Створення нових ліній арабідопсису, що марковані мутантними генами

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ РОСЛИН І ГЕНЕТИКИ

УДК 575.222.7/224:582.683.2

03.00.15 ? генетика

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

СТВОРЕННЯ НОВИХ ЛІНІЙ АРАБІДОПСИСУ (ARABIDOPSIS THALIANA (L.) HEYNH.), ЩО МАРКОВАНІ МУТАНТНИМИ ГЕНАМИ

Сігідіненко Людмила Іванівна

Київ ? 2008



Дисертацією є рукопис

Робота виконана на кафедрі біології рослин Луганського національного аграрного університету, м. Луганськ

Науковий керівник: доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Чеченєва Тетяна Миколаївна Інститут фізіології рослин і генетики НАН України, старший науковий співробітник

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор Чугункова Тетяна Володимирівна Інститут фізіології рослин і генетики НАН України, завідувач відділу

кандидат біологічних наук Овчаренко Ольга Олександрівна Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України, науковий співробітник

Захист відбудеться „ 19 ” червня 2008 р. о 12 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.212.01 Інституту фізіології рослин і генетики НАН України за адресою: 03022, м. Київ, вул. Васильківська, 31/17.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту фізіології рослин і генетики НАН України за адресою: 03022, м. Київ, вул. Васильківська, 31/17.

Автореферат розісланий „16 ” травня 2008 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради доктор біологічних наук Мордерер Є.Ю.



ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Арабідопсис Таля (Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.) на часі є найбільш відомим модельним об'єктом генетики рослин, молекулярно-біологічних, біохімічних та інших досліджень. Геном арабідопсису Таля (2n=10) було повністю секвеновано у 2000 році. Проте на сьогодні картовано лише близько 500 структурних генів. Групи зчеплення та сайти переважної більшості генів арабідопсису на генетичній карті не визначені, що створює істотні труднощі в експериментальній роботі [Ежова, 2003]. Ряд генів арабідопсису вже використано в галузі молекулярної генетики і генетичної інженерії як донорні гени при створенні цінного вихідного матеріалу для селекції у род. Brassicaceaе [Shimizu, Purugganan, 2005].

Арабідопсис - самозапильна рослина, має короткий період вегетації, високий коефіцієнт розмноження незалежно від сезону та невибаглива до умов вирощування. Молоді пагони арабідопсису використовують у їжу в якості салату та як лікарську рослину.

Для багатьох генетичних досліджень потрібні чисті лінії, що марковані двома і більшою кількістю зчеплених і незчеплених мутантних генів. Конкретно такі лінії необхідні при локалізації по хромосомах та встановленні сайтів мутантних генів, досліджень в галузі функціональної геноміки та генетичної інженерії. Ефективне використання мутантних ліній для картування можливо, якщо вони задовольняють таким вимогам: об'єднані в одному генотипі мутації мають бути отримані на генетичній основі (backgrоund) однієї чистої вихідної лінії, підтримуватись у відомих центрах по збереженню генетичних колекцій та бути загально доступними. Найбільш відомими є Ноттінгемський центр по збереженню генетичної колекції арабідопсису у Великій Британії (Nottingam Arabidopsis Stock Centre, NASC) і Центр біоресурсів при університеті штату Огайо (Arabidopsis Biological Resource Center, ABRC).

Актуальною науковою проблемою є створення полімутантних гомозиготних за рецесивними алелями ліній для розширення можливостей генетичного аналізу та функціональної геноміки арабідопсису. Цінність та значення таких ліній суттєво зростає зі збільшенням кількості гомозиготних рецесивних генів у генотипі. Найзручнішими для експериментів є гомозиготні за рецесивними генами лінії, марковані за всіма п'ятьма групами зчеплення, так звані пентарецесиви. Наявні поодинокі пентарецесиви дуже складно культивувати в стандартних умовах, оскільки до їх складу входять напівлеталі або такі, що потребують особливих умов вирощування. Тому актуальним залишається створення полімутантних ліній з відомою локалізацією генів, невибагливих до вирощування за стандартних умов, фенотипи яких легко візуально діагностувати на різних етапах онтогенезу.

Зв'язок роботи з науковими програмами, темами, планами. Робота виконувалась на кафедрі біології рослин Луганського національного аграрного університету відповідно до плану науково-дослідних робіт за темою “Створення нових ліній арабідопсису (Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.), що марковані картованими генами” (0100U004284).

Мета і завдання дослідження. Головною метою досліджень було отримання полімутантних гомозиготних за рецесивними генами ліній Arabidopsis thaliana з новими комбінаціями трьох-п'яти алелей, а також визначення придатності таких ліній для генетичного аналізу та картування.

Для досягнення вказаної мети були поставлені наступні завдання:

- теоретично обґрунтувати та експериментально перевірити запропоновані схеми ступінчастої гібридизації, котрі дозволяють істотно інтенсифікувати й полегшити отримання полімутантних гомозиготних за рецесивними генами ліній арабідопсису;

- отримати гомозиготні лінії за трьома, чотирма та п'ятьма рецесивними генами за всіма групами зчеплення арабідопсису;

- порівняти життєздатність до вирощування in vivo вихідних та створених полімутантних ліній;

- локалізувати некартовані мутації арабідопсису за формою листкової пластинки з використанням нового пентарецесиву.

Об'єкт дослідження - дімутантні лінії арабідопсису Таля (Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.). арабідопсис листковий пластинка полімутантний

Предмет дослідження - можливості та особливості поєднання в одному фенотипі декількох зчеплених і незчеплених між собою мутантних генів без суттєвого зниження життєздатності створених ліній.

Методи дослідження: основними були методи міжлінійної гібридізації, що базувались на кастрації та примусовому запиленні відповідно до схеми дослідів; визначення рослин в межах отриманих гібридних комбінацій за фенотиповими ознаками; генетичний аналіз успадкування ознак в ряду поколінь за допомогою сучасних математичних методів.

Наукова новизна отриманих результатів. Істотно інтенсифіковано та полегшено отримання полімутантних гомозиготних за рецесивними генами ліній арабідопсису на основі запропонованої схеми ступінчастої гібридизації. З використанням 10 рецесивних генів (ap1-1; bp-1; ch1-1; ch5-1; clv1-1; cp2-1; dis2-1; gl1-1; min-1; tfl1-2) одержано 20 нових тримутантних гомозиготних ліній Arabidopsis thaliana, маркованих алелями, розташованими за всіма групами зчеплення, прояв яких легко візуально виявляється на різних етапах онтогенезу рослин. Схрещуванням отриманих тримутантних ліній (за апробованою нами схемою) після добору фенотипів у F2 створено три нових гомозиготних тетрарецесиви за чотирма різними комбінаціями генів (bp-1,ch5-1,er-1,gl1-1; bp-1,clv1-1,er-1,gl1-1 та ch5-1,clv1-1,er-1,gl1-1).

