Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ БІОРЕСУРСІВ І ПРИРОДОКОРИСТУВАННЯ УКРАЇНИ

УДК:632.1: 635.21

06.01.11 - фітопатологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

СТІЙКІСТЬ КАРТОПЛІ ПРОТИ ЗБУДНИКА РАКУ (SYNCHYTRIUM ENDOBIOTICUM (SCHILB.) PERC.), МЕТОДИ ЙОГО ВИЯВЛЕННЯ І ДИФЕРЕНЦІАЦІЇ

ЗЕЛЯ АВРЕЛІЯ ГЕОРГІЇВНА

Київ - 2009

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Національному університеті біоресурсів і природокористування України Кабінету Міністрів України

Науковий керівник - доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Мельник Павло Олексійович, Українська науково-дослідна станція карантину рослин УААН, завідувач відділу фітопатології, директор

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, професор, член-кореспондент УААН ЦИЛЮРИК Анатолій Васильович, Національний університет біоресурсів і природокористування України, професор кафедри біології лісу і мисливствознавства

кандидат біологічних наук ЗАХАРЧУК Наталія Анатоліївна, Інститут картоплярства УААН, вчений секретар

Захист відбудеться " 22 " травня 2009 р. о 12.00 год. на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.004.02 у Національному університеті біоресурсів і природокористування України за адресою: 03041, м. Київ-41, вул. Героїв Оборони, 15, навчальний корпус №3, ауд. 65

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного університету біоресурсів і природокористування України за адресою: 03041, м. Київ-41, вул. Героїв Оборони, 13, навчальний корпус №4, к. 28

Автореферат розісланий " 22 " квітня 2009 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради М.С. Мороз

Анотації

Зеля А.Г. "Стійкість картоплі проти збудника раку (Synchyntrium endobioticum (schilb.) Perc., методи його виявлення і диференціації".-- Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 06.01.11 - фітопатологія. Національний університет біоресурсів і природокористування України, Київ, 2009.

Дисертаційна робота присвячена аналізу стійкості проти раку селекційного матеріалу картоплі, отриманого при різних комбінаціях схрещування вихідних батьківських форм, ролі білків та їх амінокитслотного складу в стійкості картоплі, а також у розвитку пухлин у рослин картоплі при зараженні збудником раку, розробки методів виявлення і диференціації збудника хвороби. рак пухлина картопля

Виявлена донорська здатність стійкості проти раку диких видів картоплі Solanum demissum.

На основі модельних дослідів установлено різну якість білкового спектра та його амінокислотного складу при зараженні стійких та сприйнятливих до раку сортів картоплі. Також установлено різницю при враженні рослин картоплі патотипами збудника раку Synchyntrium endobioticum (schilb.) Perc. Розроблено експрес-методи виявлення і диференціації патогену.

Результати досліджень використано для виявлення збудника хвороби, його диференціації та ідентифікації патотипів збудника раку у вогнищах.

Вивчення ступеня стійкості картоплі при її зараженні збудником раку методом інфрачервоної спектроскопії та індукованою преципітацією використовано при діагностиці на ракостійкість. На їх основі розроблені методичні рекомендації для селекційної оцінки та відбору стійкого проти раку селекційного матеріалу картоплі.

Ключові слова: стійкі та сприйнятливі сорти та види картоплі, батьківські форми, схрещування, ізоелектрофокусування білків, амінокислотний аналіз, патотипи збудника раку, ступінь стійкості картоплі до збудника раку картоплі, інфрачервона спектроскопія, iндукована преципітація, виявлення, зооспорангії, флотація, диференціація, патотипи.

Зеля А.Г. "Устойчивость картофеля против возбудителя рака (Synchytrium endobioticum (Schilb.) Perc.), методы его выявления и дифференциации". - Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата биологических наук по специальности 06.01.11 - фитопатология. Национальный университет биоресурсов и природопользования Украины, Киев, 2009.

Диссертационная работа посвящена анализу устойчивости против рака селекционного материала картофеля, полученного при разных комбинациях скрещивания исходных родительских форм картофеля, роли белков в устойчивости картофеля, развитию опухолей у растений картофеля при заражении возбудителем рака, разработке методов выявления и дифференциации патотипов возбудителя рака картофеля. На основании результатов скрещивания различних комбинаций исходных родительских форм (устойчивый х устойчивый, устойчивый х восприимчивый, восприимчивый х устойчивый и восприимчивый х восприимчивый к раку) установлено соответсвенно 100%, 56%, 54% и 6 % ракоустойчивых потомков.

Выявлена донорская способность передачи ракоустойчивости диких видов картофеля S. demissum и сортов, полученных в результате их скрещивания.

Анализованый белковый спектр комбинации скрещивания родительской форми устойчивый х восприимчивый к раку Полесский розовый х Гитте и полученного потомства и выявлено, что у представителя дикого вида S.demissum сорту Гите (устойчивый к раку) представленный 38 компонентами; сорт Полесский розовый (представитель культурного вида S.tubеrosum) представленый 32 компонентами. По данному признаку рекомендовано отбирать устойчивые исходные формы для скрещивания и получить ракоустойчивое потомство. Установлено различное качество белковых спектров и их аминокислотного состава при заражении устойчивых и восприимчивых к раку сортов картофеля. Разразботан экспрес-метод выявления возбудителя рака. Также установлено различие при заражении растений картофеля патотипами возбудителя рака Synchytrium endobioticum (Schilb.) Perc. Содержание белка у исследованных 5 патотипов колебалась в пределах 202,3 - 257,9 мкг/г. В результате проведенного изоэлектрофокусирования белков патотипов возбудителя болезни в диапазоне рН 3,5 - 10,0 выявлен своеобразный белковый спектр, уникальный для каждого из 5 патотипов, распространенных в Украине. По данным признакам рекомендовано провести дифференциацию и идентификацию существующих патотипов возбудителя и новых выявленных изолятов болезни. Разработаны методические рекомендации по выявлению возбудителя рака в агроценозах и грузах.

Изучение степени устойчивости картофеля при заражении возбудителем рака методом инфракрасной спектроскопии и индукованнной преципитацией рекомендовано использовать при испытании селекционного материала картофеля на ракоустойчивость. На их основе разработаны новые методические рекомендации для отбора и оценки картофеля устойчивого к раку.

Ключевые слова: устойчивые и восприимчивые сорта и виды картофеля, гибриды, исходные родительские формы, изоэлектрофокусирование белков, аминокислотный анализ, степень устойчивости картофеля к возбудителю рака картофеля, инфракрасная спектроскопия, индуцированная преципитация, выявление, зооспорангии, флотация, патотипы, дифференциация.

