Стан антиоксидантної ферментної системи крові чорноморських риб в умовах комплексного хронічного забруднення

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ

ОДЕСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ імені І.І. МЕЧНИКОВА

УДК: 591.11:628.19(262.5)

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

СТАН АНТИОКСИДАНТНОЇ ФЕРМЕНТНОЇ СИСТЕМИ КРОВІ ЧОРНОМОРСЬКИХ РИБ В УМОВАХ КОМПЛЕКСНОГО ХРОНІЧНОГО ЗАБРУДНЕННЯ

СКУРАТОВСЬКА КАТЕРИНА МИКОЛАЇВНА

03.00.04 - біохімія

Одеса - 2009

Дисертацію є рукопис

Робота виконана у відділі іхтіології Інституту біології південних морів імені О.О. Ковалевського Національної академії наук України

Науковий керівник: доктор біологічних наук, доцент,

Руднєва Ірина Іванівна,

Інститут біології південних морів імені О.О. Ковалевського НАН України,

провідний науковий співробітник

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Галкін Борис Миколайович,

Одеський національний університет імені І.І. Мечникова, професор кафедри мікробіології і вірусології

кандидат біологічних наук,

старший науковий співробітник

Сілкін Юрій Олександрович,

Карадазький природний заповідник НАН України,

завідувач лабораторії біохімії та фізіології морських гідробіонтів

Захист дисертації відбудеться ” 19 ” червня 2009 р. о 1100 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 41.051.06 Одеського національного університету імені І.І. Мечникова за адресою: 65058, м. Одеса, пров. Шампанський, 2 (біологічний факультет), ауд. 27.

З дисертацією можна ознайомитись в науковій бібліотеці Одеського національного університету імені І.І. Мечникова за адресою: 65082, м. Одеса, вул. Преображенська, 24.

Автореферат розісланий ” 15 ” травня 2009 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Д 41.051.06

доктор біологічних наук, професор Т.О. Філіпова

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Морські прибережні екосистеми в найбільшій мірі страждають від антропогенного забруднення, що потрапляє зі стічними водами берегових джерел і приноситься з річними стоками з усього водозбірного басейну. Це спричиняє погіршення екологічної ситуації в результаті змін фізико-хімічних властивостей води та ґрунтів, порушення зв'язків, що еволюційно склалися між різними компонентами угрупування, розвитку процесів евтрофування, скорочення чисельності видів та їх біорізноманітності (Миронов, 2002; Руднева и др., 2005; Моисеенко, 2005). Описані явища спостерігаються у багатьох районах Світового океану у зв'язку із зростанням урбанізації приморських територій (The World Health Report, 2002). Стічні води 17 країн, котрі містять промислові, побутові та сільськогосподарські відходи, перш за все забруднюють прибережні райони (Rudneva et al., 2001). Ситуацію значно ускладнюють аварії на очисних спорудах у результаті їх зношеності та застарілих конструкцій. Внаслідок цього - викид величезної кількості неочищених стічних вод безпосередньо в морські акваторії. Наприклад, біля узбережжя України в море скидається щорічно 11,4 млн. т частково очищених і 190,6 млн. т нормативно очищених стічних вод (Україна в контексті., 1998). Різні токсиканти і патогенні мікроорганізми, що потрапляють у воду та ґрунт, надають реальної небезпеки для біоти, згубно впливають на виживання, ріст, репродукцію та здоров'я гідробіонтів (Руднева и др., 2005; Моисеенко и др., 2005).

Риби як представники вищої трофічної ланки в прибережних угрупуваннях відіграють важливу роль і в найбільшій мірі споживаються людиною. Статистика уловів за останні десятиліття засвідчують те, що прибережна іхтіофауна Чорного моря змінилася - скоротилася її видова різноманітність і відбулася зміна домінуючих видів на користь малоцінних риб (Зуев и др., 2003).

У зв'язку з цим виникає необхідність пошуку більш інформативних критеріїв оцінки стану риб та їх середовища, для чого розробляються спеціальні програми біомоніторингу, засновані на концепції біоіндикаторів і біомаркерів - показників різного біологічного рівня, що реагують на вплив несприятливих факторів середовища (Shulman et al., 1999; Довженко и др., 2005; Adams, 2005; Руднева, 2006; Kopecka, 2006; Schiedek, 2006; Hansson 2006; Hoguet et al., 2007). В якості таких біомаркерів використовуються параметри молекулярних захисних систем: неспецифічні монооксигенази родини цитохрому Р-450, імунологічні показники, вміст низькомолекулярних антиоксидантів, активність ферментів антиоксидантної системи (АОС), індукція яких відбувається у результаті розвитку окислювального стресу, спричиненого високими концентраціями ксенобіотиків та їх метаболітів у середовищі та в організмі (Goksoyr, 1996; Руднева и др., 2005; Моисеенко, 2005). Надлишкова кількість токсикантів у воді та накопичення їх у організмі індукує вільнорадикальні процеси, що призводять до пошкодження життєво важливих біомолекул. В цьому випадку в якості біоіндикаторів шкідливої дії токсичних речовин застосовують параметри перекісного окислення ліпідів (ПОЛ) і окислювальної модифікації білків (ОМБ). Крім цього рівень ПОЛ і ОМБ засвідчує ефективність стану антиоксидантної системи (Goksoyr, 1996; Руднева и др., 2005).

Цілком очевидно, що пошук і область застосування біомаркерів і біоіндикаторів для екотоксикологічної характеристики водних об'єктів є перспективним напрямком, котрий дозволяє швидко отримати адекватну інформацію про стан водного середовища за відгуками біоти. Одночасно при оцінці ступеня тяжкості та прогнозування негативного впливу на організм необхідно враховувати вплив різних біотичних та абіотичних факторів на біомаркери і біоіндикатори для детального розуміння механізмів відповідних реакцій риб на дії забруднень, а також для коректного використання їх у моніторингових дослідженнях.

Зв'язок з науковими програмами, планами, темами. Дослідження проводили в Інституті біології південних морів у рамках бюджетних програмних тем НАН України «Структурно-функціональні засади біорозмаїття морських угрупувань» (№ д/р 0199U001388) (1999-2002 рр.), «Дослідження факторів підтримки усталеності морських екосистем» (№ д/р 0103U001048) (2003 - 2007 рр.).

