Розробка біоселективних елементів моно- та мультисенсорів для екологічного моніторингу

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

Інститут молекулярної біології та генетики

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

03.00.20 - біотехнологія

РОЗРОБКА БІОСЕЛЕКТИВНИХ ЕЛЕМЕНТІВ МОНО- ТА МУЛЬТИСЕНСОРІВ ДЛЯ ЕКОЛОГІЧНОГО МОНІТОРИНГУ

Виконав Солдаткін Олександр Олексійович

КИЇВ - 2009

АНОТАЦІЯ

Солдаткін О.О. Розробка біоселективних елементів моно- та мультисенсорів для екологічного моніторингу. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.20 - біотехнологія. - Інститут молекулярної біології та генетики НАН України, Київ, 2009.

Дисертацію присвячено розробці нових біоселективних елементів моно- та мультибіосенсорів для визначення токсичних речовин. Створено діючі лабораторні прототипи монобіосенсорів для визначення формальдегіду та іонів важких металів на основі формальдегіддегідрогенази і триферментної системи (глюкозооксидаза, мутаротаза, інвертаза,) як біоселективних елементів. Створено лабораторний прототип мультибіосенсора на основі рН-чутливих польових транзисторів для визначення пестицидів та іонів важких металів в складі біоселективних елементів на основі ацетилхолінестерази, бутирилхолінестерази, уреази, глюкозооксидази та триферментної системи. Досліджено і оптимізовано аналітичні характеристики усіх прототипів. Апробація біосенсорних систем показала кореляцію отриманих даних із загальноприйнятими методиками. Отримані лабораторні прототипи можуть бути основою для налагодження промислового випуску економічних пристроїв для інтегрального визначення токсичних речовин.

Ключові слова: біосенсор, мультибіосенсор, інгібіторний аналіз, ферменти, пестициди, формальдегід, іони важких металів, токсичні речовини.

біосенсор селективний інгібіторний токсичний

1. ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. З кожним роком екологічний моніторинг довкілля набуває все більшого значення в усіх країнах світу. Переважна більшість екологічно небезпечних ситуацій, як правило, обумовлена хімічним забрудненням атмосфери, води та ґрунту з несприятливими наслідками для людей, флори та фауни. Необхідність охорони довкілля та перевірки якості харчових продуктів і питної води потребує ширшого використання у практиці високочутливих, селективних, швидких та економічних методів аналізу. Разом з існуючими фізико-хімічними інструментальними методами в аналізі можуть використовуватись новітні біоелектронні аналітичні пристрої - біосенсори, що активно розробляються протягом останніх десятиліть. Для того, щоб бути конкурентноспроможними, біосенсори повинні мати аналітичні характеристики, які є аналогічними або навіть кращими за класичні фізико-хімічні та біохімічні методи, а аналізи з їхнім використанням повинні бути швидшими, простішими та, в ідеалі, дешевшими за загальноприйняті методи.

Загальновідомо, що серед токсичних речовин, які забруднюють навколишнє середовище, особливе місце належить важким металам та пестицидам. Важкі метали та їхні сполуки характеризуються відносно високою стійкістю до деградації у зовнішньому середовищі, розчинністю в атмосферних опадах, здатністю до сорбції ґрунтами і акумуляції рослинами. Вони можуть накопичуватися в організмі, відрізняються широким спектром і різноманіттям проявів шкідливого впливу та часто отруйні для людини (Горобец и др., 2005). Нарівні з важкими металами, забруднення пестицидами навколишнього середовища є ще одним фактором високого ризику для здоров'я людини (Schuman et al., 1997; Johnson, 2000). Стійкі до розпаду токсичні сполуки фосфорорганічних пестицидів, що широко використовувуються в деяких країнах, зокрема в Україні, у сільському господарстві, та їхні не менш токсичні продукти деградації (Arkhipova et al., 2001) характеризуються високим ступенем проникнення, і відповідно потрапляють у продукти харчування людей (Verscheuren, 1983). Значного впливу на екологічний стан навколишнього середовища завдає також забруднення формальдегідом, який, потрапляючи в організм людини, призводить до захворювань центральної нервової системи, крові та імунної системи (Coggon et al., 2003; Hauptmann et al., 2003).