Шляхом ступінчастої гібридизації та добору отримана нова полімутантна лінія, котра маркована одним рецесивним алелем у кожній із п'яти хромосом гаплоїдного набору (bp-1,ch5-1,clv1-1,er-1,gl1-1). Вказана лінія (N9403) є новою тест-лінією для визначення групи зчеплення в арабідопсису. Всі нові полімутантні гомозиготні за трьома-п'ятьма рецесивними генами лінії показали життєздатність на рівні вихідної лінії Landsberg erecta.

За допомогою нового пентарецесиву вперше встановлено локалізацію мутантних генів as, an, iv за формою листкової пластинки.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані лінії арабідопсису, що марковані трьома-п'ятьма рецесивними генами, знайшли різне практичне застосування. Видано “Иллюстрированный каталог генетической коллекции арабидопсиса Луганского НАУ” з описом кожної лінії. Каталог призначений для планування і проведення наукових експериментів щодо картування генів, мутагенезу, генетичної інженерії із використанням полімутантних ліній арабідопсису.

Полімутантні лінії арабідопсису суттєво полегшили та спростили роботу по збереженню колекцій мутантних алелей у порівнянні з багаточисельними мономутантними лініями.

Нова пентарецесивна лінія (N9403) має важливе значення для функціональної геноміки арабідопсису та картування генів. Всі полімутантні лінії передані, протестовані та зареєстровані під ідентифікаційними номерами у всесвітньому каталозі (NASC) та є цілком доступними для наукових досліджень. З використанням наших ліній здійснено дослідження плейотропної дії мутантних алелей на кількісні ознаки [Сыч, 2001; Карпенко, 2003].

Навчальний посібник “Генетика. Практикум”, де знайшла своє використання як базова тримутантна лінія ch5-1ch5-1er-1er-1gl1-1gl1-1 (N9529), видано і рекомендовано Міністерством освіти та науки України до застосовування в навчальному процесі для студентів вищих навчальних закладів III-IV рівнів акредитації (№14/18.2-827 від 18.04.2002).

Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота є завершеним науковим дослідженням Л.І. Сігідіненко. Здобувач оволоділа необхідними методами досліджень, самостійно опрацювала літературу за темою дисертаційної роботи, брала безпосередню участь у розробці планів досліджень, підготовці та проведенні експериментів щодо створення нових ліній, обґрунтуванні та статистичній обробці результатів, підготовці до друку наукових робіт. Матеріали дисертаційної роботи одержані автором самостійно або спільно зі співробітниками кафедри біології рослин ЛНАУ. Частка особистої участі дисертанта становить 80%.

Апробація результатів дисертації. Основні наукові результати дисертаційної роботи доповідались на VII, VIII з'їздах Українського товариства генетиків і селекціонерів (Крим, 2002; Алушта, 2007), II міжнародній конференції „Онтогенез рослин у природному і трансформованому середовищі” (Львів, 2004), міжнародній науково-практичній конференції “Україна наукова - 2003” (Дніпропетровськ, 2003), міжнародній науково-практичній конференції „Теоретичні та прикладні дослідження в ботаніці та методиці викладання біології” (Білгород, 2005), науковій конференції „Сучасна біотехнологія в сільському господарстві та медицині” (Київ, 2005) і міжнародних Ліннеївських читаннях (Луганськ, 2007).

Публікації. Основні положення дисертації опубліковані у 21 друкованій роботі: 18 статтях у фахових виданнях та 3 тезах доповідей.

Структура та обсяг роботи. Дисертаційна робота складається із списку умовних позначень та скорочень, вступу, 5 розділів, аналізу і узагальнення результатів, висновків, списку використаних джерел наукової літератури, що містить 174 найменувань та додатків. Робота викладена на 153 сторінках тексту, включає 31 таблицю, 33 рисунки.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури. В огляді літератури аналізуються узагальнені дані про Arabidopsis thaliana як модельний вид для вивчення геному рослин, використання мутантних генів арабідопсису. Окремий розділ присвячений міжнародній колекції мутантів та генетичній номенклатурі A. thaliana.

Матеріали та методи досліджень. Вихідним матеріалом для створення нових рекомбінантних ліній послужили лінії, насіння яких було отримано з Ноттінгемського центру по підтримці генетичної колекції арабідопсису у Великій Британії. Загальна характеристика ліній за фенотиповими ознаками, з наявною та невідомою локалізацією мутацій за групами зчеплення наведена в табл. 1 [Seed List, 1994].

Таблиця 1 - Загальна характеристика ліній Arabidopsis thaliana із колекції NASC

Символ алеля	Назва лінії	Фенотип	Хромосома/ сайт
er-1	Erecta	Прямостояче (еректоїдне) стебло	2/48
ap1-1	Apetala	Пелюстки відсутні або рудиментарні	1/99
bp-1	Brevipedicеllus	Короткі квітконіжки, плоди повернуті донизу	4/15
ch1-1	Chlorina	Жовто-зелена рослина	1/58
ch5-1	Chlorina	Жовто-зелена рослина	5/43
сlv1-1	Clavata	Булавовидні плоди	1/110
cp2-1	Compacta	Напівкарлик	2/38
dis2-1	Distorted trichomes	Короткі, зігнуті тріхоми на стеблі та листі	1/45
gl1-1	Glabra	Тріхоми на розетковому листі відсутні	3/46
tfl1-2	Terminal flower	Верхівка стебла (суцвіття) рано закінчується квіткою	5/2
min-1	Miniature	Напівкарлик, іноді листя буває сіро-зелене	5/90
an	Angustifolia	Вузьке листя, збільшена кількість розеткового листя	?
as	Asymmetric	Асиметричне листя	?
iv	Involuta	Скручене, дуже мале листя	?

Експеримент проводили в лабораторії світлокультури Луганського НАУ [Соколов, 2003]. Насіння до посіву готували шляхом яровізації протягом 5 діб при температурі 4-6оС та наступного однодобового пророщування при кімнатній температурі до посіву. Грунтосуміш складалась з 4 частин грунту, 2 частин піску і 1 частини торфу. Рослини культивували при температурі 18-22оС, освітлення цілодобове, освітленність у межах 4000-7000 люкс. Батьківські лінії та гібриди першого покоління вирощували у горщиках. Для аналізу розщеплення в F2 рослини вирощували в ящиках, об'єм вибірки по кожному досліду дорівнював 196 рослинам. В дослідах по локалізації генів об'єм вибірки становив 400 рослин.

