Функціональний стан тканин та зміни вмісту іонів натрію за умов патологічної гіпоксії та канцерогенезу

Размещено на http://www.allbest.ru

Київський національний університет імені Тараса Шевченка

БАБСЬКИЙ Андрій Мирославович

УДК 577.352.4:612.014.1

ФУНКЦІОНАЛЬНИЙ СТАН ТКАНИН ТА ЗМІНИ ВМІСТУ ІОНІВ НАТРІЮ ЗА УМОВ ПАТОЛОГІЧНОЇ ГІПОКСІЇ ТА КАНЦЕРОГЕНЕЗУ

03.00.02 - біофізика

Автореферат дисертації

на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

Київ - 2009

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у Львівському національному університеті імені Івана Франка Міністерства освіти і науки України, Пенсильванському університеті (м. Філадельфія, США) та Індіанському університеті (м. Індіанаполіс, США).

Науковий консультант: доктор біологічних наук, професор

Клевець Мирон Юрійович,

Львівський національний університет імені Івана Франка, завідувач кафедри фізіології людини і тварин

Офіційні опоненти:

академік НАН України, доктор біологічних наук, професор

Костерін Сергій Олексійович,

Інститут біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України, заступник директора з наукової роботи та завідувач відділу біохімії м'язів

доктор біологічних наук, професор

Воробець Зіновій Дмитрович

Львівський національний медичний університет імені Данила Галицького, завідувач кафедри медичної біології, паразитології та генетики

доктор біологічних наук, професор

Шуба Ярослав Михайлович

Інститут фізіології ім. О. О. Богомольця Національної академії наук України, провідний науковий співробітник

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Київського національного університету імені Тараса Шевченка (Київ, вул. Володимирська, 58).

Вчений секретар спеціалізованої ради О.В. Цимбалюк

ВСТУП

Актуальність теми. Пошук чутливих показників, які б відображали одночасно структурно-фізіологічний статус тканини і метаболічні зміни усередині клітини, є одним із найбільш актуальних питань сучасної біофізики, фізіології та біохімії. Одним із таких показників можуть бути іони Na⁺, градієнт яких через мембрану є інтегральним показником життєздатності клітини. Більшість живих клітин підтримують низьку внутрішньоклітинну концентрацію Na⁺ ([Na⁺]_в) (5-15 мМ) проти високого значення у міжклітинному просторі ([Na⁺]_з) (~145 мМ). Трансмембранний градієнт іонів Na⁺ підтримується роботою Na⁺/К⁺-АТФази, яка транспортує назовні клітини 3 іони Na⁺ в обмін на 2 іони К⁺ при гідролізі однієї молекули АТФ. За багатьох патологічних відхилень, що супроводжуються розвитком тканинної гіпоксії, таких як ішемія міокарду, діабетична кардіоміопатія чи ріст ракових пухлин, відмічено зростання [Na⁺]_в (Imahashi et al., 2001; Ramasamy, Schafer, 1999; Winter et al., 2001). Серед причин, які причетні до цього ефекту, найголовнішими є енергодефіцит із наступним зниженням активності Na⁺/К⁺-АТФази, а також клітинна ацидифікація, яка стимулює роботу Na⁺/Н⁺-обмінника у плазматичній мембрані, а відтак і закачування іонів Na⁺ в клітину. Іони Na⁺ залучені також в інші транспортувальні механізми, що регулюють внутрішньоклітинне рН (рН_в), зокрема у роботу НСО₃^-/Cl^--обмінника та натрій-L-лактат-симпортера. Сьогодні відсутня комплексна оцінка ролі трансмембранного градієнта Na⁺ та Na⁺-транспортувальних систем, їх зв'язку із іншими транспортувальними системами та енергетичним обміном за патологічних умов різної етіології. Тому актуальною є розробка неінвазивних методів реєстрації рівня іонів Na⁺ за таких поширених патологій як діабетична кардіоміопатія, ішемія міокарду, канцерогенез. іон міокард канцерогенез хіміотерапія

Об?єкт досліджень - обмін натрію у кардіоміоцитах та ракових клітинах.

Предмет досліджень - механізми участі іонів Na⁺ при патологічних відхиленнях за умов ішемії міокарду, діабетичної кардіоміопатії та ракових пухлин, а також при лікуванні раку.

Методи досліджень - ядерно-магнітний резонанс, біофізичні, фізіологічні, біохімічні, гістологічні, статистичні.

Мета роботи. Вивчення механізмів участі іонів Na⁺ при патологічних відхиленнях за умов ішемії міокарду, діабетичної кардіоміопатії та канцерогенезу, а також обгрунтування використання рівня іонів Na⁺ для оцінки ефективності гіпертермії та хіміотерапії експериментальних ракових пухлин.

Завдання дослідження.

1. Розробити методику підтримання життєдіяльності ізольованих кардіоміоцитів, ракових клітин і мітохондрій (МХ) за умов їх суперфузії у тривалому кількагодинному експерименті ЯМР.

2. Вивчити вклад гліколізу, окисного фосфорилювання та Na⁺/К⁺-АТФази у підтримку Na⁺-градієнту у кардіоміоцитах контрольних та діабетичних тварин.

3. Дослідити механізми впливу іонів Na⁺ на біоенергетичні параметри у здоровому серці та при діабетичній кардіоміопатії.

4. З'ясувати роль іонів Na⁺ у позитивному ефекті коротких гіпоксійних тренувань на післяішемійне відновлення рН_в та скорочувальної активності серця.

5. Вивчити вплив високих температур на Na⁺_в, клітинний ацидоз та біоенергетику ізольованих суперфузованих ракових клітин радіаційно-індукованої фібросаркоми (RIF-1).

6. Розробити методи реєстрації за допомогою методу ЯМР змін іонів Na⁺ та дифузії води у хронічному експерименті in vivo для ранньої діагностики ефективності лікування ракових пухлин фібросаркоми RIF-1, гліоми 9L та гепатоклітинної карциноми (ГКК).

7. Вивчити зв'язок між змінами параметрів дифузії води, Na⁺_в, загального тканинного Na⁺ (Na⁺_т), біонергетичним статусом та структурними змінами у ракових пухлинах за умов їх росту та при хіміотерапії.

Наукова новизна одержаних результатів. Проведено аналіз енергетичних джерел підтримки мембранного градієнту Na⁺ у кардіоміоцитах здорових і діабетичних щурів. Показано, що порушення гліколізу та функцій Na⁺/К⁺-АТФази у кардіоміоцитах за умов діабету були пов'язані із підвищенням рівня Na⁺_в.

Особистий внесок здобувача. Автор самостійно сформулював мету та завдання дослідження та розробив необхідні модифікації експериментальних досліджень. Дисертант самостійно виконував основну частину експериментів, аналізував та статистично опрацьовував результати, готував публікації до друку. Експерименти ЯМР проведені за участю співавторів публікацій із Пенсильванського та Індіанського університетів (США).

