Структурно-функціональний стан популяцій клітин кордової крові після кріоконсервування з непроникаючим кріопротектором ПЕО-1500

Размещено на http://www.allbest.ru/

Національна академія наук України

Інститут проблем кріобіології і кріомедицини

УДК: 615.361.018.5.013.8.014.41:547.422

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Спеціальність 03.00.19 - Кріобіологія

Структурно-функціональний стан популяцій клітин кордової крові після кріоконсервування з непроникаючим кріопротектором ПЕО-1500

Зубова Оксана Леонідівна

Харків - 2009

Дисертація є рукописом

Робота виконана в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України

Науковий керівник: Доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Бабійчук Любов Олександрівна, Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, зав. відділу кріоцитології та кількісної морфології, м. Харків

Офіційні опоненти: Доктор біологічних наук, професор Петренко Олександр Юрійович, Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, завідувач відділу кріобіохімії, м. Харків Кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник Самохіна Любов Михайлівна, Інститут терапії імені Л.Т. Малої АМН України, провідний науковий співробітник лабораторії біохімічних та імуноферментних методів дослідження, м. Харків

Захист відбудеться „ 20 ” жовтня 2009 року о 13-30 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.242.01. в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, 61015, Харків - 15, вул. Переяславська, 23

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці ІПКіК НАН України за адресою: 61015, Харків - 15, вул. Переяславська, 23

Автореферат розіслано „ 17 ” вересня 2009р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, академік НАН України, д.мед.н., професор Гольцев А.М.

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. У теперішній час кордова кров (КК) привертає увагу все більшої кількості дослідників і клініцистів у зв'язку з високою її терапевтичною ефективністю, обумовленою наявністю в ній насамперед стовбурових гемопоетичних клітин [Broxmeyer H.E., 1995, Gluckman E., 1998], а також фетальних еритроцитів [Garrіtsen H. et al., 2003, Paxson C.L., 1979], різних ростових, колонієстимулюючих факторів та інших біологічно активних речовин [Грищенко В.И. и др., 1997, Морозова Р.П. и др., 1999].

Широке застосування кордової крові можливе лише при наявності її запасів, що вимагає розробки нових і вдосконалення існуючих технологій кріоконсервування. У ряді робіт було показано, що максимально виражений терапевтичний ефект КК проявляється у випадку застосування її без фракціонування, оскільки маніпуляції, які проводяться на етапах складного технологічного процесу кріоконсервування, особливо сепараційні процедури, викликають зниження кількості і якості гемопоетичних попередників [Broxmeyer H.E. et al., 1992, Rubіnsteіn P. Et al., 1993]. Крім того, виділення гемопоетичних клітин в окрему фракцію може знизити ефективність приживлення зразка за рахунок видалення акцесорно-регуляторних клітинних популяцій, які визначають його функціональну повноцінність [Гольцев А.Н. и др., 1998].

Проблема кріоконсервування цільної КК є досить складною, оскільки для еритроцитів і ядровмісних клітин, що входять у її склад, ефективними для кріоконсервування є як різні кріопротектори, так і режими заморожування.

Існуючі методи кріоконсервування цільної КК не дозволяють зберігати повною мірою всі її компоненти, оскільки проникаючий кріопротектор ДМСО, а також значний лізис еритроцитів вимагають серії відмивань після розморожування [Rubіnsteіn P. Et al., 1993]. Тому збереження в кордовій крові всіх компонентів можливо лише при використанні безвідмивних технологій кріоконсервування із застосуванням непроникаючих кріопротекторів. Крім того необхідна розробка нових режимів заморожування, що дозволять зберігати в одному препараті такі різнорідні клітини, як еритроцити і ядровмісні клітини, разом з біологічно активними речовинами плазми.

Для розробки ефективних методів кріоконсервування, що дозволяють у максимальному ступені зберігати життєздатність всіх популяцій клітин, необхідне проведення комплексних досліджень, спрямованих на вивчення ролі факторів, які впливають на збереженість і життєздатність клітин на кожному з етапів технологічного процесу кріоконсервування, починаючи від температури передобробки крові кріопротектором і закінчуючи швидкістю заморожування.

Виходячи із цього, дослідження впливу факторів кріоконсервування на еритроцити і різні популяції ядровмісних клітин кордової крові, у тому числі й стовбурові гемопоетичні, є актуальною проблемою.

Зв'язок з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана відповідно до наукового напрямку роботи відділу кріоцитології і кількісної морфології Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України за темою №2.2.6.14: „Вивчення молекулярних механізмів структурно-функціональних змін плазматичних мембран і цитоскелета еритроцитів донорської й кордової крові людини під впливом температурно-осмотических ефектів і кріопротекторів різного механізму дії” (№ держ. реєстрації 0104U006436), та №2.2.6.47: „Вивчення механізмів структурно-функціональних змін ядровмісних клітин кордової крові і еритроцитів під впливом екзо- і ендоцелюлярних кріопротекторів та низьких температур” (№ держ. реєстрації 0109U00278), де автор виконував самостійні розділи.

Мета і задачі дослідження. Мета роботи - вивчити структурно-функціональний стан, збереженість і життєздатність еритроцитів та різних популяцій ядровмісних клітин, у тому числі стовбурових гемопоетичних, а також збереженість біологічно активних речовин плазми при кріоконсервуванні цільної кордової крові під захистом непроникаючого кріопротектора ПЕО-1500 залежно від режимів заморожування.

Відповідно до поставленої мети передбачалося вирішити наступні задачі:

1. Оцінити збереженість і життєздатність еритроцитів і ядровмісних клітин кордової крові, у тому числі стовбурових гемопоетичних, після кріоконсервування з ПЕО-1500 залежно від режимів заморожування. Визначити оптимальні температурні умови обробки кріопротектором і режим кріоконсервування цільної кордової крові.

2. Визначити збереженість еритроцитів, заморожених у складі цільної кордової крові по розробленому режиму, відразу після розморожування й моделювання трансфузії, а також вміст основних функціональних показників - АТФ і 2,3-ДФГ після розморожування.

3. Вивчити структурно-функціональний стан білків мембрано-цитоскелетного комплексу еритроцитів кордової крові після кріоконсервування по розробленому режиму методом електрофорезу в ПААГ з використанням зшиваючого агента діаміда.