Zelуa A.G. Potato resistance against wart Synchytrium endobioticum (Schilb). Perc..its detection and differentiation methods. - Manuscript.

Thesis for acquiring the scientific degree of "Candidate of Biological Sciences" in the field of 06.01.11 - Phytopatology. National University of Life and Environmental Science of Ukraine, Kyiv, 2009.

The thesis is dedicated to ascertaining contrast peculiarities according to cancer-resistance of different species and sorts of potatoes, as well as to the development of tumours on potato plants infected with the agent of cancer. On the basis of model tests a various quality of albuminous spectrum and its aminoacid composition was determined by means of infecting cancer-resistant and cancer-susceptible sorts of potatoes. The distinction between potato plants infected with the pathotypes of the agent of cancer Synchyntrium endobioticum (Schilb). Perc. was established.

The results of biochemical researches were used for the detection of the agent of a disease, its differentiation and identification of pathotypes of the agent of cancer in the centres.

The study of a degree of potato resistance to the infection with the agent of cancer by means of infrared spectroscopy can be used for diagnostics on resistance.

Key words: resistant and susceptible sorts and wild species of potatoes, isoelectrofocusing of albumens, aminoacid analysis, pathotypes of the agent of cancer, degree of potato resistance to the agent of potato cancer, infrared spectroscopy, precipitaced., pathotypes, differentiation.

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Серед захворювань картоплі надзвичайно небезпечний рак, який викликається внутрішньоклітинним облігатним паразитом - грибом Synchytrium endobioticum (Schilb.) Perc. Він є чинником значного зниження врожайності цієї важливої культури, через що його включено до переліку карантинних захворювань 55 країн світу. За останні роки (Мельник П.О.,2003) площа вогнищ раку картоплі досягає в України 8634 га. Фітосанітарний стан по раку картоплі в Україні залишається складним, особливо після виявлення в гірсько-карпатському регіоні агресивних патотипів збудника хвороби, де є сприятливі умови для їх утворення (Салтикова Л.П.,1984). Агресивні патотипи збудника хвороби уражують близько 90% сортів картоплі, стійких до звичайного, слабоагресивного Д 1 (далемського) патотипу (Яковлева В.О.,1986).

Найбільш ефективним заходом боротьби зі збудником раку картоплі є впровадження в сільськегосподарське виробництво ракостійких сортів. Створення стійких до раку сортів картоплі потребує глибоких знань закономірностей патогенезу в системі рослина - живитель - патоген, а також особливості збудника хвороби в популяціях. Тому для вирішення проблеми оцінки та відбору стійкого до раку селекційного матеріалу картоплі необхідно вдосконалити та розробити нові методи вивчення збудника і діагностики стійкості картоплі до патогену.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалась на кафедрі фітопатології Національного університету біоресурсів і природокористування України на базі Української науково-дослідної станції карантину рослин УААН і є частиною планової науково-дослідної роботи по темі "Розробити та вдосконалити заходи контролю обмежено розповсюдженого карантинного організму - збудника раку картоплі Synchytrium endobioticum (Schilb.) Perc" (УДК 632. 92,632.911. № державної реєстрації РК 02.02.01.0105 U005394 (2001--2006 p.).

Мета і завдання дослідження. Мета дослідження - аналіз передачі стійкості різних комбінацій схрещування батьківських вихідних форм картоплі, вивчення якісного та кількісного складу білків і амінокислот сортів та видів картоплі за нормальних умов, а також при дії на них збудника раку Synchytrium endobioticum (Schilb.) Perc. для встановлення різниці даних показників і розробки методів виявлення, диференціації патогену, визначення стійкості рослин картоплі проти патогену. Для досягнення цієї мети ставились такі завдання:

- проаналізувати механізм передачі стійкості картоплі проти раку при використанні різних комбінацій схрещування вихідних батьківських форм;

- вивчити якісний та кількісний склад білків рослин картоплі та їх амінокислот;

- вивчити склад білків і амінокислот у динаміці зараження картоплі патогеном;

- установити певні характеристики білкового складу стійких та сприйнятливих до раку сортів та видів картоплі за нормальних умов і при зараженні їх патотипами збудника раку картоплі;

- розробити методи виділення зооспорангіїв збудника раку, диференціації та ідентифікації патотипів збудника хвороби та визначити стійкість картоплі до патогену.

Об'ект дослідження. Стійкі та сприйнятливі проти раку сорти і гібриди картоплі, зооспорангії збудника раку картоплі, патотипи збудника хвороби.

Предмет дослідження. Аналіз стійкості проти раку сортів та гіридів картоплі при різних комбінаціях схрещування, вдосконалення методів виявлення та диференціації збудника раку, визначення стійкості картоплі проти збудника хвороби.

Методи дослідження. Загальноприйняті та вдосконалені методи визначення ракостійкості, виявлення збудника раку картоплі флотацією в чотирьоххлористому вуглеці, хлороформі, сахарозі та розчині натрію йодистого, диференціація патотипів збудника раку методом ізоелектрофокусування в поліакриламідному гелі, вивчення вмісту білкових комплексів спектрофотометричним способом.

Наукова новизна одержаних результатів. Проведено порівняльне дослідження стійкості до раку різних комбінацій схрещування вихідних батьківських форм картоплі та їх гібридів. Виявлено, що в комбінації схрещування вихідних батьківських форм картоплі стійкий х стійкий до раку отримано 100% нащадків стійких до звичайного патотипу збудника раку. В комбінації схрещування батьківських вихідних форм картоплі сприйнятливий х стійкий та стійкий х сприйнятливий до раку отримано до 56 % та 54% стійких гібридів картоплі. У випадку схрещування сприйнятливий х сприйнятливий отримано лише 6% стійких до раку гібридів картоплі.

Виявлена донорська здатність стійкості до раку гексаплоїдних диких видів картоплі Solanum demissum.

Проаналізовано якісний та кількісний склад білків та амінокислот різних за стійкістю до раку сортів культурних та диких видів картоплі, а також у динаміці зараження збудником раку. Встановлено різницю електрофоретичного складу білків та вміст амінокислот контрастних за ракостійкістю сортів картоплі (Зеля А.Г.та інш. пат.№ 10504 від 15.11.2005р.) Дослідження кількісного та якісного складу білків вихідних батьківських форм картоплі, що належать до диких видів з гексаплоїдним набором хромосом і отриманих після схрещування гібридів дозволили виявити залежність їх стійкості до раку з плоїдностю, що дає можливість підбирати батьківські пари для схрещування та прогнозувати вихід стійких гібридів.