Мета і завдання дослідження. Основна мета роботи - встановити особливості активності антиоксидантних ферментів і вмісту продуктів окислення білків риб різних екологічних груп, що мешкають у бухтах з неоднаковим рівнем забруднення. Згідно з метою дослідження були поставлені наступні задачі:

1. Виявити видові відмінності активності антиоксидантних ферментів еритроцитів та вмісту продуктів окислення білків сироватки крові риб.

2. Вивчити вікові та статеві особливості досліджуваних параметрів.

3. Встановити сезонні варіації активності антиоксидантних ферментів еритроцитів та вмісту продуктів окислення білків сироватки крові риб.

4. Дослідити вплив інвазії нематодами Hysterothylacium aduncum на стан ферментної антиоксидантної системи еритроцитів крові мерлана Merlangus merlangus euxinus.

5. Провести порівняльний аналіз активності ферментів еритроцитів та вмісту модифікованих білків сироватки крові риб з бухт з різним рівнем забруднення.

6. Встановити залежність активності антиоксидантних ферментів від вмісту токсичних елементів у м'язах чорноморських риб.

7. Виявити найбільш інформативні біомаркери для використання їх у моніторингових дослідженнях та оцінки стану риб та їх середовища.

Об'єкт дослідження - антиоксидантна ферментна система і динаміка вмісту продуктів окислення білків крові 6 масових видів чорноморських риб, що належать до різних екологічних груп.

Предмет дослідження - стан антиоксидантної ферментної системи еритроцитів та рівень окислювальної модифікації білків сироватки крові риб в умовах комплексного хронічного забруднення.

Методи дослідження. Комплекс спектрофотометричних і титрометричних методів визначення активності антиоксидантних ферментів - каталази (КАТ), супероксиддисмутази (СОД), пероксидази (ПЕР), глутатіонредуктази (ГР), глутатіон-S-трансферази (ГТ), рівня окислювальної модифікації білків, статистичний та кореляційний аналіз.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведено комплексне дослідження видових, статевих, вікових та сезонних особливостей антиоксидантної ферментної системи еритроцитів і вмісту продуктів окислення білків сироватки крові масових видів чорноморських риб. Встановлено видові відмінності досліджених параметрів, пов'язаних з пристосуванням видів до визначених умов існування. Показано, що з віком відбувається зниження АО ферментної активності та зростання рівня ОМБ крові риб.

Виявлено сезонні варіації досліджених параметрів крові риб, яки характеризуються збільшенням в теплу пору року, що обумовлено як підвищенням рівня метаболізму в організмі риб, так і посиленням рекреаційного навантаження на морські акваторії у даний період. Активність СОД в значній мірі залежить від температури води.

На стан АО ферментної системи крові істотний вплив здійснює зараженість риб паразитами. Показано, що у мерланки, зараженою нематодами Hysterothylacium aduncum активність КАТ, СОД та ГТ еритроцитів підвищується.

Оцінено вплив забруднення морських акваторій на досліджувані параметри. Запропоновано новий біомаркер (рівень окислювальної модифікації білків), що дозволяє оцінити стан риб, котрі мешкають в умовах хронічного забруднення, отримано патент на винахід (патент № 27484 UA, 2007). Встановлено, що вміст продуктів окислення білків сироватки крові вище у риб із забруднених акваторій. Визначено стратегію адаптації АОС еритроцитів крові до мінливих умов середовища проживання, що залежить від фізіологічного стану особнів, особливостей їх біології, природних і антропогенних факторів. Встановлено, що комплексне забруднення прибережних акваторій надає визначний вплив на активність АО ферментів і вміст окислених білків. При цьому відзначено як адаптивні відповідні реакції, що характеризуються індукцією активності ферментів зі збільшенням антропогенного навантаження, так і токсичні, які виявляються в інгібіруванні активності в районах з найбільшим рівнем забруднення.

Виявлено залежність між вмістом токсичних елементів у м'язових тканинах і активністю АО ферментів еритроцитів крові риб. Найбільш чутливою до накопичених у тканинах токсичних елементів є ГР.

Отримані результати мають теоретичне значення, так як роблять внесок у розуміння механізмів адаптації водних організмів, а також фізіологію, біохімію, екологію та екотоксикологію риб.

Практичне значення одержаних результатів. Результати роботи є цікавими для розробки моніторингових програм, а саме для біотестування і біоіндикації водних об'єктів за допомогою біомаркерів і біоіндикаторів риб. У наш час такий підхід широко застосовується у країнах ЄС, що дозволяє гармонізувати вітчизняні розробки зі стандартами Європейського співтовариства.

Критерії аналізу стану риб, засновані на вимірюванні активності ферментної антиоксидантної системи та рівня окислення білків, дають можливість отримати адекватну інформацію про здоров'я популяцій гідробіонтів в умовах хронічного забруднення морських акваторій і оцінити ступінь ризику, прогнозувати та коректувати господарську діяльність, розробляти заходи щодо їх оздоровлення.

Результати були використані у викладанні курсу лекцій «Екотоксикологія» на кафедрі біохімії Таврійського національного університету ім. В.І. Вернадського і можуть доповнити програму та вміст дисциплін «Екологія», «Гідробіологія», «Біохімія» для студентів університетів.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота є самостійним науковим дослідженням. Автором був розроблений методичний підхід виявлення залежності досліджених параметрів чорноморських риб від їх статі, віку, сезону, паразитарної інвазії, а також комплексного забруднення морських акваторій. Виконано статистичну обробку та аналіз отриманих результатів.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації повідомлені та обговорені на Всеросійській конференції за участю спеціалістів з країн Близького та Далекого зарубіжжя «Современные проблемы водной токсикологии» (Борок, 2002, 2004, 2005, 2008), на 2-му з'їзді токсикологів Росії (Москва, 2003), на Міжнародному симпозіумі «Биологические механизмы старения» (Харків, 2004, 2008), на Установчому з'їзді Українського товариства клітинної біології (Львів, 2004), на першій Міжнародній науково-практичній конференції молодих вчених «Комплексное исследование биологических ресурсов южных морей и рек» (Астрахань, 2004), на 3-ій науковій конференції «Заповедники Крыма» (Сімферополь, 2005, 2007), на конференції молодих науковців з проблем Чорного й Азовського морів «Понт Эвксинский» ІV, V (Севастополь, 2005, 2007), на 5-ій Всеукраїнській науковій конференції студентів і аспірантів «Біологічні дослідження молодих учених України» (Київ, 2005), на 7-ій Всеросійській конференції «Биоантиоксидант» (Москва, 2006), на Міжнародній науково-практичній конференції «Проблемы иммунологии, патологии и охраны здоровья рыб и других гидробионтов-2» (Борок, 2007), на науково-практичній конференції з міжнародною участю «Актуальные проблемы охраны здоровья рыб и других гидробионтов» (Феодосія, 2008), на Міжнародній науковій конференції «Современные проблемы морской инженерной экологии» (Ростов-на-Дону, 2008).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 27 наукових робіт, з них 7 в провідних наукових виданнях, затверджених ВАК України; отримано 1 патент на винахід.