На цей час у світі вже розроблено низку монобіосенсорів для визначення різних токсикантів, але більшість із них можна використовувати лише для визначення однієї токсичної речовини або класу токсичних сполук. Тому створення мультибіосенсора для одночасного визначення токсичних речовин різних класів є актуальним та перспективним для подальшого впровадження в практику. В нашій лабораторії було запропоновано загальну концепцію мультибіосенсора на основі ферментного інгібіторного аналізу для використання в екологічному моніторингу (Arkhipova et al., 2001). При розробці мультибіосенсора конкретного спеціалізованого призначення, зокрема для визначення іонів важких металів та пестицидів, одним із основних моментів є пошук біоселективних елементів, найчутливіших до цих токсичних речовин, та поєднання різних ферментних систем з відповідними перетворювачами для досягнення найбільшої чутливості та стабільності мультибіосенсора.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація відповідає основному плану науково-дослідних робіт лабораторії біомолекулярної електроніки відділу механізмів трансляції генетичної інформації Інституту молекулярної біології та генетики НАН України і виконувалася в рамках бюджетної теми 2.2.4.22 «Електрохімічні мультибіосенсори та сенсорні масиви: фундаментальні основи створення та функціонування» (№ держ. реєстрації 0107U003346, 2008-2012 рр.), а також проекту «Мультибіосенсор для визначення загальної токсичності розчинів та окремих токсичних речовин» (№ держ. реєстрації 0107U00313, 2007-2009 рр.) комплексної науково-технічної програми «Сенсорні системи для медико-екологічних та промислово-технологічних потреб». Робота також була частиною міжнародних проектів: STCU Project No 3880 “Development of enzyme multisensor arrays for ecological monitoring of toxins” (2007) та INTAS Project No 03-51-62-78 “Novel biosensors and analysis kits based on genetically engineered biomolecules for formaldehyde assay” (2004-2007).

Мета і завдання дослідження. Основною метою роботи була розробка нових біоселективних елементів моно- та мультибіосенсорів для визначення токсичних речовин таких як формальдегід, іони важких металів та пестициди.

Виходячи з мети роботи, було сформульовано такі основні завдання:

1. Дослідити можливість використання формальдегіддегідрогенази як біоселективного елемента кондуктометричного біосенсора для визначення формальдегіду у водних розчинах, визначити оптимальні умови функціонування такого біосенсора та дослідити його основні аналітичні характеристики.

2. Розробити кондуктометричний біосенсор на основі триферментної системи (інвертаза, мутаротаза, ГОД) як біоселективного елемента, визначити оптимальні умови його роботи та дослідити основні аналітичні характеристики з метою застосування його в інгібіторному аналізі іонів важких металів.

3. Розробити мультибіосенсор на основі рН-чутливих польових транзисторів та низки іммобілізованих ферментів (ацетилхолінестераза, уреаза, бутирилхолінестераза, глюкозооксидаза та триферментна система у складі інвертази, мутаротази і глюкозооксидази) для визначення низки токсичних речовин.

4. Детально дослідити основні аналітичні характеристики отриманого мультибіосенсора та підібрати оптимальні умови для одночасної роботи всіх біоселективних елементів.

5. Вивчити можливість використання створених біосенсорів та мультибіосенсора для визначення токсичних речовин у реальних зразках довкілля.

Об'єкт дослідження: ферментативний гідроліз субстратів та його інгібування токсичними речовинами при кондуктометричному та потенціометричному методі вимірювання.

Предмет дослідження: біоселективні елементи ферментних кондуктометричних монобіосенсорів та потенціометричного мультибіосенсора.

Методи дослідження: кондуктометричний метод (дослідження проходження ферментативних реакцій та вивчення інгібування іонами важких металів триферментної системи у складі інвертази, мутаротази та глюкозооксидази); потенціометричний метод (дослідження інгібування ацетилхолінестерази, бутирилхолінестерази, уреази, глюкозооксидази та триферментної системи у складі інвертази, мутаротази та глюкозооксидази іонами важких металів та пестицидами); атомно-абсорбційна спектроскопія як метод кількісного контролю іонів важких металів у досліджувальних зразках; методи математичного аналізу для відпрацювання підходів кількісного або напівкількісного визначення токсичних речовин при біосенсорному аналізі реальних зразків довкілля.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше використано фермент формальдегіддегідрогеназу, коіммобілізовану з кофактором НАД⁺ та ДЕАЕ-декстраном у БСА мембрані, як високочутливий біоселективний елемент кондуктометричного біосенсора для визначення формальдегіду.

Вперше використано триферментну систему у складі інвертази, мутаротази та глюкозооксидази для створення біоселективного елемента кондуктометричного монобіосенсора та як елемент потенціометричного мультибіосенсора для визначення іонів важких металів. Триферментна система є селективнішою і чутливішою порівнянно з іншими ферментними системами за рахунок сумарного ефекту інгібування трьох ферментів (патенти України № 18949 та № 25456).

Вперше розроблено конфігурацію мультибіосенсора на основі рН-чутливих польових транзисторів та п'яти біоселективних елементів для одночасного визначення пестицидів та іонів важких металів у аналізованих зразках (патент України № 27284).

Практичне значення одержаних результатів. Створені лабораторні прототипи двох кондуктометричних монобіосенсорів для прямого визначення формальдегіду та інгібіторного аналізу іонів ртуті і срібла та потенціометричного мультибіосенсора для аналізу токсичних речовин. Такі прилади можуть бути використані в екологічному моніторінгу різних токсикантів у водних розчинах.