4. Дослідити вплив кріоконсервування цільної кордової крові по розробленому методу на вміст тестостерону, тиреотропного гормону, тиреоїдних гормонів і альфафетопротеїну плазми кордової крові.

5. Оцінити збереженість і життєздатність різних популяцій ядровмісних клітин кордової крові залежно від способу обробки кріопротектором ПЕО-1500 і режимів заморожування.

6. Дослідити зміни ліпідної асиметрії мембран ядровмісних клітин різних популяцій кордової крові до і після кріоконсервування по досліджуваним режимам.

7. Вивчити стадії апоптозу популяцій ядровмісних клітин під впливом непроникаючого кріопротектора і режимів заморожування.

Об'єкт дослідження. Вплив кріопротектора ПЕО-1500 і процесів кріоконсервування на еритроцити, ядровмісні клітини, у тому числі стовбурові гемопоетичні, і плазму кордової крові людини.

Предмет дослідження. Стан еритроцитів і ядровмісних клітин, збереженість біологічно активних речовин плазми кордової крові.

Методи дослідження. Спектрофотометричний, світлової мікроскопії, імуноферментного аналізу, электрофорезу в поліакриламідному гелі (ПААГ), проточної цитофлуориметрії.

Наукова новизна одержаних результатів. У роботі вперше показана можливість збереження в препараті цільної кордової крові після кріоконсервування одночасно еритроцитів, ядровмісних клітин, у тому числі стовбурових гемопоетичних, і біологічно активних речовин плазми на досить високому рівні за умови обробки крові кріопротектором при низькій позитивній температурі й заморожуванні по спеціально розробленому режиму: 60⁰С/хв до температури -40⁰С перед зануренням у рідкий азот (режим кріоконсервування цільної кордової крові - КЦКК). Встановлено, що після кріоконсервування цільної кордової крові по режиму КЦКК забезпечується збереженість основних функціональних показників еритроцитів АТФ і 2,3-ДФГ. Методом електрофорезу в ПААГ із використанням білок зшиваючого агенту діаміду встановлено, що кріоконсервування цільної кордової крові по розробленому режиму викликає зміни просторового розташування білків мембрани еритроцитів, які повністю співпадають з результатами, отриманими при заморожуванні еритроцитів по оптимальному для них режиму прямим зануренням у рідкий азот. Продемонстровано високу стійкість популяцій мононуклеарів і гемопоетичних стовбурових клітин до дії факторів кріоконсервування. Вперше показано, що кріоконсервування по методу КЦКК викликає незначне збільшення кількості анексинV⁺-клітин в популяціях лімфоцитів і моноцитів. При цьому в популяції гранулоцитів спостерігається досить великий відсоток (до 45%) клітин з порушеною ліпідною асиметрією. При вивченні стадій апоптоза ядровмісних клітин встановлено, що заморожування крові по розробленому режиму забезпечує збереженість до 77% анексинV^-/7AAD^--клітин. При цьому всі популяції ядровмісних клітин демонструють залежність кількості життєздатних клітин від температури передобробки крові кріопротектором: обробка ПЕО-1500 при 0-4⁰С забезпечує збереженість анексин^-/7AAD^--клітин у більшій мірі, у порівнянні з обробкою при 20-22⁰С.

Практичне значення одержаних результатів. Проведене в процесі дослідження комплексне вивчення кордової крові як об'єкта кріоконсервування дозволило розробити безвідмивний метод заморожування цільної КК із використанням непроникаючого кріопротектора ПЕО-1500 зі збереженням у ній різних популяцій клітин й біологічно активних речовин плазми. Отримані результати досліджень захищені патентом України [Бабійчук Л.О. та ін., 2007] і мають науково-практичне значення в аспекті створення запасів цільної КК для довгострокового зберігання з метою подальшого клінічного застосування. Результати роботи можуть бути рекомендовані для розробки нових і вдосконалення існуючих безвідмивних технологій кріоконсервування клітинних суспензій, а також - у навчальному процесі при підготовці фахівців різних областей біології і медицини.

Особистий внесок здобувача. Дисертація є самостійним дослідженням здобувача. Автором разом з керівником сформульовані мета й визначені завдання дослідження. Здобувачем особисто отримані експериментальні дані у всіх розділах досліджень, проведена їхня статистична обробка. Автором роботи самостійно проаналізовані отримані результати й зроблені висновки. Спільні публікації відбивають результати спільного планування, проведення й обговорення результатів. В опублікованих разом зі співавторами роботах особистий внесок здобувача полягає:

- у роботах [2, 3, 5, 8-10, 12] у вивченні збереженості й життєздатності еритроцитів і ядровмісних клітин кордової крові після кріоконсервування з ПЕО-1500 з використанням різних режимів заморожування;

- у роботах [1-4, 8-12] у вивченні функціональної повноцінності еритроцитів, стану білків мембрано-цитоскелетного комплексу, а також збереженості деяких біологічно активних речовин плазми КК після кріоконсервування цільної КК під захистом ПЕО-1500;

- у роботах [5, 6] у проведенні досліджень по оцінці популяційного складу ядровмісних клітин кордової крові до і після кріоконсервування;

- у роботі [7] у вивченні ліпідної асиметрії і стадій апоптоза популяцій ядровмісних клітин до і після кріоконсервування з ПЕО-1500.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень, викладені в дисертаційній роботі, були представлені й обговорювалися на науково-практичній конференції з міжнародною участю "Сучасні проблеми трансфузіології" (Харків, 2004), науково-практичній конференції "Гематологія й трансфузіологія: фундаментальні та прикладні питання" (Київ, 2005), ІІ міжнародній науковій конференції студентів і аспірантів "Молодь і поступ біології" (Львів, 2006), науково-практичній конференції з міжнародною участю "Актуальні проблеми абдомінальної та судинної хірургії. Клінічні проблеми трансплантації органів" (Київ, 2006), щорічній конференції молодих вчених "Холод у біології й медицині" (Харків, 2008), V з'їзді гематологів і трансфузіологів України (Вінниця, 2008), науково-практичній конференції "Актуальні питання клінічної трансфузіології" (Харків, 2009).

Публікації. За матеріалами дисертаційної роботи опубліковано 8 статей, з них 7 - у спеціалізованих наукових журналах, 1 - у збірниках наукових конференцій, 1 - патент на винахід і 3 тез доповідей.