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень, викладених у дисертації, оприлюднено на: конференціях Міжнародного товариства «Магнітний резонанс у медицині» (Ванкувер, 1997; Філадельфія, 1999; Денвер, 2000; Глазго, 2001; Кіото, 2004; Гонолулу, 2002, 2009; Маямі, 2005; Сієтл, 2006; Берлін, 2007; Торонто, 2008), Конференції Товариства радіологів Північної Америки (Чікаго, 2008), Конференції «Біофізичні механізми функціонування живих систем» (Львів, 2008); Конференції Світового товариства внутрішньої онкології (Лос Анжелес, 2008), Конференції «Механізми функціонування фізіологічних систем» (Львів, 2006), Конференції «Клітинні та субклітинні механізми травлення» (Львів, 2004), 3^му з'їзді Українського біофізичного товариства (Львів, 2002), 49^ій конференції Північно-американського гіпертермійного товариства (Ріно, 2002), Конференції Академії молекулярних зображень (Сан Дієго, 2002), Конференціях Американського біофізичного товариства (Канзас Сіті, 1998; Балтімор, 1999; Новий Орлеан, 2000; Бостон, 2001), 49^ій конференції Американського кардіологічного коледжу (Анагайм, 2000), Конференціях Товариства експериментальної біології (Вашінгтон, 1996; Новий Орлеан, 1997; Сан Франциско, 1998; Сан Дієго, 2000); Конференції Асоціації академічної хірургії (Філадельфія, 1999), Конференціях Американської кардіологічної асоціації (Далас, 1998; Атланта, 1999), 65^ій міжнародній конференції Американського коледжу грудної хірургії (Чікаго, 1999), 3^ій міжнародній конференції „Медична гіпоксія” (Москва, 1998), 6^му з'їзді Українського біохімічного товариства (Київ, 1992).

Публікації. Основні положення дисертаційної роботи висвітлені у 24 статті, які опубліковані у фахових виданнях, та у 36 тезах доповідей у матеріалах наукових конференцій.

Структура і обсяг роботи. Дисертаційну роботу викладено на 240 сторінках друкованого тексту. Вона складається з таких розділів: „Вступ”, „Огляд літератури”, „Методи досліджень”, „Результати дослідження та їх обговорення”, „Висновки” та „Список використаних джерел”, який містить 319 посилань. Роботу ілюстровано 57 рисунками та 11 таблицями.

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

Модель діабету. Клітини підшлункової залози руйнували стрептозотоцином, цитратний розчин якого вводили щурам Sprague-Dawley внутрішньоочеревинно (в/ч) у концентрації 65 мг/кг маси (Friedman et al., 1985). Концентрацію глюкози вимірювали у пробі крові із хвостової вени за допомогою апарату Accu-Chek bG (Bio-Dynamics, Boehringer, Germany). Через 4 тижні після введення стрептозотоцину концентрація глюкози в крові зростала із 7,12 мМ до 38,0 мМ.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕННЯ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

1. Метаболічний контроль транспорту Na⁺ у кардіоміоцитах діабетичних тварин

Біоенергетичний контроль транспорту Na⁺ за умов гіпоксії усе ще залишається незрозумілим. Особливо це стосується взаємовідносин між окисним фосфорилюванням, гліколізом, Na⁺/К⁺-АТФазою та Na⁺-транспортувальними системами у нормі і при патологіях. Відомо, що діабетична кардіоміопатія супроводжується пошкодженням коронарних судин, що призводить до серцевої ішемії та функціональної гіпоксії (Dhalla et al., 1998). У роботі було проведено порівняльну оцінку ролі біоенергетичних процесів у забезпеченні транспорту Na⁺ у кардіоміоцитах діабетичних і контрольних тварин.

Ізольовані кардіоміоцити поміщали в агарозні кульки і при суперфузії середовищем №199 досліджували методами спектроскопії ²³Na- і ³¹Р-ЯМР (Doliba et al., 2001). Вихідний рівень внутрішньоклітинного Na⁺ був вищим у діабетичних тварин (0,08 0,01 мкмоль/мг білка), ніж у контрольних (0,04 0,01 мкмоль/мг білка, Р 0,05). Натомість біоенергетичні показники діабетичних клітин (вАТФ і фосфокреатин (КРФ)) були нижчими за контрольні на ~30% (Р 0,03). Ці зміни можуть слугувати однією із причин інгібування роботи Na⁺/K⁺-АТФази і, відповідно, збільшення [Na⁺]_в. Для вивчення ролі енергетичного дефіциту і зміни роботи Na⁺/K⁺-АТФази у підвищенні [Na⁺]_в були використані інгібітори гліколізу (2-деоксиглюкоза, 2-ДОГ), окисного фосфорилювання (динітрофенол, ДНФ) та Na⁺/K⁺-АТФази (оуабаїн, ОУА). Суперфузія кардіоміоцитів і контрольних, і діабетичних тварин із цими інгібіторами призводила до підвищення рівня [Na⁺]_в (рис. 1). Однак, за умов діабету вплив 2-ДОГ та ДНФ на [Na⁺]_в був мінімальним, що свідчить про вихідний низький рівень гліколітичної та Na⁺/K⁺-АТФазної активності (табл. 1). У той самий час у кардіоміоцитах контрольних тварин обидва інгібітори вірогідно знижували рівень [Na⁺]_в. Цей показник, наприклад, на 60 хв перфузії клітин із 2-ДОГ збільшувався у контрольних клітинах на 33 8 % (Р 0,05), а у клітинах діабетичних тварин навіть дещо зменшувався. ОУА у свою чергу викликав збільшення [Na⁺]_в у кардіоміоцитах контрольних тварин на 51 9 %, а у діабетичних - лише на 21 9 % (р 0,05). Найбільш виражено [Na⁺]_в зростав за впливу ДНФ (на 120 - 140 %), але без суттєвої різниці між двома експериментальними групами.

2. Вплив Na⁺ на дихання та окисне фосфорилювання у серці діабетичних тварин

Як було наведено вище, концентрація [Na⁺]_в у кардіоміоцитах діабетичних тварин удвічі перевищує контрольні показники. Ми припустили, що зростання [Na⁺]_в активує Na⁺/Ca²⁺-обмінник у мітохондріальній мембрані і призводить до зниження концентрації Са²⁺ у МХ, а відтак і до гальмування Са²⁺-залежних біоенергетичних процесів. Для перевірки цієї гіпотези дихання та синтез АТФ вивчали полярографічним методом та методом спектроскопії ³¹Р-ЯМР. Додавання іонів Na⁺ (3 - 10 мМ) у полярографічну комірку зменшувало швидкість дихання стимульованого АДФ та швидкість окисного фосфорилювання і у контрольних, і у діабетичних МХ.