Структура й обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів, двох розділів результатів досліджень та їх обговорення, узагальнення, висновків та списку літератури, який містить 265 джерел. Робота викладена на 149 сторінках, містить 30 таблиць та 18 рисунків.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури. Розглянуто процеси вільнорадикального окислення (ВРО) у живих організмах, надано загальну характеристику АОС риб. Наведено відомості про статеві та вікові особливості вмісту продуктів ВРО й АОС гідробіонтів, а також про вплив на них природних і антропогенних факторів. Показано роль параметрів АОС у якості біомаркерів, що характеризують стан риб в умовах інтенсивного забруднення водного середовища.

Матеріали і методи досліджень. Дослідження проводили на 6 масових видах чорноморських риб, що належать до різних екологічних груп: морський йорж Scorpaena porcus L. (донна група), морський минь Gaidropsarus mediterraneus L., султанка Mullus barbatus ponticus Essipov (придонна група), мерланка Merlangus merlangus euxinus Nordmann, спікара Spicara flexuosa Rafinesque (придонна-пелагічна група), ставрида Trachurus mediterraneus ponticus Aleev (пелагічна група).

Повний біологічний аналіз риб проводили за загальноприйнятими методиками (Правдин, 1966; Шварц, 1968).

Активність АО ферментів еритроцитів крові риб визначали спектрометричними і титрометричними методами. Активність КАТ виявляли за реакцією розкладу перекису водню (Асатиани, 1969), активність СОД - за ступенем зниження швидкості процесів відновлення нітросинього тетразоля в інкубаційному середовищі (Nishikimi et al, 1972), активність ПЕР - за реакцією з бензидином (Литвин, 1981), активність ГР - за зменшенням НАДФН, активність ГТ - з 1-хлор-2,4-динітробензолом (Переслегина, 1989). Активність ферментів перераховували на мг гемоглобіну (Hb) за хвилину. Вміст гемоглобіну визначали згідно методу, описаному (Андреева, 2001).

Рівень ОМБ аналізували на основі реакції взаємодії окислених амінокислотних залишків білка з 2,4-динітрофенілгідрозином з утворенням 2,4-динітрофенілгідразонів. Оптичну щільність утворених 2,4-динітрофенілгідразонів реєстрували при наступній довжині хвиль: 346 нм і 370 нм (альдегідні та кетонні продукти окислювальної модифікації нейтрального характеру), а також при 430 нм і 530 нм (альдегідні та кетонні продукти окислювальної модифікації основного характеру).

Дослідження біохімічних параметрів проводили на зразках, отриманих від індивідуальних особнів. Статистичну обробку даних проводили за (Лакін, 1990). Вираховували середнє арифметичне (М), помилку середнього арифметичного (m). Порівняльний аналіз даних здійснювали з використанням t-критерію Стьюдена і U-критерію Уїлкоксона (Манна-Уїтні). Відмінності між рядами, що порівнюються, вважали достовірними і статистично значимими при p ? 0,05. З метою виявлення залежності між параметрами, котрі досліджуються, розраховували коефіцієнт кореляції (r) за допомогою стандартної програми «EXCEL”.

Результати та їх обговорення

Видові відмінності активності антиоксидантних ферментів еритроцитів крові чорноморських риб. Для виявлення видових особливостей активності АО ферментів проведено її порівняльний аналіз у еритроцитах крові риб (рис. 1). Встановлено високе значення активності СОД, ГР і ГТ у представників придонної групи (морський минь, султанка), що, напевно, пов'язано з мінливістю середовища і наявністю певних рівнів токсикантів. Мінімальне значення активності даних ферментів помічено у морського йоржа (донна група), що може бути обумовлено інгібіруючим ефектом токсичних речовин, що містяться у високих концентраціях у придонному шарі води і в ґрунті.

Однак для ПЕР виявлено зворотну тенденцію: активність ферменту максимальна в еритроцитах крові морського йоржа, мінімальна у султанки, що може бути обумовлено компенсаційними ефектами ферментної АОС риб при дії несприятливих факторів.

Статеві і вікові особливості активності антиоксидантних ферментів крові чорноморських риб. Результати продемонстрували, що активність АО ферментів еритроцитів крові масових прибережних видів риб не залежить від статі. Це дозволяє використовувати їх у якості інформативних біомаркерів у моніторингових програмах без градації за статевою ознакою.

Дослідження вікових особливостей АОС риб різних екологічних груп дозволило виявити зниження ферментної активності в еритроцитах крові зі збільшенням віку. Відзначено зниження активності КАТ, СОД і ГТ у морського йоржа 5-7 років у порівнянні з більш молодшими 2-3-річними особнями (табл. 1).

Для султанки встановлено мінімальне значення активності КАТ, СОД і ГР у віці 5 років (табл. 2). Активність КАТ і ГТ знижена у спікари 4-річного віку, КАТ і ПЕР у 3-річних особнів ставриди у порівнянні з показниками риб молодших вікових груп (табл. 3,4).