Обсяг і структура дисертації. Дисертаційна робота обсягом 181 сторінка складається із вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів, результатів власних досліджень і їхнього обговорення, аналізу й узагальнення результатів власних досліджень, висновків, переліку використаної літератури (260 першоджерел, розміщено на 29 сторінках). Робота проілюстрована 17 таблицями та 34 рисунками.

Основний зміст роботи

Матеріали і методи дослідження

Дослідження були виконані на кордовій крові людини, отриманої з вени пуповини після нормальних пологів при наявності інформованої згоди породіллі відповідно до вимог комісії по біоетиці ІПКіК НАНУ і заготовленої на консерванті "Глюгіцир".

Обробка цільної крові і еритроцитів кріопротектором ПЕО-1500 і заморожування-відігрівання. Перед заморожуванням суспензію клітин інкубували з 30%-м розчином кріопротектора ПЕО-1500 у співвідношенні 1:1 за об'ємом: при кімнатній температурі (20-22⁰С) і при низькій позитивній температурі (0-4⁰С). Суспензію клітин заморожували зі швидкістю 40⁰С/хв, 60⁰С/хв, 80⁰С/хв до кінцевих температур -20⁰С, -40⁰С и -60⁰С перед зануренням у рідкий азот, а також зі швидкістю 3⁰С/хв до температури -80⁰С перед зануренням у рідкий азот і прямим зануренням у рідкий азот. Відтаювання проводили на водяній бані при температурі 40-42⁰С.

Визначення рівня гемолізу еритроцитів проводили за вмістом вільного гемоглобіну в супернатанті спектрофотометрично на СФ-46 (ЛОМО, Росія) при довжині хвилі 543 нм [Дервиз Г.В. и др., 1966].

Визначення збереженості ядровмісних клітин. Підрахунок клітин проводили в камері Горяєва відповідно до стандартних методик [Davіs J.M., 2002].

Фенотипування та визначення життєздатності [Schmіd І. et al., 1992] CD45⁺- і CD34⁺-клітин проводили за допомогою проточного цитофлуориметра FACS Calіbur фірми Becton Dіckіnson (США) з використання реагентів BD по міжнародному ІSHAGE протоколу. Результати оцінювали за допомогою програмного забезпечення - CELLQuest Pro (BD).

Моделювання трансфузії. Після розморожування клітини переносили у фізіологічний розчин (150 мм NaCl, 10 мм Трис-НCl (рН 7,4)) (1:10 за об'ємом) з підтримкою температури 37⁰С протягом однієї години, після чого еритроцити осаджували при 1500 об/хв, у супернатанті визначали рівень гемолізу.

Неферментативний метод визначення концентрації 2,3-дифосфоглицеринової кислоти еритроцитів проводили по методу [Шарова Ю.А. и др., 1978].

Спектрофотометричний гексокіназний метод визначення вмісту АТФ. Рівень АТФ визначали спектрофотометрично відповідно до методу [Beutler E., 1975].

Одержання тіней еритроцитів. Після експериментальних впливів аліквоти клітин інкубували при 37⁰С у присутності 2,5 мМ діаміда протягом години [Haest C.W.H. et al., 1977], після чого одержували білі тіні еритроцитів гіпотонічним шоком за методом [Faіrbanks G. et al., 1971].

Електрофорез білків мембран еритроцитів. Електрофорез білків проводили у вертикальних пластинах SDS-ПАА гелі за системою Лемлі [Остерман Л.А., 1981]. Для визначення молекулярної маси білків використовували маркери фірми Fluka. Оцінку відносного вмісту білків різних фракцій на доріжці SDS-ПААГ проводили за допомогою денситометрування (денситометр DM2120 "Solar") і комп'ютерної програми Scіon Іmage. кріоконсервування кордова кров еритроцит

Визначення експресії фосфатидилсерина проводили за допомогою проточного цитофлуориметра FACS Calіbur (BD) з використанням реагентів BD (набір Annexіn V-FІTC detectіon KІТ). Результати вимірів оцінювали за допомогою програмного забезпечення фірми BD - CELLQuest Pro.

Отримані результати статистично обробляли за методом Ст'юдента-Фішера з використанням програми для ПК "Stat Graphіcs".

Результати досліджень та їх обговорення

Збереження в цільній кордовій крові після кріоконсервування всіх типів клітин і біологічно активних речовин плазми можливо тільки при використанні безвідмивних технологій із застосуванням непроникаючих у клітини кріопротекторів, які не потребують видалення після розморожування.

У ряді робіт було показано, що серед непроникаючих кріопротекторів найбільш ефективним для кріозахисту еритроцитів як донорської [Бабийчук Л.А. и др., 2001], так і кордової крові людини [Бабийчук Л.А. и др., 2005] є поліетиленоксид з м.м. 1500 (ПЕО-1500). При цьому максимальна збереженість еритроцитів досягалася при обробці клітин кріопротектором при низькій позитивній температурі. У зв'язку із цим на першому етапі роботи були проведені дослідження з оцінки ефективності даного кріопротектора для захисту ядровмісних клітин (ЯВК). Було показано (табл.1), що використання даного кріопротектора й оптимальної для ЯВК швидкості заморожування 3⁰С/хв дозволяє досить ефективно зберігати клітини, однак при цьому відбувається значна загибель еритроцитів внаслідок невідповідного для даних клітин режиму заморожування.

Таблиця 1. Збереженість ядровмісних клітин та гемоліз еритроцитів цільної кордової крові у залежності від швидкості заморожування

Умови експерименту	Заморожування зі швидкістю 30С/хв	Заморожування зануренням у рідкий азот
	Обробка ПЕО-1500 при 0-40С	Обробка ПЕО-1500 при 20-220С	Обробка ПЕО-1500 при 0-40С	Обробка ПЕО-1500 при 20-220С
Збереженість ЯВК, %	78,6±4,60	76,5±3,60	48,9±2,65	47,7±2,48
Гемоліз еритроцитів, %	37,7±1,00	40,7±1,54*	0,63±0,15	1,9±0,32*

Примітка. Дані представлені у відсотках, у вигляді М±SЕ. *- дані відрізняються від обробки ПЕО-1500 при 0-4⁰С з рівнем р<0,05.