У процесі патогенезу у сприйнятливих зразків картоплі встановлено зменшення загального вмісту білка та компонентів у електрофоретичних спектрах на весь період розвитку хвороби. У стійких зразків, у тому числі представників видів Solanum demissum виявлено стресові білки, що синтезуються протягом 21 доби після зараження патогеном, як відповідь на захисну реакцію рослини-живителя.

При вивченні амінокислотного складу сприйнятливих сортів виявлено підвищення вмісту глютамінової кислоти, цистеїну та цистину. У стійких сортів картоплі встановлено підвищення вмісту аланіну, лейцину та їзолейцину. Отримані дані пропонується використати як показники стійкості картоплі до раку.

Розроблені методи інфрачервоної спектроскопії (Зеля А.Г. та інщ., пат. № 17048 від 15.09.2006р.) та індукованої преципітації (Зеля А.Г. та інш., пат. № 24113 від 25.06.2007р.) дозволяють визначити ступінь стійкості селекційного матеріалу картоплі проти збудника раку.

Розроблено експрес-метод виявлення, визначення життездатності та ідентифікації зооспорангіїв збудника раку шляхом флотації в 48,5% розчині натрію йодистого. що дозволяє одночасово виділяти збудника та визначити його життездатність (Зеля А.Г. та інш., пат. № 17049 від 15.09.2006р.). Встановлено якісні та кількісні особливості білкового складу патотипів збудника раку картоплі. За даними ознаками розроблено метод диференціації та ідентифікації патотипів збудника раку (Зеля А.Г. та інш., патенти № 17050 та № 17156 від 15.09.2006р). Відібрані нові тест-сорти картоплі української селекції для диференціації та ідентифікації патотипів збудника хвороби. Розроблено метод індукованої преципітації для диференціації патотипів Synchytrium endobioticum (Schilb). Perc.

Практичне значення отриманих результатів. На основі модифікованих методик виділення зооспорангіїв збудника раку з ґрунту та змивів із поверхні бульб картоплі розроблено експрес-метод виявлення патогену та методичні рекомендації з виявлення збудника у вантажах і агроценозах, які використовуються карантинними інспекціями при виявленні даного карантинного організму у польових умовах та при митному догляді вантажів.

На основі виявлених якісних і кількісних особливостей білків патотипів збудника раку картоплі розроблено методи диференціації та ідентифікації патотипів збудника хвороби. Вони використовуються карантинними інспекціями при диференціації та ідентифікації нових патотипів та ізолятів патогена у виявленних вогнищах.

Отримані характеристики видів та сортів вихідних форм картоплі та їх гібридів використовуються селекційними установами для визначення успадкування стійкості селекційного матеріалу картоплі до раку при підборі вихідних форм картоплі для схрещування й отримання ракостійкого потомства.

Нові методи діагностики стійкості картоплі до збудника раку інфрачервоною спектроскопією та індукованою преципітацією рекомендуються для випробування селекційного матеріалу картоплі на стійкість до раку. На їх основі розроблені нові методи відбору селекційного матеріалу картоплі, стійкого до хвороби.

Особистий внесок здобувача. Особистий внесок автора є основним в отриманні наукових результатів, викладених у дисертації, і полягає у постановці мети, формуванні обсягів і визначенні методів досліджень; у виконанні основного обсягу експериментальної роботи; в аналізі та узагальненні результатів; статистичній обробці матеріалів; апробації отриманих результатів і підготовці наукових праць до друку; написанні та оформленні дисертації. Аналіз і обговорення результатів досліджень проведено спільно з науковим керівником.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи доповідались на Всеросійській конференції з імунітету рослин до хвороб та шкідників, прісвяченій 300 річниці Санкт-Петербургу (Санкт-Петербург, Росія, Всеросійській науково-дослідний інститут захисту рослин, 2002 р.), на першому Міжнародному конгресі з картоплярства (Москва, Росія, 21-24 серпня, 2007р.), на Європейській фітосанітарній конференції картоплі та інших продовольчих культурах (Чернівці 06 - 10 жовтня, 2008р.), а також на засіданнях вченої ради Української науково-дослідній станції карантину рослин УААН (Бояни, 2002--2008 рр.).

Публікації. На основі матеріалів дисертації автором та за його участю опубліковано у виданнях ВАКу 7 наукових статтей, 4 тези доповідей, отримано 6 патентів на корисну модель, 3 свідоцтва на сорти картоплі, розроблено 2 методичні рекомендації.

Структура та обсяг дисертаційної роботи. Дисертаційна робота складається зі вступу, шести розділів, висновків, пропозицій виробництву. Робота викладена на 146 сторінках друкованого тексту і включає 1 схему, 37 рисунків, 6 таблиць, 9 фото, 37 додатків. Список використаної літератури складається з 265 найменування, серед яких 85 іноземних.

Основний зміст роботи

В огляді літератури висвітлено значення картоплі в народному господарстві, основні хвороби картоплі, в тому числі карантинні, серед яких найнебезпечнішою є рак (збудник хвороби - Synchytrium endobioticum (Schilb.) Perc.). Показано біологічну спеціалізацію збудника раку та внутрішньовидову мінливість гриба. Дано характеристику патотипів збудника раку картоплі. Висвітлено методи виявлення, диференціації та ідентифікації патогену, основні біохімічні показники рослин у нормі та при ураженні хворобами, а також методи визначення стійкості рослин до патогенів.

Матеріали і методи досліджень. У роботі використовували стійкі до збудника раку сорти картоплі: Темп, Невська, Луговська, Барбара і представників диких видів: Solanum demissum, Solanum stoloniferum, Solanum rybinii, Solanum chacoense та сприйнятливі до раку сорти: Вале, Поліська рожева, гібрид П 85 145-5; вихідні батьківські форми картоплі Гитте, Поліська рожева, а також гібриди, отримані після різних комбінацій схрещування, представлені Інститутом картоплярства УААН, а також Поліською дослідною станцією ІК УААН; ракові нарости, отримані після зараження cприйнятливих сортів картоплі. Для зараження використовували зооспорангії звичайного патотипу збудника раку картоплі та 4-х агресивних: 11 - Міжгірського, 13 - Рахівського, 18 - Ясинського та 22 - Бистрецького патотипів збудника хвороби.

Вивчення вмісту та поліморфізму білків картоплі та аналіз їх амінокислотного складу. Білки виділяли за методом Гааль Е., Медьєші Г. та Верецького Л. (1982). Їх вміст визначали за методом Bradford T (1986). Як стандарт використовували сироватку бика.