Таблиця 1

Активність антиоксидантних ферментів в еритроцитах крові морського йоржа різного віку (М ± m)

Фермент	2 року, n=51	3 року, n=106	4 року, n= 81	5 років, n=44	6-7 років, n = 18
КАТ, мг Н2О2/мг Hb у хв	0,47±0,03	0,46±0,02	0,42±0,01	0,41±0,01	0,38± 0,03*
СОД, ум. од./мг Hb у хв	165,60±15,41	148,12±7,89	138,60±11,0	114,19±9,81*	114,9± 15,02*
ПЕР, опт. од./мг Hb/хв	28,07±1,62	26,0±1,19	30,24±1,44	33,28±1,58	30,75± 3,74
ГР, нмоль НАДФН/мг Hb у хв	1,33±0,24	2,37±0,34	2,55±0,42	2,10±0,44	2,31± 1,14
ГT, нмоль кон'юг./мг Hb у хв	11,43±1,29	10,81±1,08	11,42±1,29**	7,37± 1,26*	4,86± 1,38*

Примітка:* - відмінності достовірні у порівнянні з 2-3-річними особнями; ** - відмінності достовірні у порівнянні з 5-7-річними особнями (р <0,05 - 0,01); n - кількість особнів

Таблиця 2

Активність антиоксидантних ферментів в еритроцитах крові султанки різного віку (М ± m)

Фермент	1 рік, n= 12	2 року, n= 41	3 року, n= 17	4 року, n= 6	5 років, n=5
КАТ, мг Н2О2 /мг Hb у хв	0,46±0,09	0,52±0,04*	0,62±0,05*	0,48± 0,10	0,35± 0,05
СОД, ум. од. /мг Hb у хв	405,20±65,78*	314,42±31,51	326,24±62,17	268,11± 68,23	254,57± 24,48
ПЕР, опт. од./мг Hb у хв	7,68±2,13	4,72±0,73	5,09±1,72	10,06± 4,13	12,67± 5,76
ГР, нмоль НАДФН/мг Hb у хв	8,81±3,37* **	5,82±1,10* **	5,32±1,47* **	1,31± 0,12	0,46± 0,32
ГT, нмоль кон'юг. /мг Hb у хв	17,08±6,09	22,84±4,64	29,91±8,90	16,02± 2,89	13,12± 3,01

Примітка: * - відмінності достовірні у порівнянні зі значеннями 5-річних особнів; ** - відмінності достовірні у порівнянні зі значеннями 4-річних особнів (р < 0,05); n - кількість особнів

Спад активності ОА ферментів у риб старших вікових груп може бути пов'язаний як з посиленням вільнорадикальних процесів, так і зі зниженням синтезу АО ферментів, що призводить до виснаження захисних систем організму в умовах посиленого антропогенного впливу.

Таблиця 3

Активність антиоксидантних ферментів в еритроцитах крові спікари різного віку (М ± m)

Фермент	1 рік, n= 18	2 року, n= 28	3 року, n= 26	4 року, n= 7
КАТ, мг Н2О2/мг Hb у хв	0,47±0,07	0,43±0,05	0,60±0,09*	0,34±0,04
СОД, ум. од. /мг Hb у хв	195,71±35,69	182,46±24,28	145,23±37,51	159,02±31,06
ПЕР, опт. од./мг Hb у хв	7,21±2,38	14,89±3,21	11,02±2,51	13,11±6,65
ГР, нмоль НАДФН/мг Hb у хв	3,31±1,38	3,02±0,72	3,77±0,81	3,80±2,03
ГT, нмоль кон'юг./мг Hb у хв	11,72±2,37*	13,61±3,49*	17,63±3,21*	6,02±1,29

Примітка: * - відмінності достовірні у порівнянні зі значеннями 4-річних особнів (р < 0,05); n - кількість особнів

Таблиця 4

Активність антиоксидантних ферментів в еритроцитах крові ставриди різного віку (М ± m)

Фермент	1 рік, n= 71	2 року, n= 50	3 року, n= 12
КАТ, мг Н2О2/мг Hb у хв	0,28±0,02	0,34±0,02	0,26±0,02*
СОД, ум. од./мг Hb у хв	228,25±23,08	196,78±20,63	179,59±27,37
ПЕР, опт. од./мг Hb у хв	18,72±2,51**	17,87±2,18**	9,68±2,51
ГР, нмоль НАДФН/мг Hb у хв	4,47±0,91	4,29±0,32	3,12±0,83
ГT, нмоль кон'юг./мг Hb у хв	20,02±2,27	19,81±2,38	21,78±4,07

Примітка: * - відмінності достовірні у порівнянні зі значеннями 2-річних особнів; ** - відмінності достовірні у порівнянні зі значеннями 3-річних особнів (р < 0,05); n - кількість особнів

Сезонні варіації активності АО ферментів еритроцитів крові чорноморських риб. При вивченні сезонних варіацій параметрів АО ферментів крові чорноморських риб у більшості випадків встановлено їх підвищення у весняний та літньо-осінній періоди у порівнянні з зимовим.

Тільки для ПЕР, спроможної розкладати вуглеводні нафти, що потрапляють до організму (Руднєва, 2000), виявлено зворотну тенденцію. Активність ферменту мінімальна в крові риб у весняно-літній період, що може бути пов'язано з високою чисельністю нафторуйнівних мікроорганізмів у воді, які інтенсивно утилізують і розкладають нафтопродукти.

Варто відзначити незначні коливання активності АО ферментів в еритроцитах крові морського йоржа протягом року у порівнянні з іншими видами риб, що, певно, пов'язано з осілим способом життя, постійним антропогенним пресингом і органічною кормовою базою. Саме тому мігранти (султанка, ставрида, спікара), котрі мають більш широкий ареал, ніж осілі риби, інтенсивніше споживають їжу, характеризуються більш широкою амплітудою сезонних фізіологічних ритмів.

Зміна активності АО ферментів протягом року може бути пов'язана як з існуванням сезонних фізіологічних ритмів, обумовлених коливаннями температурного і кисневого режимів, особливостями харчування (Шульман, 1972), так і з різним рівнем антропогенного навантаження протягом року. З одного боку, з підвищенням температури спостерігається інтенсифікація обмінних процесів в організмі риб, підготовка до нересту і нерест. Переднерестовий і нерестовий періоди характеризуються високим рівнем метаболізму у досліджених видів і супроводжується інтенсивним живленням (Шульман, 1972, Багнюкова та ін., 2000). В цей час у риб відмічено максимальний рівень тканинного дихання (Столбов, 1990). З іншого боку, у зв'язку з підвищенням температури збільшується рекреаційне навантаження на прибережні акваторії, що сприяє проникненню в організм біогенів і ксенобіотиків у високих концентраціях. Все це призводить до зростання активності АО ферментів в еритроцитах крові риб у теплу пору року.