І, навпаки, швидкий режим заморожування зануренням у рідкий азот забезпечує високу збереженість еритроцитів і низьку - ЯВК (табл.1). Таким чином, виходячи з отриманих даних, можна зробити висновок, що ПЕО-1500 є досить ефективним кріопротектором для захисту як еритроцитів, так і ядровмісних клітин за умови використання оптимальної для кожного типу клітин швидкості охолодження.

У зв'язку із цим для вирішення завдання кріоконсервування цільної кордової крові необхідна розробка режимів, які б дозволяли зберігати в достатній мірі, як еритроцити, так і ядровмісні клітини. Зважаючи на те, що як повільне програмне заморожування, так і швидке заморожування зануренням у рідкий азот не підходять одночасно таким різним клітинам, було досліджено режими кріоконсервування, що перебувають у температурному діапазоні між цими крайніми значеннями швидкостей (1-3⁰С и 180-200⁰С). З цією метою були обрані наступні швидкості заморожування: 40⁰С/хв, 60⁰С/хв і 80⁰С/хв до наступних температур охолодження перед зануренням у рідкий азот: -20⁰С, -40⁰С, -60⁰С. Крім цього, обробку крові кріопротектором проводили двома способами: при низькій позитивній температурі (0-4⁰С) і при кімнатній температурі (20-22⁰С).

Оцінка рівня гемолізу в зразках цільної кордової крові, заморожених різними методами, показала, що гемоліз у групах, заморожених зі швидкістю 40⁰С/хв, є високим (до 18%). Тому даний режим кріоконсервування в подальших дослідженнях не використовувався, а були залишені режими зі швидкостями 60⁰С/хв і 80⁰С/хв, де гемоліз становив 2,0-4,5%.

Іншим важливим критерієм оцінки ефективності режиму заморожування цільної кордової крові є визначення збереженості ядровмісних (CD45⁺), у тому числі й стовбурових гемопоетичних (CD34⁺), клітин. Проведені нами експерименти показали, що найкраща збереженість як CD45⁺-, так і CD34⁺-клітин, спостерігається при кріоконсервуванні цільної КК зі швидкістю 60⁰С/хв. При цьому найбільша збереженість клітин спостерігається в пробах, заморожених з даною швидкістю до температур -40⁰С та -60⁰С перед зануренням у рідкий азот (табл.2).

Оскільки оцінка збереженості клітин після кріоконсервування є важливим, але недостатнім тестом, що визначає стан клітин, було проведено визначення їхньої життєздатності методом проточної цитофлуориметрії з використанням 7-аміно-актиноміцину D (7AAD).

Дані по життєздатності ЯВК та CD34⁺-клітин корелюють зі збереженістю клітин, демонструючи кращі результати при заморожуванні зі швидкістю 60⁰С/хв до температур -40⁰С и -60⁰С з послідуючим зануренням у рідкий азот. При цьому краща життєздатність клітин спостерігається в групах, що інкубували з ПЕО-1500 при низькій позитивній температурі.

Таким чином, оптимальним режимом для заморожування цільної кордової крові з метою збереження в ній як еритроцитів, так і ЯВК, є режим заморожування зі швидкістю 60⁰С/хв до -40⁰С перед зануренням у рідкий азот із передобробкою крові ПЕО-1500 при 0-4⁰С (режим КЦКК).

Таблиця 2 Збереженість ядровмісних (CD45⁺-) і CD34⁺-клітин КК залежно від режимів заморожування

Умови експерименту	Збереженість ЯВК, %	Збереженість CD34+-клітин, %
Швидкість заморожування	Температура охолодження перед зануренням у рідкий азот	Обр. при 0-40С	Обр. при 20-220С	Обр. при 0-40С	Обр. при 20-220С
600С/хв	-200С	61,3±1,92	58,9±1,39	70,7±0,86	68,1±1,18*
	-400С	74,7±1,99	72,8±2,00	82,9±1,04	80,0±0,61*
	-600С	73,4±1,98	72,0±2,05	82,0±0,78	81,7±0,90
800С/хв	-200С	52,4±2,37	52,0±2,54	60,6±1,82	58,1±2,14
	-400С	55,8±2,85	53,8±3,59	63,8±1,38	63,8±1,61
	-600С	57,1±2,28	55,7±2,20	62,1±2,69	63,3±1,47

Примітка. Дані представлені у відсотках, у вигляді М±SЕ. *- дані відрізняються від обробки ПЕО-1500 при 0-4⁰С з рівнем р<0,05.

Одним із важливих тестів, що характеризують збереженість еритроцитів після розморожування, є визначення гемолізу в надосадовій рідині. Однак це недостатній параметр для визначення подальшого поводження клітин в умовах кровоносного русла. Тому було проведене вивчення стійкості деконсервованих еритроцитів, перенесених у фізіологічні умови, що моделюють процес трансфузії. Еритроцити, заморожені у складі цільної КК по режиму КЦКК демонстрували досить високу збереженість як відразу після розморожування, так і після моделювання трансфузії.

Загальноприйнятими критеріями структурно-функціональної повноцінності еритроцитів іn vіtro є вміст АТФ і 2,3-ДФГ - проміжних продуктів і основних фосфоорганічних сполук у їхньому метаболізмі. Проведені нами дослідження показали, що заморожування еритроцитів у складі цільної КК по розробленому режиму дозволяє повністю зберігати їхній вміст, що свідчить про незмінний метаболічний стан клітин у результаті даних впливів. Отримані результати свідчать також, що й витоку цих метаболітів через мембрану не відбувається.

Відомо, що однією з найбільш кріочутливих структур клітин є мембрана. Характер змін, що виникають у мембрано-цитоскелетній білковій сітці еритроцитів під впливом кріопротектора й заморожування-відігрівання, можна оцінити методом електрофорезу в ПААГ, використовуючи білок зшиваючий реагент діамід, який має здатність формувати дисульфідні містки між SH-групами білків, що перебувають на певній один від одного відстані, доступній для його дії, у результаті чого утворюються агрегатні комплекси.

Встановлено, що обробка суспензії клітин кріопротектором ПЕО-1500 і, особливо, кріоконсервування по досліджуваним нами режимам викликає модифікації білків мембрано-цитоскелетного комплексу, які у деяких випадках призводять до критичного зближення макромолекул, що проявляється в утворенні білкових агрегатів на старті гелю (Рис.2).

