієвої води в реакційному середовищі, у той час як у “нефосфорилуючих” тилакоїдах рівень включення тритію у CF1 строго залежить від концентрації Т2О у водній фазі.

Отже, представлені дані свідчать про два стани тилакоїдної мембрани - “фосфорилуючий”, що формується при освітленні мембран у присутності АДФ і фосфату (арсенату), і “нефосфорилуючий” - характерний для освітлених “нефосфорилуючих” тилакоїдів.

У “фосфорилуючому” стані утруднений обмін між мембранозв'язаним тритієм і водною фазою. Згідно з нашим припущенням, мембранозв'язаний тритій локалізується в областях тилакоїдної мембрани з утрудненою дифузією у водне середовище. І отже, активація перенесення мембранозв'язаного тритію може свідчити про формування специфічних шляхів перенесення іонів водню з внутрішньомембранних ансамблів тритій-акцепторних груп до АТФсинтази.

Енергозалежне включення тритію в білки світлозбирального комплексу хлоропластів СЗКII. Формування електрохімічного градієнта протонів ?pH індукує процеси, що ведуть до гасіння флуоресценції хлорофілу і відомі як qЕ. Показано, що саме закиснення люмена тилакоїдів при освітленні є первинним тригером формування qE (Rees et al., 1989). Згідно з моделлю П. Хортона і співавт. (Horton et al., 1991) qE виникає в результаті рН-залежних структурних змін у СЗКII. Цілий ряд експериментальних фактів підтверджує справедливість запропонованої моделі (Horton, Ruban, 1992). Зокрема, було показано, що модифікатор карбоксильних груп білків ДЦКД інгібував qE в хлоропластах шпинату без дисипації трансмембранного ?pH, ковалентно зв'язуючись із компонентами СЗКII.

У нашій роботі було проведено дослідження умов включення тритію в білки СЗКII у тилакоїдах і вивчений вплив інгібіторів і роз'єднувачів на величину світлозалежного зв'язування тритію з комплексом CЗKII. У табл. 2 наведені дані по зв'язуванню тритієвої мітки з СЗКII, ізольованим із хлоропластів, що були протягом 4 годин проінкубовані в середовищі з 3 мКі Т2О/мл. Потім хлоропласти розводили нерадіоактивним середовищем й освітлювали. Видно, що зворотний обмін значно прискорювався при освітленні препарату і частково інгібувався модифікатором карбоксильних груп ДЦКД-ом. Ці дані свідчать про світлоіндуковані структурні зміни білкового комплексу СЗКІІ як результат впливу ДЦКД.

Таблиця 2 - Зворотний світлоіндукований протон-тритієвий обмін у тилакоїдах, передурівноважених у середовищі 3 мКі Т2О/мл

Умови	T/СЗКII, розп./хв • мкг білка	Кількість тритію (моль/моль СЗКII)
D (темрява)	44,9 ± 2,5	27,0 ± 1,5
L (світло)	31,2 ± 2,1	14,6 ± 1,0
L + ДЦКД	36,4 ± 2,3	21,8 ± 1,4

Примітки: Хлоропласти інкубували протягом 4 год. у середовищі, яке містило 3 мКі Т2О в 1 мл при концентрації хлорофілу 4 мг/мл. Після інкубації хлоропласти розводили в 20 разів нерадіоактивним середовищем, що містило 0,1 мМ МВ, і освітлювали. Рівень радіоактивності визначали в ізольованому СЗКII. Результати наведені у вигляді М (n = 4).

Освітлення тилакоїдів у присутності акцептора електронів МВ приводило до включення в білки СЗКІІ 10-16 атомів тритію. Цей пул тритію залишався зв'язаним з комплексом протягом усієї процедури виділення і очищення препарату СЗКІІ, яка займала не менше 3 год. Спеціальні дослідження, результати яких наведені в табл. 3, показали, що в основному пул тритію залишається пов'язаним з білками препарату принаймні протягом 72 годин.

Таким чином, освітлення тилакоїдів протягом 4 хвилин у середовищі, що містить тритієву воду, приводить до включення в СЗКІІ 10-16 атомів тритію, які надалі не обмінюються на мобільні протони розчинника в процесі багаторазових промивань і тривалої інкубації в нерадіоактивному середовищі.