Головними методами дослідження були міжлінійна гібридизація та генетичний аналіз успадкування ознак. Кастрація та примусова гібридизація проводилась за допомогою бінокулярного мікроскопу. Генетичний аналіз створених ліній проводили в F2. Перевірку гомозиготності створених ліній за мутантними рецесивними генами проводили в F3. Достовірність результатів дослідів перевіряли математично за критерієм вірогідності ч2 та методом ц-Фішера, оцінку частоти рекомбінації при локалізації некартованих генів (an, as, iv) проводили за допомогою функції Косамбі [Захаров, 1979; Лакин, 1990].

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Створення тримутантних ліній Arabidopsis thaliana, маркованих рецесивними генами. Для отримання тримутантних гомозиготних ліній за рецесивними генами використовували генотипи, котрі розрізняються за алельним станом двох генів (ААbbcc х aaBBcc). При створенні тримутантної лінії за генами bp-1, ch5-1, er-1 за батьківські форми брали лінії Brevipedicellus з генотипом bp-1bp-1er-1er-1 та Chlorina з генотипом ch5-1ch5-1er-1er-1. З урахуванням генів CH5 та BP розщеплення відбувається за схемою дигібридного схрещування:

Р + ch5-1ch5-1Bp-1Bp-1er-1er-1 х > Ch5-1Ch5-1bp-1bp-1er-1er-1

F1 Ch5-1ch51-1Bp-1bp-1er-1er-1 x Ch5-1ch5-1Bp-1bp-1er-1er-1

F2 9 Ch5-1- Bp-1-er-1er-1: 3 Ch5-1- bp-1bp-1er-1er-1:

3 ch5-1ch5-1Bp-1-er-1er-1: 1 ch5-1ch5-1bp-1bp-1er-1er-1



Таким чином, замість тригібридного схрещування, отримання та аналіз тримутантів проводили за схемою дигібридного схрещування. Достовірність розщеплення була оцінена за критерієм ч2 (табл. 2).

Таблиця 2 - Розщеплення в поколінні F2 за генами CH5, BP

Позначення	Ch5-1-Bp-1-	ch5-1ch5-1Bp-1-	Ch5-1-bp-1bp-1	ch5-1ch5-1bp-1bp-1	Усього
f	106	35	43	9	193
f/	107	37	37	12	193
d	-1	-2	6	-3
d2	1	4	36	9
	0.01	0.1	0.97	0.75	1.83

Порівнюючи ч2 із ч2st, встановили, що ч2 < ч2st (Р<0.95). Отже, гіпотеза про розщеплення у відношенні 9:3:3:1 підтверджується. Таке розщеплення є результатом незалежного комбінування за двома ознаками. За таким підходом було отримано, передано та протестовано у Ноттінгемському центрі 20 тримутантних ліній, які наведено в табл. 3. До складу нових тримутантних ліній входять рецесивні алелі, розташовані по всіх 5 хромосомах гаплоїдного набору.

Таблиця 3 - Тримутантні лінії арабідопсису

№ з/п	Лінія по генах	Фенотип	Номер у колекції
			ЛНАУ	NASC
1	ap1-1,bp-1,еr-1	Квітка без пелюсток, короткі квітконіжки, еректоїдне стебло	Lug 215	N9517
2	ap1-1,ch5-1,er-1	Квітка без пелюсток, жовто-зелена рослина, еректоїдне стебло	Lug 26	N9518
3	ap1-1,dis2-1,er-1	Квітка без пелюсток, короткі тріхоми, еректоїдне стебло	Lug 213	N9519
4	аp1-1,er-1,gl1-1	Квітка без пелюсток, еректоїдне стебло, розеткове листя без тріхом	Lug 24	N9520
5	ap1-1,er-1,tfl1-2	Квітка без пелюсток, еректоїдне стебло, закрите суцвіття	Lug217	?
6	bp-1,ch5-1,er-1	Короткі квітконіжки, жовто-зелена рослина, еректоїдне стебло	Lug 29	N9521
7	bp-1,clv1-1,er-1	Короткі квітконіжки, булавовидні плоди, еректоїдне стебло	Lug 216	N9522
8	bp-1,er-1,gl1-1	Короткі квітконіжки, еректоїдне стебло, розеткове листя без тріхом	Lug 23	N9523
9	bp-1,er-1,min-1	Короткі квітконіжки, еректоїдне стебло, напівкарлик	Lug 214	N9524
10	bp-1,er-1,tfl1-2	Короткі квітконіжки, еректоїдне стебло, закрите суцвіття	Lug 218	N9525
11	ch1-1,er-1,gl1-1	Жовто-зелена рослина, еректоїдне стебло, розеткове листя без тріхом	Lug 22	N9526
12	ch5-1,clv1-1,er-1	Жовто-зелена рослина, булавовидні плоди, еректоїдне стебло	Lug 27	N9528
13	ch5-1,dis2-1,er-1	Жовто-зелена рослина, короткі тріхоми, еректоїдне стебло	Lug 28	N9527
14	ch5-1,er-1,gl1-1	Жовто-зелена рослина, еректоїдне стебло, розеткове листя без тріхом	Lug 21	N9529
15	ch5-1,er-1,tfl1-2	Жовто-зелена рослина, еректоїдне стебло, закрите суцвіття	Lug 210	N9530
16	clv1-1,er-1,gl1-1	Булавовидні плоди, еректоїдне стебло, розеткове листя без тріхом	Lug 25	N9535
17	cp2-1,er-1,gl1-1	Напівкарлик, еректоїдне стебло, розеткове листя без тріхом	Lug 215	N9536
18	cp2-1,er-1,tfl1-2	Напівкарлик, еректоїдне стебло, закрите суцвіття	Lug 219	N9537
19	dis2-1,clv1-1,er-1	Короткі тріхоми, булавовидні плоди, еректоїдне стебло	Lug 212	N9538
20	dis2-1,er-1,tfl1-2	Короткі тріхоми, еректоїдне стебло, закрите суцвіття	Lug 211	N9539

Сім тримутантних ліній, які мали в своєму генотипі рецесивні алелі ch1-1 та ch5-1, перевіряли на життєздатність, оскільки у гомозиготному стані вказані алелі мають зменшену життєздатність (Koornneef, 1987).