При цьому кількість агрегатів білків мембран еритроцитів, інкубованих у розчині ПЕО-1500 при 20-22⁰С, як до, так і після кріоконсервування суспензії клітин по різним режимам, була значно вище, ніж у відповідних експериментальних групах, оброблених кріопротектором при 0-4⁰С, що свідчить про більше число білкових модифікацій, які виникають у клітині при кімнатній температурі.

Виявлена нами особливість, пов'язана зі зниженням процентного вмісту ряду білків в еритроцитах, інкубованих із кріопротектором при 20-22⁰С, свідчить про порушення просторової конформації білків, у результаті чого вони стають доступними для дії діаміда. Разом з тим після розморожування клітин, оброблених ПЕО-1500 при 0-4⁰С, спостерігається відносне збільшення вмісту таких білків, як білок смуги 4.2, актин, білок смуги 6, що свідчить про кращу збереженість структурного стану даних білків у порівнянні із клітинами, обробленими ПЕО-1500 при 20-22⁰С. Слід зазначити, що всі тенденції, виявлені в еритроцитах, заморожених по методу КЦКК, повністю співпадають з результатами, отриманими на еритроцитах, заморожених по оптимальному для них режиму прямим зануренням у рідкий азот.

Відомо, що плазма кордової крові є унікальною біологічно активною субстанцією. Для вивчення впливу кріоконсервування цільної кордової крові по розробленому методу на збереженість біологічно активних речовин плазми визначали вміст тироксину, трийодтироніну, тиреотропного гормону, тестостерону й альфафетопротеїну методом імуноферментного аналізу. Було показано, що низькотемпературне консервування не призводить до змін вмісту досліджуваних біологічно активних речовин плазми кордової крові.

Оскільки популяції ЯВК КК є неоднорідними, оцінка популяційного складу CD45⁺-клітин на стадіях кріоконсервування є необхідним завданням для вивчення змін складу суспензії клітин залежно від температури обробки крові кріопротектором і режиму заморожування, а також для визначення кріостійкості кожної із фракцій.

Проведені нами дослідження показали, що після розморожування суспензії клітин, кріоконсервованих як по досліджуваним режимам, так і по оптимальному для ЯВК режиму заморожування, відбувається перерозподіл співвідношення між лімфоцитами, моноцитами й гранулоцитами у сторону збільшення відносного вмісту мононуклеарів і зниження кількості клітин гранулоцитарного ряду.

При цьому співвідношення популяцій ЯВК після заморожування крові зі швидкістю 60⁰С/хв відрізняється від контрольних значень у меншій мірі, ніж після заморожування зі швидкістю 80⁰С/хв, і вірогідно не відрізняється від значень після заморожування по оптимальному для ЯВК режиму зі швидкістю 3⁰С/хв.

Оскільки кріоконсервування викликає перерозподіл у процентному вмісті основних популяцій лейкоцитів, можна зробити висновок, що дані популяції мають різну кріочутливість. Оцінка збереженості після розморожування клітин досліджуваних популяцій показала, що гранулоцити є найбільш чутливими до процесів кріоконсервування, у порівнянні з лімфоцитами й моноцитами, у яких збереженість після заморожування по режиму КЦКК була до 91% і 95% відповідно, а у гранулоцитів лише 60%.

Оцінка життєздатності кожної популяції після заморожування суспензії клітин по досліджуваним режимам показала, що життєздатність лімфоцитів і моноцитів, як і їхня збереженість, значно вище, ніж життєздатність гранулоцитів (до 92%, 93% і 63%, відповідно) після кріоконсервування цільної кордової крові по розробленому методу.

Наслідком процедур заморожування-відігрівання може бути загибель клітин у результаті реалізації каскадного механізму апоптозу [Baust J.M. et al, 2001, Hollіster W.R. et al., 1998], початкова стадія якого для клітин супроводжується порушенням ліпідної асиметрії плазматичної мембрани, що призводить до експонування фосфатидилсерина (ФС) на поверхні клітини [Fadok V.A. et al., 1992]. У нормі він перебуває тільки на внутрішній поверхні плазматичної мембрани.

У зв'язку із цим була проведена оцінка порушення ліпідної асиметрії мембран ядровмісних клітин методом проточної цитофлуориметрії з використанням маркера анексинV, який має високоспецифічну спорідненість до негативно заряджених фосфоліпідів, таких як ФС.

Було показано, що кріоконсервування викликає збільшення кількості анексинV⁺-клітин, у порівнянні, як з контролем, так і з клітинами, обробленими ПЕО-1500. Причому, лише у незначної частини лімфоцитів і моноцитів відбувається порушення ліпідної асиметрії, як при додаванні ПЕО-1500 (до 0,5% у лімфоцитів і до 1% у моноцитів), так і при заморожуванні-відігріванні (до 8% і 9,5%, відповідно). З іншого боку, кількість анексинV-мічених клітин була досить високою у загальній популяції ядровмісних клітин (до 25%), що обумовлено значним відсотком таких клітин (до 45%) у популяції гранулоцитів. Для оцінки стадій апоптоза ЯВК був застосований цитофлуориметричний метод, який базується на використанні комбінації анексинаV з фарбуванням вітальним ДНК барвником 7AAD. Флуоресцентний барвник 7AAD легко проникає в клітини на пізніх стадіях апоптозу або некрозу, але він не може потрапити в клітини, що перебувають на початковому етапі апоптозу [Koopman et al., 1994, Vermes et al., 1995].

Проведені дослідження показали, що збільшення швидкості заморожування суспензії клітин викликає ріст відсотка як мічених анексином клітин, так і пофарбованих 7-AAD. Однак, кількість клітин, які перебувають на ранній стадії апоптоза, хоч і зростає після розморожування, все ж таки залишається досить незначною. При цьому відсоток пізніх апоптичних/некротичних клітин також збільшується разом зі збільшенням швидкості охолодження суспензії клітин. Показано, що кількість анексинV^-/7AAD⁺-клітин не відрізняється вірогідно при охолодженні клітин зі швидкістю 3⁰С/хв (оптимальний режим для ЯВК) і зі швидкістю 60⁰С/хв (режим КЦКК) (Рис.5Б,В), однак висока швидкість заморожування зануренням у рідкий азот викликає значне збільшення кількості клітин, мічених подібним чином (Рис.5Г).