Інгібітор електронного транспорту діурон гальмував включення тритію в СЗКII. Роз'єднувачі електронного перенесення в тилакоїдах, зокрема, Сl-CCP, а

Таблиця 3 - Включення тритію в СЗКII в процесі світлової енергізації тилакоїдних мембран

Умови	T/СЗКII, розп./хв • мкг білка	Кількість тритію (моль/моль СЗКII)
D (темрява)	2,6 ± 0,4	7,2 ± 1,1
L (світло)	7,3 ± 0,8	20,5 ± 2,3
L + Cl-CCP	2,9 ± 0,7	8,1 ± 2,0
L + граміцидин А	2,8 ± 0,6	7,7 ± 1,7
L + нігерицин	2,7 ± 0,5	7,5 ± 1,5
L + діурон	2,3 ± 0,4	6,4 ± 1,1
L + антиміцин А	6,5 ± 1,3	18,3 ± 3,6
L + ДЦКД	2,2 ± 0,3	6,2 ± 1,1

Примітки: Питома радіоактивність розчину 0,5 мКі/мл. Інгібітори додавали до початку освітлення, і суспензію інкубували протягом 5 хв. Кінцева концентрація ДЦКД - 0,2 мM, нігерицину - 1 мкМ, граміцидину А - 0,5 мкМ, діурону - 10 мкМ, антиміцину - 1 мкМ. Результати наведені у вигляді М (n = 4).

також іонофорні антибіотики граміцидин А і нігерицин інгібували світлоіндуковане включення тритію в СЗКII. Оскільки в результаті внесення роз'єднувачів знижується трансмембранний ДрН, можна припустити, що гальмування протон-тритієвого обміну в СЗКII, яке спостерігається при освітленні тилакоїдів у присутності роз'єднувачів, пов'язане з підвищенням рН люмена. Це припущення узгоджується з раніше отриманими фактами, які вказують на взаємозв'язок процесу закиснення тилакоїдного люмена і структурного стану СЗКII (Horton, Ruban, 2005), а також з тим, що антиміцин А, інгібітор цитохромного комплексу, що практично не впливає на величину ДpH у тилакоїдах, також не здійснює істотного впливу і на величину тритієвого включення в СЗКII (табл. 3).

Відомо, що в складі СЗКII є декілька глутамінових і/або аспарагінових амінокислотних залишків, локалізованих поблизу люменальної (внутрішньої) поверхні тилакоїдної мембрани. Ці залишки ковалентно модифікуються при обробці тилакоїдів гідрофобним карбодіімідом ДЦКД, що корелює з інгібуванням qE. У наших дослідах (табл. 3) обробка тилакоїдів ДЦКД-ом приводила до повного інгібування світлоіндукованого включення тритію в комплекс СЗКII. Таким чином, модифікація центрів протонування СЗКII поблизу люменальної поверхні тилакоїдів за допомогою ДЦКД запобігала енергозалежним структурним перебудовам СЗКII, що фіксуються за зміною кінетики протон-тритієвого обміну.

На основі отриманих даних можна зробити висновок, що включення тритію в білки СЗКІІ пов'язане з участю комплексу в процесах захоплення і перенесення протона (тритію) від центру ФСІІ, що окиснює воду, у люмен.

Визначення умов специфічної модифікації АТФсинтази хлоропластів ДЦКД-ом. Гідрофобний конденсуючий агент ДЦКД є також сильним інгібітором мембранозв'язаних F0F1-ATФaз, який блокує протонний канал цих ферментів (McCarty, 1980; Nelson, 1980). Дія ДЦКД неспецифічна: окрім модифікації субодиниць III АТФсинтази, ушкоджуються також деякі компоненти в ланцюзі перенесення електронів (Sane et al., 1979), світлозбиральний комплекс хлоропластів (Ruban et al., 1992), а за певних умов ДЦКД зв'язується з карбоксильними групами CF1 (Shoshan, Selman, 1980). У зв'язку з цим коректна інтерпретація результатів експериментів, виконаних у присутності інгібітора, вимагає підтвердження специфічності ДЦКД-обробки. Тестом на специфічність модифікації АТФсинтази в хлоропластах може бути швидкість роз'єднаного перенесення електронів по повному ланцюгу: якщо ДЦКД блокує синтез АТФ, але не інгібує роз'єднаний транспорт електронів, можна говорити про специфічність ДЦКД-модифікації протонного каналу CF0.