Поліморфізм білків контрастних за ракостійкістю сортів картоплі, у процесі патогенезу, а також патотипів збудника раку картоплі вивчали методом ізоелектрофокусування при використанні амфолінів з інтервалом pH 3,5--10,0 (Рігетті Т., 1986) на приладі АГГЕ--3 фірми "Хійу Калур" в ПААГ при Т = 5%, С = 3%. Для розділення білків використовували буферні розчини, кислоти і луги. Білкові екстракти ізоелектрофокусували протягом 2-х годин при напрузі 600 В і силі струму 15 мА. Гелі фіксували в 15% ТХО кислоті і фарбували 0,5% розчином Coomassie blue G--250 на суміші ТХО : етанол: вода (10 : 25 : 65) протягом 30 хвилин. Розрахунок білкових компонентів проводили за допомогою комп'ютерної програми, удосконаленою співробітниками УкрНДСКР (2008).

Амінокислотний склад білків сортів картоплі, а також заражених рослин збудником раку вивчали за методом Плешкова Б.П. (1986) на амінокислотному аналізаторі JLC--6 фірми JEOL (Японія).

Гідроліз білків проводили з 6 н HCl протягом 24 годин при 105?С у співвідношенні кислоти до білка 100 : 1 в запаяних ампулах. Хроматографію амінокислот проводили, використовуючи 0,2 н Na-цитратний буфер pH 3,25, 0,25 н Na-цитратний буфер pH 4,25 і 0,35 н Na-цитратний буфер pH 5,28, фарбували нінгідриновим реактивом. В якості стандарту використовували стандартний розчин амінокислот і отримали стандартну хроматограму, за винятком триптофану.

Визначення триптофану проводили окремо, оскільки при кислотному гідролізі він руйнується. Зразки білків розчиняли в 0,2 н NaOH при слабкому нагріванні, додавали 23,7 н сірчану кислоту + 0,03% парадиметиламінобензольдегід і заливали на 12 годин. Потім додавали 0,1 мл 0,045%-ного розчину азиду натрію і після 30 годин визначали оптичну щільність на спектрофотометрі СФ--26 при 600 нм. Для контролю брали воду.

Статистичну обробку отриманих даних проводили за методом Ю.І. Маслова (1988).

Визначення стійкості картоплі до збудника раку

Метод 1. Визначення стійкості сортів та гібридів картоплі до збудника хвороби проводились методом Салтикової Л.П. та Яковлевої В.І. (1982) прямого зараження зразків зооспорангіями від свіжих ракових наростів. Зразки бульб картоплі у фазі, коли паростки досягали 1 - 2 мм заражали літніми зооспорангіями протягом 24 годин при 11 - 13?С. Для цього на верхівку бульби картоплі навколо паросткової частини закріплювали паперове кільце за допомогою суміші парафіну та вазеліну (1 : 0,5). В кільце наливали дистильовану воду, клали свіжі ракові нарости розміром 0,5 см 3. Зразки залишали в клімокамері з підвищеною вологістю і температурою 11 - 13?С. Час експозиції 24 години. Інфекцію з паперовими кільцями знімали з бульб, а зразки залишали в темряві на 21 добу при температурі 17 - 18?С до прояви симптомів захворювання. На 21-й день проводили облік уражених бульб картоплі. Для діагностики використовували 3 ступені (групи) оцінки.

Метод 2. Визначення ракостійкості картоплі за допомогою білкового екстракту, виділеного з ракових наростів, відокремлених від рослин сприйнятливих сортів картоплі проводили за методикою, запропонованою Яковлевою Н.М. та Кадирматовим І.Н. (1973). При цьому ракові нарости розтирали у фарфоровій ступці з рівним об'ємом калій-фосфатного буфера, який містив 12,5% глюкози, 1% аскорбінової кислоти, 1% метабісульфіту калію та 0,018% MgCl2, pH 7,4. Гомогенат витискали крізь капронову сітку і центрифугували 25 хвилин при 12000 об./хв. При цьому білки виділялися у супернатанті, а залишки випадали в осад. Супернатант очищали через колонку із сафадексом G--25, врівноваженим буфером, який вміщував 4,66% трису; 0,59% ЕДТА-натрію та 0,3 г борної кислоти, pH 8,6. Екстрактом заражали листки картоплі.Облік проводили на 21 день після зараження екстрактом за 3-х бальною шкалою.

Метод 3. Визначення ракостійкості картоплі методом інфрачервоної спектроскопії проводили таким чином: зразки картоплі заспорювали літніми зооспорангіями зі свіжих ракових наростів, як було вказано вище. З уражених бульб на 21-й день після зараження паростки поміщали у кювети і аналізували на інфрачервоному аналізаторі ІФА--61. При аналізі використовували довжину хвиль 1510 нм. З метою підвищення точності аналізу за результат брали середнє із трьох значень, отриманих при повороті кювети на 90?. Ступінь стійкості картоплі до збудника раку визначали за формулою:

,

де: К - константа градуйованого рівняння;

ОГ - оптична густина при (W) - аналітична довжина хвилі (1510 нм);

У - ступінь стійкості зразків картоплі до збудника раку (в %).

Метод 4. З паростків різних сортів картоплі а також з ракових наростів виділяли білковий екстракт таким чином: 2 г наростів подрібнювали і розтирали з 2 мл 5М боратним буфером (рН 8,4), . Гомогенат віджимали крізь капронову сітку і центрифугували 10 хвилин при 12000 об/хв. При цьому білки виділяються в супернатанті, а залишки випадали в осад. Супернатант 7 мл очищують через колонку з сефадексом G - 25, врівноважену буфером, який вміщував той же боратний буфер (рН 8,4).Після початку виходу білка відбирали 2 - 3 мл і зберігали в холодильнику при 4 - 6 С. Для визначення ступеню індукованої преципітації при утворенні комплексів рослина-хазяїн-патоген додавали рівну кількість (1мл) білкового екстракту з рослин картоплі + екстракт з ракового наросту + 4% розчин поліетиленгликолю і при температурі 18 С на протязі 1 години визначають утворення комплексів. На спектрофотометрі "Ломо-26" при довжини хвилі 450нм визначали величину пропускання світла Р (в %) за формулою: Р= Ро - Рк (Рпег - Рбуф.) де Р - підсумковий результат проби в відсотках пропускання світла, або одиниця оптичної щільності, Ро - відсоток пропускання світла дослідного зразка, Рк - контрольної, Р пег - 40 поліетиленгликолю та величину екстинкції: Е = -lg P. Концентрацію комплексів (в г/л) визначали за формулою Е= кС, де Е - величина екстинкції, к - коефіціент пропускання світла, С - концентрація комплексу білка рослина-живитель-патоген.