Таблиця 4 - Вплив генів ch1 і ch5 на життєздатність тримутантних ліній

Алелі	Кількість насіння	Рослини з квітками	Рослини %	F-критерій Фішера
Дослід 1
er-1	49	44	89.8
ap1-1	49	43	87.8	0.10
ch5-1	49	31	63.3	10.40**
аp1-1,ch5-1,er-1	49	46	93.9	0.55
Дослід 2
er-1	49	45	91.8	-
bp-1	49	46	93.9	0.55
ch5-1	49	45	91.8	2.08
bp-1,ch5-1,er-1	49	45	91.8	0.12
Дослід 3
er -1	49	42	85.7	-
ch1-1	49	27	55.1	11.78***
gl1-1	49	45	91.8	0.53
сh1-1,er-1,gl1-1	49	40	81.6	0.30
Дослід 4
er -1	49	45	91.8	-
ch5-1	49	40	81.6	2.29
clv1-1	49	42	85.7	0.93
сh5-1,clv1-1,er -1	49	45	89.8	0.12
Дослід 5
er-1	49	44	89.8	-
ch5-1	49	45	91.8	0.12
dis2-1	49	44	89.8	0.00
сh5-1,er-1,dis2-1	49	45	91.8	0.12
Дослід 6
er-1	49	44	89.8	-
ch5-1	49	46	93.9	0.55
gl1-1	49	44	89.8	0.00
сh5-1,er-1,gl1-1	49	45	91.8	0.12
Дослід 7
er -1	49	48	98.0	-
ch5-1	49	35	71.5	7.30**
tfl1-2	49	46	93.9	1.10
ch5-1,er-1,tfl1-2	49	45	91.8	2.08

У табл. 4 представлені результати цих досліджень. Встановлено, що алель ch1-1 у гомозиготному стані поводилась як субвиталь (дослід №3). Алель ch5-1 у дослідах №2, №4, №5 і №6 достовірно не знижувала життєздатності, а в дослідах №1 і №7 - знижувала (0.99<Р<0.999) і поводилася як напівлеталь. Слід зазначити, що всі створені тримутантні лінії, які у гомозиготному стані несуть алелі ch1-1 і ch5-1, мали життєздатність на рівні лінії Landsberg erecta. Незначна різниця в життєздатності ліній не є перешкодою для використання їх у дослідженнях.

Створені тримутантні лінії можна використовувати при визначенні груп зчеплення некартованих генів, оскільки вони мають різні комбінації рецесивних генів усіх п'яти груп зчеплення. Цінність та значення полімутантних ліній підвищується зі збільшенням кількості гомозиготних рецесивних генів у генотипі, оскільки набагато швидше та зручніше проводити генетичний аналіз та картування за наявності якнайбільшої кількості маркерних генів.

Отримання полімутантних ліній арабідопсису. Отримання гомозиготних ліній, котрі мають по чотири рецесивних гени. Наступним кроком було отримання з використанням тримутантних ліній тетрарецесивів, тобто гомозиготних ліній, котрі мають по чотири рецесивних гени у генотипі. Традиційна схема схрещування для отримання гомозиготної лінії при розщепленні за чотирма генами має вигляд:

P + AABBccdd x > aabbCCDD

v

F1 AaBbCcDd x AaBbCcDd

v

F2 81 : 27 : 27 : 27 : 27 : 9 : 9 : 9 : 9 : 9 : 9 : 3 : 3 : 3 : 3 : 1 aabbccdd

Отже, для отримання тетрарецесива необхідно 256 рослин. У нашому експерименті для отримання тетрамутантної лінії використовували тримутантні лінії, де по два гени знаходяться у гомозиготному стані й участі в розщепленні не беруть. Таким чином розщеплення проходить за дигібридною схемою:

Р + ААbbссdd x > aaВВccdd

v

F1 AaBbccdd x AaBbccdd

v

F2 9 A-B-ccdd : 3 aaB- ccdd : 3 A-bb ccdd : 1 aabbccdd

Порівняно з традиційною схемою, запропонована та апробована нами схема дозволяє зменшити необхідний розмір вибірки у 16 разів, що полегшує роботу щодо отримання тетрарецесивів. У результаті проведеного досліду була отримана нова тест-лінія Brevipedicellus,Chlorina,Erecta,Glabra. Рослини цієї лінії мали фенотип з характерними морфологічними особливостями: короткі квітконіжки, плоди повернуті донизу, рослини жовто-зеленого кольору, еректоїдне стебло, тріхоми на розетковому листі відсутні. Дані ознаки легко ідентифікуються на ранніх етапах онтогенезу без застосування будь-яких збільшувальних приладів і зберігаються впродовж усього вегетаційного періоду. Ця лінія занесена до каталогу генетичної колекції арабідопсису Луганського НАУ під номером Lug 31. У каталозі NASC вона має номер N9541. За таким схемою досліду було отримано ще дві гомозиготні лінії, які мають у генотипі по чотири рецесивних гени. Тест-лінія за генами bp-1,clv1-1,er-1,gl1-1 з фенотипом: короткі квітконіжки, булавовидні плоди повернуті донизу, еректоїдне стебло, тріхоми на розетковому листі відсутні. У каталозі ЛНАУ вона має номер Lug 32, а у NASC ? N9542. Тест-лінія за генами ch5-1,clv1-1,er-1,gl1-1 має фенотип: жовто-зелена рослина, булавовидні плоди, еректоїдне стебло, тріхоми на розетковому листі відсутні. Вказана лінія також занесена до каталогу генетичної колекції арабідопсису Луганського НАУ під номером Lug 33. У каталозі NASC вона має номер N9543.

Отримання пентарецесиву за генами bp-1, ch5-1, clv1-1, er-1, gl1-1, котрі зумовлюють ознаки: короткі квітконіжки, жовто-зелена рослина, булавовидний плід, еректоїдне стебло, листя розетки без тріхом. Традиційна схема схрещування для отримання гомозиготної пентарецесивної лінії при розщепленні за п'ятьма генами має вигляд:

P + AABBccddff x > aabbCCDDFF

v

F1 AaBbCcDdFf x AaBbCcDdFf

v

F2 243: 81: 81 : 81 : 81 : 81 : 27 : 27 : 27 : 27 : 27 : 27 : 27 : 27 : 27 : 27 : 9 : 9 : 9 : 9 : 9 : 9 : 9 : 9 : 9 : 9 : 3 : 3 : 3 : 3 : 3 : 1 aabbccddff

Таким чином, для отримання пентарецесива за наведеною схемою вибірка складає як мінімум 1024 рослини. У нашому експерименті для створення пентарецесивної лінії використовували тримутантну і тетрамутантну гомозиготні рецесивні лінії, відповідно з трьома і чотирма мутантними алелями. Таким чином, замість пентагібридного схрещування проведено тригібридне. Генотип Р1 - Bp-1Bp-1Ch5-1Ch5-1clv1-1clv1-1er-1er-1gl1-1gl1-1, генотип P2 - bp-1bp-1ch5-1ch5-1Clv1-1Clv1-1er-1er-1gl1-1gl1-1. Гени gl1 і er знаходяться у гомозиготному рецесивному стані, тому з урахуванням генів BP, CH5 та СLV1 розщеплення проходить за тригібридною схемою:

Р + Bp-1Bp-1Ch5-1Ch5-1clv1-1clv1-1 х > bp-1bp-1ch5-1ch5-1Clv1-1Clv1-1

er-1er-1gl1-1gl1-1 er-1er-1gl1-1gl1-1

v

F1 Bp-1bp-1Ch5-1ch5-1Clv1-1clv1-1 х Bp-1bp-1Ch5-1ch5-1Clv1-1clv1-1

er-1er-1gl1-1gl1-1 er-1er-1gl1-1gl1-1

v

F2 27 Bp-1-Ch5-1-Clv1-1-er-1er-1gl1-1gl1-1 :

9 bp-1bp-1Ch5-1-Clv1-1-er-1er-1gl1-1gl1-1 :

9 Bp-1-ch5-1ch5-1Clv1-1-er-1er-1gl1-1gl1-1 :

9 Bp-1-Ch5-1-clv1-1clv1-1er-1er-1gl1-1gl1-1 :

3 bp-1bp-1ch5-1ch5-1 Clv1-1-er-1er-1gl1-1gl1-1:

3 bp-1bp-1Ch5-1-clv1-1clv1-1er-1er-1gl11gl1-1:

3 Bp-1-ch5-1ch5-1clv1-1clv1-1er-1er-1gl1-1gl1-1:

1 bp-1bp-1ch5-1ch5-1clv1-1clv1-1er-1er-1gl1-1gl1-1

У F2 відібрали рослини жовто-зеленого кольору з короткими квітконіжками, повернутими донизу булавовидними плодами, еректоїдним стеблом, без тріхом на розетковому листі. Таким чином була отримана нова тест-лінія, в якої кожна з п'яти хромосом маркована однією рецесивною мутантною алеллю: bp-1 (4 хромосома, сайт 15), ch5-1 (5 хромосома, сайт 43), clv1-1 (1 хромосома, сайт 110), er-1 (2 хромосома, сайт 48), gl1-1 (3 хромосома, сайт 46). Лінія занесена до каталогу генетичної колекції арабідопсису Луганського НАУ під номером Lug 41, в NASC - під номером N9403.

Отже, для отримання пентарецесиву в цьому випадку було достатньо вибірки з 64 рослин. Порівняно з класичною схемою ми зменшили необхідний розмір вибірки в 16 разів, таким чином істотно інтенсифікували отримання пентарецесиву. Порівняльна характеристика традиційного та запропонованого і здійсненого підходу до виділення полімутантних рецесивних ліній представлена в табл. 5.

Таблиця 5 - Порівняння традиційного і запропонованого нами методів отримання полімутантних ліній арабідопсису

Гомозиготні рецесивні лінії	Число генів, за якими розрізняються батьки	Частота рецесивних гомозигот	Зменшення об'єму необхідної вибірки
	традиційний	наш	традиційний	наш
Пентарецесив	5	3	1 : 1024	1 : 64	16
Тетрарецесив	4	2	1 : 256	1 : 16	16
Трирецесив	3	1	1 : 16	1 : 4	4

У цілому з використанням запропонованого та протестованого методу отримання полімутантних ліній значно інтенсифікується та суттєво полегшується експериментальна робота, зменшується обсяг необхідної вибірки (від 4 до 16 разів).

Локалізація некартованих мутантних генів за допомогою створеного пентарецесиву. Полімутантні рецесивні лінії арабідопсису дозволяють здійснити локалізацію некартованих генів по сайтах та групах зчеплення. Проведено гібридологічний аналіз по картуванню мутантних генів по формі листкової пластинки за допомогою створеного нового пентарецесиву як тест-лінії по генах bp-1,ch5-1,clv1-1,er-1,gl1-1. Мутанти за рецесивними генами an, as, iv (рис. 1.) схрещували з вказаною мультимаркерною лінією (рис. 1.).

Локалізацію маркерів по групах зчеплення і сайтах пентарецесивної мультимаркерної лінії показано на рис. 2.

З представленого рисунку видно, що загальна довжина генома A. thaliana складає 122+83+96+76+98=475 сМ. Вірогідність визначення локалізації до групи зчеплення при використанні даної тест-лінії становить 84%. При незалежному розподілі двох алелей відповідно до закону розщеплення по Менделю, відношення по фенотипу в F2 очікується 9:3:3:1. Із 400 рослин F2 у експериментах очікується поява приблизно 25 подвійних рецесивів (димутантів) (1/16 частина). Якщо кількість таких рецесивів явно менша 25, є підстава припускати зчеплення генів.

Результати визначення локалізації рецесивного гена an (фенотип - вузьке листя) з пентарецесивом наведені в табл. 6.

Таблиця 6 - Оцінка відстаней між рецесивним геном an і маркерними генами

Маркерні гени	Хромосома	Частота рекомбінації та її помилка	Відстань між генами за функцією Косамбі, сМ
clv1	1	0.41±0.04	58.3
er	2	0.46±0.04	81.8
gl1	3	0.43±0.03	66.6
bp	4	0.49±0.03	139.7
ch5	5	0.0	0.0



Дані вказують на відсутність зчеплення гена an з маркерами clv1, er, gl1 і bp. Водночас підтверджується зчеплення генів an і ch5. Вибіркова оцінка частоти кросинговера свідчить про положення an в безпосередній близькості від ch5. В даному випадку незалежного розщеплення не спостерігається. Гени an і ch5 тісно зчеплені між собою, локус гена an розташований у п'ятій хромосомі, сайт 42 сМ.

Подібним чином визначали локалізацію рецесивного гена as (фенотип - асиметричний лист). Для визначення локалізації до групи зчеплення алелі as проводили схрещування вказаного мутанта з тест-лінією. По розщепленню у потомстві F2 перевіряли зчеплення з маркерними генами. Оцінка частоти кросинговера та відстані між генами наведені в табл. 7.

Таблиця 7 - Оцінка відстані між рецесивним геном as і маркерними генами

Маркерні гени	Хромосома	Частота рекомбінації та її помилка	Відстань між генами за функцією Косамбі, сМ
clv1	1	0.11±0.05	11.3
er	2	0.41±0.04	59.2
gl1	3	0.45±0.04	74.2
bp	4	0.35±0.03	44.0
ch5	5	0.44±0.04	71.1

Як видно з табл. 7, ген as знаходиться у першій хромосомі поблизу від маркерного гена clv1. Внаслідок нашого експерименту вперше встановлено сайт гена as - 98.7 сМ, хромосома 1.

