Фізіологічні особливості взаємодії сої та люпину з новими штамами повільнорослих бульбочкових бактерій (Bradyrhizobium), отриманими транспозоновим мутагенезом

Размещено на http://www.allbest.ru/

національна академія наук України

інститут фізіології рослин і генетики

УДК 579.262:631.461.5:579.253.4

03.00.12 - фізіологія рослин

автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Фізіологічні особливості взаємодії сої та люпину з новими штамами повільнорослих бульбочкових бактерій (Bradyrhizobium), отриманими транспозоновим мутагенезом

Василюк Вікторія Миколаївна

Київ - 2008

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у відділі симбіотичної азотфіксації інституту фізіології рослин і генетики НАН України, м. Київ

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор Коць Сергій Ярославович, інститут фізіології рослин і генетики НАН України, завідувач відділу

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор, чл.-кор. НАН України Мусатенко Людмила іванівна, Інститут ботаніки імені М.Г. Холодного НАН України, завідувач відділу

доктор біологічних наук, професор Антипчук Адель Федорівна, Відкритий міжнародний університет розвитку людини “Україна”, професор кафедри мікробіології та сучасних біотехнологій

Захист відбудеться: “22” травня 2008 р. о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.212.01 при інституті фізіології рослин і генетики НАН України за адресою: 03022, м. Київ, вул. Васильківська, 31/17.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці інституту фізіології рослин і генетики НАН України за адресою: 03022, м. Київ, вул. Васильківська, 31/17.

Автореферат розісланий “18” квітня 2008 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, доктор біологічних наук Є.Ю. Мордерер



ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Вирішення проблеми підвищення продуктивності агроекосистем у сучасних умовах розвитку сільськогосподарського виробництва тісно пов'язане зі збільшенням ефективності їх важливих складових - бобово-ризобіальних симбіозів.

Ефективність процесу фіксації молекулярного азоту визначається взаємодією обох партнерів - макро- і мікросимбіонта, вплив яких на активність симбіозу істотно залежить від добору й постійного поновлення сортів вирощуваних бобових рослин і комплементарних їм активних штамів бульбочкових бактерій (Антипчук, 1994; Патика 2003; Коць, 2001, 2007). Застосування нових біотехнологічних підходів, у тому числі методів генетичної інженерії, буде сприяти прискоренню одержання нових штамів бульбочкових бактерій з поліпшеними симбіотичними властивостями і, зокрема, з високою азотфіксувальною активністю. Одним із таких методів є транспозоновий мутагенез, що має ряд переваг у порівнянні із застосуванням традиційних підходів у селекції бульбочкових бактерій (Симаров, 1990; Тихонович, Проворов, 2005).

На сьогодні більшість робіт із транспозонового мутагенезу виконана на швидкорослих ризобіях. Не менш важливими, проте мало дослідженими є питання застосування транспозонового мутагенезу для отримання мутантів повільнорослих ризобій - мікросимбіонтів таких важливих сільськогосподарських культур як соя і люпин. При цьому, з точки зору фундаментальної науки важливо виявити такі мутації, що впливають на фізіологічні процеси при формуванні й функціонуванні симбіозу. Дослідження транспозонових мутантів повільнорослих ризобій може бути одним із напрямків одержання активних штамів бульбочкових бактерій та виготовлення на їх основі бактеріальних добрив, які забезпечували б максимальну фіксацію біологічного азоту й одержання екологічно чистої продукції.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконувалася в рамках науково-дослідних тем відділу симбіотичної азотфіксації Інституту фізіології рослин і генетики НАН України: 2001-2005 рр. „Вивчити процеси взаємодії бульбочкових бактерій із рослиною-хазяїном та розробити заходи підвищення продуктивності бобових культур за рахунок максимального використання біологічного азоту” (р/№ 0101U000627), 2002-2006 рр. „Методами генної інженерії отримати нові штами азотфіксуючих мікроорганізмів і створити високоефективні азотфіксуючі системи бобових та злакових культур” (р/№ 0102U002460), 2006-2010 рр. „Дослідити фізіологічні процеси функціонування бобово-ризобіального симбіозу і розробити методи його інтенсифікації” (р/№ 0106U006461), 2007-2011 рр. „Біотехнологічними методами створити високоефективні штами повільнорослих бульбочкових бактерій з широким інокуляційним спектром та вивчити їх взаємодію з рослинами” (р/№ 0107U004022).

Мета і задачі дослідження. Головною метою досліджень було отримати транспозонові мутанти повільнорослих бульбочкових бактерій і з'ясувати фізіологічні особливості їх взаємодії з рослинами сої та люпину при формуванні симбіозу. Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити наступні задачі:

- підібрати до відповідного донора штами-реципієнти повільнорослих бульбочкових бактерій, провести у них транспозоновий мутагенез і отримати Tn5-мутанти;

із-поміж одержаних відібрати транспозонові мутанти зі зміненими симбіотичними характеристиками;

вивчити вплив Tn5-мутантів із контрастними симбіотичними властивостями на формування й функціонування симбіозу з рослиною-хазяїном і оцінити ефективність інокуляції сої та люпину одержаними мутантами у порівнянні з вихідними та виробничими штамами бульбочкових бактерій;

у різних органах сої та люпину вивчити активність ферментів антиоксидантної системи захисту рослин - пероксидази і каталази в залежності від інокуляції різними за активністю транспозоновими мутантами;

дослідити динаміку інтенсивності газообміну СО2 у сої та зв'язок цього процесу з азотфіксувальною активністю кореневих бульбочок, сформованих штамами і транспозоновими мутантами з різними симбіотичними характеристиками;

- встановити вплив окремих транспозонових мутантів на ефективність симбіотичних систем і з'ясувати перспективність застосування Tn5-мутагенезу для селекції високоактивних штамів повільнорослих бульбочкових бактерій сої та люпину.

Об'єкт дослідження - симбіотичні системи, створені за участю рослин сої (Glycine max (L.) Merr.) сорту Мар'яна і штамів 634б, 646 та Tn5-мутантів бульбочкових бактерій Bradyrhizobium japonicum 646, а також рослин люпину (Lupinus luteus L.) сортів Промінь і Круглик і штамів 359а, 168, 10 й Tn5-мутантів бульбочкових бактерій Bradyrhizobium sp. (Lupinus) 10 і 168.