Дослідження впливу ДЦКД на реакції роз'єднаного перенесення електронів від води до метилвіологену, швидкість циклічного (з феназинметосульфатом - ФМС) і нециклічного (з МВ) фотофосфорилування показало, що інгібування цих процесів сильно залежить від природи і концентрації розчинника, що використовувався для введення ДЦКД. У присутності ДМСО (0,5 % і меншій) ДЦКД гальмує синтез АТФ переважно за рахунок інгібування АТФсинтази (табл. 4), у той час як додавання невеликих кількостей спирту приводить до гальмування роз'єднаного перенесення електронів від води до МВ (рис. 4).

Таблиця 4 - Залежність [I]50 від вмісту розчинників у середовищі реакції при інгібуванні циклічного (з ФМС) і нециклічного (з МВ) фотофосфорилування

Кофактор фотофосфорилування	[I]50 при різному вмісті розчинників у середовищі реакції, мкМ
	ДМСО	Етанол
	0,1 %	0,25 %	0,5 %	0,1 %	0,25 %	0,5 %
ФМС МВ	56 ± 8 55 ± 5	42 ± 5 12 ± 5	26 ± 5 8 ± 3	58 ± 10 25 ± 5	42 ± 5 12 ± 5	26 ± 5 8 ± 3

Примітка: результати наведені у вигляді М у (n = 15).

Для уточнення меж концентраційної залежності інгібування електронного транспорту ДЦКД-ом було виконано серію експериментів по вивченню його впливу на роз'єднане перенесення електронів, обробляючи хлоропласти ДЦКД-ом без розчинника. У табл. 5 наведені результати, отримані при вивченні впливу етанолу на швидкість роз'єднаного електронного транспорту в хлоропластах, оброблених 20 або 50 мкМ ДЦКД-ом без розчинника. Самі по собі ці концентрації ДЦКД не впливали на роз'єднане перенесення електронів, проте додавання до препарату навіть таких невеликих концентрацій етанолу, як 0,02-0,05 %, приводило до істотного інгібування світлоіндукованого поглинання кисню в присутності МВ. Синергетичний ефект спирту в цьому випадку особливо виражений, що, ймовірно, пов'язано з відмінністю в розподілі інгібітора між мембранними і водорозчинними білками хлоропластів при інкубації тилакоїдів з ДЦКД у присутності спиртів або без розчинника.

Таблиця 5 - Вплив етанолу на швидкість роз'єднаного перенесення електронів від Н2О до МВ у хлоропластах, оброблених ДЦКД без розчинника

Добавки	Швидкість перенесення електронів від Н2О до МВ, % від контролю
	20 мкМ ДЦКД	50 мкМ ДЦКД
Без добавок	100	100
+ етанол 0,002 %	84	75
0,005 %	44	12
0,01 %	17	0
0,02 %	4	0

Таким чином, наші досліди дозволили визначити умови експерименту, при дотриманні яких ДЦКД можна розглядати як специфічний інгібітор АТФсинтази хлоропластів. Дані дозволяють також припускати, що ДЦКД за умов специфічної модифікації може викликати протонний сліп (внутрішньомембранне роз'єднування) в АТФсинтазі хлоропластів, оскільки інгібування синтезу АТФ не пов'язане з гальмуванням перенесення електронів.

Вплив субстратів фотофосфорилування на швидкість перенесення електронів за умов інгібування синтезу АТФ у хлоропластах. Світлоіндуковане перенесення електронів у хлоропластах є сполученим з формуванням градієнта рН на тилакоїдній мембрані. За умов насичення по інтенсивності світла, концентрації акцептора електронів тощо швидкість перенесення електронів по електронтранспортному ланцюгу визначається швидкістю виходу з енергізованих тилакоїдів протонів, що накопичилися. Раніше висловлювалося припущення, що, так само як і специфічний Н+-транспорт крізь трансмембранний білковий комплекс CF1CF0, стехіометрично зв'язаний із синтезом АТФ (“фосфорилуюче” перенесення протонів), не зв'язане з синтезом АТФ перенесення протонів (“нефосфорилуюче” перенесення протонів) теж здійснюється крізь комплекс CF1CF0. У цьому випадку за відсутності АДФ і фосфату швидкість перенесення електронів визначається величиною пасивної проникності тилакоїдної мембрани і швидкістю “нефосфорилуючого” витоку протонів крізь комплекс спряження.