За допомогою кореляційного аналізу показано, що найбільш чутливою до температурних коливань є СОД (r = 0,43 - 0,96).

Вплив паразитарної інвазії на стан АО ферментної системи крові риб. Результати досліджень показали, що у мерланки під впливом інвазії нематодами Hysterothylacium aduncum відбувається індукція активності КАТ, СОД і ГТ в еритроцитах крові. Певно, впровадження паразита у стінки органів травлення, виділення метаболітів у організм хазяїна посилює процеси ВРО і є потужними факторами, стимулюючими активність АО ферментів.

Враховуючи високий ступінь біологічного забруднення Чорного моря, досліджені параметри дозволяють оцінити стан риб і можуть бути використані у якості індикаторів впливу на них біотичних факторів.

Екологічна характеристика районів дослідження. Для оцінки антропогенних факторів, що впливають на організми риб, проаналізували екологічний стан бухт, в яких вони були відловлені.

Дослідження проводили у трьох севастопольських бухтах - Мартинова, Карантинній та Стрілецькій, котрі піддаються різному антропогенному навантаженню. Найбільший вміст токсичних речовин у воді та ґрунті відзначено у Стрілецькій бухті. Ґрунт бухти Мартинова є більш забрудненим, ніж Карантинної, тоді як рівень токсичних речовин вище у воді останньої, що обумовлено різним розташуванням даних районів і наявністю в Карантинній бухті викидів господарсько-побутових стічних вод. Цей факт необхідно враховувати при вивченні впливу забруднення на досліджувані параметри крові риб, що належать до різних екологічних груп.

Вплив комплексного забруднення морських акваторій на стан АО ферментної системи еритроцитів крові риб. Отримані результати продемонстрували різні відгуки риб на несприятливі фактори середовища: адаптивний (у придонно-пелагічних та пелагічних видів з бухти Карантинної; у донного йоржа з бухти Мартинова), пов'язаний зі збільшенням активності ферментів в еритроцитах крові на підвищення рівня забруднення, і токсичний (у всіх досліджених видах зі Стрілецької бухти), коли відбувається інгібірування активності ферментної АОС при наявності токсикантів високих концентрацій у воді та ґрунті.

Зокрема, відзначено підвищення активності КАТ, СОД, ПЕР і ГТ в еритроцитах крові морського йоржа з бухти Мартинова, яка характеризується більш високим вмістом токсичних речовин у ґрунті, у порівнянні з Карантинною. Однак у особнів з найбільш забрудненої Стрілецької бухти активність усіх досліджених ферментів знижена (табл. 5).

Таблиця 5

Активність антиоксидантних ферментів в еритроцитах крові морського йоржа з різних бухт (М ± m)

Фермент	Б. Мартинова, n = 83	Б. Карантинна, n = 32	Б. Стрілецька, n = 12
КАТ, мг Н2О2/мг Hb у хв	0,41 ± 0,01	0,37 ± 0,01**	0,37 ± 0,03
СОД, ум. од./мг Hb у хв	167,38 ± 10,13*	104,88 ± 9,32**	80,95 ± 10,90
ПЕР, опт. од./мг Hb у хв	29,33 ± 1,47*	26,47 ± 2,10	22,55 ± 2,62
ГР, нмоль НАДФН/мг Hb у хв	3,31 ± 0,50	1,52 ± 0,37**	1,72 ± 0,44**
ГТ, нмоль кон'юг./мг Hb у хв	11,66 ± 1,24*	11,71 ± 1,91*	4,86 ± 0,68

Примітка: * - відмінності достовірні у порівнянні зі значенням риб з бухти Стрілецької; ** - те ж у порівнянні зі значенням риб з бухти Мартинова (р < 0,05); n - кількість особнів

антиоксидантний фермент риба кров

Для султанки і спікари відзначено варіації активності АО ферментів з різних акваторій: підвищення активності КАТ і СОД у риб з Карантинної бухти у відповідь на високий вміст токсичних речовин у воді та зниження активності СОД у особнів зі Стрілецької бухти (табл. 6,7).

Таблиця 6

Активність антиоксидантних ферментів в еритроцитах крові султанки з різних бухт (М ± m)

Фермент	Б. Мартинова, n=21	Б. Карантинна, n=9	Б. Стрілецька, n=8
КАТ, мг Н2О2/мг Hb у хв	0,43±0,04	0,73±0,05**	0,81±0,09**
СОД, ум. од./мг Hb у хв	283,25±35,92*	365,50±50,97*	122,30±12,90
ПЕР, опт. од. /мг Hb у хв	4,61±1,01	2,98±1,07	3,97±0,93
ГР, нмоль НАДФН/мг Hb у хв	7,44±1,61	12,10±4,50	5,37±2,0
ГТ, нмоль кон'юг./мг Hb у хв	36,18±8,45	15,31±2,36**	20,72±5,24

Таблиця 7

Активність антиоксидантних ферментів в еритроцитах крові спікари з різних бухт (М ± m)

Фермент	Б. Мартинова, n=5	Б. Карантинна, n=8	Б. Стрілецька, n=13
КАТ, мг Н2О2/мг Hb у хв	0,49±0,10	0,71±0,13*	0,38±0,02
СОД, ум. од./мг Hb у хв	137,04±22,03*	274,53±33,14* **	76,37±18,10
ПЕР, опт. од. /мг Hb у хв	6,33±3,0*	3,48±0,64	2,80±0,26
ГР, нмоль НАДФН/мг Hb у хв	2,21±0,66	2,54±1,04	1,27±0,25
ГТ, нмоль кон'юг./мг Hb у хв	8,89±2,40	14,54±3,78	8,84±3,25

На біохімічні параметри пелагічної ставриди також вплинув вміст токсичних речовин у воді. Зростання АО ферментної активності характерне для риб з Карантинної бухти, у порівнянні з бухтою Мартинова. У особнів зі Стрілецької бухти, навпаки, відзначено зниження активності СОД і ГТ у відповідь на високий вміст ксенобіотиків у середовищі (табл. 8).