Особистий внесок здобувача. У процесі виконання дисертаційної роботи автором самостійно проаналізовано наукову літературу за темою досліджень, разом із керівником поставлено мету, розроблено програму проведення експериментів та підібрано методи вирішення поставлених завдань. Дисертаційну роботу було виконано здобувачем особисто або за безпосередньої участі у виконанні експерементів. Зокрема автором самостійно розроблено усі біоселективні елементи для використання їх у складі моно- та мультибіосенсорів та досліджено їхні основні аналітичні характеристики. Частину експериментальних досліджень із визначення оптимальних умов функціонування моно- та мультибіосенсорів виконано в тісному співробітництві з к.б.н. О.А. Назаренко, В.М. Пєшковою та О.Ф.Сосовською. Обговорення та аналіз результатів дослідження проведено з науковим керівником д.б.н., професором, академіком НАН України Г.В. Єльською та д.б.н., с.н.с. С.В. Дзядевичем. Дисертант дуже вдячний їм за навчання. Здобувач висловлює подяку к.б.н., с.н.с. Я.І. Корпану та к.б.н., с.н.с. В.М. Архиповій за численні поради щодо створення моно- та мультибіосенсорів. Дисертант щиро вдячний за надану допомогу із створення прототипу приладу, необхідного для проведення експериментів з мультибіосенсором, співробітникам Інституту фізики напівпровідників імені В.Є.Лашкарьова НАН України О.С. Павлюченко та к.ф-м.н., с.н.с. О.Л. Куклі, з якими автор має спільні публікації.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень були представлені на Українсько-Німецькому симпозіумі із нанотехнологій (Київ, 2006); Міжнародній конференції “Functional Materials” ICFM-2007 (Партеніт, 2007); 3-ій Міжнародній науково-технічній конференції «Сенсорна електроніка та мікросистемні технології» (СЕМСТ-3) (Одеса, 2008).

2. ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

Матеріали і методи дослідження.

У роботі використано такі ферменти: формальдегіддегідрогеназа (ФДГ) з Рseudomonas putida (КФ 1.2.1.46) активністю 3,7 од.акт./мг фірми „Sigma-Aldrich Chemie” (Франція); глюкозооксидаза (ГОД) з Penicillium vitale активністю 130 од. акт./мг фірми «Діагностикум» (Львів, Україна); інвертаза із пекарських дріжджів активністю 355 од.акт./мг фірми „Fluka” (Швейцарія); мутаротаза із нирки свині активністю 100 од.акт./мг фірми „Biozyme Laborаtories Ltd” (Велика Британія); уреаза із бобів сої активністю 31 од.акт./мг фірми „Fluka” (Німеччина); ацетилхолінестераза (AцХЕ) із електричного вугря активністю 426 од.акт./мг фірми „Sigma-Aldrich Chеmie” (Німеччина); бутирилхолінестераза (БуХЕ) із сироватки крові коня активністю 13 од.акт./мг фірми „Sigma-Aldrich Chеmie” (Німеччина); альбумін сироватки бика (БСА) (фракція V) фірми „Sigma-Aldrich Chеmie” (Німеччина); НАД⁺ фірми „Sigma-Aldrich Chemie” (Франція); ДЕАЕ-декстран фірми „Fluka Biochemica” (Франція); 50 %-й водний розчин глутарового альдегіду (ГА) фірми „Sigma-Aldrich Chеmie” (Німеччина); трихлорфон - фосфорорганічний пестицид фірми „Riedel-de-Haen” (Швейцарія); карбофуран - карбаматний пестицид фірми „Riedel-de-Haen” (Швейцарія). Формальдегід (5 М) отримували із параформу гідролізом. Як робочий буфер використовували фосфатний розчин (КН₂Р0₄-NаОН) фірми "Merck" (Німеччина). Інші реактиви, які використовували у работі, були вітчизняного та закордонного виробництва та мали кваліфікацію "ос. ч." та "х. ч.".

У роботі використовували кондуктометричні перетворювачі двох типів (1). Перші було виготовлено в Інституті хемо- та біосенсорики (Мюнстер, Німеччина) і вони складалися з двох ідентичних пар платинових гребінчастих електродів, нанесених на скляну підкладинку. Другий тип кондуктометричних перетворювачів було виготовлено в Інституті фізики напівпровідників імені В.Є.Лашкарьова (м. Київ, Україна), складом із двох ідентичних пар золотих гребінчастих електродів, нанесених на ситалову підкладинку. При розробці мультибіосенсора використовували 6-канальну сенсорну лінійку на основі кремнієвих рН-чутливих польових транзисторів (рН-ПТ), що були виготовлені на НВО “Квазар”, Київ.

Для створення біоселективних елементів використовували такі протоколи іммобілізації:

- Формальдегіддегідрогеназа. Суміш 0,1 М НАД⁺, 5 % ФДГ, 5 % БСА, 12,5 % ДЕАЕ-декстран у 20 мМ фосфатному буфері рН 7,2. Іммобілізація в насичених парах ГА.