Введення субстратів фосфорилування приводить до появи додаткового “фосфорилуючого” транспорту протонів і значного прискорення перенесення електронів по ланцюгу переносників. Стимуляція електронного транспорту АДФ і фосфатом може бути тісно пов'язана з активацією процесу фотофосфорилування. Проте згідно з (Underwood, Gould, 1980), синтез АТФ і “фосфорилуюче” перенесення протонів крізь АТФсинтазу не є жорстко пов'язаними процесами, і після інгібування синтезу АТФ частка “фосфорилуючого” витоку протонів крізь комплекс спряження CF1CF0 зберігається. У цій частині роботи наведені результати вивчення впливу субстратів фотофосфорилування на швидкість електронного перенесення від води до МВ у хлоропластах, синтез АТФ в яких був заінгібований або в результаті дії каналоутворюючого антибіотика граміцидину А, або за допомогою інгібітора протонного каналу CF0 АТФсинтази ДЦКД.

Відомо, що граміцидин у низьких концентраціях інгібує фотофосфорилування без впливу на величину трансмембранного протонного градієнта, швидкості “фосфорилуючого” і “нефосфорилуючого” перенесення електронів у хлоропластах (Pick et al., 1987). На рис. 5 наведена залежність уявної константи швидкості реакції Мелера в присутності і за відсутності 1 нМ граміцидину від концентрації АДФ у середовищі, що містить субстратну кількість фосфату. Видно, що константи активації (Ка) і максимальні швидкості реакції в контролі і в присутності низької концентрації граміцидину, достатньої для повного інгібування синтезу АТФ, суттєво не відрізнялися одна від одної.

Дані вимірювання фотохімічної активності ДЦКД-оброблених хлоропластів (табл. 6) свідчать про те, що фотофосфорилування загальмоване повністю, базальний транспорт електронів - частково, а роз'єднаний електронний транспорт не відрізняється від контрольного. ДЦКД блокує синтез АТФ і перенесення електронів по фотосинтетичному ланцюгу внаслідок повного інгібування перенесення протонів крізь фактор CF0. З цих позицій, проте, не можна пояснити вплив аденіннуклеотидів на швидкість перенесення електронів у ДЦКД-оброблених мембранах. З даних табл. 7 видно, що введення в середовище субстратів фотофосфорилування викликало прискорення перенесення електронів як у контрольних, так і в ДЦКД-оброблених хлоропластах.

Залежність уявної константи швидкості реакції Хілла для контрольних і ДЦКД-оброблених хлоропластів від концентрації АДФ у середовищі, що містить субстратну кількість фосфату, показало, що максимальна швидкість реакції в модифікованих хлоропластах приблизно в три рази нижча, ніж у контрольних, а константи активації (Ка) є рівними для обох реакцій і становлять близько 40 мкмоль АДФ.

Отримані результати свідчать, що, незважаючи на повне інгібування

Таблиця 6 - Фотохімічна активність контрольних і ДЦКД-оброблених хлоропластів

Показник	Контроль	ДЦКД-оброблені хлоропласти
Швидкість фосфорилування з МВ, мкмоль АТФ / мг хл · год.	210 ± 10	0
Швидкість фосфорилування з ФМС, мкмоль АТФ / мг хл · год.	480 ± 45	0
Швидкість базального електронного транспорту Н2О>МВ, мкмоль / мг хл · год.	120 ± 30	50 ± 20
Швидкість роз'єднаного електронного перенесення Н2О>МВ, мкмоль / мг хл · год. (в присутності 1 мкмоль граміцидину А)	580 ± 55	575 ± 55

Примітка: результати наведені у вигляді М у (n = 8).



Таблиця 7 - Вплив субстратів і продукту фосфорилування на швидкість електронного перенесення від води до МВ в ДЦКД-оброблених хлоропластах, мкмоль / мг хл · год.

Вміст субстратів, мМ	Контроль	ДЦКД-оброблені хлоропласти
Контроль	112 ± 12	65 ± 6
АДФ - 0,05	110 ± 15	65 ± 7
АДФ - 0,50	110 ± 15	67 ± 7
Фосфат - 5	115 ± 15	68 ± 4
АДФ - 0,05; фосфат - 5	220 ± 20	95 ± 9
АДФ - 0,50; фосфат - 5	380 ± 35	170 ± 15

Примітка: результати наведені у вигляді М у (n = 6).

синтезу АТФ у присутності граміцидину і в ДЦКД-модифікованих препаратах (табл. 5), регуляторні механізми, які відповідають за стимуляцію швидкості електронного транспорту в присутності субстратів фотофосфорилування, за цих умов не пошкоджуються.