Однак у МХ діабетичних тварин це зниження було вірогідно нижчим. Цей ефект іонів Na⁺ знімався додаванням у полярографічну комірку іонів Са²⁺. При цьому у МХ контрольних тварин для нівелювання ефекту Na⁺ достатньо було і 0,035 мкМ Са²⁺, в той час як у МХ діабетичних тварин ефект блокувався лише дозою Са²⁺ майже утричі більшою (0,114 мкМ) (рис. 3). Іншим доказом того, що ефект Na⁺ у МХ пов'язаний із Na⁺/Са²⁺-обмінником, було блокування інгібуючого дихання ефекту іонів Na⁺ специфічним інгібітором цього обмінника дилтіаземом (250 мкМ). З іншого боку, інгібітор поглинання Са²⁺ у МХ рутенієвий червоний (1 мкМ) тільки підсилював інгібуючий ефект Na⁺ у МХ обох експериментальних груп (статистично вірогідно лише у діабетичних тварин). Порушення процесів синтезу АТФ іонами Na⁺ було підтверджено даними експериментів ³¹Р-ЯМР. Вони показали, що суперфузія ізольованих МХ серця із 5, 10 чи 30 мМ Na⁺ зменшувала співвідношення вАТФ/Ф_н у діабетичних МХ у два і більше разів, в той час як у контрольних МХ це зниження складало менше 30%. Дилтіазем (250 мМ) і в експериментах ЯМР повністю знімав ефект Na⁺ в обох експериментальних групах.

Ці дані підтвердили нашу гіпотезу, що у кардіоміоцитах діабетичних тварин підвищений рівень цитоплазматичного Na⁺ призводить до порушення окисних процесів та синтезу АТФ і ці зміни пов'язані із стимульованим іонами Na⁺ зменшенням концентрації Са²⁺ у МХ.

3. Вплив короткотривалих гіпоксійних сеансів на рівень Na⁺ та внутрішньоклітинне рН в ізольованому перфузованому серці щура

На відміну від патологічної функціональної гіпоксії короткі гіпоксійні сеанси (КГС) перед тривалою ішемією міокарду позитивно впливають на післяішемійне відновлення серця і знижують розміри некротичних зон (Schulz et al., 2001). При цьому критичним моментом відновлення функцій серця є нормалізація внутрішньоклітинних концентрацій Н⁺ та Са²⁺. Іони Na⁺ залучені у ці процеси через Na⁺/Н⁺, Na⁺/Са²⁺, Na⁺-К⁺-2Сl^- та Cl^-/НСО₃ іонні транспортувальні механізми. Окрім того, як показано вище, Na⁺ є важливим регулятором біоенергетичних процесів у кардіоміоцитах. Поки що не існує одностайної думки про величину, час та механізми змін рівня Na⁺_в протягом КГС, тривалої ішемії та післяішемійної реперфузії (Tosaki et al., 1996; Tani et al., 1999; Imahashi et al., 2001).

Три 5-ти хвилинні зупинки перфузії серця (із почерговими відновленнями перфузії тривалістю 5 хв, 5 хв і 10 хв) перед тривалою ішемією (20-ти хвилинна зупинка перфузії) призводили до швидшого і повнішого відновлення внутрішньосерцевого тиску та частоти скорочень серця. Після ішемії рН_в було вірогідно (Р 0,05) нижчим у контрольній групі (6,40 0,2) у порівнянні до КГС-групи (6,67 0,1). Наприкінці КГС у клітинах серця рівень Na⁺_в зростав в обох група на 30-35%, а після ішемії до 50-70% без суттєвої відмінності між групами. Зате відновлення рівня Na⁺_в було швидшим у КГС-серцях, ніж у контрольних. Так, вже на третій хвилині реперфузії Na⁺_в у КГС-групі знижувався на 31,0%, а у контролі - лише на 3,8%.

Ми припустили, що ці зміни є результатом активації Na⁺/Н⁺-обмінника протягом КГС. Активність цього обмінника оцінювали за співвідношенням змін Na⁺_в та рН_в (ДNa⁺_в / ДрН), яке практично не змінювалось у контрольних серцях і суттєво зростало після ішемії у КГС-серцях, залишаючись дещо підвищеним і протягом реперфузії. Це, очевидно, обумовлено, у першу чергу, активним входом Na⁺ у клітини і відносно незначними змінами рН_в у КГС-серцях. Традиційний погляд на зростання Na⁺_в у серці передбачає активацію Na⁺/Са²⁺-обмінника і, як наслідок, надмірне нагромадження Са²⁺ у міокарді (Murphy et al., 1999). Проте, Tosaki et al. (1996) показали зниження нагромадження Са²⁺ клітинами у КГС-серцях, можливо, за рахунок „реверсу” роботи Na⁺/Ca²⁺-обмінника, коли іони Са²⁺ викачуються із клітини в обмін на Na⁺ (Kohomoto et al., 1989). Підсумовуючи, можна сказати, що стимульовані КГС іонні транспортувальні процеси, в які залучені іони Na⁺, можуть запобігти надмірному закисленню кардіоміоцитів протягом ішемії і сприяти кращому відновленню механічних функцій міокарду після ішемії.

4. Зростання Na⁺_в за впливу високих температур у суперфузованих ракових клітинах лінії RIF-1

Класичним прикладом патологічної гіпоксійної тканини є ракова пухлина. Відомо, що злоякісні новоутворення характеризуються невнормованою кровоносною системою, яка не встигає розвинутись у тканині, що швидко росте (Choyke et al., 2006). Це призводить до 1) суттєвого сповільнення постачання кисню, 2) зростання питомого вкладу гліколізу у біоенергетичні процеси у порівнянні із окисним фософрилюванням та 3) метаболічної закисленості клітин. Одним із способів лікування раку є гіпертермія. Зазвичай вважається, що підвищення температури до 42 - 45 ^оС розширює судини, покращуючи транспорт кисню в пухлині (Falk, Issels, 2001). Це сприяє не тільки кращому постачанню антитіл до пухлин, а й утворенню вільних радикалів і полегшенню транспортування препаратів, що підвищує ефективність радіо- та хіміотерапії, відповідно. Вважається, що трансмембранний градієнт служить важливою мішенню при гіпертермії (Mikkelsen, Asher, 1990). Ми припустили, що у цьому випадку висока температура може опосередковувати свій вплив на трансмембраниий потенціал через Na⁺-транспортувальні системи.