- Триферментна система. Суміш 5 % інвертаза, 5 % мутаротаза, 5 % ГОД , 5 % БСА, 10 % гліцерин у 20 мМ фосфатному буфері, рН 6,5. Іммобілізація в краплі з 1% водним розчином ГА.

- АцХЕ, БуХЕ, уреаза, ГОД. Суміш 5 % ферменти, 5 % БСА, 10 % гліцерин у 20 мМ фосфатному буфері, рН 6,5. Іммобілізація в краплі з 1 % водним розчином ГА.

При роботі з кондуктометричними біосенсорами для визначення формальдегіду та іонів важких металів використовували фосфатний, боратний та універсальний буфери з різними рН та концентраціями. Вимірювання мультибіосенсором проводили у 2 мМ фосфатному буфері, рН 6,5 за кімнатної температури з використанням проточної системи.

Концентрацію субстратів та інгібіторів при роботі з біосенсорами та мультибіосенсорами змінювали додаванням до робочого буфера порцій стандартних концентрованих вихідних розчинів. Інгібування біоселективних елементів проводили інкубацією біосенсора протягом 20-30 хв у розчинах токсичних речовин (інгібіторів). Дослідження проводили щонайменше у 3-5 серіях. При статистичній обробці результатів, вираховували значення середньої арифметичної та її стандартне відхилення, вірогідним вважали дані при р < 0,05. Неспецифічні зміни вихідного сигналу, пов'язані з коливанням температури, рН середовища, електричними наводками, не впливали на кінцевий результат завдяки використанню в роботі диференційного режиму вимірювань.

Результати дослідження та їхнє обговорення.

Використання ферменту формальдегіддегідрогеназа для створення формальдегідного кондуктометричного біосенсора. В основі роботи формальдегід-чутливого біосенсора лежить ферментативна реакція (1), яка призводить до генерації заряджених іонів і спричиняє зміну провідності розчину, що і досліджується за допомогою кондуктометричного методу аналізу.

(1)

Принципово новою є запропонована методика формування біоселективної мембрани на поверхні тонкоплівкових планарних електродів, яка полягає у коіммобілізації ферменту ФДГ з його кофактором НАД⁺ та ДЕАЕ-декстраном. Останній запобігає активному вимиванню НАД⁺ із мембрани і дозволяє багаторазово застосовувати створений біосенсор без регенерації кофактора, оскільки його концентрація у мембрані залишається високою і складає 100 мМ.

Кондуктометричний метод досліджень ґрунтується на вимірюванні зміни провідності аналізованого розчину, яка в свою чергу залежить, від природи самої ферментативної реакції та характеристик розчину, де ця реакція відбувається. Зважаючи на ці факти, було досліджено залежність величини відгуку створеного лабораторного прототипу кондуктометричного біосенора від концентрації формальдегіду при різних концентраціях буфера (2). Встановлено, що лінійний діапазон визначення був до 50 мМ розчину формальдегіду з нижньою межею визначення 0,1 мМ, що є достатнім для оцінки забруднених зразків.

Як видно із результатів наведених на рисунку, при збільшенні концентрації робочого буфера зменшується сигнал біосенсора на формальдегід. В подальших експериментах було вирішено використовувати 10 мМ боратний буфер, при якому достатньо висока буферна ємність і досить великі сигнали на формальдегід.

Крім того, було показано, що сигнал біосенсора значно падає при збільшенні концентрації NaCl у зразку до 50 мМ і залишається практично незмінним при подальшому збільшенні вмісту NaCl до 200 мМ. Було визначено, що рН оптимум іммобілізованої формальдегіддегідрогенази був 8,7.

Важливими характеристиками будь-якого сенсора є його операційна стабільність та стабільність при зберіганні. Для дослідження першої протягом одного робочого дня з інтервалом 40 хв було отримано сигнали біосенсора на дві концентрації формальдегіду - 10 та 25 мМ. Біосенсор характеризувався високою операційною стабільністю із похибкою не більше 10 %. Щодо стабільності при зберіганні, то найкращі результати були отримані у випадку, коли біосенсор зберігали у 10 мМ боратному буфері, рН 8,7 за температури 4^оС. Відгук біосенсора залишався відносно стабільним щонайменше 130 днів.

Практично в усіх відомих розробках біосенсорів для визначення формальдегіду є проблема з селективністю щодо метанолу, етанолу та іноді гліцерину, тому було досліджено чутливість біосенсора саме до цих компонентів (табл. 1). Як і очікувалося, створений сенсор є надзвичайно селективним щодо формальдегіду, а інші інтерференти, зокрема гліцерин, метанол та етанол, не впливають на сигнал біосенсора.