Розробка методів виявлення та диференціації патотипів збудника раку. Проби зразків грунту для виявлення зооспорангіїв збудника раку картоплі відбірали за схемою конверту, квадрату, трикутника та човника. Виявлення патогену проводили за методом Шарикова К.Е.(1964) - флотацією в розчині чотирьоххлористого вуглеця, Голика І.В. (1974) - флотацією в суміші чотирьоххлористого вуглеця та ефіру для наркозу (2:1), Володимирської Н.М.(1978) - флотацією у діброметані, Яковлевої В.О.(1984)- флотацією в чотирьоххлористому вуглеці та фарбуванням в бромистому етідію та розробленим експрес- методом флотації в 48,5% розчині натрію йодистого (Зеля А.Г.,2006). Диференціацію патотипів збудника хвороби проводили способом ізоелектрофокусування білків в поліакриламідному гелі в градіенті рН 3.5 - 10.0 (Сологуб О.С., 2006), визначенням вмісту білка у різних патотипів збудника раку (Зеля А.Г., Мельник П.О., 2006) та методом індукованої преципітації тест-сортів картоплі та патотипів збудника хвороби.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Аналіз стійкості вихідних батьківських форм картоплі та їх гібридів проти збудника раку.

В результаті проведених досліджень з вивченню реакції вихідних батьківських форм картоплі та гібридів, отриманих після їх схрещування виявлено що в випадку використання комбінації за схемою: сприйнятливий х стійкий (Поліська рожева х Гітте), отримано 54% стійких проти раку гібридів.

У випадку використання комбінації схрещування батьківських вихідних форм за схемою: стійкий х сприйнятливий (Гітте х Поліська рожева) отримано 56% стійких до раку нащадків картоплі. В даних випадках сорт картоплі Гітте є представником диких видів картоплі Solanum demissum і є гексаплоїдом (6n). Сорт картоплі Поліська рожева є представником культурного виду Solanum tuberosum і є тетраплоїдом (4n).

У випадку використання комбінації схрещування за сх емою: стійкий х стійкий (Гітте х П 88 128-7), з яких одна батьківська форма отримана в результаті схрещування диких видів отримано 100% стійкого проти раку селекційного матеріалу картоплі. При схрещуванні сортів культурних видів отримано 100% стійких проти раку гібридів

У разі використання для схрещування комбінації схрещування за схемою: сприйнятливий х сприйнятливий, отримано 6% стійкого селекційного матеріалу картоплі. У нашому випадку такими представниками стали сприйнятливий до раку сорт Поліська рожева та гібридП 85 145-5

Результати отримані на основі експериментальних досліджень проведених в лабораторних та польових умовах 2002-2004рр. в лабораторії карантину рослин УкрНДСКР і польовому стаціонарі.

Отже, найбільший вихід стійких гібридів картоплі спостерігалось при використанні вихідних батьківських форм представників Solanum demissum, що також виявлено Хютті О.В. (2008).

Вивчення вмісту та поліморфізму білків картоплі

У результаті вивчення вмісту білків у аналізованих видів і сортів картоплі виявлено 212,6--523,2 мкг/г загального білка

У зразків картоплі представників диких видів виявлено до 523.2 мкг/г загального білка. У представників культурних видів картоплі вміст білка коливався у межах 212.6 - 230.0 мкг/г.

У результаті проведеного ізоелектрофокусування білків в ПААГ стійких та сприйнятливих до хвороби сортів картоплі, виявлено, що у всіх досліджуваних стійких сортів і видів та сприйнятливих сортів картоплі різна кількість білкових компонентів. Вона коливається у межах 32--54 компонентів. Кожний сорт картоплі відрізняється своїм білковим набором.

Отримані нами результати вивчення відмінностей білкового складу різних за ракостійкістю сортів картоплі узгоджуються з дослідженнями Голика І.В. (1974), Деревенко О.С. (1986), Кадирматова І.Н. (1993).

У ряді праць з порівняльного вивчення поліморфізму білків різних за стійкістю до хвороб рослин установлено також різницю між ними за цим біохімічним показником (Громова Б.Б., Шопина О.В., Патрикеева М.В., 1992).

Амінокислотний склад білків картоплі

У зв'язку з тим, що нами знайдено відмінності у складі білкових компонентів контрастних за ракостійкістю сортів картоплі доцільно провести аналіз їх амінокислотного складу. Для дослідження використовували білкові екстракти паросткової частини бульб картоплі високостійкого до звичайного та агресивних патотипів збудника раку сорту Божедар і сприйнятливого до всіх патотипів збудника хвороби сорту Поліська рожева.

Порівняльна оцінка амінокислотного складу білків даних сортів дозволила виявити їх схожість за кількістю двоосновних амінокислот (лізину, гістидину й аргініну). Із амінокислот, що містять сірку, був виявлений цистеїн і цистін.

Зафіксовано присутність треоніну і серину (4.5 та 5.0%), а вміст гліцину, аланіну був майже однаковий у даних сортів картоплі. Для них характерна велика кількість дикарбонових амінокислот: глютамінової, аспарагінової. Іх кількість відповідно складає 11,0% і 10,6% у сорту Божедар і 9,0% і 10,8% у сорту Поліська рожева. Аналізуючи склад незамінних амінокислот - лізину, треоніну, метіоніну, лейцину, ізолейцину, валіну, триптофану і фенілаланіну, які входять до складу білків картоплі, можна побачити значну різницю: їх сума у стійкого проти збудника раку сорту картоплі Божедар становите 41,6%, а у сприйнятливого до раку сорту Поліська рожева - 43,8%. Вміст амінокислот зростає в основному за рахунок триптофану і незначно - фенілаланіну, лізину. лейцину, ізолейцину. У сприйнятливого проти раку сорту картоплі Поліська рожева вміст амінокислот вищий, ніж у стійкого сорту Божедар. Відомо, що картопля тим і ціниться, що вона містить важливі для людини всі 8 незамінних амінокислот, хоча уражається інтенсивно раком картоплі та іншими збудниками хвороб і шкідників.

Ліпсиц Д.В. (1987), аналізуючи білковий склад сортів картоплі, а також вміст амінокислот стійких і сприйнятливих сортів методом хроматоелектрофорезу виявив у сприйнятливого до раку сорту більше амінокислот, ніж у стійкого.

Мельником П.О. (2003) отримано аналогічні результати при вивченні амінокислотного складу різних за ракостійкістю сортів картоплі.