Для перевірки цієї гіпотези ефект гіпертермії на рівень Na⁺_в, біоенергетичний статус та рН_в досліджували у суперфузованих ізольованих ракових клітинах RIF-1 за допомогою спектроскопії ²³Na- та ³¹Р-ЯМР. 30-ти хвилинне перебування клітин при 45 ^оС викликало 50%-не зростання рівня Na⁺_в (рис. 6), зменшення на 0,42 одиниці значення рН_в (рис. 7 Б) і 40 - 45 % зменшення співвідношення АТФ/Ф_н (рис. 7 В). Протягом післягіпертермійної суперфузії клітин при 37 ^оС значення рН_в та АТФ/Ф_н повертались до норми (рис. 8). При цьому Na⁺_в спочатку знижувався, а згодом знову зростав до гіпертермійного рівня через 60 хв після закінчення нагрівання. Нагрівання клітин до 42 ^оС викликало лише 15-20%-не зростання Na⁺_в, який згодом повертався до норми протягом відновлення суперфузії при 37 ^оС. За присутності 3 мкМ ЕІПА - інгібітора Na⁺/H⁺-обмінника плазматичної мембрани - стимулюючий рівень Na⁺_в ефект температури зникав. Однак ЕІПА не запобігав закисленню внутрішньоклітинного середовища. Причиною цього може бути те, що рН_в регулюється також іншими іонними переносниками, такими як НСО₃^-/Сl^--обмінник (Lyons et al, 1993) чи симпортер монокарбоксильних кислот (Barbarat, Podevin , 1988). Викликане гіпертермією незворотнє зростання Na⁺_в свідчить про пошкодження ракових клітин за умов гіпертермії.

5. Вплив циклофосфаміду на рівень тканинного Na⁺ у пухлині RIF-1

Експерименти на ізольованих ракових клітинах за умов суперфузії in vitro були зручною моделлю для вивчення механізмів реакції внутрішньоклітинного метаболізму за дії протипухлинної терапії. Проте за умов in vivo ефективність терапії багато у чому залежить від фізіологічних процесів у пухлині, зокрема від швидкості постачання кисню до клітин. Тому можливість використання сигналу ²³Na-ЯМР як показника ефективності хіміотерапії була протестована на експериментальних пухлинах привитих мишам чи щурам підшкірно. Це дало змогу контролювати ріст пухлини та отримати їх якісні зображення ¹Н- та ²³Na-ЯМР за умов хронічного експерименту. Ефект відомого протипухлинного препарату ЦФ на підшкірно імплантовану мишам лінії С3Н пухлину RIF-1 вивчали in vivo за допомогою ¹Н- та ОК-²³Na-ЯМР методів. Разове введення ЦФ вірогідно (Р 0,05) знижувало об'єм пухлин вже через 2-3 дні в усіх пухлинах дослідної групи. При цьому загальний рівень Na⁺ у тканині після лікування був вірогідно вищим у порівнянні із контролем. Це добре видно на прикладі зображень ЯМР типових зразків двох пухлин з кожної експериментальної групи. Бачимо, що інтенсивність (яскравість) сигналу ²³Na зростала після ін'єкції ЦФ. Додаткові дослідження з використанням поверхневого кільцевого резонатора показали, що час релаксації сигналу ²³Na (Т₁) та відносний внесок повільної та швидкої компоненти релаксації (Т_s і Т_f) вірогідно не відрізнялись (Р > 0,1) у контрольних і дослідних пухлинах. Це свідчить, що зареєстровані зміни сигналу ²³Na були обумовлені змінами концентрації Na⁺.

Цікаво, що після введення ЦФ через 2 і 3 дні зростав і КДВ на 18 % (2-й день) та 49% (3-й день) у порівнянні із рівнем до лікування. Зміни ²³Na і КДВ корелювали із високим ступенем вірогідності (R² = 0,97). Порівняння зображень ²³Na- та ¹Н-ЯМР із гістологічними зрізами пухлин показало, що ділянки із високим рівнем тканинного Na⁺_т та інтенсивної дифузії води часто співпадають із ділянками некротичної тканини, для яких є характерною менша кількість клітин та їх щільність. Диструктивний хімічний аналіз підтвердив, що величина ЗКС у пухлинах оброблених ЦФ була вірогідно вищою (Р 0,05) за пухлини контрольних тварин. Цим методом також було підтверджено зростання [Na⁺]_т після ефективної хіміотерапії до 58 10 мМ у порівнянні до контролю (45 7 мМ). Збільшення ЗКС, правдоподібно, є причиною паралельного зростання і Na⁺_т, і дифузії води. Відомо, що концентрація [Na⁺]_з є у 15-20 разів вищою, ніж усередині клітини. З іншого боку, прийнято вважати, що рухливість молекул води поза клітиною, зазвичай, є вищою, ніж у гелеподібному внутрішньоклітинному середовищі.

6. Вплив хіміотерапії на рівень тканинного Na⁺ і дифузію води у підшкірній гліомі 9L

Рос та ін. (2002, 2005) на підставі дослідів із гліомою 9L у мозку щурів висловили припущення, що зростання [Na⁺]_т та дифузії води у раковій пухлині є загальним феноменом при ефективній хіміотерапії. Для перевірки цієї гіпотези ми дослідили ефект залужнюючого протипухлинного препарату БХНС (кармустин) на Na⁺_т та КДВ у підшкірно-імплантованій гліомі 9L щурів. Вимірювання зображень ²³Na-ЯМР та КДВ провадили на контрольних щурах лінії Fisher та щурах тієї ж лінії після разової ін'єкції БХНС (25 мг/кг, в/ч) один день до ін'єкції і на 1-й, 3-й і 5-й день після неї.

Відповідно до того чи ріст пухлин після ін'єкції БХНС зупинявся чи продовжувався вони були розділені на чутливі і резистентні до препарату групи. Контрольні та резистентні до лікування пухлини за 6 днів спостережень збільшувались удвічі. Як видно, ріст чутливих до БХНС пухлин зупинявся. До лікування значення [Na⁺]_т та КДВ були вищими у чутливих до БХНС пухлинах у порівнянні із контрольними і резистентними (рис. 8 Б і В). Наведено зразки змін КДВ та інтенсивності сигналу ²³Na-ЯМР трьох пухлин з кожної із трьох експериментальних груп пухлин 9L (контрольні, резистентні та чутливі). Як видно, рівень Na⁺_т та дифузія води суттєво зростали у контрольних та резистентних пухлинах, що видно за збільшенням інтенсивності (яскравості) сигналу, та залишались незмінними чи навіть трохи зменшувались у чутливих до БХНС пухлинах. Статистична обробка даних підтвердила це спостереження і засвідчила високий ступінь кореляції за збільшення рівнів Na⁺_т та КДВ (R² = 0,95).