Предмет дослідження - фізіологічні процеси, що відбуваються в симбіотичних системах сої і люпину, мікросимбіонтами яких є штами й транспозонові мутанти відповідних їм повільнорослих бульбочкових бактерій. донор штам реципієнт рослина

Методи дослідження - фізіологічні (вимірювання інтенсивності фотосинтезу, дихання й транспірації), біохімічні (визначення азотфіксувальної активності симбіотичних систем, вмісту фотосинтетичних пігментів у листках, активності пероксидази і каталази в рослинах, вмісту азоту), генетичні (проведення транспозонового мутагенезу), мікробіологічні (вирощування мікроорганізмів, встановлення їх резистентності до антибіотиків), біометричні (вимірювання ростових параметрів рослин) і статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. На прикладі сої та люпину і нових транспозонових мутантів повільнорослих бульбочкових бактерій розширено уявлення про фізіологічні особливості функціонування різних за ефективністю бобово-ризобіальних систем.

Показана можливість здійснення мутагенезу повільнорослих бульбочкових бактерій сої і люпину за допомогою плазміди pSUP2021 з транспозоном Tn5. Встановлено, що не всі штами B. japonicum і Bradyrhizobium sp. (Lupinus) можуть бути реципієнтами вказаної плазміди, оскільки частота транспозиції у деяких із них досить низька.

Уперше при використанні плазміди pSUP2021::Tn5 отримано колекцію транспозонових мутантів ризобій сої і люпину, здійснено їх первинний скринінг за ознаками „азотфіксація” і „ефективність симбіозу” та встановлено гетерогенність цих мутантів за симбіотичними ознаками.

У різних за ефективністю симбіотичних системах сої, створених за участю нових транспозонових мутантів повільнорослих бульбочкових бактерій, виявлено два типи динаміки азотфіксувальної активності та інтенсивності фотосинтезу. Перший тип характеризується максимальною активністю вказаних процесів у фазу бутонізації, а другому притаманна найвища інтенсивність їх у фазу цвітіння. Належність симбіотичних систем, утворених за участю штамів і Tn5-мутантів, до першого чи другого типу динаміки асиміляційної активності не впливає на продуктивність рослин.

З'ясовано, що у рослин сої, інокульованої транспозоновими мутантами, активність ферменту пероксидази у листках, коренях та бульбочках залежить від ефективності симбіозу. Показано, що у бульбочках сої, бактеризованої Tn5-мутантами B. japonicum 646, існує позитивний зв'язок між активністю каталази й азотфіксувальною активністю кореневих бульбочок.

Практичне значення отриманих результатів. Підібрані штами B. japonicum і Bradyrhizobium sp. (Lupinus) можуть бути використані як реципієнти плазміди pSUP2021::Tn5. Одержано транспозонові мутанти, які можна застосовувати для проведення експериментів із вивчення особливостей формування й функціонування бобово-ризобіального симбіозу.

Встановлено, що інокуляція рослин сої і люпину активними Tn5-мутантами B. japonicum і Bradyrhizobium sp. (Lupinus) підвищує ефективність функціонування симбіотичних систем і призводить до збільшення їх продуктивності. Викладені в роботі результати свідчать про перспективність застосування методу транспозонового мутагенезу при селекції штамів повільнорослих бульбочкових бактерій з високою азотфіксувальною активністю, а одержані Tn5-мутанти можуть бути використані для отримання нових штамів із господарсько-цінними ознаками та виготовлення бактеріальних добрив.

Особистий внесок здобувача полягає в самостійному опрацюванні літератури, оволодінні необхідними методами досліджень, безпосередній участі у плануванні та проведенні експериментів, аналізі, статистичній обробці, інтерпретації одержаних результатів, підготовці до друку наукових праць. Матеріали дисертаційної роботи одержані автором самостійно або спільно зі співробітниками Інституту фізіології рослин і генетики НАН України. Частка особистої участі здобувача складає понад 75 %.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень були представлені на Науковій конференції молодих учених „Сучасні проблеми фізіології рослин і біотехнології” (Ужгород, 2005), 10-й Пущинській школі-конференції молодих учених, присвяченій 50-річчю Пущинського наукового центру РАН „Біологія - наука ХХІ століття” (Пущино, Росія, 2006), Міжнародній науково-практичній конференції, присвяченій 15-річчю науково-дослідної лабораторії „Екологія і освіта” „Екологія: наука, освіта, природоохоронна діяльність” (Умань, 2007), ІІІ Міжнародній конференції молодих вчених „Розмаїття живого. Екологія. Адаптація. Еволюція”, присвяченій 100-річчю з дня народження видатного українського ліхенолога М.Ф. Макаревича (Одеса, 2007), Всеукраїнській науково-практичній конференції до 80-річчя професора Л.Г. Долгової „Сучасні проблеми фізіології та інтродукції рослин” (Дніпропетровськ, 2007), Міжнародній науковій конференції, присвяченій 200-річчю заснування Кременецького ботанічного саду „Різноманіття фітобіоти: шляхи відновлення і збереження. Історія та сучасні проблеми” (Кременець - Тернопіль, 2007), VI з'їзді товариства фізіологів рослин Росії „Современная физиология растений: от молекул до экосистем” (Сиктивкар, Росія, 2007), ХХХVII Європейському з'їзді з нових методів у сільськогосподарських дослідженнях (Дубна, Росія, 2007), ІІІ Міжнародній конференції „Онтогенез рослин у природному та трансформованому середовищі. Фізіолого-біохімічні та екологічні аспекти” (Львів, 2007), Х конференції молодих вчених „Сучасний стан і пріоритети розвитку фізіології рослин, генетики і біотехнології” (Київ, 2007), 11-ій Пущинській міжнародній школі-конференції „Біологія - наука ХХІ століття” (Пущино, Росія, 2007).

Публікації. За матеріалами дисертаційної роботи опубліковано 17 наукових праць, із них 6 статей у провідних фахових виданнях і 11 тез доповідей.