Таблиця 8

Активність антиоксидантних ферментів в еритроцитах крові ставриди з різних бухтах (М ± m)

Фермент	Б. Мартинова, n=14	Б. Карантинна, n=29	Б. Стрілецька, n=8
КАТ, мг Н2О2/мг Hb у хв	0,30±0,03	0,34±0,02	0,39±0,05
СОД, ум. од./мг Hb у хв	192,03±26,94*	217,82±9,22*	64,95±4,55
ПЕР, опт. од./мг Hb у хв	9,38±1,99	14,83±2,48	9,76±3,47
ГР, нмоль НАДФН/мг Hb у хв	2,21±0,66	4,37±0,55	3,30±1,37
ГТ, нмоль кон'юг./мг Hb у хв	26,01±4,41*	17,64±2,80*	5,88±2,0

Таким чином, активність АО ферментів можна застосовувати у якості біомаркерів для оцінки стану риб та їх середовища і використовувати разом з іншими параметрами у моніторингових дослідженнях. При цьому необхідно враховувати біологічні особливості та екологічну приналежність досліджених видів. Варто відзначити, що найбільш яскравий відгук з боку АО ферментної системи характерний для морського йоржа (табл. 10). У зв'язку з тим, що даний вид веде осілий спосіб життя і підвладний постійному антропогенному впливу, його параметри найбільш адекватно відображають стан середовища, що дозволяє використовувати морського йоржа в якості біомоніторного виду у сучасних екотоксикологічних дослідженнях (Руднева и др., 2000, 2004; Вахтина и др., 2005).

Вплив вмісту токсичних елементів у м'язах на активність антиоксидантних ферментів та рівень окислювальної модифікації білків крові риб. З метою детального аналізу впливу забруднення на стан ферментної АОС крові проведено кореляційний аналіз залежності цих параметрів від вмісту токсичних елементів у м'язах досліджених риб.

Встановлено, що АО ферменти у більшій мірі реагують на присутність Cu у тканинах, що, певно, пов'язано з високою біофільністю цього елементу (Скальний, 2004, Моисеенко и др., 2006). Ступінь чутливості ферментів АОС до накоплених у тканинах риб металів виражається в наступній послідовності: ГР > СОД, КАТ > ГТ, ПЕР. Найбільш чутливою до накоплених у тканинах токсичних елементів є ГР, що може бути обумовлено роллю цього ферменту у відновленні глутатіону, який входить до складу глутатіонпероксидази і ГТ, котрі виконують найважливіші функції у процесі біотрансформації ксенобіотиків.

Видові відмінності вмісту продуктів окислення білків у сироватці крові прибережних видів риб. Вміст усіх продуктів окислення білків у сироватці крові султанки значно перевищує відповідні показники морського йоржа, мерланки і ставриди (p < 0,05 - 0,01). Високий рівень модифікованих компонентів виявлено також у миня і спікари.

Загальний вміст окислених форм білків у риб розподіляється наступним чином (у порядку зростання): ставрида > мерланка > морський йорж > морський минь > спікара > султанка.

Низький вміст продуктів окислення білків у сироватці ставриди, скоріш за все, пов'язаний з її способом життя. Це пелагічний вид, що швидко переміщується, спроможний перейти з акваторії з підвищеним забрудненням у більш чисті райони. Як відомо, у рухливих риб вище рівень обмінних процесів (Шульман, 1989), у зв'язку з чим в організмі ставриди відбувається більш швидке розщеплювання і виведення продуктів окислення.

Збільшення вмісту продуктів окислення білків у сироватці крові придонних (морський минь і султанка) та придонно-пелагічних (спікара) риб може бути обумовлено мінливістю, що стимулює окислювальні процеси в організмі риб.

Очевидно, відмінності у рівні ОМБ сироватки крові риб обумовлені не тільки приналежністю до екологічної групи, а також визначаються видовою специфічністю та способом життя.

Статеві та вікові особливості вмісту продуктів окислення білків у сироватці крові риб. У наших дослідженнях не встановлено статевих відмінностей у вмісті модифікованих білків у сироватці крові риб.

При вивченні вмісту продуктів окислення білків у сироватці крові морського йоржа і мерланки різного віку встановлено збільшення їх рівня в риб старших вікових груп у порівнянні з молодими.

Відзначено високий вміст продуктів окислення білків у сироватці крові риб в період статевого дозрівання: морський йорж - 3 роки, мерланка - 1 рік. Як відомо, у даний час спостерігається інтенсифікація метаболічних процесів (Шульман, 1972) та збільшення концентрації вільних радикалів у тканинах (Соколовский, 1988), що призводить до посиленого утворення модифікованих форм білків.

Підвищення рівня ОМБ у риб старших вікових груп свідчить як про зниження захисних функцій з боку АОС, так і про посилення процесів ВРО в результаті накопичення токсичних речовин у тканинах.

Сезонні варіації вмісту продуктів окислення білків у сироватці крові риб. При вивченні сезонної динаміки вмісту продуктів окислення білків у сироватці крові риб встановлено підвищення їх рівня у літньо-осінній період.

Підвищення рівня ОМБ в сироватці крові риб у літньо-осінній період пов'язано, імовірно, як з інтенсифікацією обмінних процесів зі зростанням температури води, так і з підвищенням антропогенного навантаження у даний період року.

Вплив комплексного забруднення прибережних акваторій на вміст продуктів окислення білків у сироватці крові риб. Різне антропогенне навантаження вплинуло на рівень продуктів окислення білків у сироватці крові риб, що мешкають у досліджених бухтах.

Виявлено високий вміст продуктів окислення білків у сироватці крові морського йоржа з бухти Мартинова у порівнянні з відповідними показниками особнів з бухти Карантинної, що свідчить про активацію процесів ВРО у донних риб, що перебувають в умовах підвищеного забруднення ґрунтів.

Для мерланки і ставриди встановлено більш високий рівень ОМБ з Карантинної бухти через наявність викидів господарсько-побутових і зливових стічних вод, що певно, стимулює процеси окислення білків у придонно-пелагічних і пелагічних риб у даному районі.