Результати визначення локалізації рецесивного гена iv (фенотип - скручене листя) після схрещування з пентарецесивом наведені в табл. 8. Зв'язок між ознаками, що визначали гени iv і clv1, неможливий. Отже, зчеплення між даними генами відсутнє, як і між геном iv та іншими маркерами.



Таблиця 8 - Оцінка відстані між рецесивним геном iv і маркерними генами

Маркерні гени	Хромосома	Частота рекомбінації та її помилка	Відстань між генами за функцією Косамбі, сМ
clv1	1	0.44±0.04	70.0
er	2	0.48±0.03	103.5
gl1	3	0.45±0.03	73.6
bp	4	0.44±0.04	73.3
ch5	5	0.48±0.03	112.6

З жодним із маркерів ген iv не має зчеплення. Він локалізований поза дотичними до маркерних генів частинами хромосом, які позначені на рис.2. Цей ген знаходиться в одній із ділянок хромосоми 1 або 4. У результаті проведених досліджень було встановлено, що створена нами лінія bp-1bp-1ch5-1ch5-1clv1-1clv1-1er-1er-1gl1-1gl1-1 ефективна для визначення груп зчеплення мутантних генів Arabidopsis thaliana, зокрема за формою листкової пластинки.

Аналіз і узагальнення результатів. Відповідно до поставленої мети, головними результатами даної роботи можна вважати отримання полімутантних ліній Arabidopsis thaliana, маркованих високожиттєздатними алелями, прояв яких легко візуально визначається на різних етапах онтогенезу рослин. Всього було використано 10 рецесивних генів (ap1-1; bp-1; ch1-1; ch5-1; clv1-1; cp2-1; dis2-1; gl1-1; min-1; tfl1-2). Вперше отримано 20 нових тримутантних ліній, що мають різні комбінації рецесивних генів за всіма п'ятьма групами зчеплення, 4 з них мають в своєму складі по два рецесивних гена в одній групі зчеплення (табл.9).

Таблиця 9 - Тримутантні гомозиготні рецесивні лінії

№ з\п	Мутантні алелі ліній	Розташування генів по групах зчеплення
1	ap1-1, bp-1, er-1	1, 2, 4
2	ap1-1, ch5-1, er-1	1, 2, 5
3	ap1-1, dis2-1, er-1	1, 1, 2
4	ap1-1, er-1, gl1-1	1, 2, 3
5	ap1-1, er-1, tfl1-2	1, 2, 5
6	bp-1, ch5-1, er-1	2, 4, 5
7	bp-1, clv1-1, er-1	1, 2, 4
8	bp-1, er-1, gl1-1	2, 3, 4
9	bp-1, er-1, min-1	2, 4, 5
10	bp-1, er-1, tfl1-2	2, 4, 5
11	ch1-1, er-1, gl1-1	1, 2, 3
12	ch5-1, clv1-1, er-1	2, 3, 5
13	ch5-1, dis2-1, er-1	1, 2, 5
14	ch5-1, er-1, gl1-1	2, 3, 5
15	ch5-1, er-1, tfl1-2	2, 5, 5
16	clv1-1, er-1, gl1-1	1, 2, 3
17	ср2-1, er-1, gl1-1	2, 2, 3
18	ср2-1, er-1, tfl1-2	2, 2, 5
19	dis2-1, clv1-1, er-1	1, 1, 2
20	dis2-1, er-1, tfl1-2	1, 2, 5

За допомогою таких ліній можна ідентифікувати групи зчеплення некартованих генів арабідопсису, але для цього потрібно провести як мінімум три варіанти схрещувань. Тому для картування доцільніше використовувати полімутантні рецесивні лінії з більшою кількістю генів в одному генотипі. Конкретно при застосуванні трьох новостворених тетрамутантних ліній, локалізацію генів можна провести при використанні двох варіантів схрещувань. Розроблена нами схеми схрещування на основі методів класичного генетичного аналізу дозволила отримати нову полімутантну лінію, котра маркована однією рецесивною алеллю по кожній із п'яти хромосом гаплоїдного набору (bp-1,ch5-1,clv1-1,er-1,gl1-1). Встановлено, що тест-лінія ефективна для визначення груп зчеплення раніше некартованих мутантних генів арабідопсису в ході одного досліду.

Отримані нами лінії арабідопсису, що марковані 3-5 числом мутантних алелей, знайшли різне практичне застосування [Сигидиненко, 2005]. Нові полімутантні лінії використані рядом авторів для вивчення спільної плейотропної дії мутантних алелей на кількісні ознаки. Ряд ліній використовується у навчальному процесі з генетики.

ВИСНОВКИ

У дисертації наведено теоретичне і експериментальне узагальнення можливості створення гомозиготних полімутантних ліній, що марковані різними рецесивними генами за всіма групами зчеплення Arabidopsis thaliana. Доказана реальність отримання полімутантних ліній, що марковані високожиттєздатними алелями, прояв яких легко візуально діагностується на всіх етапах онтогенезу рослин за звичайних умов культивування. Створені лінії забезпечують суттєве полегшення проведення генетичного аналізу арабідопсису, дозволяють локалізувати некартовані мутації, підвищують комбінаційну мінливість геному арабідопсису.

Вперше з використанням 10 рецесивних генів (ap1-1; bp-1; ch1-1; ch5-1; clv1-1; cp2-1; dis2-1; gl1-1; min-1; tfl1-2) одержано 20 нових тримутантних гомозиготних ліній Arabidopsis thaliana, маркованих алелями, розташованими по всіх групах зчеплення.

Нові тримутантні гомозиготні лінії арабідопсису дозволяють проведення генетичного аналізу за допомогою одного-чотирьох фенотипових маркерів за групою зчеплення.

Встановлено, що сім створених тримутантних ліній, котрі у гомозиготному стані несуть алелі ch1-1 та ch5-1, мають життєздатність на рівні лінії Landsberg erecta.

Розроблено і апробовано схему схрещування тримутантних ліній, за допомогою якої після добору фенотипів у F2 створено три нові гомозиготні лінії за чотирма різними рецесивними генами.

Вперше шляхом ступінчастої гібридизації і добору отримано нову полімутантну лінію, марковану одним рецесивним алелем у кожній із п'яти хромосом гаплоїдного набору (bp-1,ch5-1,clv1-1,er-1,gl1-1). Новий пентарецесив є унікальною за життєздатністю тест-лінією арабідопсису.

Виявлено, що створена нами пентарецесивна лінія bp-1bp-1ch5-1ch5-1clv1-1clv1-1er-1er-1gl1-1gl1-1 ефективна для локалізації некартованих мутантних генів арабідопсису за формою листкової пластинки. Вперше встановлено, що ген as (асиметричний лист) знаходиться у хромосомі 1, сайт 98.7 сМ.