Отже, на відміну від результатів отриманих при лікуванні пухлин RIF-1 із ЦФ (представлені у попередньому розділі), коли Na⁺_т та КДВ зростали при ефективній хіміотерапії, блокування росту гліоми 9L після введення БХНС характеризувалось нижчим рівнем Na⁺_т та КДВ у порівнянні із інтенсивно зростаючим рівнем цих показників у контрольних та резистентних пухлинах. Наші дані отримані на пухлинах 9L добре узгоджуються із результатами Winter et al. (2001), які продемонстрували, використовуючи метод спектроскопії ЯМР, відносно нижчий рівень Na⁺_т після ефективного лікування гліоми. Автори пояснили цей факт відомими із попередніх експериментів даними про покращення постачання кисню, а відтак і покращення біоенергетичних показників та зростання рН_в у пухлинах після хіміотерапії (Steen, 1989; Winter et al., 2001). Зростання рівня АТФ повинно додатково підтримати функціонування основного регулятора градієнту натрію Na⁺/К⁺-АТФази і полегшити підтримку низької концентрації Na⁺ у клітині. Необхідно зазначити, що Schepkin et al. (2005), досліджуючи експериментальну гліому 9L розташовану безпосередньо у мозку щура, отримали протилежні до наших результати. Вони продемонстрували зростання [Na⁺]_т та КДВ після ефективної терапії із БХНС і зробили припущення, що це є загальним типовим ефектом при хіміотерапії пухлин. Однак, наші результати на підшкірній гліомі не підтверджують цю гіпотезу. Додатковим сумнівом щодо загального характеру повсякчасного паралельного зростання і Na⁺_т, і КДВ слугує порівняння гістологічних зрізів п/шк гліоми 9L із зображеннями ²³Na- та ¹Н-ЯМР. Ділянки зображень ЯМР з інтенсивними сигналами ²³Na та ¹Н не завжди корелювали між собою, а також із некротичними зонами із зменшеною кількістю клітин. Таким чином, розташування пухлини (наприклад, підшкірне і ортотопне), а також її тип можуть суттєво змінювати ефективність лікування навіть тих самих ракових клітин, що є важливим при виборі стратегії боротьби із метастазами раку.

7. Зміни внутрішньоклітинного Na⁺ при ефективному лікуванні пухлин RIF-1 5-фторурацилом

Треба зазначити, що до наших досліджень роль Na⁺_в, як індикатора росту пухлин та ефективності їх лікування, практично не досліджували. Як було показано вище, зміни Na⁺_т відображають переважно структурні зміни у пухлині. Зміни Na⁺_в пов'язані з метаболічними змінами у клітині і тому ми припустили, що цей показник може бути навіть чутливішим, ніж Na⁺_т, показником для оцінки ефективності хіміотерапії.

Ефект 5ФУ на підшкірно імплантовану мишам лінії С3Н пухлину RIF-1 вивчали in vivo за допомогою ¹Н-, ОК-²³Na та ТКФ-²³Na-ЯМР, а також методу ПЕТ. Зображення ¹Н- та ²³Na-ЯМР реєстрували у контрольних та лікованих із 5ФУ мишах один раз до ін'єкції препарату (150 мг/кг, в/ч), а згодом на 1-й, 2-й і 3-й день після ін'єкції. Об'єм пухлин вірогідно зменшувався у лікованих тварин на 2-й і 3-й день після лікування (рис. 8 А). У ці дні зростав рівень загального тканинного Na⁺_т та КДВ. Натомість обидва показники залишались практично незмінними у контрольних пухлинах. З іншого боку, Na⁺_в, який оцінювали за інтенсивністю ТКФ-²³Na-зображень, зростав у контрольних пухлинах, але не змінювався у дослідних на третій день після терапії (рис. 12). Подібно до Na⁺_в, поглинання ФДГ, що реєстрували за допомогою ПЕТ, було вірогідно нижчим у цей день у лікованих пухлинах у порівнянні із контрольними.

Паралельне зростання рівня Na⁺_т та дифузії води у пухлині, очевидно, як і у випадку із лікуванням пухлин із ЦФ, відображає збільшення зовнішньоклітинного простору внаслідок відмирання ракових клітин після ефективної хіміотерапії. Нижчий рівень Na⁺_в у порівнянні із контрольними пухлинами може бути результатом зсуву енергетичного обміну від гліколізу до окисного фосфорилювання. На це також вказують наші експерименти з використанням ПЕТ, коли поглинання ФДГ зменшувалося після терапії із 5ФУ, підтверджуючи дані інших авторів про те, що хіміотерапія із цим препаратом супроводжується покращенням біоенергетичних показників ракових клітин в результаті підвищення постачання кисню та ефективнішого використання глюкози (Sijens et al., 1991; Li et al., 1991). Проте не можна виключити, що зменшення інтенсивності сигналу ЯМР від Na⁺_в може бути пов'язане також із зменшенням кількості клітин у пухлині після лікування, як це показав аналіз гістологічних зрізів.

8. Використання спектроскопії ²³Na-ЯМР для одночасного моніторингу дифузії води у внутрішньо- та зовнішньоклітинному просторі на прикладі м'язової аноксії

На сьогоднішній день відсутні методи одночасної реєстрації дифузії води у внутрішньо- та зовнішньоклітинному просторі. Швидка дифузія води через плазматичну мембрану не дозволяє використовувати ¹Н-ЯМР для цієї мети. Запропоновані дотепер методи реєстрації КДВ (Duong et al, 1998, 2001; Sehy et al, 2002) за допомогою маркерів обох клітинних компартментів дозволяють реєструвати КДВ лише за послідовного, а не одночасного моніторингу. Ми запропонували для одночасного вимірювання КДВ метод спектроскопії ²³Na-ЯМР, який, як вказували вище, дозволяє виокремити сигнали ²³Na-ЯМР із внутрішньо- та зовнішньоклітинного простору з використанням реагентів зсуву. Іони Na⁺ завжди присутні у біологічних рідинах і їх рух фактично відображає рух води у живій тканині. У цих дослідах використовували реагент зсуву TmДОТФ^5-, який вводили в організм щура через підщелепну вену. Через 30 хв пік Na⁺_з-ЯМР у скелетних м'язах був зсунутий на 4 одиниці ррm відносно піку Na⁺_в-ЯМР. Це дозволило визначити коефіцієнт дифузії поза і усередині клітини. На відміну від КДВ ракових тканин дифузійні коефіцієнти у скелетних мязах виміряні за допомогою ²³Na-ЯМР у зовнішньо- та внутрішньоклітинному середовищах за умов нормоксії виявились приблизно одинаковими. Глибока мортальна гіпоксія (аноксія), яку ініціювали введенням повітря у підщелепну вену, призводила до вірогідного зниження дифузійних процесів у міжклітинному середовищі на 20-25% протягом 120-240 хв, залишаючи практично незмінними дифузійний коефіцієнти Na⁺_в та води. Зміни КДВ у міжклітинному просторі (оцінені за Na⁺_з) залежать від багатьох біофізичних та фізіологічних показників (Duong et al., 1998), однак у нашому випадку найбільш доцільним поясненням його зниження є типове для ішемії набухання клітин і зменшення зовнішньоклітинного простору, а також його звивистості (tortuosity). Відносна стабільність КДВ усередини клітини може бути пояснена збалансованістю процесів, які можуть як збільшувати цей показник, так і знижувати його при ішемії, як от нагромадження клітиною води при набуханні і зменшення енергозалежного транспорту макромолекул, відповідно.