Таким чином, рівень ОМБ сироватки крові адекватно відображає стан риб в умовах хронічного комплексного забруднення морських акваторій. Даний параметр можна рекомендувати у якості біомаркера для оцінки здоров'я організму і його середовища (патент № 27484 UA, 2007). Однак, при оцінці факторів, що модифікують білки крові, необхідно враховувати не тільки насиченість середовища токсичними речовинами, але й екологічні особливості риб.

Отримані результати можуть мати практичне значення і представляють інтерес для розробки моніторингових програм, а саме для біотестування та біоіндикації водних об'єктів за допомогою біомаркерів і біоіндикаторів риб.

Критерії аналізу стану риб, засновані на вимірюванні активності ферментної АОС та рівня ОМБ, дають можливість отримати адекватну інформацію про здоров'я популяцій гідробіонтів в умовах комплексного хронічного забруднення. При цьому для екотоксикологічної оцінки середовища риб необхідно враховувати особливості досліджених об'єктів, вікові та сезонні варіації біохімічних параметрів, у зв'язку з чим варто дотримуватися наступних рекомендацій: дослідження риб проводити в єдиний сезон; вибірка об'єктів має складатися з близьких за віком риб.

Запропоновані рекомендації дозволяють уніфікувати групу об'єктів, що тестуються, і тим самим отримати більш точні результати, які відображають вплив комплексного забруднення на риб, що і потрібно у моніторингових програмах.

ВИСНОВКИ

1. Порівняльний аналіз активності антиоксидантних ферментів і рівня окислювальної модифікації білків крові шести видів чорноморських риб виявив наявність виражених видових відмінностей, що залежать від екологічних і біологічних особливостей риб, природних та антропогенних факторів.

2. Встановлено вікову динаміку досліджених параметрів, що характеризується зниженням активності антиоксидантних ферментів і підвищенням рівня окислювальної модифікації білків крові у риб старших вікових груп.

3. Сезонна динаміка досліджених показників проявляється в їх збільшенні в теплу пору року і пов'язана як з підвищенням рівня метаболізму в організмі риб, так і з посиленням рекреаційного навантаження на морські акваторії у даний період. Встановлено високий кореляційний зв'язок між активністю СОД та температурою води (r = 0,43 ч 0,96).

4. У мерланки під впливом паразитарної інвазії нематодами Hysterothylacium aduncum активність КАТ, СОД і ГТ еритроцитів крові достовірно підвищується.

5. Забруднення морського середовища модифікує активність ферментів антиоксидантної системи еритроцитів крові риб. При цьому відзначені як адаптивні реакції у відповідь, що характеризуються індукцією активності ферментів зі збільшенням антропогенного навантаження, так і токсичні, котрі проявляються в інгібіруванні активності у районах з високим рівнем забруднення.

6. Виявлено залежність між вмістом токсичних елементів у тканинах риб і активністю антиоксидантних ферментів. Найбільш чутливою до накопичених у тканинах токсичних елементів є ГР (r = -0,50 ч -0,90).

7. Знайдено, що рівень окислювальної модифікації білків сироватки крові вище у риб з більш забрудненого середовища.

8. Активність антиоксидантних ферментів і рівень окислювальної модифікації білків крові можна рекомендувати у якості біомаркерів для оцінки стану риб та їх середовища. При цьому слід ввести певні обмеження для моніторингових програм, які виражаються в необхідності тестування риб однієї вікової групи і в єдиний сезон. При інтерпретації отриманих результатів необхідно враховувати біологічні особливості досліджуваних видів та їх приналежність до екологічних груп.

СПИСОК ОСНОВНИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Скуратовская Е.Н. Ответные реакции антиоксидантных ферментов морского ерша (Scorpaena porcus L.) на антропогенное загрязнение / Е.Н. Скуратовская // Учен. зап. Тавр. нац. ун-та им. В.И. Вернадского. Сер. Биология. - 2003. - Т. 16 (55), № 2. - С. 175-178.

2. Руднева И.И. Влияние антропогенного загрязнения на активность антиоксидантных ферментов крови некоторых видов черноморских рыб / И.И. Руднева, Е.Н. Скуратовская, Т.Б. Вахтина // Вісн. Одес. нац. ун-ту. Біологія. - 2004. - Т. 9, вип. 5. - С. 116-120 (Особистий внесок здобувача полягає в проведенні досліджень та обробці фактичного матеріалу).

3. Скуратовская Е.Н. Активность глутатион-S-трансферазы крови морского ерша (Scorpaena porcus L.) в зависимости от пола, сезона и возраста / Е.Н. Скуратовская // Укр. біохим. журн. - 2005. - Т. 77, № 5. - С. 116-119.

4. Скуратовська К.М. Вікові зміни активності антиоксидантних ферментів у крові чорноморської скорпени (Scorpaena porcus L.) / Скуратовська К.М.// Біологічні дослідження молодіх учених в Україні: Матеріали V всеукр. наук. конф. студентів та аспірантів, 15 - 16 вересня 2005 р. - Київ, 2005. - С 88-90.

5. Скуратовская Е.Н. Влияние паразитарной инвазии на активность некоторых антиоксидантных ферментов тканей черноморского шпрота (Sprattus sprattus phalericus R.) / Е.Н. Скуратовская, А.В. Завьялов // Риб. госп-во України. - 2006. - № 5-6. - С. 54-55 (Особистий внесок здобувача полягає у формулюванні цілі роботи, проведенні досліджень, обробці та аналізі даних, написанні тексту статті).

6. Скуратовская Е.Н. Влияние антропогенного загрязнения на активность антиоксидантных ферментов крови некоторых видов черноморских рыб / Е.Н. Скуратовская // Проблемы иммунологии, патологии и охраны здоровья рыб и других гидробионтов - 2: Расширенные материалы Междунар. науч. -практ. конф. Борок - Москва, 2007. - С. 264-268.

7. Скуратовская Е.Н. Влияние экологических и антропогенных факторов на процессы окислительной модификации сывороточных белков черноморских рыб / Е.Н. Скуратовская, И.И. Дорохова, Ю.А. Граб // Риб. госп-во України. - 2007. - № 5. - С. 12 -15 (Особистий внесок здобувача полягає у формулюванні цілі роботи, проведенні досліджень, обробці та аналізі даних, написанні тексту статті).

