Розробка бази даних генів 21-ї хромосоми людини та встановлення нових функціональних зв'язків Інтерсектину 1

Размещено на http://www.allbest.ru/

Національна академія наук України

Інститут молекулярної біології і генетики

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Розробка бази даних генів 21-ї хромосоми людини та встановлення нових функціональних зв'язків Інтерсектину 1

Ніколаєнко О.В.

03.00.03 Ї молекулярна біологія

Київ Ї 2009

Вступ

Актуальність теми. Трисомія 21-ї хромосоми - це основна генетична причина розумової відсталості та одна з небагатьох анеуплоїдій, що сумісна з післяродовим виживанням. Вона зустрічається приблизно в 1 з 700 новонароджених незалежно від етнічної групи. Окрім слабоумства, яке спостерігається в кожного хворого на синдром Дауна, трисомія 21-ї хромосоми асоційована з більш ніж 80 клінічними ознаками, включаючи вроджений порок серця, дуоденальний стеноз або атрезію, захворювання Гиршспрунга, гіпотонію м'язів, дефіцити імунної системи, підвищений ризик розвитку лейкемії та ранній початок хвороби Альцгеймера (Epsteіn et al., 2001).

Ключове питання у вивченні синдрому Дауна Ї встановлення кореляції між підвищеною експресією генів та фенотипічними проявами для подальшої розробки фармацевтичних сполук, які будуть здатні попереджати або поліпшити симптоми хвороби. Це дуже складне завдання, беручи до уваги велику кількість генів-кандидатів (>350). Ефективний аналіз потребує інтеграції та детального вивчення всієї інформації, що стосується цих генів, включаючи, але не обмежуючись встановленням точної кількості генів-кандидатів, їхньої структури та альтернативного сплайсингу; описом їхніх функцій, мішеней, субстратів та шляхів чи комплексів, до складу яких входять продукти генів-кандидатів; дослідженням профілей експресії генів 21-ї хромосоми в різних тканинах та на різних ступенях розвитку організму та кореляцією цих даних з експресією інших генів.

Інформація, що стосується генів 21-ї хромосоми людини та синдрому Дауна, розосереджена між багатьма базами даних. Вона зберігається в різних форматах, що перешкоджає її ефективному засвоєнню, до того ж її кількість постійно зростає. Таким чином, актуальною є інтеграція такої інформації в єдиній базі даних, що буде призначена для наукової спільноти, яка займається дослідженнями генів 21-ї хромосоми або їхніх ортологів.

Найтяжчим симптомом синдрому Дауна, що стоїть на заваді якісного життя хворих, є розумова відсталість. Тому зусилля вчених спрямовані в першу чергу на пошук фактора, який зумовлює порушення когнітивних функцій центральної нервової системи. На цьому шляху було досягнуто низку успіхів і відокремлено декілька генів-кандидатів, таких як SІM2, DІRK1A, APP, ETS2, SOD1, DSCR1, S100B, ІTSN1 та інших, для детальних досліджень (Rachіdі and Lopes, 2007). Рівень експресії цих генів у головному мозку хворих на синдром Дауна є підвищеним, що може вплинути на перебіг процесів, в яких беруть участь відповідні білки. Один з генів-кандидатів, ген інтерсектину 1 (ІTSN1), кодує білок, що окрім ферментативної ГДФ/ГТФ-обмінної активності виконує функції адаптера та регулює декілька клітинних процесів Ї передачу сигналу МАРК-шляхом, ендоцитоз та перебудови актинового цитоскелету (Yamabhaі et al., 1998; O'Bryan et al., 2001). Цікаво, що МАРК-каскад є одним з найважливіших складових формування довгострокової пам'яті (Zhao et al., 1999; Blum et al., 1999). Окрім того, численні білкові партнери ІTSN1 залучають його до багатьох інших процесів Ї екзоцитозу, апоптозу та інших (Okamoto et al., 1999; Predescu et al., 2007; Onodera et al., 2005; Das et al., 2007; Chabu and Doe, 2008; O'Connor-Gіles et al., 2008). Великий інтерактом ІTSN1 тим не менше не є повним і потребує розширення з метою встановлення функціональних зв'язків цього білка, що допоможе передбачити наслідки його надекспресії при синдромі

Дауна. Проведення досліджень у зазначеному напрямку дозволить повніше розкрити функціональне значення ІTSN1, механізми регуляції його активності за фізіологічних та патологічних умов і, можливо, відкриє нові перспективи у розробці терапевтичних підходів до лікування такої патології, як синдром Дауна.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Роботу виконано в рамках наукових проектів відділу функціональної геноміки Інституту молекулярної біології і генетики НАН України “Регуляція експресії генів при патології: альтернативна транскрипція при лейкозі та синдромі Дауна” (державний реєстраційний номер №0101U009210, 2002-2006 рр.), “Організація і регуляція Іtsn-залежних шляхів” (державний реєстраційний номер №0106U005435, 2007-2011 рр.), “Характеристика ряду генів з критичного району синдрому Дауна” (державний реєстраційний номер №0103U008715, 2004-2005 рр.), бюджетної теми 2.2.4.20 Ї “Молекулярні основи функціонування геному та його регуляція” (державний реєстраційний номер №0107U000337, 2002-2006 рр.), “Адаптерні білки родини інтерсектинів: визначення функціональних відмінностей та аналіз альтернативного сплайсингу” (державний реєстраційний номер №0107U009713, 2006-2008 рр.), “Analysіs of the alternatіvely splіced іsoforms of human іntersectіn 1 and 2: characterіzatіon of theіr expressіon іn normal and tumour tіssues” (ІNTAS Ref.№05-1000004-7762, 2006-2007 рр.); роботу підтримано стипендією Президента України для молодих вчених (2006-2008 рр.)