Об'єм та структура роботи. Дисертація викладена на 159 сторінках друкованого тексту й містить 8 рисунків і 30 таблиць. Робота складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів досліджень, п'яти розділів, у яких наведено результати досліджень, висновків та списку використаної літератури (219 найменувань).

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

огляд літератури

У першому розділі дисертації викладено огляд вітчизняної й зарубіжної літератури стосовно фізіолого-біохімічних особливостей формування та функціонування бобово-ризобіального симбіозу. Охарактеризовано основні фактори, що визначають симбіотичні взаємовідносини між партнерами симбіозу і його ефективність. Подано загальну характеристику генетичних та біотехнологічних підходів, які використовують при селекції ризобій. Показано переваги транспозонового мутагенезу над іншими методами при роботі з бульбочковими бактеріями. Висвітлено перебіг основних фізіолого-біохімічних процесів (азотфіксація, фотосинтез), що відбуваються в азотфіксувальних симбіотичних системах. Розглянуто особливості функціонування антиоксидантної системи захисту бобових рослин, інокульованих бульбочковими бактеріями. На основі аналізу літературних даних обґрунтовано актуальність проведення досліджень за темою дисертаційної роботи.

об'єкти і методи досліджень

Дослідження проводили з рослинами сої Glycine max (L.) Merr. сорту Мар'яна спільної селекції Інституту фізіології рослин і генетики НАН України (ІФРГ НАН України), Селекційно-генетичного інституту та Інституту землеробства УААН, а також люпину жовтого Lupinus luteus L. сортів Промінь і Круглик селекції Інституту землеробства УААН. У роботі були також використані штами й Tn5-мутанти повільнорослих бульбочкових бактерій Bradyrhizobium japonicum та Bradyrhizobium sp. (Lupinus). Штами B. japonicum 646 і 634б та Bradyrhizobium sp. (Lupinus) 10, 168 і 359а отримані з музейної колекції азотфіксувальних мікроорганізмів ІФРГ НАН України. Tn5-мутанти ризобій одержані методом транспозонового мутагенезу за допомогою плазміди pSUP2021::Tn5 спільно зі співробітниками відділу симбіотичної азотфіксації ІФРГ НАН України.

Мікровегетаційні та вегетаційні досліди проводили на вегетаційному майданчику ІФРГ НАН України. В залежності від завдань досліду вирощували по 6-8 рослин на промитому річковому піску (60 % повної вологоємкості) за умов природного освітлення у 2-, 6-, 8- і 13-кілограмових посудинах Вагнера, які попередньо стерилізували 20 %-ним розчином Н2О2. Джерелом мінерального живлення була суміш Гельрігеля, що містила 0,25 норми азоту (Са(NO3)2) з додаванням мікроелементів В, Мо і Fe. Перед посівом насіння сої стерилізували 70 %-ним розчином етанолу, а насіння люпину - 16 %-ним пероксидом водню. Після цього насіння інокулювали бактеріальною суспензією в концентрації 108 кл./мл. При цьому інфекційне навантаження становило 20 тис. кл./насінину. Контролем слугували рослини, інокульовані вихідними та виробничими штамами.

Мікропольові та польові досліди. Мікропольові експерименти закладали на дослідній ділянці ІФРГ НАН України. ґрунт сірий лісовий, супіщаний. Облікова площа ділянки - 2 м2. Польові експерименти проводили в умовах Черкаської (ґрунт темно-сірий опідзолений) та Київської (ґрунт сірий лісовий, супіщаний) областей. Облікова площа дослідних ділянок - 5 м2, повторність 4-кратна, розміщення - рендомізоване. Сою висівали з розрахунку 600 тис., люпин - 750 тис. схожих насінин/га.

Транспозоновий мутагенез проводили за методикою Новикової (Новикова и др., 1986), пристосованою для повільнорослих бульбочкових бактерій, з використанням плазміди pSUP2021::Tn5 (Simon et al. 1986). Азотфіксувальну (нітрогеназну) активність бульбочок визначали ацетиленовим методом (Hardy et al., 1968; Крикунець, 1993). Інтенсивність фотосинтезу й дихання вимірювали за допомогою оптико-акустичного інфрачервоного газоаналізатора ГІАМ-5М. Розрахунки параметрів газообміну СО2 проводили за загальноприйнятою методикою (Мокроносов, Ковалев, 1989). Транспірацію визначали вимірюванням вологості повітря термоелектричним мікропсихрометром, вміст пігментів - за методикою Велбурна (Wellburn, 1994). Активність пероксидази вимірювали за методом Починка (Починок, 1976) із модифікаціями (Salzwedel, 1993). Активність каталази визначали за методикою Френсіса й Александера (Fransis, Alexander, 1972). Вміст загального азоту в насінні визначали методом К'єльдаля (Плешков, 1985). Усі результати обраховували статистично (Доспехов, 1985), у таблицях і на рисунках представлені середні арифметичні значення та їхні стандартні похибки.

Транспозоновий мутагенез штамів Bradyrhizobium - мікросимбіонтів сої та люпину

Підбір штамів-реципієнтів та отримання Tn5-мутантів повільнорослих бульбочкових бактерій. Підібрано відповідні реципієнти для мобілізуючого штаму E. сoli S17-1 - донора плазміди pSUP2021::Tn5, яку використовували при проведенні транспозонового мутагенезу. Із 16 досліджуваних штамів, що інокулюють сою, за ознаками чутливості до канаміцину (50-70 мкг/мл) та стійкості до стрептоміцину (800-1000 мкг/мл) для проведення транспозонового мутагенезу виявилися придатними лише три - B. japonicum 646, 614а і 71т (табл. 1). Із 7 люпинових штамів відібрано також три штами - Bradyrhizobium sp. (Lupinus) 10, 168 і 359а.