Таблиця 1. Селективність кондуктометричного біосенсора на основі ФДГ

Таким чином, було показано, що ФДГ може бути використана для створення кондуктометричного біосенсора для визначення формальдегіду, а сконструйований біосенсор можна використовувати для аналізу формальдегіду в реальних зразках і в подальшому, як біоселективний елемент мультисенсора.

Розробка кондуктометричного біосенсора на основі трьох ферметів (інвертаза, мутаротаза, глюкозооксидаза) для визначення іонів важких металів. В основі роботи біоселективного елемента кондуктометричного біосенсора лежить такий каскад ферментативних реакцій:

Під час реакцій генеруються заряджені іони, при цьому змінюється рН і провідність розчину, яку можна реєструвати за допомогою кондуктометричного перетворювача. Для аналізу іонів важких металів необхідно проінкубувати біосенсор в аналізованому розчині з можливим вмістом у ньому токсикантів. Після інгібування ферментів під час каскаду реакцій генерується менша кількість іонів, що призводить до зменшення відгуку. На рис. 3 наведено типову схему проведення інгібіторного аналізу на прикладі визначення іонів Hg²⁺. Залежно від величини сигналів отримували залишкову активність Z за формулою Z=Y*100/X, де X, Y - величини сигналів біосенсора до і після інкубації його в розчині з іонами ртуті, відповідно.

Першим етапом роботи було дослідження умов роботи та характеристик біосенсора при прямому аналізі субстрату (сахарози). Показано, що час визначення концентрації сахарози в розчині складав 1-2 хв. Динамічний діапазон аналізу може змінюватися залежно від буферної ємності і в 5 мМ фосфатному буферному розчині складав 2 мкМ - 5 мМ сахарози. Досліджено залежність величини відгуків триферментного біосенсора на сахарозу від іонної сили розчину. Залежність була типовою для потенціометричних ферментних біосенсорів. Визначено оптимум рН буфера для роботи всіх трьох ферментів у складі біоселективного елемента біосенсора, що склав 6,0. Розроблений кондуктометричний біосенсор характеризувався високою операційною стабільністю та відтворюваністю сигналу. Проведено серію дослідів із вивчення стабільності біосенсорів при зберіганні за різних умов (в 5 мМ фосфатному буфері рН 6,0 при температурах +20°С та +4°С, а також у сухому вигляді при температурах +20°С, +4°С та -5°С). Біосенсори, що зберігалися при температурі -5°С та +4°С в сухому вигляді (найкращі умови), залишались стабільними протягом місяця.

Наступним етапом роботи провели адаптацію розробленого триферментного біосенсора для визначення іонів важких металів. Робочі характеристики біосенсора залежать від складу біоселективної мембрани та методу іммобілізації ферментів. Тому подальші експерименти направлено на оптимізацію ферментного складу біоселективної мембрани. Оптимальні концентрації ферментів у біоселективній мембрані складали 5 % для усіх трьох ферментів. Крім того, для досягнення найкращої чутливості біосенсора до іонів важких металів визначено оптимальну концентрацію сахарози, як субстрату при інгібіторному аналізі, яка склала 1,5 мМ.

Важливе значення при визначенні концентрацій токсикантів відіграє час інкубації біосенсора у досліджуваному розчині. Результати аналізу залишкової активності біоселективного елемента залежно від часу інгібування показали, що оптимальний час інкубації біосенсора був 30 хв для отримання необхідного діапазону визначення концентрацій ртуті.

Досліджено залежність залишкової активності триферментної системи біосенсора від концентрації іонів різних важких металів. Як видно з рис. 4, найбільший вплив на активність ферментів мали іони Ag⁺ та Hg²⁺. Інші важкі метали при їхніх концентраціях до 100 мкМ лише незначною мірою впливали на роботу ферментативної системи. Дослідження селективності розробленого біосенсора до різних груп токсикантів, які можуть бути присутні в реальних зразках навколишнього середовища показало, що наявність в аналізованому розчині формальдегіду, пестицидів та гербіцидів в 1 мМ концентраціях ніяк не впливала на відгук сенсора, що свідчить про високу селективність розробленого біосенсора (табл. 2).

Таблиця 2. Перевірка впливу різних груп токсикантів на роботу біоселективного елемента на основі триферментної системи

Таким чином, можна зробити висновок, що біоселективній елемент на основі ГОД, інвертази та мутаротази у складі кондуктометричного біосенсора можна досить ефективно використовувати для високочутливого (нижня межа визначення 0,05 мкМ ) та селективного аналізу іонів ртуті та срібла, і в подальшому застосовуватись як один із елементів мультибіосенсора.

Розробка ферментного мультибіосенсора на основі рН-чутливих польових транзисторів для визначення іонів важких металів та пестицидів. В основі роботи мультибіосенсора для інгібіторного аналізу токсинів лежить ефект інгібування таких ферментативних реакцій:

При проходженні реакцій (6-8) та каскадів реакцій (9, 10) змінюється концентрація протонів, відповідно має місце локальна зміна рН розчину в мембрані. Це дозволяє використовувати матрицю рН-чутливих польових транзисторів як перетворювач. На рис. 5 наведено типовий вигляд сигналів при проведенні інгібіторного аналізу на прикладі визначення іонів Hg²⁺.