Нашими дослідженнями уточнено амінокислотний склад білків у контрастних за ракостійкістю сортів картоплі на сучасному амінокислотному аналізаторі, який дозволяє більш точно визначити вміст кожної амінокислоти. Це дає змогу детальніше вивчити, як відрізняються ці показники при зараженні картоплі збудником раку. Тому наступним етапом досліджень було вивчення ролі білків у стійкості рослин проти збудника раку.

Вивчення вмісту та поліморфізму білків картоплі у процесі патогенезу

Відомо, що найбільш чутливим до дії різних факторів на рослину, в т. ч. патогенів, є білки. Тому наступним етапом вивчення з біохімічних показників був аналіз вмісту та поліморфізму білків шляхом їх ізоелектрофокусування у ПААГ при зараженні контрастних за ракостійкістю сортів картоплі Поліська рожева (сприйнятливий до раку) та Божедар (стійкий до патогену).

При визначенні вмісту білка контрастних за ракостійкістю сортів картоплі Поліська рожева та Божедар у процесі їх зараження збудником раку на 21-у добу у сорту Поліська рожева виявлено зменшення загальної кількості білка від 223,4 до 202,3 мкг/г, а у сорту Божедар - збільшення від 329,8 до 356,3 мкг/г.

Отримані результати з вивчення поліморфізму білків у процесі патогенезу збудника раку картоплі вказують на те, що у пухлинних клітинах відбувається не тільки змінений біосинтез білків, на що вказували експерименти Ліпсица Д.В. (1974), Голика І.В. (1974), але і якість синтезованих білків змінена.

При зараженні стійкого до раку картоплі сорту Божедар у білковому спектрі з'являються додаткові білкові компоненти на 14-у добу (цьому періоду дорівнює цикл розвитку патогену у рослини-живителя), що можна пояснити тим, що ці поліпептиди є стресовими або патогенозалежними білками рослини-хазяїна, які виконують захисну функцію рослини при ураженні її патогеном.

При зараженні сприйнятливого до раку сорту картоплі Поліська рожева у білковому спектрі зменшується кількість білкових компонентів до 28 (на 21-у добу після зараження).

У літературі є небагато оглядів про білки, що виконують захисну функцію (Горбачова Л.Д., Дударєва Н.А., Салганик Р.І. (1991) при дії на рослини різних факторів. Стресові або патогенозалежні білки (PR-білки) не є нормальними компонентами здорових клітин, а якщо містяться в нативній тканині, то у залишковій кількості. Відомо, що PR-білки володіють деякими загальними властивостями: низькою молекулярною масою, крайніми ізоелектричними точками, високою стійкістю до дії протеїназ, локалізацією їх у позаклітинному просторі та здатністю екстрагуватися при низьких значеннях pH. Є також дані, що в деяких рослинних PR-білків виявлено хітиназну та глюконазну активність, а хітин і глюкани, як відомо, - це компоненти, що входять до складу покривних тканин фітопатогенів. Можливо, існують ще інші, поки що невідомі функції і механізми дії PR-білків, пов'язаних зі стійкістю рослин до хвороб. Синтез заново і накопичення великої кількості низькомолекулярних кислих білків у міжклітинному просторі зумовлює зміну властивостей зовнішньої частини і має фізіологічне значення, а також відіграє певну роль у взаємодії клітин, метаболізмі та захисті клітинної стінки.

Поява додаткових білкових фракцій при зараженні стійкого до раку сорту картоплі Божедар патогеном на 14-туі 21-у добу після зараження поясняється синтезом стресових білків.

Отримані дані узгоджуються із проведеними дослідженнями інших авторів. У ряді праць із порівняльного вивчення стресових білків при дії на рослини різних факторів та фітопатогенів також установлено певні відмінності за їх фракційним складом (Григорюк І.П. (1996), Шматько І.Г., Шведова О.В. (1989), Лісовий М.П., Сігарьова Д.Д., Сова В.М. (1996)). Ці автори рекомендують використовувати методику виявлення або аналізу PR-білків як експрес-метод діагностики ураження патогенами, а виявлення стресових або PR-білків - як біохімічні маркери стійкості до хвороб.

Особливості патотипів збудника раку картоплі

Вивчення вмісту білків патотипів збудника раку картоплі

При визначенні вмісту білків різних патотипів збудника хвороби виявлено різну кількість білка. Вона становила(мкг/г): у звичайного патотипу - 202,3 мкг/г, у 11 - Міжгірського агресивного патотипу - 226,8, у 13 - Рахівського --236,3, у 18 - Ясинського - 256,3, у 22 - Бистрецього - 257,9 мкг/г

Аналіз вмісту загального білка патотипів збудника раку картоплі (пат.№ 17156, 2006 р.) дозволяє ідентифікувати виявлені патотипи та нові ізоляти раку.

Поліморфізм білків патотипів збудника раку картоплі

Для порівняльного вивчення поліморфізму білків патотипів збудника раку використовували білки з ракових наростів 5 патотипів збудника хвороби.

У результаті їх ізоелектрофокусування у ПААГ було отримано своєрідні білкові спектри.

Білковий спектр Далемського (Д 1) патотипу представлений 28 компонентами, 11 - Міжгірського агресивного патотипу - 32, 13 - Рахівського агресивного - 42, 18 - Ясинського агресивного патотипу - 50, 22 - Бистрецького агресивного патотипу - 53

Виявлені білкові фракції звичайного й агресивних патотипів відрізняються як за кількістю, наявністю в них білка, так і за їх ізоелектричними точками. Проведені дослідження показали варіабельність білкових денситограм різних патотипів збудника раку картоплі. При їх порівнянні спостерігається відмінність між патотипами, зареєстрованими на території України за кількістю білкових компонентів в денситограмах. Зафіксовано індивідуальні особливості кожного патотипу за його білковому поліморфізму. На основі отриманих результатів розроблено спосіб диференціації патотипу збудника раку картоплі, який нами запатентовано (Сологуб О.С., Зеля А.Г., пат. №17050 від 15.09.2006р.).

Розробка методів визначення стійкості картоплі до збудника раку Synchytrium endobioticum (Schilb.) Perc.

Визначення стійкості картоплі до збудника раку методом інфрачервоної спектроскопії

Спосіб визначення стійкості картоплі до збудника раку, який запропоновано нами, засновано на зараженні паростків картоплі зооспорами з літніх зооспорангіїв свіжих ракових наростів патогену з наступним аналізом реакції паростків бульб картоплі на зараження хворобою на інфрачервоному аналізаторі ІФА - 61. при довжині хвилі 1510нм. Таким чином вдалося визначити ступінь стійкості картоплі до хвороби ((Пат № 17048, 2006 р.).