Клітини всіх відібраних штамів-реципієнтів бульбочкових бактерій сої і люпину виявилися компетентними, тобто здатними сприйняти транспозон донора. Проте потенційні можливості вектора pSUP2021::Tn5 по-різному реалізовувались у штамів, які використовували при кон'югації. Частота утворення канаміцинрезистентних мутантів ризобій сої була найвищою для штаму 646 і становила 10-6. З-поміж досліджуваних люпинових штамів найбільша частота транспозиції встановлена для штамів 168 і 10 - відповідно 10-7-10-8. Тому мутанти B. japonicum 646 і Bradyrhizobium sp. (Lupinus) 168 й 10 і були використані нами для подальшої роботи.

Отже, не всі штами Bradyrhizobium були придатними для транспозонового мутагенезу. Встановлено резистентність їх до антибіотиків і відібрано ті, які можна використовувати як реципієнти плазміди pSUP2021::Tn5 при проведенні транспозонового мутагенезу. У результаті отримано близько 1600 Tn5-мутантів B. japonicum і 400 мутантів Bradyrhizobium sp. (Lupinus).

Селекція одержаних Tn5-мутантів повільнорослих бульбочкових бактерій за симбіотичними характеристиками. В умовах мікровегетаційних експериментів проводили первинний скринінг транспозонових мутантів за ознакою впливу на наростання вегетативної маси рослин, ними інокульованих. Із усіх отриманих взято для випробувань близько 100 мутантів бульбочкових бактерій сої і 30 мутантів ризобій люпину, вивчення яких продовжили у вегетаційних та мікропольових експериментах. Показано, що більшість досліджуваних мутантів бульбочкових бактерій не відрізнялися за симбіотичними характеристиками від вихідних штамів. Із-поміж них за різними симбіотичними показниками відібрано 7 Tn5-мутантів ризобій сої і 2 мутанти бульбочкових бактерій люпину. У подальшому вони були використані для створення симбіотичних систем із різним рівнем ефективності.

Таким чином, методом транспозонового мутагенезу з використанням плазміди pSUP2021::Tn5 отримано колекцію мутантів повільнорослих бульбочкових бактерій сої та люпину. У результаті скринінгу відібрано Tn5-мутанти, які відрізняються за симбіотичними характеристиками від вихідних і виробничих штамів. Зазначені транспозонові мутанти ризобій сої і люпину можуть бути використані для вивчення механізмів формування і функціонування симбіотичних систем, створених за участю бульбочкових бактерій та бобових рослин, а високоактивні - для виготовлення бактеріальних добрив.

Ефективність симбіозу сої та люпину з

Tn5-мутантами Bradyrhizobium

Особливості формування і функціонування симбіотичного апарату сої в залежності від інокуляції Tn5-мутантами штаму 646 B. japonicum. Виділено два Tn5-мутанти бульбочкових бактерій сої (107 і 113), які у фазу цвітіння забезпечували формування на коренях рослин найбільшої кількості бульбочок (табл. 2). Бульбочки, утворені цими мутантами, характеризувалися меншою загальною масою у порівнянні з бульбочками, сформованими контрольними штамами та іншими транспозоновими мутантами. Інокуляція мутантом 21-2 сприяла підвищенню нодуляції на початку вегетації рослин, і до кінця спостереження кількість бульбочок була на рівні вихідного штаму.

Інокуляція високовірулентними мутантами 107 і 113, а також середньовірулентним мутантом 118-8 призводила до значного зниження азотфіксувальної активності у порівнянні з контрольними варіантами протягом усього періоду дослідження. У той же час, мутанти 21-2, 17-2 і 9-1 формували з рослинами активний симбіотичний апарат.

Встановлено позитивний вплив інокуляції насіння сої активними Tn5-мутантами 21-2, 9-1 і 17-2 на наростання маси рослин (табл. 2). Використання мутантів 107, 113 і 118-8 призводило до зниження цих показників.

Отже, в ході досліджень отримано і відібрано Tn5-мутанти штаму 646, що характеризувалися різними симбіотичними властивостями: мутанти 21-2, 17-2, 9-1, які з рослинами сої формували ефективно діючі симбіотичні системи, і мутанти 107, 113 і 118-8, що характеризувалися низькою азотфіксувальною активністю і спричиняли зниження біологічної продуктивності рослин у порівнянні з контролями.

Особливості взаємодії люпину з Tn5-мутантами штамів Bradyrhizobium sp. (Lupinus) 10 і 168. Встановлено, що уже у фазу бутонізації тенденція до підвищення бульбочкоутворення спостерігалася у рослин люпину, насіння яких бактеризували Tn5-мутантом 10-1. У період цвітіння кількість бульбочок, сформованих цим транспозоновим мутантом, у 5,2 раза перевищувала вихідний штам 10 (табл. 3).

Встановлено, що обидва досліджувані Tn5-мутанти Bradyrhizobium sp. (Lupinus) формували із рослинами люпину симбіоз, який характеризувався низькою азотфіксувальною активністю, що істотно впливало на приріст вегетативної маси рослин (табл. 3). У фазу цвітіння маса надземної частини рослин, інокульованих мутантами і малоактивним штамом 168, була нижчою у порівнянні з варіантами із вихідним 10 в виробничим 359а штамами. Отже, обидва досліджувані транспозонові мутанти бульбочкових бактерій люпину утворювали з рослинами малоефективний симбіоз.

Таким чином, за допомогою методу транспозонового мутагенезу ми отримали Tn5-мутанти ризобій сої і люпину, які формували симбіотичні системи різної ефективності й можуть слугувати моделлю при вирішенні низки наукових завдань із оптимізації умов утворення та функціонування ефективного бобово-ризобіального симбіозу.

Активність окисно-відновних ферментів у рослин, інокульованих різними за симбіотичними властивостями Tn5-мутантами Bradyrhizobium

Реакцією рослини на інфікування є утворення активних форм кисню (АФК). У бобово-ризобіальному симбіозі їхня роль залишається недостатньо вивченою. Припускають, що АФК беруть участь у регуляції інфекційного і нодуляційного процесів при визначенні сумісності макро- і мікросимбіонта (Santos et al., 2000; Ramu et al., 2002; Васильева и др., 2005). АФК нейтралізуються за участю антиоксидантної системи захисту клітини, до якої належать ферменти пероксидаза і каталаза.