Першим етапом розробки мультибіосенсора була оптимізація роботи ферментних біоселективних елементів у складі потенціометричного мультибіосенсора при прямому аналізі субстратів. У роботі показано, що час проведення прямого аналізу субстратів складав 10 хв. Динамічний діапазон визначення субстратів залежав від використаних ферментних систем, відрізнявся за верхньою межею визначення і знаходився в межах від 0,1 мМ до 1,5-10 мМ залежно від субстрату. У випадку інгібіторного аналізу важливо працювати при концентраціях насичення ферментів субстратами - якщо відгуки елементів мультисенсора стабільні і добре відтворювані, тоді залежність від концентрації інгібіторів буде достатньо вираженою. Цьому положенню відповідають такі концентрації субстратів: 10 мМ ацетилхолін, 5 мМ бутирилхолін, 5 мМ сечовина, 5 мМ сахароза та 2 мМ глюкоза.

В роботі досліджено залежності відгуків біоселективних елементів мультибіосенсора від рН, іонної сили та буферної ємності розчину, в результаті чого вибрано 2мМ фосфатний буфер, рН 6. У наступних дослідженнях отримано дані із перехресного впливу субстратів для всіх використаних біоселективних елементів, що враховувались при подальшій математичній обробці результатів. Усі біоселективні елементи мультибіосенсора характеризувались високою операційною стабільністю з похибкою не більше 10 % і залишалися активними більше 2-х тижнів.

Наступним етапом розробки мультибіосенсора було визначення оптимальних умов використання біоселективних елементів мультибіосенсора для інгібіторного аналізу токсикантів. Необхідно було вибрати такі умови, за яких при відносно невеликому часі інкубації, а, відповідно, і часі проведення всього аналізу, є можливість визначення достатньо низьких концентрацій токсикантів. Результати експериментів показали, що оптимальний час інкубації у розчині токсикантів був вибраний 20 хв для необхідного діапазону визначення концентрацій іонів важких металів та пестицидів.

Далі досліджували інгібіторний вплив окремих токсикантів та їхніх сумішей на ферменти та відповідно відгуки мультибіосенсора (табл. 3). В таблиці наведено лише частину отриманих результатів.

Отримані величини інгібування біоселективних елементів різними концентраціями токсикантів та різноманітними варіантами сумішей в подальшому були використані для їх аналізу за допомогою методів математичної обробки. Згідно розробленої моделі усі можливі інгібітори були зведені у три групи: «іони Hg²⁺ та Ag⁺», «інші іони важких металів» та «пестициди». В табл. 4 наведено порівняння передбачених результатів, що були розраховані за допомогою математичних методів обробки даних з реальними складами досліджувальних модельних сумішей.

Таблиця 3. Інгібіторний вплив токсичних речовин та їхніх сумішей на біоселективні елементи мультибіосенсора (100 % - повне інгібування; відносна похибка вимірювань - 8 %)

Таблиця 4. Порівняння реальних складів сумішей з розрахованими методами математичної обробки експериментальних даних (відносна похибка вимірювань - 8 %)

З метою перевірки працездатності розробленого мультибіосенсора вирішено проаналізувати реальні водні зразки на наявність у них токсичних речовин. Для цього в ряді водоймищ м. Києва було відібрано проби води. Крім того, в кілька проб було додано відому кількість токсичних речовин для перевірки, на скільки збільшаться рівні інгібування біоселективних елементів мультибіосенсора, і як це відповідає реальним концентраціям доданих токсикантів. Результати отримані різними методами аналізу токсичних речовин, наведено в табл. 5.

Таблиця 5. Порівняння різних методів аналізу реальних зразків довкілля

Для аналізу також взято водні зразки з полігону твердих побутових відходів №5. Після мультибіосенсорного аналізу зразки для контролю аналізували за допомогою традиційних методів визначення токсинів (атомно абсорбційна спектроскопія, тонкошарова хроматографія та атомно-абсорбційний аналізатор ртуті). З даних таблиці видно кореляцію отриманих результатів традиційними та мультисенсорним методами. Перевищення допустимих концентрацій виявлено у зразках, в які навмисно додано відповідні аліквоти токсикантів. У всіх інших зразках із водоймищ м. Києва, як показали всі методи визначення, наявності небезпечних концентрацій токсикантів отримано не було. За допомогою ААС зареєстровано перевищення ГДК по міді, кобальту, цинку та хрому, і відсутність ртуті та пестицидів для зразка з полігону побутових відходів №5, що повністю збігається із даними, отриманими з використанням мультибіосенсора. Таким чином, результати аналізу всіх проб, отримані традиційними методами визначення токсикантів, підтверджують результати, отримані мультисенсором.