Слід також зазначити, що інкубування крові з ПЕО-1500 при низькій позитивній температурі забезпечує в цілому більшу збереженість анексинV^-/7AAD^--клітин після кріоконсервування, у порівнянні з обробкою кріопротектором при кімнатній температурі.

Вивчення стадій апоптоза популяцій ЯВК показало, що кожна з популяцій має свої особливості в характері й ступені дезорганізації клітинної структури після розморожування. Залежність від режиму кріоконсервування виражається, загалом, лише в збільшенні відносного числа клітин, мічених певним чином, але в основному не змінює "якість" мічення. Так, у популяції лімфоцитів після розморожування переважають клітини пофарбовані 7AAD, але не мічені анексином. При цьому їх кількість зростає разом зі збільшенням швидкості заморожування. Доля клітин тільки з порушеною асиметрією залишається мізерно малою (навіть після заморожування зануренням у рідкий азот не перевищує 1,5%). Відносно моноцитів можна сказати, що кріоконсервування викликає збільшення всіх трьох варіантів зв'язування із ДНК барвником і анексиномV. У популяції гранулоцитів основну частку після розморожування становлять анексинV⁺/7AAD⁺-клітини. Частка інших мічених гранулоцитів збільшується тільки після заморожування крові зануренням у рідкий азот. Можливо, виявлені особливості дезорганізації структури досліджуваних популяцій клітин можна пояснити їхніми морфо-функціональними відмінностями і, як наслідок, загибель клітин у результаті дії заморожування-відігрівання може йти різними шляхами.

Заморожування крові по режиму КЦКК забезпечує збереженість досить великої кількості анексинV^-/7AAD^--клітин (до 77%). Крім цього слід зазначити, що всі популяції ЯВК демонструють залежність кількості життєздатних клітин від температури передобробки крові кріопротектором. Обробка ПЕО-1500 при 0-4⁰С забезпечує збереженість після розморожування анексинV^-/7AAD^--клітин у більшій мірі, у порівнянні з обробкою при 20-22⁰С. Аналіз результатів по вивченню впливу кріоконсервування із кріопротектором ПЕО-1500 на структурно-функціональні показники клітин кордової крові, свідчить про важливість оптимізації процесу кріоконсервування, що залежить як від початкових умов, при яких клітини інкубуються з кріопротектором, так і від вибору оптимальної швидкості заморожування для забезпечення максимальної збереженості клітин у життєздатному стані.

Таким чином, отримані в результаті проведеної роботи дані дозволили розробити метод кріоконсервування цільної кордової крові зі збереженням у ній після розморожування еритроцитів, ядровмісних клітин (у тому числі й стовбурових гемопоетичних), а також біологічно активних речовин плазми на досить високому рівні.

Висновки

У дисертаційній роботі представлено теоретичне узагальнення й нове рішення наукового завдання, спрямованого на вивчення стану клітин кордової крові під впливом кріоконсервування із кріопротектором ПЕО-1500 залежно від температурних умов інкубації клітин із кріопротектором і швидкості охолодження суспензії.

1. Оцінка збереженості й життєздатності клітин цільної кордової крові, кріоконсервованої різними методами, виявила, що заморожування зі швидкістю 60⁰С/хв до температури -40⁰С перед зануренням у рідкий азот разом з обробкою кріопротектором ПЕО-1500 при 0-4⁰С (режим КЦКК) є оптимальним для збереження одночасно еритроцитів і ядровмісних клітин, у тому числі стовбурових гемопоетичних, у порівнянні з іншими режимами заморожування.

2. Показано, що еритроцити, заморожені у складі цільної кордової крові по режиму КЦКК, характеризуються високою збереженістю як відразу після розморожування, так і після моделювання трансфузії. При цьому вміст основних функціональних показників клітин - АТФ і 2,3-ДФГ повністю зберігається після розморожування.

3. Виявлено, що модифікації білків мембрано-цитоскелетного комплексу еритроцитів після кріоконсервування цільної кордової крові по режиму КЦКК залежать від температури інкубації суспензії клітин із кріопротектором: інкубація при 0-4⁰С сприяє утворенню меншої кількості агрегатів і кращої збереженості структури таких білків як спектрин, б.с.4.2, актин, б.с.6, б.с.8 після розморожування, у порівнянні з обробкою при 20-22⁰С, що повністю співпадає з результатами, отриманими на еритроцитах, заморожених по оптимальному для них режиму прямим зануренням у рідкий азот.

4. Кріоконсервування цільної кордової крові по методу КЦКК не призводить до змін вмісту таких біологічно активних речовин плазми кордової крові, як тестостерон, тиреотропний гормон, тиреоїдні гормони та альфафетопротеїн.

5. Оцінка збереженості та життєздатності популяцій ядровмісних клітин кордової крові після заморожування по досліджуваним режимам продемонструвала різну чутливість цих популяцій до факторів кріоконсервування. Було показано, що популяції лімфоцитів і моноцитів мають більшу кріостійкість, а клітини гранулоцитарного ряду найбільш чутливі до впливу низьких температур.

6. Показано, що порушення ліпідної асиметрії як при обробці кріопротектором ПЕО-1500, так і після заморожування по всім досліджуваним режимам відбувається лише в незначної частини лімфоцитів і моноцитів, а висока кількість анексин-мічених клітин у загальній популяції ядровмісних клітин обумовлена значним відсотком таких клітин у популяції гранулоцитів.

7. Оцінка стадій апоптоза популяцій ядровмісних клітин залежно від режиму заморожування показала, що кріоконсервування цільної кордової крові по режиму КЦКК дозволяє зберігати до 77% анексин^-/7AAD^--клітин. Отримані дані близькі до таких після заморожування крові по оптимальному для ядровмісних клітин режиму.

Перелік опублікованих робіт

1. Рязанцев В.В. Криоконсервирование кордовой крови с использованием ПЭО-1500 / В.В. Рязанцев, Л.А. Бабийчук, О.Л. Тимченко // Гематологія і переливання крові. - 2004. - Вып.32, Ч.1. - С.118-125.

2. Бабийчук Л.А. Новые методы криоконсервирования кордовой крови человека под защитой непроникающего криопротектора полиэтиленоксида м.м. 1500 / Л.А. Бабийчук, В.В. Рязанцев, П.М. Зубов, О.Л. Тимченко // Проблемы криобиологии. - 2005. - Т.15, №3. - C.556-560.