Пероксидаза - поліфункціональний фермент, що бере участь у захисних реакціях рослинних клітин. Показано, що у фазу бутонізації у листках, коренях і бульбочках сої, інокульованої Tn5-мутантами 21-2, 9-1 і 17-2, активність пероксидази була вищою або знаходилася на рівні рослин, бактеризованих контрольним штамом 646 (рис. 1). Серед варіантів із використанням в якості інокулянтів транспозонових мутантів найбільшу активність пероксидази відмічали у рослин, бактеризованих ефективними мутантами 21-2 і 9-1 у порівнянні з варіантами із інокуляцією малоактивними 107 і 113. Отже, пероксидазна активність у різних органах сої, інокульованої транспозоновими мутантами, залежала від активності мікросимбіонта.

Основним ферментом утилізації пероксиду водню є каталаза. Відомо, що активність цього ферменту пов'язана з регуляторними і захисними механізмами рослини-хазяїна (Акимова и др., 2005). У листках і коренях сої ми не спостерігали чіткої залежності між активністю каталази та азотфіксувальною активністю у рослин, інокульованих транспозоновими мутантами різної активності. Із літератури відомо (Жизневская и др., 2001), що каталаза у бульбочках рослин, що транспортують уреїди (до них, зокрема, належить і соя), розкладає пероксид водню, що утворюється із сечової кислоти. Остання бере участь у синтезі алантоїну - транспортної форми симбіотично фіксованого азоту у рослинах з уреїдним типом обміну. Показано, що активність каталази у бульбочках рослин, інокульованих активними транспозоновими мутантами 21-2, 9-1 і 17-2 та вихідним штамом 646, вища у порівнянні з активністю у сої, бактеризованої малоактивними Tn5-мутантами 107 і 113 (табл. 4).

Таким чином, встановлено зв'язок між активністю каталази у кореневих бульбочках та азотфіксувальною активністю мікросимбіонта. Висока активність каталази у бульбочках є необхідною умовою активного функціонування симбіотичних систем у сої як представника рослин з уреїдним типом обміну речовин.

У симбіотичних системах, сформованих за участю рослин люпину і штамів та транспозонових мутантів Bradyrhizobium sp. (Lupinus), нами не виявлено чіткої залежності між активністю мікросимбіонта і пероксидазною та каталазною активністю.

Газообмін СО2 у різних за ефективністю симбіотичних системах соя - Tn5-мутанти B. japonicum

Відомо, що між споживанням фотоасимілятів і експортом із бульбочок азоту встановлюється баланс, який певною мірою визначає ефективність симбіозу та його фізіологічну доцільність для рослини (Hunt, Layzell, 1993). Незважаючи на важливість цих досліджень, наразі існує небагато даних про те, як реалізуються потреби бульбочок і всієї рослини в азоті та вуглеці з урахуванням закономірностей їх формування, росту й функціонування в різні фази онтогенезу.

Нами показано динаміку інтенсивності фотосинтезу листків у сої на різних етапах її розвитку (табл. 5). У рослин, інокульованих високовірулентними малоактивними транспозоновими мутантами 107 і 113, відмічали зниження цих показників у всі фази спостереження, тоді як у рослин, бактеризованих високоактивними Tn5-мутантами 21-2, 17-2 і 9-1, інтенсивність фотосинтезу листків перевищувала або була на рівні вихідного штаму.

Відомо, що існує залежність між асиміляційною активністю і вмістом фотосинтетичних пігментів у рослинах. Тому одним із опосередкованих показників ефективності симбіозу може бути кількість хлорофілів, що накопичується рослиною (Антипчук, 1990). У сої, бактеризованої Tn5-мутантами 35-2, 107 і 113, спостерігали значне зниження вмісту хлорофілів у порівнянні з контрольними варіантами (інокуляція вихідним 646 і виробничим 634б штамами) (рис. 2). Збільшення вмісту хлорофілів у порівнянні з вихідним штамом спостерігали у рослин, інокульованих активними Tn5-мутантами 21-2, 17-2 і 9-1.

У результаті проведених досліджень нами виявлено два типи динаміки азотфіксувальної активності та інтенсивності фотосинтезу (рис. 3). Перший з них відзначався максимумами активності цих процесів у фазу бутонізації (варіанти з інокуляцією Tn5-мутантами 21-2, 35-2 і 113 та вихідним штамом B. japonicum 646). Для другого типу були характерні зростання азотфіксувальної активності та інтенсивності фотосинтезу упродовж фаз 3-х справжніх листків - цвітіння з найвищою інтенсивністю згаданих фізіологічних процесів у період цвітіння сої (симбіотичні системи, утворені мутантами 17-2, 107 і штамом B. japonicum 634б). Встановлено, що частина досліджуваних Tn5-мутантів за своїм впливом на рослини схожі з вихідним штамом 646, тоді як решта транспозонових мутантів - із виробничим штамом B. japonicum 634б.

Тісний зв'язок азотфіксації і фотосинтезу показаний у роботах багатьох дослідників (Коць, 1994; de Lima et al., 1994). Проте, питання про можливість використання показника інтенсивності фотосинтезу при селекції ризобій на підвищення симбіотичної активності та ефективності залишається відкритим. Рослини, інокульовані Tn5-мутантами 21-2 і 17-2, формували урожай насіння, вищий, ніж у контролі, але належали до різних типів виявленої нами динаміки асиміляційної активності. Очевидно, підвищення продуктивності симбіотичних систем сої можна досягнути шляхом добору різних генотипів мікро- і макросимбіонтів для поєднання особливостей обох типів динаміки з підтриманням високої азотфіксувальної активності й фотосинтезу протягом періоду бутонізації - цвітіння.

Вплив Інокуляції Tn5-мутантами Bradyrhizobium на продуктивність сої та люпину

Показано, що бактеризація трьома досліджуваними Tn5-мутантами бульбочкових бактерій сої (21-2, 17-2, 9-2) збільшувала зернову продуктивність на 14,7-23,3 % у порівнянні з інокуляцією виробничим штамом 634б (табл. 6). Отже, всі вони виявилися вірулентними та активними мікросимбіонтами сої. Отримані дані свідчать, що за комплексом симбіотичних ознак кращими серед перспективних транспозонових мутантів є 21-2 і 17-2.