Окрім того, безпосереднє вимірювання рівня Na⁺ у цих тканинних компартментах підтвердило можливість використання ²³Na-ЯМР як інтегрального показника метаболічних процесів у клітині. Так рівень Na⁺_в зростав після ініціювання аноксії у 2,5 рази, відображаючи, у першу чергу, зменшення активності Na⁺/К⁺-АТФази в результаті припиненняя доступу кисню, а також активації Na⁺/Н⁺-обмінника в ацидифікованій аноксійній тканині м'язів. З іншого боку, Na⁺_з зменшувався на 25%, відображаючи зменшення трансмембранного градієнту Na⁺ за рахунок, в основному, входження іонів у клітину. Отже, моніторинг інтенсивності сигналу ²³Na-ЯМР дозволяє оцінити одночасно і дифузійні процеси усередині клітини та поза нею, і зміни трансмембранного іонного градієнту, які відображають біоенергетичні та іонні зміни при обмеженні доступу кисню до клітини.

9. Дифузія води та рівень Na⁺ в ортотопній та підшкірній гепатоклітинній карциномі

Попередні дослідження ракових пухлин провадили переважно на п/шк моделях зручних для отримання зображень ЯМР і контролю змін об'єму пухлин. Однак ракові клітини розташовані під шкірою і ортотропно можуть виявляти різні властивості через відмінності у кровоносній системі пухлин, температурі чи спонтанних некротичних перетвореннях. Ці відмінності можуть суттєво змінювати дифузію води та рівень іонів Na⁺. Для перевірки цієї гіпотези вибрали експериментальну модель ГКК привитої у лівій частці печінки та підшкірно на задній лапці щура. Іншою метою цього розділу роботи було показати переваги використання ²³Na-ЯМР перед КДВ за моніторингу змін пухлин в органах очеревини, що постійно рухаються в результаті дихання і серцебиття.

На 7-й день після ін'єкції ракових клітин N1S1 на деяких зображеннях Т₂-¹Н-ЯМР у лівій частці печінки можна було спостерігати ГКК, яка відрізнялась від тканини печінки інтенсивіншим сигналом ¹Н-ЯМР. На цей час об'єм пухлини складав 0,13 ± 0,05 см³. Через 1, 2 і 3 тижні після цього він інтенсивно збільшувався до 1,23 ± 0,36 см³, 3,22 ± 0,83 см³, 6,19 ± 1,88 см³, відповідно. Час подвоєння об'єму пухлини у середньому складав 3,9 дні. Ріст п/шк ГКК був дещо повільніший у порівнянні до росту ортотопної пухлини. Зокрема час подвоєння об'єму п/шк ГГК складав 11,2 дні.

Вимірювання КДВ провадили на підставі зображень Т₂-¹Н-ЯМР за різних значень b-фактору. Зазвичай, моніторинг дифузії води у печінці суттєво утруднений постійним рухом органу, що може призводити до артефактів у визначенні КДВ. Щоб уникнути ці труднощі реєстрацію ¹Н-сигналу узгоджували із фазою дихання тварини. Однак, як бачимо із рис. 16, за високих значень b-фактору, коли відстань між двома дифузійними сигналами є найбільшою, спостерігали певну „розмитість” зображення (А, Б), що призводило до локальних артефактів на мапі КДВ у вигляді завищених КДВ, які доводилось уникати за обрахунку. Натомість КДВ у п/шк ГКК не піддавався впливу руху органу під час реєстрації. Це позитивно вплинуло на якість дифузійно-градієнтних зображень ¹Н навіть за високих значень b-факторів, а також на якість мап КДВ.

Розрахований на підставі зображень ¹Н-ЯМР КДВ пухлин ГКК на 7-й день після ін'єкції складав 1,4 Ч 10^-3 мм²/с і був вірогідно вищий (Р < 0,05) за КДВ у суміжній тканині печінки (1 Ч 10^-3 мм²/с) (рис. 17 А). Ці результати узгоджуються із величинами КДВ, які були показані в клінічних дослідженнях ГКК (Colagrande et al., 2006; Taouli et al., 2003; Kim et al., 1999) та печінки (Kim et al., 1999; Namimoto et al., 1997; Yamada et al., 1998). Ріст пухлини вірогідно не впливав на її КДВ, хоча величина коефіцієнту на 28-й день була дещо нижчою (1,05 Ч 10^-3 мм²/с) (Р < 0,12). КДВ у суміжній таканині печінки також залишався відносно стабільним хоча й дещо зменшувався на 28-й день - 0,65 Ч 10^-3 мм²/с (Р < 0,07). В усі досліджувані дні КДВ пухлини був вірогідно вищим за КДВ печінки. Різниця цих показників на 7-, 14-, 21- і 28-й дні після ін'єкції складала (у Ч 10^-3 мм²/с) 0,45, 0,50, 0,40 і 0,43, відповідно. В результаті, незважаючи на ріст ГКК, співвідношення КДВ пухлини до КДВ печінки також залишалось практично незмінними і коливалось у межах 1,5 - 1,6 (рис. 17 А). КДВ у п/шк ГКК був вірогідно нижчий (P < 0,01), ніж у ГКК локалізованій у печінці на 53%, 37% і 24% на 14-й, 21-й і 28-й дні, відповідно. На відміну від ортотопної ГКК КДВ у п/кш пухлині вірогідно збільшувався із (у Ч 10^-3 мм² / с) 0,63 ± 0,01 до 0,72 ± 0,04 (21-й день) і 0,79 ± 0,06 (28-й день, P < 0,05), відповідно. Цікаво, що при цьому він був майже удвічі менший у порівнянні із скелетнимим м'язами, КДВ яких не змінювався впродовж усіх експетиментів. У стандартному розчині 0,3% NaCl, який поміщали у пробірку і розташовували поруч із пухлиною, КДВ був стабільний - 2,3 ± 0,01Ч 10^-3 мм² /c.