3. Бабийчук Л.А. Криоконсервирование цельной кордовой крови / Л.А. Бабийчук, В.В. Рязанцев, П.М. Зубов, О.Л. Зубова, Т.М. Гурина // Проблемы, достижения и перспективы развития медико-биологических наук и практического здравоохранения. Труды Крымского государственного медицинского университета им. С.И. Георгиевского.- 2006. - Т.142, ч.2. - C.5-7.

4. Рязанцев В.В. Криоконсервирование кордовой крови с использованием ПЭО-1500 / В.В. Рязанцев, Л.А. Бабийчук, О.Л. Зубова, Т.М. Гурина // Проблемы криобиологии. - 2007. - Т.17, №3. - С.256-262.

5. Бабийчук Л.А. Криоконсервирование цельной кордовой крови с ПЭО-1500: оценка структурно-функциональных свойств клеток / Л.А. Бабийчук, О.Л. Зубова, В.В. Рязанцев, П.М. Зубов // Гематологія і переливання крові. - 2008. - №34. - C.12-16.

6. Зубова О.Л. Криоконсервирование цельной кордовой крови / О.Л. Зубова, П.М. Зубов, Л.А. Бабийчук, В.В. Рязанцев // Проблемы криобиологии. - 2008. - Т.18, №1. - С.58-61.

7. Зубова О.Л. Оценка стадий апоптоза ядросодержащих клеток при криоконсервировании цельной кордовой крови / О.Л. Зубова, Л.А. Бабийчук, П.М. Зубов, В.В. Рязанцев // Гематологія і переливання крові. - 2009. - №34(додатковий). - C.147-150.

8. Бабийчук Л.А. Безотмывочный метод криоконсервирования цельной кордовой крови / Л.А. Бабийчук, В.В. Рязанцев, П.М. Зубов, О.Л. Зубова // „Новое в гематологии и трансфузиологии.” Международный научно-практический рецензируемый сборник. - Киев. - 2007. - С.60-63.

9. Україна, пат. № 80062, МПК А01N1/02, заявл. 27.02.06; опубл. 10.08.07. Бюл. №12 „Спосіб кріоконсервування цільної кордової крові” авт. Бабійчук Л.О., Грищенко В.І., Гуріна Т.М., Рязанцев В.В., Зубова О.Л., Зубов П.М. З-к: ІПКіК НАН України.

10. Бабийчук Л.А., Грищенко В.И., Рязанцев В.В., Зубов П.М., Тимченко О.Л. Новые подходы к проблеме криоконсервирования гемопоэтических клеток кордовой крови // Материалы научно-практической конференции „Гематологія і трансфузіологія: фундаментальні та прикладні питання”, Київ, 13-14 жовтня 2005.- Т.4. - C.122-123.

11. Зубов П.М., Зубова О.Л. Структурно-функціональні показники еритроцитів кордової та донорської крові при кріоконсервуванні з ПЕО-1500 // ІІ Міжнародна наукова конференція студентів та аспірантів „Молодь і поступ біології”, Львів, 21-24 березня 2006.- C.49-50.

12. Бабійчук Л.О., Рязанцев В.В., Зубова О.Л., Зубов П.М. Кріоконсервування кордової крові людини для клінічної практики // Клінічна хірургія.-2006.- №4-5.- C.85.

Анотація

Зубова О.Л. Структурно-функціональний стан популяцій клітин кордової крові після кріоконсервування з непроникаючим кріопротектором ПЕО-1500. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.19 - кріобіологія.- Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, Харків, 2009.

Дисертаційна робота присвячена вивченню стану популяцій клітин кордової крові під впливом кріоконсервування залежно від температури інкубації клітин із кріопротектором ПЕО-1500 і режиму охолодження суспензії. Встановлено, що заморожування зі швидкістю 60⁰С/хв до температури -40⁰С перед зануренням у рідкий азот разом з обробкою кріопротектором ПЕО-1500 при 0-4⁰С (режим КЦКК) є оптимальним для збереження одночасно еритроцитів і ядровмісних клітин, у тому числі стовбурових гемопоетичних, у порівнянні з іншими режимами заморожування. Еритроцити, заморожені у складі цільної кордової крові по режиму КЦКК, характеризуються високою збереженістю як відразу після розморожування, так і після моделювання трансфузії. При цьому вміст основних функціональних показників клітини - АТФ і 2,3-ДФГ повністю зберігається після розморожування. Методом електрофорезу в ПААГ із використанням білок зшиваючого агенту діаміду встановлено, що кріоконсервування цільної кордової крові по розробленому режиму викликає зміни просторового розташування білків мембрани еритроцитів, які повністю співпадають з результатами, отриманими при заморожуванні еритроцитів по оптимальному для них режиму прямим зануренням у рідкий азот. Показано, що кріоконсервування цільної кордової крові по методу КЦКК не призводить до змін вмісту таких біологічно активних речовин плазми кордової крові як тестостерон, тиреотропний гормон, тиреоїдні гормони й альфафетопротеїн.

Виявлено різну чутливість популяцій ядровмісних клітин до факторів кріоконсервування: більшу кріостійкість мають популяції лімфоцитів і моноцитів, у той час як клітини гранулоцитарного ряду є більш чутливими до впливу низьких температур. Встановлено, що порушення ліпідної асиметрії як при обробці кріопротектором ПЕО-1500, так і після заморожування по всім досліджуваним режимам відбувається лише у незначної частини лімфоцитів і моноцитів, а висока кількість анексин-мічених клітин у загальній популяції ядровмісних клітин обумовлена значним відсотком таких клітин у популяції гранулоцитів. Оцінка стадій апоптоза ядровмісних клітин залежно від режиму заморожування показала, що кріоконсервування цільної кордової крові по режиму КЦКК дозволяє зберігати до 77% анексинV^-/7AAD^--клітин. Отримані дані близькі до таких після заморожування крові по оптимальному для ядровмісних клітин режиму.

Ключові слова: кордова кров, популяції ядровмісних клітин, стовбурові гемопоетичні клітини, еритроцити, кріоконсервування, кріопротектор ПЕО-1500.

Аннотация

Зубова О.Л. Структурно-функциональное состояние популяций клеток кордовой крови после криоконсервирования с непроникающим криопротектором ПЭО-1500.- Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.19 - криобиология. Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, Харьков, 2009.