У дослідах із рослинами люпину показано, що приріст урожаю за умов інокуляції Tn5-мутантом 168-23 становив 10,1 % у порівнянні з варіантом, де інокулянтом був виробничий штам 359а (табл. 7). Бактеризація іншими двома випробуваними мутантами (168-19 і 168-21) призвела до зниження врожаю зерна на 9,7-16,4 %. Таким чином, лише один із трьох відібраних Tn5-мутантів бульбочкових бактерій люпину підвищував урожай рослин в умовах польових експериментів.

Отже, застосування передпосівної інокуляції насіння сої та люпину новими транспозоновими мутантами бульбочкових бактерій позитивно впливало на формування та функціонування досліджуваних бобово-ризобіальних систем. У польових експериментах встановлено, що використання для інокуляції відібраних Tn5-мутантів B. japonicum і Bradyrhizobium sp. (Lupinus) підвищує урожай насіння відповідно сої і люпину. Це свідчить про перспективність застосування методу транспозонового мутагенезу при селекції ефективних штамів повільнорослих бульбочкових бактерій, а відібрані нами мутанти можуть бути використані при виготовленні бактеріальних препаратів.



ВИСНОВКИ

1. Уперше при використанні плазміди pSUP2021::Tn5 отримано колекцію транспозонових мутантів повільнорослих бульбочкових бактерій сої і люпину, здійснено їх первинний скринінг за ознаками „азотфіксація” й „ефективність симбіозу” та встановлено гетерогенність за симбіотичними властивостями.

2. Соя і люпин, інокульовані новими Tn5-мутантами, утворюють симбіотичні системи, в яких інтенсифікація чи гальмування окремих фізіолого-біохімічних процесів пов'язані з формуванням симбіозу різної ефективності.

3. Активність пероксидази в листках, коренях і бульбочках сої, інокульованої транспозоновими мутантами Bradyrhizobium japonicum 646, пов'язана з ефективністю симбіозу. За інокуляції активними Tn5-мутантами активність цього ферменту зростає.

4. Показано позитивний зв'язок між активністю каталази в бульбочках сої, інокульованої різними за активністю Tn5-мутантами, і інтенсивністю азотфіксації, тоді як активність даного ферменту в листках і коренях не залежала від симбіотичних властивостей мікросимбіонта.

5. У симбіотичних системах, сформованих за участю рослин люпину і штамів та транспозонових мутантів Bradyrhizobium sp. (Lupinus), нами не виявлено чіткої залежності між активністю мікросимбіонта і пероксидазною та каталазною активністю у різних органах.

6. У неефективних симбіотичних системах Glycine max (L.) Merr. - Tn5-мутанти B. japonicum 646 низький рівень асиміляції N2 супроводжується зменшенням вмісту хлорофілів у листках, інгібуванням активності процесів газообміну СО2 і зниженням насіннєвої продуктивності рослин.

7. У різних за ефективністю симбіотичних системах сої виявлено два типи динаміки азотфіксувальної активності та інтенсивності фотосинтезу, перший з яких характеризується максимальною активністю цих процесів у фазу бутонізації, а другий - у фазу цвітіння. Насіннєва продуктивність рослин не залежала від типу динаміки асиміляційної активності симбіотичних систем, утворених штамами і Tn5-мутантами ризобій сої, які використовували для інокуляції.

8. Показано, що використання для інокуляції бобових рослин високоактивних Tn5-мутантів B. japonicum і Bradyrhizobium sp. (Lupinus) підвищує урожай насіння сої і люпину відповідно на 15-23 % і 10 %, а також сприяє збільшенню вмісту протеїну в насінні на 1-1,5 абс. %.

9. Транспозонові мутанти повільнорослих бульбочкових бактерій сої (21-2, 17-2, 9-2) та люпину (168-23) з покращеними симбіотичними властивостями можуть бути використані для отримання нових штамів із господарсько-цінними ознаками та виготовлення на їх основі бактеріальних добрив.



СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Маліченко С.М., Даценко В.К., Василюк В.М. Ефективність симбіотичних систем, утворених за участю сої і транспозантів бульбочкових бактерій Bradyrhizobium japonicum 646 // Наук. вісн. Ужгород. ун-ту: Серія Біологія. - 2006. - Вип. 18. - С. 144-148.

2. Василюк В.М., Мельникова Н.М., Михалків Л.М., Омельчук С.В., Коць С.Я. Формування симбіотичних взаємовідносин рослин люпину з транспозоновими мутантами Bradyrhizobium sp. (Lupinus) // Физиология и биохимия культ. растений. - 2007. - 39, № 3. - С. 233-241.

3. Василюк В.М., Кругова О.Д., Мандровська Н.М., Коць С.Я. Активність пероксидази і каталази у сої, інокульованої Tn5-мутантами Bradyrhizobium japonicum // Физиология и биохимия культ. растений. - 2007. - 39. - № 4. - С. 334-342.

4. Маліченко С.М., Даценко В.К., Василюк В.М., Коць С.Я. Транспозоновий мутагенез штамів Bradyrhizobium japonicum // Физиология и биохимия культ. растений. - 2007. - 39, № 5. - С. 409-418.

5. Василюк В.М., Маменко П.М., Береговенко С.К. Дослідження симбіотичних властивостей Tn5-мутантів бульбочкових бактерій сої // Сільськогосподарська мікробіологія: міжвідомчий тематичний науковий збірник // 2007. - № 6. - С. 39-50.

6. Василюк В.М., Кірізій Д.А., Коць С.Я. Динаміка фотосинтетичної й азотфіксувальної активностей та продуктивність сої, інокульованої Tn5-мутантами Bradyrhizobium japonicum // Доповіді НАН України. - 2008. - № 1. - С. 147-152.

7. Мельникова Н.М., Михалків Л.М., Василюк В.М., Омельчук С.В., Маменко П.М. Формування симбіотичних систем люпину при інокуляції транспозантами Bradyrhizobium sp. (Lupinus) // Сучасні проблеми фізіології рослин і біотехнології: Тези доп. конференції молодих учених (Ужгород, 1-3 грудня 2005 р.). - Ужгород, 2005. - С. 85.