Як завершальний етап досліджень запропоновано методику проведення аналізу токсичних речовин у реальних зразках розробленим лабораторним прототипом мультибіосенсора, яка із успіхом апробована в представлених вище дослідженнях та коротко може бути описана таким чином.

Отримуємо відгуки мультибіосенсора на суміш субстратів до та після інкубації біоселективних елементів у зразку, що аналізується. Залежно від ступеня інгібування існує три варіанти продовження аналізу. Якщо хоч один елемент мультибіосенсора інгібується більше ніж на 90 %, зразок розводять, поки результат інгібування не буде в межах 5 - 90 %. Якщо жоден з біоселективних елементів не заінгібувався навіть на 5 % - досліджувальний зразок не має в своєму складі токсикантів. У випадку коли біоселективні елементи мультибіосенсору заінгібувались на 5 - 90 % - результати обробляються за допомогою математичних підходів, що дозволяє визначати чи кількісний склад токсикантів у зразку, чи яка саме група токсичних речовин присутня в зразку. При необхідності зразки можна відправити для подальшого точного визначення токсикантів традиційним методом, який також вибирається згідно результатів мультибіосенсорного аналізу.

Таким чином, створено лабораторний прототип мультибіосенсора для екологічного моніторингу, який може бути основою при розробці та налагодженні промислового випуску вимірювальних приладів для експресного, інтегрального та селективного визначення певних забруднювачів води.

ВИСНОВКИ

Розроблено низку нових біоселективних елементів моно- та мультисенсорів для екологічного моніторингу та вивчено їхню роботу в складі біосенсорних систем.

1. Продемонстровано можливість використання формальдегіддегідрогенази у складі біоселективного елемента кондуктометричного біосенсора для визначення формальдегіду у водних розчинах, визначено оптимальні умови функціонування такого біосенсора та досліджено його основні аналітичні характеристики.

2. Розроблено біоселективний елемент на основі триферментної системи (інвертаза, мутаротаза, ГОД) кондуктометричного біосенсора для визначення іонів важких металів. Визначено оптимальні умови роботи біосенсора та досліджено його основні аналітичні характеристики.

3. Підібрано оптимальні умови для одночасної роботи біоселективних елементів на основі ацетилхолінестерази, уреази, бутирилхолінестерази, глюкозооксидази та триферментної системи - інвертази, мутаротази, глюкозооксидази у складі мультисенсора на основі рН-чутливих польових транзисторів та детально досліджено їхні основні аналітичні характеристики.

4. Створено лабораторний прототип мультибіосенсора для одночасного визначення пестицидів та іонів важких металів і проведено його апробацію при аналізі реальних водних зразків різного походження. Показано кореляцію отриманих даних із результатами аналізів загальноприйнятими традиційними методами.

ПЕРЕЛІК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Ензимний кондуктометричний сенсор для визначення концентрації формальдегіду у модельних зразках / О.О.Солдаткін, О.Ф.Сосовська, І.В.Бенілова, М.В.Гончар, Я.І.Корпан // Біополімери і клітина. -2005. -Т. 21, № 5. - С. 425 - 432. (Особистий внесок здобувача - розробка та оптимізація роботи біосенсора для визначення формальдегіду.)

2. Novel sucrose three-enzyme conductometric biosensor / O.O.Soldatkin, V.M.Peshkova, S.V.Dzyadevych, A.P.Soldatkin, N.Jaffrezic-Renault, A.V.El'skaya // Materials Science and Engineering C. -2008. - Vol. 28. -Р. 959-964. (Особистий внесок здобувача - адаптація роботи біосенсора на основі триферментної системи для прямого визначення сахарози як субстрату.)

3. Кондуктометричний біосенсор на основі триферментної системи для селективного визначення іонів важких металів / О.О.Солдаткін, В.М.Пєшкова, С.В.Дзядевич, О.П.Солдаткін, Г.В.Єльська // Sensor Electronics and Microsystem Technologies -2008. -№ 2. -С. 48-58. (Особистий внесок здобувача - розробка та оптимізація роботи триферментного біосенсора для інгібіторого визначення іонів важких металів.)

4. Оптимізація роботи ферментних біоселективних елементів як складових потенціометричного мультибіосенсора / О.О.Солдаткін, О.А.Назаренко, О.С.Павлюченко, О.Л.Кукла, В.М.Архипова, С.В.Дзядевич, О.П.Солдаткін, Г.В.Єльська // Биополімери і клітина -2008. -Т. 24, № 1.- С.41-50. (Особистий внесок здобувача - оптимізація одночасної роботи біоселективних елементів у складі мультибіосенсора для визначення токсичних речовин.)