Процес визначення ступеня стійкості 57 зразків картоплі збудником раку на інфрачервоному аналізаторі склав 18 хвилин.

При діагностиці стійкості картоплі інфрачервоною спектроскопією для зараження використовується 1 г інфекційного матеріалу проти 10 г, які використовуються при інших методах.

Запропонований метод діагностики дозволяє визначити ступінь стійкості за значно коротший термін часу - 21 добу (при раніше використовуючих методах - протягом вегетаційного періоду розвитку картоплі - 3 місяців).

Визначення стійкості картоплі до збудника раку методом індукованої преципітації

За результатами аналізу здатності утворення комплексів зразків картоплі з патогеном у сприйнятливих сортів картоплі Поліська рожева, Вале, Гібрид П 95 145-5 коливається в межах 1,4 - 1,8 (мкг/г); у стійких сортів картоплі Божедар, Водограй, Подолянка находилась в межах 0,4 - 0,8 Концентрація комплексів рослина-живитель-патоген сприйнятливого до раку сорту картоплі Поліська рожева (1,6), сприйнятливого до раку сорту картоплі Вале (1,4), сприйнятливого до раку гібриду картоплі П 85 145-5 (1,8) та концентрацію комплексів рослина хазяїн- патоген стійкого до раку сорту картоплі Подолянка (0,6), стійкого до раку сорту картоплі Водограй (0,8)та стійкого до раку сорту картоплі Божедар (0,4 мкг/г). Концентрація даних комплексів знаходиться в прямій залежності від ступеня стійкості даних сортів картоплі до збудника раку Synchytrium endobioticum (Schilb.) Perc.

Дані методи були впроваджені в Інституті картоплярства УААН, на Поліській дослідній станції ІК УААН, в Інституті землеробства і тваринництва західного регіону УААН в 2003-2008рр. при випробуванні селекційного матеріалу картоплі на ракостійкість на загальну суму 186 тисяч гривень.

Розробка експрес- методів виявлення збудника раку картоплі в грунті та диференціації патотипів

Для виявлення збудника раку картоплі було апробовано декілька методів виділення зооспорангіїв збудника хвороби з проб грунту. У випадку пісчаної проби грунту ії розтирали на гумовій подушці гумовим пестиком і потім просіювали через набір сит з діаметром 0,5мм; 0,25мм та 0,03мм. Наважку грунту (1г) центрифугували в розчині натрію йодистого (48.5%) 3 хвилини при 3000 обертів за хвилину. При цьому зооспорангії піднімались на концентрованій верхній частині рідини. Їх збирали на годинникове скельце і підраховували під мікроскопом кількість зооспорангіїв. Якщо проба грунту вміщала гумус, перед центрифугуванням ії промивали ефіром (3 мл) для розчинення органічних сполук і додавали 48,5% розчин натрію йодистого з питомою вагою 1.3 одночасово дозволив і виділяти літні зооспорангії збудника і визначити життездатність, оскільки він їх фарбує в жовтий колір. Для визначення життездадності зимових зооспорангіїв, оскільки вони мають золотистий жовтий колір, додатково в суспензію додавали барвник Кумасі блакитний G-250, який фарбує їх в голубий колір. Даний метод запатентований (Зеля А.Г., Мельник П.О., пат. № 17049 від 15.09.2006р.) на основі чого нами були розроблені методичні рекомендації з виявлення збудника раку картоплі в грунті та вантажах і визначення життездатності зимових і літних зооспорангіїв Synchytrium endobioticum (Schilb.) Perc.

Експрес-метод виявлення зооспорангіїв збудника раку картоплі був впроваджений в Київську, Закарпатську, Львівську, Івано-Франківську, Житомирську, Тернопільську, Донецьку, Чернігівську, Чернівецьку державні інспекції з карантину рослин при проведенні паспортизації даних областей на виявлення збудника раку в 2003 - 2008рр. на загальну суму 76 тис. гривень.

Для диференціації патотипів збудника раку пропонується новий тест-сортимент картоплі української селекції, який диференцьовано уражується існуючими патотипами збудника раку: Поліська рожева, Слов'янка, Тетерів, Червона рута, Малінська біла, Фантазія, Щедрик, Сантарка, Божедар.

Таблиця 1 - Концентрація білкових комплексів рослина-живитель-патоген тест- сортів картоплі української селекції з патотипами збудника раку (в мкг/г сирої речовини) (2007-2008 рр.)

№	Назва сорту	Концентрація комплексів
		Д 1 зви	11 Мі	13 Рах	18 Яс	22 Бис
1	Гібрид 0427-14	1.4	1.6	1.8	1.8	1.6
1	Гібрид 85145-5	1.6	1.8	1.7	1.8	1.8
1	Поліська рожва	1.4	1.6	1.4	1.6	1.4
2	Слов, янка	0.4	1.4	1.4	1.6	1.4
2	Тетерів	0.8	1.8	1.6	1.8	1.8
2	Серпанок	0.6	1.4	1.6	1.6	1.8
3	Фантазія	0.8	1.8	1.8	1.4	0.6
3	Поран	0.6	1.6	1.6	1.8	0.8
3	Червона рута	0.6	1.6	1.8	0.8	1.4
3	Щедрик	0.4	0.8	0.6	1.4	1.6
3	Забава	0.6	0.6	1.6	1.8	1.8
3	Калинівська	0.8	1.8	0.6	0.8	0.6
3	Малинська	0.6	0.8	1.4	0.8	0.8
4	Базис	0.8	0.8	0.6	0.8	0.8
4	Сантарка	0.6	0.8	0.8	0.7	0.6
4	Божедар	0.4	0.6	0.8	0.8	0.6

Примітка: різниця між концентрацією комплексів достовірна (Р < 0,09) диференціацію проводять біохімічними методами визначення вмісту білків та їх ізоелектрофокусування в ПААГ (методи наведені в розділі "Особливости патотипів збудника раку".