8. Василюк В.Н., Маличенко С.М., Даценко В.К., Коць С.Я. Эффективность симбиотических систем сои при инокуляции Tn5-мутантами Bradyrhizobium japonicum 646 // Биология - наука ХХІ века: 10-я Пущинская школа-конференция молодых ученых (Пущино, 17-21 апреля 2006 г.). - Пущино, 2006. - С. 185.

9. Коць С.Я., Даценко В.К., Маліченко С.М., Василюк В.М. Tn5-мутанти Bradyrhizobium japonicum 646 - можливі біологічні компоненти бактеріальних добрив під сою // Екологія: наука, освіта, природоохоронна діяльність: Матеріали Міжнародної науково-практичної конференції, присвяченої 15-річчю науково-дослідної лабораторії „Екологія і освіта”. - К.: Наук. світ, 2007. - С. 35-36.

10. Vasyliuk V., Melnykova N., Mykhalkiv L. Formation of symbiotic interactions between lupine plants and Tn5-mutants of Bradyrhizobium sp. (Lupinus) in soil experiments // Матеріали ІІІ Міжнародної конференції молодих вчених „Розмаїття живого. Екологія. Адаптація. Еволюція.”, присвяченій 100-річчю з дня народження видатного українського ліхенолога М.Ф. Макаревича (Одеса, 15-18 травня 2007 р.). - Одеса: Печатний дом, 2007. - С. 76.

11. Василюк В.М. Особливості взаємодії Glycine max (L.) Merr. із Tn5-мутантами Bradyrhizobium japonicum 646 // Сучасні проблеми фізіології та інтродукції рослин: Матеріали ІІ Всеукраїнської науково-практичної конференції до 80-річчя професора Л.Г. Долгової (Дніпропетровськ, 22-23 травня 2007 р.). - Дніпропетровськ: ДНУ, 2007. - С. 18-19.

12. Василюк В.М., Маліченко С.М., Даценко В.К. Вплив інокуляції Tn5-мутантами Bradyrhizobium japonicum 646 на нодуляційну активність симбіотичних систем сої // Різноманіття фітобіоти: шляхи відновлення і збереження. Історія та сучасні проблеми: Матеріали Міжнародної наукової конференції, присвяченої 200-річчю заснування Кременецького ботанічного саду (Кременець, 18-23 червня 2007 р.). - Кременець-Тернопіль: Підручники і посібники, 2007. - С. 118-119.

13. Vasyliuk V.M., Malichenko S.M., Datsenko V.K., Kots S.Ya. Symbiotic properties of Tn5-mutants of Bradyrhizobium japonicum 646 // Современная физиология растений: от молекул до экосистем: Материалы VI съезда общества физиологов растений России (Сыктывкар, 18-24 июня 2007 г.). - Сыктывкар, 2007. - С. 47.

14. Vasyliuk V., Kirisij D., Kots S. Photosynthetic activity of the Glycine max (L.) Merr. inoculated with Tn5-mutants of Bradyrhizobium japonicum // XXXVII Esna annual meeting Jinr - Dubna, Russia (September 10-14, 2007) 2007. - Book of abstracts. - Dubna, 2007. - P. 58.

15. Василюк В.М., Коць С.Я. Вплив Tn5-мутантів Bradyrhizobium japonicum на азотфіксувальну активність, вміст пігментів та продуктивність Glycine max (L.) Merr. // Онтогенез рослин у природному та трансформованому середовищі. Фізіолого-біохімічні та екологічні аспекти: Тези доп. ІІІ Міжнародної конференції (Львів, 4-6 жовтня). - Львів, 2007. - С. 59.

16. Василюк В.М., Якимчук Р.А., Коць С.Я. Ефективність симбіозу сої і люпину з Tn5-мутантами Bradyrhizobium в умовах Черкаської області // Сучасний стан і пріоритети розвитку фізіології рослин, генетики і біотехнології: Тези доп. Х конференції молодих вчених (Київ, 25-26 жовтня 2007 р.). - К., 2007. - С. 87.

17. Василюк В.Н., Киризий Д.А., Маличенко С.М. Влияние Tn5-мутантов Bradyrhizobium japonicum на азотфиксирующую активность и интенсивность фотосинтеза сои // Биология - наука ХХІ века: 11-я Пущинская международная школа-конференция молодых ученых (Пущино, 29 октября - 2 ноября 2007 г.). - Пущино, 2007. - С. 185.



АНОТАЦІЯ

Василюк В.М. Фізіологічні особливості взаємодії сої та люпину з новими штамами бульбочкових бактерій (Bradyrhizobium), отриманими транспозоновим мутагенезом. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.12 - фізіологія рослин. Інститут фізіології рослин і генетики НАН України, Київ, 2008.

Дисертація присвячена вивченню фізіологічних особливостей формування і функціонування симбіотичних систем, утворених за участю нових Tn5-мутантів повільнорослих бульбочкових бактерій і рослин сої та люпину. Показана можливість застосування транспозонового мутагенезу для селекції високоактивних штамів ризобій.

Уперше при використанні плазміди pSUP2021::Tn5 отримано колекцію Tn5-мутантів повільнорослих бульбочкових бактерій сої і люпину, здійснено первинний скринінг за ознаками „азотфіксація” і „ефективність симбіозу” та встановлено гетерогенність цих мутантів за симбіотичними властивостями. У бобово-ризобіальних системах сої, утворених за участю транспозонових мутантів Bradyrhizobium japonicum, активність пероксидази у листках, коренях та бульбочках залежала від ефективності симбіозу. У бульбочках сої, інокульованої Tn5-мутантами, показано позитивний зв'язок між активністю каталази та інтенсивністю азотфіксації. У симбіотичних системах, сформованих за участю люпину і штамів та транспозонових мутантів Bradyrhizobium sp. (Lupinus) не виявлено чіткої залежності між активністю мікросимбіонта і пероксидазною та каталазною активністю у різних органах. У різних за ефективністю симбіотичних системах сої, інокульованої штамами і Tn5-мутантами ризобій виявлено два типи динаміки азотфіксувальної активності та інтенсивності фотосинтезу листків. Перший тип характеризувався максимальною активністю вказаних процесів у фазу бутонізації, а другий - у період цвітіння рослин. Показано перспективність застосування методу транспозонового мутагенезу при селекції активних штамів повільнорослих бульбочкових бактерій для підвищення ефективності симбіозу.