Диссертационная работа посвящена изучению структурно- функционального состояния, сохранности и жизнеспособности эритроцитов и различных популяций ядросодержащих клеток, в том числе стволовых гемопоэтических, а также сохранности биологически активных веществ плазмы кордовой крови при криоконсервировании цельной кордовой крови с непроникающим криопротектором ПЭО-1500 в зависимости от режимов замораживания.

Установлено, что замораживание цельной кордовой крови со скоростью 60⁰С/мин до конечной температуры -40⁰С перед погружением в жидкий азот в сочетании с обработкой криопротектором ПЭО-1500 при 0-4⁰С (режим криоконсервирования цельной кордовой крови - режим КЦКК) является оптимальным, по сравнению с другими режимами замораживания, для сохранения одновременно эритроцитов и ядросодержащих, в том числе стволовых гемопоэтических, клеток кордовой крови.

Показано, что эритроциты, замороженные в составе цельной кордовой крови по режиму КЦКК, характеризуются высокой сохранностью как сразу после размораживания, так и после моделирования трансфузии. При этом полностью сохраняется содержание таких функциональных показателей клетки, как АТФ и 2,3-ДФГ.

С помощью метода электрофореза в ПААГ установлено, что криоконсервирование цельной кордовой крови по разработанному режиму приводит к модификациям мембрано-цитоскелетного комплекса эритроцитов. Данные модификации зависят от температуры инкубации суспензии клеток с криопротектором: инкубация при 0-4⁰С способствует образованию меньшего количества белковых агрегатов и лучшей сохранности таких белков, как спектрин, б.п.3, б.п.4.2, актин, б.п.6, б.п.7, б.п.8 после размораживания, по сравнению с обработкой при 20-22⁰С, что полностью сопоставимо с результатами, полученными на эритроцитах, замороженных прямым погружением в жидкий азот.

Показано, что криоконсервирование цельной кордовой крови по методу КЦКК не приводит к изменениям содержания таких биологически активных веществ плазмы кордовой крови как тироксин, трийодтиронин, тиреоидные гормоны, тестостерон и альфафетопротеин.

Установлена различная чувствительность популяций ядросодержащих клеток к факторам криоконсервирования. Показано, что наблюдаемое после размораживания увеличение относительного содержания лимфоцитов и моноцитов происходит вследствие того, что клетки гранулоцитарного ряда наиболее чувствительны к воздействию низких температур.

С помощью метода проточной цитофлуориметрии установлено, что нарушение липидной асимметрии, как при обработке криопротектором ПЭО-1500, так и после замораживания по всем изучаемым режимам происходит лишь у незначительной части лимфоцитов и моноцитов, а высокое количество аннексин-меченых клеток в общей популяции ядросодержащих клеток обусловлено значительным процентом таких клеток в популяции гранулоцитов.

Показано, что криоконсервирование цельной кордовой крови по режиму КЦКК позволяет сохранять до 77% аннексинV^-/7AAD^--клеток. При этом все популяции ЯСК демонстрируют зависимость количества жизнеспособных клеток от температуры предобработки крови криопротектором. Обработка ПЭО-1500 при 0-4⁰С обеспечивает сохранность клеток в жизнеспособном состоянии в большей степени, по сравнению с обработкой при 20-22⁰С. Полученные данные близки к таковым после замораживания крови по оптимальному для ядросодержащих клеток режиму.

Таким образом, можно заключить, что в результате проведенной работы был разработан метод криоконсервирования цельной кордовой крови с сохранением в ней после размораживания эритроцитов, ядросодержащих клеток (в том числе стволовых гемопоэтических) и биологически активных веществ плазмы на достаточно высоком уровне.

Ключевые слова: кордовая кровь, популяции ядросодержащих клеток, стволовые гемопоэтические клетки, эритроциты, криоконсервирование, криопротектор ПЭО-1500.

Annotation

Zubova O.L. Structural-functional condition of cord blood cell populations after cryopreservation with the nonpenetrating cryoprotectant PEO-1500.- Manuscript.

Dissertation for the candidate of biological science degree (PhD equivalent) in the speciality 03.00.19 - Cryobiology.- Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of Science of Ukraine, Kharkiv, 2009.

The dissertation is devoted to study of cord blood cell populations influenced by cryopreservation depending on incubation temperatures of cells with the cryoprotectant PEO-1500 and regimens of cooling suspensions. It has been established that freezing at the rate of 60^oC/min up to -40^oC before a dip in liquid nitrogen with a preliminary processing with the cryoprotectant PEO-1500 (the regimen CWCB) is an optimal regimen for simultaneous preservation of erythrocytes and nucleated cells including stem hemopoietic ones in comparison with other freezing regimens. Erythrocytes frozen in the whole blood according to the regimen CWCB are characterized by a high safety both right after thawing and after a simulative transfusion. The basic functional indices of cells such as ATP and 2,3-diphosphoglycerate contents are remain unchanged after thawing. PAAG electrophoresis with diamide as a protein crosslinking agent showed that cryopreservation of the whole blood according to the regimen elaborated caused changes in spatial arrangement of erythrocyte membrane proteins, which corresponded completely with the results obtained when erythrocytes were frozen by the optimal for this type of cells regimen- a direct dip in liquid nitrogen. It was found that cryopreservation of the whole blood according to the regimen CWCB did not result in changes of cord blood plasma biologically active substances such as testosterone, thyreotropin, thyroid hormones and alfa-fetoprotein.

Different sensitivities of nucleated cell populations to cryopreservation factors were observed: minor populations of lymphocytes and monocytes were more cryotolerant, while cells from granulocytic series were more sensitive to low temperature influence. It was discovered that disorders in lipid asymmetry during the cryoprotectant PEO-1500 processing as well as after freezing by all the regimen studied occurred in a minute part of lymphocytes and monocytes only; and a big quantity of annexin-labeled cells in the total population of nucleated cells was due to a high percentage of these cells in granulocyte population. The assessment of apoptosis stages in nucleated cells depending on freezing regimens demonstrated that cryopreservation of the whole blood according to the regimen CWCB allowed to save up to 77% of annexinV^-/7AAD^-cells. The data obtained were close to those after freezing blood by to an optimal for nucleated cells regimen.

Key words: cord blood, nucleated cell populations, hemopoietic stem cells, erythrocytes, membrane, cryopreservation, cryoprotectant PEO-1500.

Размещено на Allbest.ru

...