З останнього висновку закономірно виникає питання про природу цих механізмів. Якщо виходити з того, що ДЦКД, зв'язуючись з АТФсинтазою, припиняє перенесення протонів крізь цей білковий комплекс, то необхідно припускати існування АДФ-фосфат-залежного, відмінного від АТФсинтази протонного (або іонного) витоку крізь тилакоїдну мембрану. Цей витік може бути пов'язаний із внутрішньомолекулярним роз'єднуванням (“сліпом”) на рівні АТФсинтазного комплексу за умов мінімальної модифікації ферменту ДЦКД, що супроводжується інгібуванням фотофосфорилування, причому протонне перенесення, що зберігається, сприймає регуляторний вплив субстратів і продукту фотофосфорилування, хоча власне синтез АТФ за цих умов є неможливим (табл. 6, 7).

Роль трансмембранного рН у регуляції розподілу енергії світла між фотосистемами II та I в ізольованих хлоропластах. Високополярні акцептори електронів приймають електрони як від фотосистеми I, так і від фотосистеми II залежно від стану тилакоїдної мембрани (Самуилов и др., 1997; Martinson et al., 1998). Основним центром фотовідновлення фериціаніду (FeCy) у тилакоїдній мембрані є акцепторна частина ФСI, що було неодноразово доведено в експериментах з інгібуванням пластоціаніну (Trebst, 1974). Разом з цим, у пошкоджених мембранах, а також у субхлоропластних фрагментах фериціанід відновлюється з високими швидкостями компонентами ФСII (Itoh, 1979). На рис. 6 наведені залежності швидкості відновлення FeCy хлоропластами класу В від рН. Максимальна швидкість фотовідновлення фериціаніду реєструється при рН 8,5. При зниженні рН швидкість падає, проте при рН близько 5 активність цієї фотохімічної реакції знову зростає, і на кривій реєструється пік з максимумом при рН 5,1. Аналіз залежності швидкості відновлення фериціаніду від концентрації DBMIB (2,5-дибром-3-метил-ізопропілбензохінон) і NQNO (2-н-ноніл-4-гідроксихінолін N-оксид), інгібіторів цитохромного b6f-комплексу на рівні відновлення пластохінону в центрі Qc, показав (табл. 8), що ці інгібітори значно менш ефективно гальмують фотовідновлення FeCy при рН 5,1, ніж при рН 8,5.

На основі даних табл. 8 можна припустити, що відновлення фериціаніду при рН 5,1 відбувається за участю фотосистеми II. Це узгоджується з літературними даними (Itoh, 1978) про наявність електростатичного бар'єра на поверхні мембрани в області ФСII, що перешкоджає контакту аніона Fe(CN)63- і акцепторного центру ФСII.

Таблиця 8 - Вплив інгібіторів DBMIB і NQNO на швидкість перенесення електронів від води до K3Fe(CN)6 у залежності від величини рН

Концентрація інгібітора	Швидкість фотовідновлення FeCy, мкмоль / мг хл · год.
	рН 5,1	рН 8,5
	DBMIB	NQNO	DBMIB	NQNO
Контроль	56 ± 6	56 ± 6	160 ± 20	160 ± 20
0,2 мкМ	55 ± 6	50 ± 5	110 ± 12	90 ± 8
0,5 мкМ	50 ± 5	38 ± 4	45 ± 5	60 ± 5
1 мкМ	42 ± 5	25 ± 3	20 ± 1	10 ± 1
2 мкМ	35 ± 4	20 ± 2	10 ± 1	-

Примітка: результати наведені у вигляді М у (n = 8).

При екрануванні негативного поверхневого заряду протонами доступ фериціаніду до центру його відновлення у ФСII полегшується. Показано також, що в цьому діапазоні рН зростає швидкість відновлення молекулярного кисню (Хоробрых и др., 2002).

У табл. 9 наведені дані, що показують зв'язок між величиною трансмембранного протонного градієнта в тилакоїдах і ступенем інгібування електронного перенесення від води до фериціаніду в присутності 2 мкМ DBMIB або 1 мкМ NQNO. Величину ДрН варіювали шляхом зміни інтенсивності освітлення, а також додаванням субстратів і продукту фотофосфорилування, які є фізіологічними регулювальниками величини рН (McCarty et al., 1971; Evron, Avron, 1990; Groth, Junge, 1993).

...