Ключові слова: Glycine max, Lupinus luteus, Bradyrhizobium japonicum, Bradyrhizobium sp. (Lupinus), транспозоновий мутагенез, Tn5-мутанти, симбіотичні властивості, інтенсивність фотосинтезу, пероксидаза, каталаза, продуктивність.



АННОТАЦИЯ

Василюк В.Н. Физиологические особенности взаимодействия сои и люпина с новыми штаммами клубеньковых бактерий (Bradyrhizobium), полученными транспозоновым мутагенезом. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.12 - физиология растений. - Институт физиологии растений и генетики НАН Украины, Киев, 2008.

Диссертация посвящена изучению физиологических особенностей формирования и функционирования симбиоза новых Tn5-мутантов медленнорастущих клубеньковых бактерий с растениями сои и люпина. Показана возможность использования транспозонового мутагенеза для селекции высокоактивных штаммов ризобий.

Впервые при использовании плазмиды pSUP2021::Tn5 получена коллекция Tn5-мутантов медленнорастущих клубеньковых бактерий сои и люпина, осуществлен первичный скрининг по признакам „азотфиксация” и „эффективность симбиоза” и установлена их гетерогенность по симбиотическим свойствам.

Показано, что в бобово-ризобиальных системах сои, созданных с помощью транспозоновых мутантов Bradyrhizobium japonicum, активность фермента пероксидазы в листьях, корнях и клубеньках зависит от эффективности симбиоза. В клубеньках сои, инокулированной Tn5-мутантами, показана позитивная связь между активностью каталазы и интенсивностью азотфиксации, тогда как активность данного фермента в листьях и корнях не зависела от симбиотических свойств микросимбионта.

В симбиотических системах, сформированных при участии люпина, а также штаммов и транспозоновых мутантов Bradyrhizobium sp. (Lupinus), не выявлено четкой зависимости между активностью микросимбионта и пероксидазной и каталазной активностью в разных органах.

В различных по эффективности симбиотических системах сои выявлены два типа динамики азотфиксирующей активности и интенсивности фотосинтеза, первый из которых характеризируется максимальной активностью этих процессов в фазу бутонизации, а второму свойственна наивысшая интенсивность указанных процессов в период цветения. Продуктивность растений не зависела от типа динамики ассимиляционной активности в симбиотических системах, образованных штаммами и Tn5-мутантами, использованными для инокуляции.

В неэффективных симбиотических системах Glycine max (L.) Merr. - Tn5-мутанты B. japonicum низкий уровень ассимиляции N2 сопровождается уменьшением содержания хлорофиллов в листьях, ингибированием активности процессов газообмена СО2 и снижением семенной продуктивности.

Установлено, что использование в качестве инокулянтов высокоэффективных Tn5-мутантов B. japonicum и Bradyrhizobium sp. (Lupinus) повышает урожай семян сои и люпина соответственно на 15-23 % и 10 %.

Результаты работы существенно углубляют представление о физиологических особенностях функционирования различных по эффективности бобово-ризобиальных симбиотических систем на примере сои и люпина и новых мутантов медленнорастущих клубеньковых бактерий. Полученные данные свидетельствуют о перспективности использования метода транспозонового мутагенеза при селекции эффективных штаммов ризобий, а исследованные транспозоновые мутанты могут быть использованы для получения новых штаммов с хозяйственно-ценными признаками и изготовления бактериальных удобрений.

Ключевые слова: Glycine max, Lupinus luteus, Bradyrhizobium japonicum, Bradyrhizobium sp. (Lupinus), транспозоновый мутагенез, Tn5-мутанты, симбиотические свойства, интенсивность фотосинтеза, пероксидаза, каталаза, продуктивность.



ABSTRACT

Vasyliuk V.M. Physiological peculiarities of investigations soybean and lupine with new nodule bacteria (Bradyrhizobium) strains, obtained by transposone mutagenesis. - Manuscript.

Dissertation for the candidate of biological sciences (Ph. D.) degree in speciality 03.00.12 - plant physiology. - Institute of Plant Physiology and Genetics, National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2008.

Dissertation covers investigation of physiological peculiarities of formation and functioning of symbiosis between new Tn5-mutants of slow-growing nodule bacteria and soybean and lupine plants. In addition, the possibility transposone mutagenesis application for the selection of highly active strains of rhizobia was demonstrated.

At the first time there was obtained collection of Tn5-mutants of slow-growing nodule bacteria for soybean and lupine plants, using plasmids pSUP2021. Initial screening by the traits “nitrogen fixation” and “symbiosis efficiency” was performed and heterogeneity of the mutants involved by the symbiotic characters was found. Peroxidase activity of leaves, roots and nodules within leguminous-rhizobial systems of soybean plants formed through transposone mutant implication had depended on symbiosis activity. Under inoculation by the effective Tn5-mutants the peroxidase activity had increased in all plant organs. It was established that positive correlation between catalase activity and nitrogen fixation intensivity in soybean nodules, formed by transposone mutants. This activity in leaves and roots was independent on symbiotic properties. Two types of dynamics for nitrogen fixing activity and leaf photosynthesis intensity was revealed in symbiotic systems soybean - Tn5-mutant rhizobia with different efficiency. First type was distinguished by the maximal activities of the named processes of budding phase and their decline during plant flowering, while on other had showed top intensity of these processes within flowering phase. Perspectivity of the transposone mutagenesis technique in selection of the effective slow-growing nodule bacteria strains used for increasing of symbiosis efficiency was shown.

Key words: Glycine max, Lupinus luteus, Bradyrhizobium japonicum, Bradyrhizobium sp. (Lupinus), transposone mutagenesis, Tn5-mutants, symbiotic properties, photosynthetic rate, peroxidasе, catalase, productivity.

Размещено на Allbest.ru

...