8. Скуратовская Е.Н. Видовые особенности антиоксидантной ферментной системы крови некоторых видов черноморских рыб / Е.Н. Скуратовская, И.И. Руднева // Риб. госп-во України. - 2008. - № 1. - С. 15-18 (Особистий внесок здобувача полягає в проведенні досліджень, обробці та аналізі даних).

9. Скуратовская Е.Н. Влияние паразитарной инвазии на состояние антиоксидантной ферментной системы крови мерланга (Merlangus merlangus euxinus) / Е.Н. Скуратовская, А.В. Завьялов // Ветеринарна медицина. - 2008. - № 90. - С. 394-398 (Особистий внесок здобувача полягає у формулюванні цілі роботи, проведенні досліджень, обробці та аналізі даних, написанні тексту статті).

10. Скуратовская Е.Н. Применение биохимических маркеров в условиях нефтяного загрязнения / Е.Н. Скуратовская // Современные проблемы морской инженерной экологии: Материалы междунар. науч. конф. (Ростов-на-Дону, 9-11 июня 2008 г.). - Ростов-на-Дону. - С. 233-236.

АНОТАЦІЯ

Скуратовська К.М. Стан антиоксидантної ферментної системи крові чорноморських риб в умовах комплексного хронічного забруднення. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 - біохімія. - Одеський національний університет імені І. І. Мечникова, Одеса, 2009.

Дисертаційна робота присвячена дослідженню видових, статевих, вікових і сезонних особливостей АО ферментної системи і вмісту продуктів окислення білків крові деяких чорноморських риб, а також впливу комплексного забруднення морських акваторій на дані параметри з метою використання їх у якості біомаркерів для характеристики гідробіонтів та їх середовища.

Виявлено видові особливості активності АО ферментів та рівня ОМБ крові риб. Показано, що з віком відбувається зниження АО ферментної активності та підвищення рівня ОМБ крові риб. Встановлено, що досліджені параметри підвладні сезонним коливанням, які характеризуються збільшенням у теплу пору року (за винятком активності ПЕР). На стан АО ферментної системи крові істотний вплив здійснює зараженість риб паразитами. Виявлено залежність між вмістом токсичних елементів у тканинах риб і активністю АО ферментів крові риб. Встановлено, що активність АО ферментів та рівень ОМБ крові адекватно відображає стан риб, у зв'язку з чим їх можна рекомендувати в якості біомаркерів у екотоксикологічних дослідженнях.

Ключові слова: антиоксидантна система, вільнорадикальне окислення, окислювальна модифікація білків, комплексне забруднення, біомаркери.

АННОТАЦИЯ

Скуратовская Е.Н. Состояние антиоксидантной ферментной системы крови черноморских рыб в условиях комплексного хронического загрязнения. - Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04 - биохимия. - Одесский национальный университет имени И. И. Мечникова, Одесса, 2009.

Диссертационная работа посвящена исследованию видовых, половых, возрастых и сезонных особенностей АО ферментной системы и содержания продуктов окисления белков сыворотки крови некоторых черноморских рыб, а также влиянию комплексного загрязнения морских акваторий на данные параметры с целью применения их в качестве биомаркеров для характеристики гидробионтов и среды их обитания.

Обнаружены видовые особенности активности АО ферментов и уровня ОМБ крови рыб, связанные с приспособленностью видов к определенным условиям существования.

Показано, что с возрастом происходит снижение АО ферментной активности и повышение уровня ОМБ крови рыб, обусловленное как усилением процессов свободнорадикального окисления, так и снижением синтеза ферментов АОС.

Выявлено, что исследованные параметры подвержены сезонным колебаниям, характеризующимся увеличением в теплое время года (за исключением активности ПЕР). Активность СОД в наибольшей степени зависит от температуры воды в каждый сезон года.

Установлено, что на активность АО ферментов влияет паразитарная инвазия рыб. У мерланга, зараженного нематодами Hysterothylacium aduncum, активность КАТ, СОД и ГТ эритроцитов крови повышается.

Оценено влияние загрязнения морских акваторий на исследованные параметры. Показано, что загрязнение морской среды модифицирует активность ферментов АОС крови рыб. При этом отмечены как адаптивные ответные реакции, характеризующиеся индукцией активности ферментов с увеличением антропогенной нагрузки, так и токсические, проявляющиеся в ингибировании активности в районах с высоким уровнем загрязнения. Уровень ОМБ сыворотки крови выше у рыб из более загрязненной среды обитания.

Установлено, что наиболее чувствительной к накопленным в тканях токсичным элементам является ГР. Активность АО ферментов и уровень ОМБ крови можно рекомендовать в качестве биомаркеров для оценки состояния рыб и среды их обитания.

Ключевые слова: антиоксидантная система, свободнорадикальное окисление, окислительная модификация белков, комплексное загрязнение, биомаркеры.

SUMMARY

Skuratovskaya E.N. Condition of antioxidant enzyme system in blood of the Black Sea fish species under the pressure of complex steady contamination. - Manuscript.

The dissertation for the candidate's degree of biological sciences in speciality 03.00.04 - Biochemistry. - I. I Mechnikov Odessa National University, Odessa, 2009.

The dissertation is devoted to the investigation of species, sex, age and seasonal characteristics of antioxidant (AO) enzyme system and level of oxidative proteins in blood of some Black Sea fish species, and the influence of steady contamination of the sea waters on these parameters with the aim to use them as biomarkers to characterize hydrobionts and their environment.

Fish species differences of AO enzyme activity and level of oxidative proteins in fish blood have been found. It has been shown, that with the age the enzyme activity decreases while oxidative protein level increases. The parameters studied are effected by seasonal variations, characterized by the increase of the activity in warm time of the year (an exception is Peroxidase). Parasite invasion, has been shown, to affect the condition of fish AO enzyme system. Dependence between the level of toxic elements in fish tissues and AO enzyme activity has been determined. It has been found, that AO enzyme activities and level of oxidative proteins in blood adequately reflect fish condition, therefore they can be recommended as biomarkers in ecotoxicological investigations.

Key words: antioxidant system, free radical oxidation, oxidative protein modification, complex contamination, biomarkers.

Размещено на Allbest.ru

...