При використанні способу індукованої преципітації використовували білкові екстракти 5 патотипів збудника раку та екстракти паростків сортів-диференціаторів картоплі, аналізували утворення комплексів рослина-живитель-патоген за допомогою каталізатора 4% поліетиленгликолю і визначили концентрацію даних комплексів спектрофотометричним способом при 450 нм. Утворення білкових комплексів проходило за принципом іммунодифузії білків рослина-живитель-патоген. В результаті проведених нами досліджень з аналізу концентрації (мкг/г) утворенних комплексів у сортів-диференціаторів картоплі першої групи (сорти та гібриди картоплі, які уражаються всіма 5-ма патотипами збудника хвороби) - Н 01 24-17, Поліська рожева, Гібрид П 95 145-5 коливається в межах 1,4 - 1,8мкг/г. Концентрація комплексів сортів-диференціаторів другої групи (сорти, які уражаються лише 4-мя агресивними патотипами збудника раку) - Слов янка, Тетерів, Загадка, Серпанок знаходиться в межах 0,6 - 0,8 мкг/г. Концентрація комплексів сортів-диференціаторів третьої групи (сорти, які диференційовано уражаються патотипами) - Фантазія, Поран, Червона рута, Щедрик, Малинська біла - 0,4 - 1,8 мкг/г.

Сорти-диференціатори червертої групи Базис, Сантарка та Божедар мали саму низьку концентрацію комплексів рослина-живитель-паразит - 0,3 - 0,5 мкг/г. (табл. 1).Концентрація даних комплексів знаходиться в прямій залежності з ступенем стійкості даних сортів-диференціаторів картоплі до патотипів збудника раку Synchytrium endobioticum (Schilb.) Perc. І рекомендується як експрес-метод диференцііації та ідентифікації патотипів у вогнищах збудника хвороби.

Висновки

Результати досліджень стійкості картоплі до збудника раку Synchytrium endobioticum {Schilb.) Perc., розробки методів виявлення та диференціації патотипів хвороби дають підставу для ряду принципово важливих висновків:

1. При порівняльному дослідженні стійкості до раку різних комбінацій схрещування вихідних батьківських форм картоплі виявлено, що в комбінації схрещування стійкий х стійкий до раку отримано 100% гібридів картоплі стійких до звичайного патотипу збудника раку. У результаті досліджень комбінації схрещування стійкий х сприйнятливий проти раку та сприйнятливий х стійкий виявлено до 55% стійких проти раку гібридів картоплі. При дослідженні комбінації схрещування батьківських форм картоплі сприйнятливий х сприйнятливий отримано до 6% стійких проти раку гібридів.

2. Виявлена донорська здатність стійкості проти раку диких видів картоплі Solanum demissum. При використанні для схрещування батьківських форм картоплі даних видів отримано до 100% гібридів стійких проти звичайного патотипу збудника раку.

3. Дослідження кількісного та якісного складу білків і амінокислот контрастних за стійкістю проти раку сортів і гібридів картоплі, представників диких та культурних видів, а також вихідних батьківських форм та їх гібридів дозволили виявити залежність їх стійкості проти раку з плоїдностю, що дає можливість підбирати батьківські форми картоплі для схрещування та прогнозувати вихід стійких гібридів. У гексаплоїдних стійких зразків картоплі вміст білка склав до 523,2 мкг/г. У тетраплоїдних сприйнятливих до раку зразків - до 223.4 мкг/г. У результаті електрофорезу в ПААГ кількість білкових компонентів у стійких зразків картоплі склав 38; у сприйнятливих - 32. У сприйнятливих зразків картоплі вміст незамінних амінокислот склав 43,8%, у стійких - 41,6%.

4. При визначенні ролі білків у процесі патогенезу виявлено, що при зараженні паростків сприйнятливих проти раку сортів картоплі, які належать до виду Solanum tuberosum (тетраплоїдів) через 21 добу після зараження патогеном установлено зменшення загального вмісту білка з 223,4 мкг/г до 202,3 та компонентів в електрофоретичних спектрах з 32 до 28. При зараженні стійких до раку зразків картоплі, у тому числі представників Solanum demissum (гексаплоідів) виявлено збільшення загального вмісту білка з 329,8 до 356,3 мкг/г, а в білковому спектрі спостерігалася поява стресових білків з 38 до 43 білкових компонентів, що пов, язано із захисною реакцією рослини-живителя. При вивченні амінокислотного складу ураженого сорту картоплі Поліська рожева встановлено підвищення вмісту глютамінової кислоти та амінокислот, що містять сірку (цістеїн та цістин); а у стійкого до раку сорту картоплі Божедар установлено підвищення вмісту аланіну, ізолейцину, лейцину та гуаніну.

5. Застосування нового розробленого нами експрес-методу виявлення зооспорангіїв збудника раку картоплі шляхом флотації в 48,5% розчині натрію йодистого дозволяє виділяти літніх зооспорангії збудника хвороби та одночасно визначити їх життездатність.

6. Для визначення життездатності зимових зооспорангіїв рекомендовано профарбувати 0,1% розчином Кумассі блакитним G-250.

7. Для патотипів збудника раку картоплі встановлено різний вміст загального білка - з 202,3 до 257,9 мкг/г і специфічний поліморфізм білків. При зараженні картоплі звичайним патотипом збудника раку кількість білкових компонентів склала 28; міжгірським (11) агресивним патотипом - 30; рахівським (13) агресивним патотипом - 42; ясинським (18) агресивним патотипом - 51; бистрецьким (22) агресивним патотипом - 53 білкових компонентів. За даними ознаками рекомендовано провести диференціацію та ідентифікацію патотипів в нових вогнищах хвороби.

8. Відібрано новий тест-сортимент картоплі української селекції для диференціації та ідентифікації існуючих патотипів та нових виявлених ізолятів збудника хвороби.

9. Розроблено новий метод диференціації патотипів збудника раку картоплі шляхом індукованої преципітації, який рекомендований карантинним установам для використання при проведенні диференціації патотипів збудника раку в нових вогнищах.

10. Розроблені методи визначення стійкості картоплі до збудника раку шляхом інфрачервоної спектроскопії та індукованою преципітацією рекомендовано селекційним установам України для відбору селекційного матеріалу картоплі, стійкого проти збудника хвороби.

Пропозиції виробництву

Отримані результати досліджень стійкості до раку різних комбінацій схрещування вихідних батьківських форм картоплі та їх гібридів, поліморфізму білків та їх амінокислот деяких контрастних за ракостійкістю видів та сортів картоплі при їх зараженні збудником раку Synchytrium endobioticum (Schilb.) Perc. можна використовувати селекційними установами при підборі батьківських вихідних форм картоплі для схрещування й отримання ракостійкого потомства.

Спосіб виділення зооспорангіїв збудника раку картоплі у ґрунті флотацією в 48,5%-му розчині натрію йодистого запропоновано карантинним інспекціям для виявлення патогену у вогнищах збудника хвороби та при митному догляді вантажів. На основі цього методу розроблено методичні рекомендації з виявлення збудника раку в агроценозах і вантажах.

...