На 7-й день після ін'єкції клітин у деяких тварин можна вже було спостерігати доволі виражений сигнал ОК- чи ТКФ-²³Na-ЯМР із ГКК, який був яскравіший за сигнал із суміжної тканини печінки. Наведено приклади ортотопної та п/шк ГКК, на яких виразно видно зростання сигналів ОК- чи ТКФ-²³Na-ЯМР із пухлини на 28-ий день після інокуляції клітин N1S1 у порівнянні із 14-им днем в обох місцях локалізації. Як бачимо, зростання сигналів ²³Na-ЯМР у п/шк ГКК корелювало із наведеним вище зростанням КДВ оскільки обидва параметри, як зазначали раніше, залежать від розмірів ЗКС. Наведено відносні зміни загальнотканинного Na⁺ у ГКК та суміжній тканині печінки, коли рівень співвідношення інтенсивності ОК-²³Na-сигналу у пухлині до ОК-²³Na-сигналу стандарту (Na⁺_т) на 7-й день після ін'єкції клітин був прийнятий за 100%. Вірогідне зростання Na⁺_т у пухлині на 150% спостерігали на 28-й день після ін'єкції клітин (Р < 0,05). Оскільки Na⁺_т у печінці суттєво не змінювався, це призводило до вірогідного (Р < 0,05) збільшення на 42% і 50% співвідношення Na⁺_т у пухлині до Na⁺_т у печінці на 21-й і 28-й день після ін'єкції, відповідно (рис. 19 А). На рис. 19 Б наведено відносні зміни внутрішньоклітинного Na⁺ у ГКК та суміжній тканині печінки, коли співвідношення інтенсивності сигналу ТКФ-²³Na-ЯМР у пухлині до сигналу ОК-²³Na-ЯМР стандарту (Na⁺_в) на 7-й день після ін'єкції було прийнято за 100%. На 21-й і 28-й день після ін'єкції Na⁺_в у пухлині зростав на 110% і 170%, відповідно (Р < 0,05). Як і у випадку із Na⁺_т, рівень Na⁺_в у печінці залишався практично незмінним, що призводило до вірогідного (Р < 0,05) зростання на 80% співвідношення Na⁺_в у пухлині до Na⁺_в у печінці на 21-й і 28-й день після ін'єкції (рис. 19 Б).

На рис. 19 В наведено відносні зміни загального тканинного та внутрішньоклітинного Na⁺ за умов росту п/шк ГКК, які вимірювали на 14-, 21- і 28-ий день після ін'єкції клітин N1S1. Статистичний аналіз виявив, що Na⁺_т у п/шк ГКК вірогідно зростав на 55% на 28-ий день у порівнянні до рівня виявленого для цього показника на 14-ий день (рис. 19 В). Зміни Na⁺_в були навіть більш вираженими. Так на 21- та 28-ий дні [Na⁺]_в вірогідно зростав на 75% і 83% (P < 0,05), відповідно.

Характерні зразки гістологічних зрізів ГКК на 4-й тиждень після ін'єкції клітин. Видно, що на межі між нормальною тканиною печінки та ГКК розташована сполучна фіброгенна тканина (А). У місцях розташування життєздатних ракових клітин (В, Д) їх щільність є меншою, ніж у здоровій тканині печінки (Б), що призводить до збільшення ЗКС. Іншою причиною збільшення ЗКС є розвиток запальних і некротичних процесів у ГКК (Г). Наведено характерні некротичні перетворення у пухлині на прикладі п/шк ГКК. Можна легко відрізнити життєздатні ракові клітини (а) від клітин охоплених запальними процесами (в) та некротичних клітин коагулятивного типу (б), коли значна частина пухлини заповнена некротичними „тінями” клітин без ядер. На деяких гістологічних зрізах також видно, що некротичні зони часто заповнені сполучною тканиною (стромою), схожою на колаген.

В окремій групі тварин гістологічні зрізи ГКК у печінці робили на 7-, 14- та 21-ий день. Статистичний аналіз гістологічних зрізів ГКК наведено у табл. 2. Відносне значення ЗКС у нормальній тканині печінки було вірогідно нижчим (Р < 0,05) у порівнянні до зон життєздатних ракових клітин після інокуляції та запальних і некротичних зон із пухлин на 28-й день. Розміри ЗКС у життєздатних клітин в усі досліджувані терміни росту пухлини вірогідно не відрізнялись між собою, але завжди були вищими за цей показник у нормальній печінці. На 7-й день після інокуляції у ГКК не спостерігали зон запалення чи некрозу. Розміри ЗКС у зонах запалення та некрозу в усі досліджувані терміни росту пухлини також вірогідно не відрізнялись між собою, але були вищими у порівнянні із печінкою. Цікаво зазначити, що кількість життєздатних, запальних і некротичних ракових клітин (28-ий день після інокуляції) на одиницю площі (50000 мкм²) була вищою у порівнянні до суміжної тканини печінки: 668 ± 76, 1393 ± 115 і 237 ± 9, відповідно. Однак, таке зростання кількості клітин аж ніяк не пов'язане із зростанням їх щільності. Навпаки, як було наведено вище, ЗКС у пухлині зростає. Справа у тому, що у життєздатних ракових клітинах суттєво зменшується об'єм цитоплазми. Тому співвідношення об'єму (площі) клітини до її ядра у нормальній печінці складало 4,9, а у життєздатних ракових клітинах - тільки 1,6 - 1,7 (ортотопна ГКК) чи 1,1 (п/шк ГКК) (табл. 2). Обрахунок цього співвідношення для запальних чи некротичних клітин був неможливий через відсутність чи катастрофічне зменшення ядра у цих дегенерованих клітинах. Статистичний аналіз п/шк ГКК не виявив вірогідних відмінностей між ЗКС, співвідношенням клітина/ядро і кількістю клітин у порівнянні із ортотопною ГКК (табл. 2).

Отже, вищі показники дифузії води, а також загальнотканинного і внтрішньоклітинного Na⁺ у ГКК, які реєстрували за допомогою методу ЯМР, можуть бути показником ранніх неоплазматичних перетворень у тканині печінки, пов'язаних із змінами зовнішньоклітинного середовища та внутрішньоклітинного іонного метаболізму. Протилежні за напрямком зміни КДВ в ортотопній та п/шк ГКК можуть свідчити або про те, що суттєві відмінності дифузійних і перфузійних процнсів у цих пухлинах, або про те, що вплив руху органу на КДВ у випадку ортотопної пухлини не вдалось повністю уникнути. З іншого боку, сигнал ²³Na-ЯМР не підлягає впливу руху органу і тому може використовуватись для моніторингу структурних і функціональних показників за умов зміни розміру ГКК, незалежно від її розташування.