5. Оптимізація роботи мультибіосенсора при інгібіторному аналізі токсинів / О.О.Солдаткін, О.С.Павлюченко, О.Л.Кукла, В.М.Архипова, С.В.Дзядевич, О.П.Солдаткін, Г.В.Єльська // Біополімери і клітина. -2008. -Т.24, № 6. -С.494-502. (Особистий внесок здобувача - оптимізація характеристик мультибіосенсора та перевірка його роботи при використанні в інгібіторному аналізі токсикантів.)

6. Сенсорні масиви на основі диференційних ІСПТ-елементів для моніторингу токсичних речовин природного та штучного походження / О.Л.Кукла, О.С.Павлюченко, Ю.В.Голтвянський, О.О.Солдаткін, В.М.Архипова, С.В.Дзядевич, О.П.Солдаткін // Sensor Electronics and Microsystem Technologies -2008. -№ 2. -С.58-68. (Особистий внесок здобувача - перевірка роботи сенсорних масивів у складі біосенсорних систем.)

7. Патент України №18949, Кондуктометрична біосенсорна система для визначення цукрози / О.О.Солдаткін, С.В.Дзядевич, О.П.Солдаткін, Г.В.Єльська // Заявл. 26.06.2006; Опубл. 15.11.2006, Бюл. №11. -8 с. (Особистий внесок здобувача - розробка біосенсора на основі триферментної системи.)

8. Патент України №25456, Кондуктометричний біосенсор для визначення концентрації іонів важких металів у водних розчинах / О.О.Солдаткін, С.В.Дзядевич, О.П.Солдаткін, Г.В.Єльська // Заявл. 28.03.2007; Опубл. 10.08.2007, Бюл. №12. -8 с. (Особистий внесок здобувача - дослідження можливості використання триферментного біосенсора для визначення іонів важких металів.)

9. Патент України № 27284, Мультибіосенсор для визначення концентрацій токсичних речовин у водних розчинах / О.О.Солдаткін, В.М.Архипова, С.В.Дзядевич, О.А.Назаренко, О.П.Солдаткін, Г.В.Єльська, О.С.Павлюченко, О.Л.Кукла, // Заявл. 08.06.2007; Опубл. 25.10.2007, Бюл. №17. -10 с. (Особистий внесок здобувача - дослідження оптимальних умов роботи мультибіосенсора для визначення токсикантів

10. Кондуктометричний формальдегід-чутливий біосенсор зі специфічно адаптованими аналітичними характеристиками / О.О.Солдаткін, І.В.Бенілова, О.Ф.Сосовська, Я.І.Корпан, С.В.Дзядевич, Г.В.Єльська // Конференція - звіт з комплексної програми фундаментальних досліджень НАН України „Дослідження у галузі сенсорних систем та технологій ”, 2-3 лютого 2005р.: тези доп. - Київ, 2005.-С.83. (Особистий внесок здобувача - розробка біосенсора на основі формальдегіддегідрогенази та адаптація його основних аналітичних характеристик.)

11. New conductometric biosensor based оn multienzyme membrane for selective sucrose determination / O.O.Soldatkin, V.M.Peshkova, S.V.Dzyadevych, A.P.Soldatkin, A.V.El'skaya // Ukrainian-German Symposium on Nanobiotechnology, 14-16 December 2006: abstracts. - Kyiv, 2006, -Р.142. (Особистий внесок здобувача - адаптація триферментного біосенсора для прямого аналізу сахарози.)

12. Development of enzyme multibiosensor of several toxic compounds / O.O.Soldatkin, O.A.Nazarenko, S.V.Marchenko, O.S.Pavluchenko, O.L.Kukla, V.M.Arkhipova, S.V.Dzyadevych, A.P.Soldatkin, A.V.El'skaya // International Conference “Functional Materials”, October 2007: abstracts. - Partenit, 2007, -Р. 485. (Особистий внесок здобувача - розробка мультибіосенсора для детекціії іонів важких металів та пестицидів.)

13. Використання глюкозного та сахарозного біосенсорів для визначення іонів важких металів в екології / О.О.Солдаткін, В.М.Пєшкова, С.В.Дзядевич, О.П.Солдаткін // Всеукраїнський науковий семінар «Біомедична електроніка та фізичні методи в екології», 13-16 вересня 2007р.: тези доп. - Ворохта, 2007, -С. 40. (Особистий внесок здобувача - перевірка можливості використання в інгібіторному аналізі іонів важких металів двох біосенсорів, один на основі трьох ферментів та другий на основі глюкозооксидази.)

14. Розробка кондуктометричного біосенсора на основі три ферментної системи для визначення іонів важких металів / О.О.Солдаткін, В.М.Пєшкова, В.М.Архипова, Г.В.Єльська // 3-а Міжнародна науково-технічна конференція «Сенсорна електроніка та мікросистемні технології» 2-6 червня 2008р.: тези доп. - Одеса, 2008, -С. 236. (Особистий внесок здобувача - розробка біосенсора для визначення іонів важких металів та дослідження його основних аналітичних характеристик.)

Размещено на Allbest.ru