Вперше встановлено, що ген an (вузький лист) локалізований у хромосомі 5, сайт 42 сМ, тісно зчеплений із сайтом гена ch5.

З'ясовано ефективність використання нової тримутантної лінії за рецесивними генами ch5-1,er-1,gl1-1, які розташовані у 2, 3 і 5 групах зчеплення, як основної у лабораторному практикумі з генетики.



СПИСОК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Соколов І.Д., Шеліхов П.В., Соколова Т.І., Наумов С.Ю., Сич О.І., Сігідіненко Л.І. Генетика. Практикум. - К.: Арістей, 2003. - 176 с.

2. Соколов И.Д., Шелихов П.В., Сигидиненко Л.И., Наумов С.Ю., Пилавов Г.Ш., Сыч Е.И. Иллюстрированный каталог генетической коллекции арабидопсиса Луганского НАУ. - Луганск: “Элтон-2”, 2004. - 36 с.

3. Сигидиненко Л.И., Шелихов П.В., Соколов И.Д. Создание димутантных линий арабидопсиса gl1,clv1; clv1,bp; ch5,clv1; ch5,bp; gl1,bp; ch5,gl1 // Зб. наук. пр. ЛНАУ. - Луганськ: “Елтон-2”, 2003. - №22 (34). - С. 51-52.

4. Сигидиненко Л.И., Шелихов П.В. Влияние дифференциальной жизнеспособности на отношение расщепления при моногибридном и дигибридном наследовании // Зб. наук. пр. ЛНАУ. - Луганськ: “Елтон-2”, 2003. - №32 (44). - С. 72-74.

5. Соколов І.Д., Сігідіненко Л.І., Шеліхов П.В., Сич О.І., Ніколаєнко Н.П. Життєздатність мутантних ліній арабідопсису в зв'язку з їх використанням у навчальному процесі з генетики // Вісник ЛДПУ. - 2003. - №1 (57). - С. 51-57.

6. Соколов И.Д., Сигидиненко Л.И., Сыч Е.И., Шелихов П.В., Степанов М.Ю., Наумов С.Ю. Новая линия Arabidopsis thaliana (L.) Heynh., маркированная пятью мутантными аллелями (bp-1, ch5-1, clv1-1, er-1, gl1-1). // Зб. наук. пр. ЛНАУ. - Луганськ: “Елтон-2”, 2003. - №32 (44). - С. 18-22.

7. Сигидиненко Л.И., Шелихов П.В. Синтез тримутантных линий арабидопсиса bp-1,ch5-1,gl1-1; bp-1,clv1-1,gl1-1; ch5-1clv1-1,gl1-1 // Зб. наук. пр. ЛНАУ. - Луганськ: “Елтон-2”, 2004. - №39 (51). - С. 18-20

8. Сігідіненко Л.І., Соколов І.Д., Сич О.І., Шеліхов П.В. Динаміка формування листків в онтогенезі лінії сh5-1,gl1-1 Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. // Зб. наук. пр. ЛНАУ. - Луганськ: “Елтон-2”, 2004. - №43 (55). - С. 44-48.

9. Соколов И.Д., Сигидиненко Л.И., Соколова Т.И., Сыч Е.И., Шелихов П.В. Организация малого практикума по генетике на модельном объекте Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. // Вісник Українського тов. генетиків і селекціонерів. Т. 2. № 2. - Луганськ: “Елтон-2”, 2004. - С. 243-248.

10. Соколов И.Д., Сова Т.В., Сигидиненко Л.И., Наумов С.Ю., Харченко В.Е., Седова В.Т., Хаблак С.Г., Пилавов Г.Ш. Строение соцветий гомозиготной линии ap1-1 арабидопсиса Таля Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. // Зб. наук. пр. ЛНАУ. - Луганськ: “Елтон-2”, 2005. - №48 (71). - С. 78-82.

11. Сигидиненко Л.И., Шелихов П.В. Практическое применение димутантных и более сложных линий Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. // Зб. наук. пр. ЛНАУ. - Луганськ: “Елтон-2”, 2005. - №48 (71). - С. 82-85.

12. Сигидиненко Л.И. Получение рекомбинантных линий арабидопсиса bp-1, tfl1-2; cp2-1,gl1-1; cp2-1,tfl1-2 // Зб. наук. пр. ЛНАУ. - Луганськ: “Елтон-2”, 2005. - №52 (75). - С. 48-51.

13. Соколов И.Д., Хаблак С.Г., Сыч Е.И., Сигидиненко Л.И. Совместное влияние мутантных аллелей ap1-1 и bp-1 на архитектуру соцветия арабидопсиса (Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.) // Вісник Українського тов. генетиків і селекціонерів. - Т. 3, № 1-2. - Луганськ: “Елтон-2”, 2005. - С. 48-56.

14. Сыч Е.И., Сигидиненко Л.И., Наумов С.Ю., Соколов И.Д. Проявление действия мутантной аллели bp-1 на различных генофонах у арабидопсиса (Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.) // Зб. наук. пр. ЛНАУ. - Луганськ: “Елтон-2”, 2006. - № 57 (80). - С. 95-99.

15. Сич О.І., Карпенко Т.М., Соколов І.Д., Сігідіненко Л.І., Чеченєва Т.М. Арабідопсис (Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.) як донор генів у селекції культурних рослин методами трансгенеза // Науковий вісник Національного аграрного університету. - К., 2006. - Вип. 95. - С. 31-35.

16. Сигидиненко Л.И., Чеченева Т.Н. Создание новых рекомбинантных линий арабидопсиса и их применение // Зб. наук. пр. ЛНАУ. - Луганськ: “Елтон-2”, 2006. - № 66 (89). - С. 53-55.

17. Сигидиненко Л.И., Чеченева Т.Н. Расширение генетической коллекции арабидопсиса Аrabidopsis thaliana (L.) Нeynh. // Досягнення і проблеми генетики, селекції та біотехнології: Зб. наук. пр. / Укр. т-во генетиків і селекціонерів ім. М.І. Вавилова. - К.: Логос, 2007. - Т. 1. - С. 395-399.

18. Чеченева Т.Н., Сигидиненко Л.И., Кирпичева И.В., Соколов И.Д. Локализация мутаций по форме листовой пластинки арабидопсиса Таля с помощью новой мультимаркерной линии // Науковий вісник Національного аграрного університету. - К., 2007. - Вип. 117. ? С. 160?166.

19. Сигидиненко Л.И., Соколов И.Д. Новая линия арабидопсиса CH5,GL1 в учебном процессе // Україна наукова - 2003: Міжнар. Наук.-практ. конференції. - Дніпропетровськ: Наука і освіта, 2003. - Т. 4. - С. 49-51.