Як свідчать наведені у роботі дані, зміни рівня іонів Na⁺ відображають фізіологічні та метаболічні перетворення, що виникають за умов гіпоксії, та можуть використовуватись як інтегральний показник цих перетворень (рис. 21). Помірне і поступове зростання Na⁺_в, яке спостерігали у наших дослідах при коротких гіпоксійних сеансах ізольованого серця, може відігравати позитивну роль при адаптації цього органу до глибокої ішемії. Це, очевидно, пов'язано із збільшенням кількості Na⁺/Н⁺-обмінників протягом КГС, що забезпечує швидше і повніше відновлення рН_в у післяішемійний період, а відтак і механічних функцій мокарду (ці метаболічні перетворення позначені на схемі пунктирними стрілками).

Суттєве зростання внутрішньоклітинної концентрації іонів Na⁺ можна вважати яскравим показником функціональних змін пов'язаних із патологічною гіпоксією, що супроводжується вірогідним зниженням біоенергетичного статусу та закисленням внутрішньоклітинного середовища. Ми спостерігали зростання [Na⁺]_в у кардіоміоцитах при діабетичній кардіоміопатії та при ішемії ізольованого міокарду. Зростання [Na⁺]_в є не тільки наслідком зростання ролі гліколізу за гіпоксійних умов, але й може слугувати причиною подальшого зниження енергетичного статусу. Як показали наші дані на МХ серця хворих на діабет, за цих умов активується Na⁺/Ca²⁺-обмінник мітохондріальної мембрани, що призводить до зменшення [Ca²⁺] у МХ і зниження активності Са²⁺-залежних ферментів цих органел (піруват-, -кетоглутарат-, ізоцитрат- та сукцинатдегідрогеназ), а відтак і до подальшого зниження співвідношення АТФ/Ф_н.

Якщо з лікувальної точки зору зростання [Na⁺]_в за кардіоміопатії чи ішемії слід розцінювати як показник прогресуючої патології, а його зниження як показник ефективності лікування, то у виражено гіпоксійній раковій тканині збільшення [Na⁺]_т класифікується як показник ефективності ракової терапії. Одним із ефективних способів лікування злоякісних пухлин є гіпертермія (Falk, 2001). Нагрівання пухлини до 42-45 ^оС сприяє не тільки кращому постачанню антитіл, а й утворенню вільних радикалів, підвищуючи ефективність радіотерапії, і полегшенню транспортування препаратів за хіміотерапії. Проте гіпертермія може мати і безпосередній вплив на ракові клітини. Як показали наші експерименти, гіпертермія ізольованих клітин RIF-1 викликає незворотнє зростання рівня Na⁺_в через активацію Na⁺/H⁺-обмінника плазматичної мембрани і свідчить про те, що трансмембранний іонний градієнт відіграє важливу роль у пошкодженні ракових клітин за умов високої температури. Дослідження механізмів контролю хіміотерапевтичних ефектів у ракових пухлинах показало, що рівень Na⁺ може бути чутливим показником як ефективності лікування, так і ранніх стадій злоякісного перетворення тканини. На нашу думку, рівень Na⁺_в є чутливішим до змін у пухлині, ніж рівень Na⁺_т. Зміни Na⁺_в залежать від швидких метаболічних та фізіологічних процесів у тканині і служать інтегральним показником, що відображає біоенергетичний статус та рівень закисленості ракової клітини. У той же час, рівні Na⁺_т та КДВ в основному залежать від структурних змін у пухлині (зокрема від розміру зовнішньоклітинного середовища), що розвиваються вже після змін фізіологічних і метаболічних процесів. Крім того, відносне зменшення Na⁺_в у порівнянні з нелікованою пухлиною може слугувати загальним показником ефективності лікування, а зростання Na⁺_в - показником неоплазматичних перетворень і росту пухлини. Це пов'язано із розвитком гіпоксійного стану у пухлині, що росте, і, з іншого боку, із зростанням ролі окисного фосфорилювання в уцілілих після лікування ракових клітинах (Bhujwalla et al, 1998; Poptani et al, 2003). Na⁺_т та КДВ, як показали наші дані, не можуть бути таким інтегральним показником оскільки зміни їх рівня залежать від типу ракової моделі та її розташування. Так у пухлинах RIF-1 ефективна хіміотерапія із ЦФ та 5ФУ викликала збільшення зовнішньоклітинного середовища, Na⁺_т та КДВ, а у гліомі 9L ефективна хіміотерапія із БХНС не викликала вірогідних змін цих показників на відміну від контрольних і резистентних пухлин (рис. 22). У той же час, як показали результати наших досліджень, в обох ракових моделях рівень Na⁺_в був нижчим після ефективного лікування різними препаратами у порівнянні з нелікованими пухлинами, у яких рівень Na⁺_в вірогідно зростав. У майбутньому неінвазивний метод вимірювання Na⁺_в за допомогою ²³Na-ЯМР має більше перспектив для використання у клініці, ніж популярний зараз метод ПЕТ, оскільки останній передбачає введення радіоактивного ізотопу у кров пацієнта.

Переважну кількість даних, представлених у роботі, отримано із використанням методу ²³Na-ЯМР. Моніторинг іонів Na⁺ дає можливість вивчати за умов in vitro механізми підтримання трансмембранного градієнту та спряжених із ним біоенергетичних процесів та рН_в, які реєстрували у більшості наших експериментів методом спектроскопії ³¹Р-ЯМР паралельно із моніторингом іонів Na⁺. За умов in vivo, метод спектроскопії ²³Na-ЯМР та зображень відкриває унікальні можливості одночасної реєстрації як структурних змін тканини, так і метаболічних перетворень у клітині. Як показали наші дані, зміни Na⁺_т у раковій пухлині, які реєстрували методом ОК-²³Na-ЯМР, в основному, відображають зміни зовнішньоклітинного середовища за росту пухлини чи при її зменшенні. У той самий час зміни [Na⁺]_в, які відслідковували за інтенсивністю ТКФ-²³Na-ЯМР, залежать, в основному, від ефективності біонергетичних процесів та рН_в. Вимірювання Na⁺_в і Na⁺_т у пухлинах очеревини має переваги перед популярним в останні 15 років методом вимірювання КДВ, як маркера ефективності терапії пухлин. Рух органів очеревини спричинений диханням чи серцебиттям може суттєво спотворювати величину КДВ. Натомість сигнал ОК-²³Na-ЯМР, який подібно до КДВ в основному відображає структурні зміни ракової тканини, не спотворюється рухом органу. Поєднання методу ЯМР із іншими методами аналізу такими як 1) полярографічний метод вивчення дихання ізольованих МХ та клітин, 2) позиторонно-емісійна томографія, яка дозволяє оцінити інтенсивність гліколізу, 3) гістологічний аналіз тканин та ін. доповнило результати, отримані з допомогою ЯМР, що суттєво допомогло у з'ясуванні механізмів розвитку станів гіпоксії при різноманітних патологіях та у моніторингу ефективності лікування.