20. Сігідіненко Л.І., Соколов І.Д., Сич О.І., Шеліхов П.В. Формування листків в онтогенезі лінії ch5-1,gl1-1 Аrabidopsis thaliana (L.) Нeynh. // Онтогенез рослин у природному і трансформованому середовищі: II Міжнар. конференція. - Львів: СПОЛОМ, 2004. - С. 224.

21. Сигидиненко Л.И., Соколов И.Д. Генетические ресурсы Аrabidopsis thaliana (L.) Нeynh. в связи с проблемой видообразования // Міжнар. Ліннеївські читання. - Луганськ: “Елтон-2”, 2007. - С. 47.



АНОТАЦІЯ

Сігідіненко Л.І. Створення нових ліній арабідопсису (Аrabidopsis thaliana (L.) Нeynh.), що марковані мутантними генами. ? Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.15 ? генетика. Інститут фізіології рослин і генетики НАН України, Київ, 2008.

Дисертація присвячена недостатньо дослідженій проблемі отримання полімутантних ліній, маркованих високожиттєздатними у звичайній культурі алелями, прояв яких візуально легко виявляється на різних етапах онтогенезу рослини. У дисертації наведено експериментальне і теоретичне узагальнення можливості створення полімутантних ліній, маркованих різними рецесивними генами за всіма групами зчеплення Arabidopsis thaliana. Даний підхід забезпечує значне розширення можливостей генетичного аналізу нащадків за різними фенотиповими ознаками і сприяє істотному зростанню комбінаційної мінливості виду. З використанням 10 рецесивних генів (ap1-1; bp-1; ch1-1; ch5-1; clv1-1; cp2-1; dis2-1; gl1-1; min-1; tfl1-2) одержано 20 нових тримутантних гомозиготних рецесивних ліній Arabidopsis thaliana, маркованих високожиттєздатними алелями, прояв яких легко візуально визначається на різних етапах онтогенезу рослин. Показано за допомогою схеми схрещування отриманих нами тримутантних ліній, за якою після відбору потрібних фенотипів у F2 створено три нові гомозиготні лінії за чотирма різними рецесивними генами (bp-1,ch5-1,er-1gl1-1; bp-1,clv1-1,er-1,gl1-1 і ch5-1,clv1-1,er-1,gl1-1). Одержана шляхом ступінчатої гібридизації і відбору нова полімутантна лінія, маркована одним рецесивним мутантним алелем у кожній із п'яти хромосом гаплоїдного набору (bp-1,ch5-1,clv1-1,er-1,gl1-1). Вказана лінія є тест-лінією для визначення групи зчеплення в арабідопсису. Встановлено, що створена нами лінія bp-1bp-1ch5-1ch5-1clv1-1clv1-1er-1er-1gl1-1gl1-1 ефективна для визначення груп зчеплення мутантних генів Arabidopsis thaliana, зокрема за формою листкової пластинки. Вперше встановлено, що ген as (асиметричний лист) знаходиться у хромосомі 1, сайт 98.7 сМ, ген an (вузький лист) локалізований у хромосомі 5, сайт 42 сМ, тісно зчеплений із сайтом гена ch5. З'ясовано ефективність використання нової тримутантної лінії за рецесивними генами ch5-1,er-1,gl1-1, розташованими в 2, 3 і 5 групах зчеплення, як основної у лабораторному практикумі з генетики.

Ключові слова: арабідопсис, полімутантні лінії, тест-лінія, групи зчеплення, алель, схрещування.



АННОТАЦИЯ

Сигидиненко Л.И. Создание новых линий арабидопсиса (Аrabidopsis thaliana (L.) Нeynh.), маркированных мутантными генами. ? Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.15 ? генетика. Институт физиологии растений и генетики НАН Украины, Киев, 2008.

Диссертация посвящена недостаточно исследованной проблеме получения полимутантных линий, маркированных высокожизнеспособными в обычной почвенной культуре аллелями, проявление которых визуально легко обнаруживается на разных этапах онтогенеза растения. В диссертации приведено экспериментальное и теоретическое обобщение возможности создания гомозиготных полимутантных линий, маркированных различными рецессивными генами по всем группам сцепления Arabidopsis thaliana. Доказана реальность получения полимутантных линий, маркированных высокожизнеспособными аллелями при стандартных условиях культивирования, проявление которых легко визуально обнаруживается на разных этапах онтогенеза растения. Полимутантные линии арабидопсиса облегчают работу по сохранению коллекций мутантных аллелей в сравнении с многочисленными мономутантными линиями. Созданные линии обеспечивают значительное ускорение и облегчение проведения генетического анализа арабидопсиса по различным фенотипическим признакам, позволяют локализовать некартированные мутации, расширяют возможности функциональной геномики вида, поскольку способствуют существенному увеличению комбинационной изменчивости арабидопсиса.

С использованием 10 рецессивных генов (ap1-1; bp-1; ch1-1; ch5-1; clv1-1; cp2-1; dis2-1; gl1-1; min-1; tfl1-2) получено 20 новых тримутантных гомозиготных рецессивных линий Arabidopsis thaliana, маркированных высокожизнеспособными аллелями, проявление которых легко визуально определяется на различных этапах онтогенеза растений. Новые тримутантные гомозиготные линии арабидопсиса обеспечивают проведение генетического анализа с помощью одного-трех фенотипических маркеров по группам сцепления. В процессе эксперимента установлено, что семь созданных тримутантных линий, которые в гомозиготном состоянии несут аллели ch1-1 и ch5-1, имеют жизнеспособность на уровне линии Landsberg erecta. Проведена схема скрещивания полученных нами тримутантных линий, по которой после отбора нужных фенотипов в F2 созданы три новых гомозиготных линии по четырем разным рецессивным генам (bp-1,ch5-1,er-1gl1-1; bp-1,clv1-1,er-1,gl1-1 и ch5-1,clv1-1,er-1,gl1-1). Путем ступенчатой гибридизации и отбора создана новая полимутантная линия, маркированная одной рецессивной мутантной аллелью по каждой из пяти хромосом гаплоидного набора (bp-1,ch5-1,clv1-1,er-1,gl1-1). Указанная линия является тест-линией при определении группы сцепления у арабидопсиса. Установлено, что созданная нами линия bp-1bp-1ch5-1ch5-1clv1-1clv1-1er-1er-1gl1-1gl1-1 эффективна для определения групп сцепления мутантных генов Arabidopsis thaliana, в частности по форме листовой пластинки. Впервые установлено, что ген as (асимметричные листья) находится в хромосоме 1, сайт 98.7 сМ, ген an (узкие листья) локализован в хромосоме 5, сайт 42 сМ, тесно сцепленный с сайтом гена ch5. Выяснена эф...