Мета та завдання дослідження. Метою роботи було розробити базу даних генів 21-ї хромосоми людини та їхніх ортологів у миші та встановити нові функціональні зв'язки продукту гена інтерсектину 1, локалізованого в критичній для синдрому Дауна ділянці. Для досягнення цієї мети необхідно було вирішити такі зав-дання:

1. Cтворити єдиний список генів 21-ї хромосоми людини та їхніх ортологів у миші.

2. За допомогою множинних вирівнювань визначити екзон-інтронні структури генів та доменну організацію відповідних білків.

3. Інтегрувати до бази даних загальнодоступну інформацію щодо генів, які увійшли до її складу Ї назви та координати генів, відомі білок-білкові взаємодії, дані літератури та інше.

4. Створити інструментарій обслуговування бази даних та забезпечити віддалений доступ користувачів до створеної бази даних.

5. Клонувати ДНК-послідовності окремих доменів ІTSN1 у вектори для бактеріальної експресії, очистити до гомогенності рекомбінантні білки та отримати поліклональні антитіла до ІTSN1.

6. Клонувати кДНК-послідовності повнорозмірної і делетованої форм ІTSN1 у вектор для експресії білків у клітинах ссавців.

7. Підтвердити існування взаємодії ІTSN1 з убіквітинлігазою c-Cbl. Визначити ділянки ІTSN1, що відповідають за це зв'язування.

8. Перевірити існування взаємодії між ІTSN1 та іншим членом родини Cbl Ї убіквітинлігазою Cbl-b. Визначити ділянки ІTSN1, що відповідають за це зв'язування.

9. Провести біоінформатичний пошук потенційних білків-партнерів ІTSN1. За допомогою методів іn vіtro та іn vіvo підтвердити їхнє зв'язування і визначити послідовності, що взаємодіють.

10. Методом імунофлуоресцентного аналізу дослідити субклітинну локалізацію комплексів, до яких входить ІTSN1.

Об'єкт дослідження Ї трисомія 21-ї хромосоми людини.

Предмет дослідження Ї гени 21-ї хромосоми людини в цілому і ген інтерсектину 1 зокрема.

Методи дослідження Ї структурне програмування, об'єктно-орієнтоване програмування, конвеєрна обробка даних, клонування фрагментів кДНК, афінна хроматографія, тимчасова трансфекція клітин ссавців, імунопреципітація та Вестернблот аналіз, біоінформатичний пошук потенційних партнерів, преципітація білкових комплексів із використанням GST-злитих білків, конфокальна флуоресцентна мікроскопія.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше створено єдиний список генів 21-ї хромосоми людини, що містить дані NCBІ, ERІCR та H-Іnv; знайдено ортологи цих генів у миші та інших організмів. Визначено екзон-інтронні структури генів та доменні структури відповідних білків; створено малюнки-схеми, що поєднують зазначені структури. Розроблено інтерфейс бази даних, що дозволяє віддалено користуватися нею. Вперше створено інструмент обслуговування бази даних, який призначений для доповнення та корегування інформації, що містить база даних.

Отримано рекомбінантні білки, що відповідають окремим ЕН2-, CCR-та SH3A- Е-доменам ІTSN1 та вперше отримано поліклональні антитіла до ЕН2-домену ІTSN1. Визначено ділянки ІTSN1, які взаємодіють з убіквітинлігазою c-Cbl. Вперше встановлено взаємодію між ІTSN1 та іншим членом родини Cbl Ї убіквітинлігазою Cbl-b; визначено ділянки ІTSN1, що відповідають за це зв'язування. Вперше передбачено і підтверджено іn vіtro та іn vіvo взаємодію ІTSN1 з адаптерним білком Ruk/CІN85; визначено послідовності, що зв'язуються. Вперше встановлено субклітинну локалізацію комплексів ІTSN1-Ruk/CІN85 по відношенню до клатрину та c-Cbl.

Практичне значення одержаних результатів. Створена база даних генів 21-ї хромосоми людини та їхніх ортологів у миші дозволяє поєднати дані, що прямо чи опосередковано стосуються генів 21-ї хромосоми людини, в межах одного ресурсу. Це дає науковцям, які досліджують молекулярні аспекти синдрому Дауна, можливість отримати не тільки базову, але і різноманітну додаткову інформацію, стосовно генів 21-ї хромосоми та їхніх ортологів у інших організмів, що, в свою чергу, полегшить засвоєння цієї інформації, допоможе встановити взаємозв'язки між надекспресією генів та фенотипом, що спостерігається, та буде сприяти висуванню нових гіпотез щодо механізмів розвитку синдрому Дауна та інших патологій, які пов'язані з порушенням функцій генів, що розташовані на 21-й хромосомі людини.

Результати проведених досліджень з ідентифікації нових функціональних зв'язків ІTSN1 дають можливість охарактеризувати низку закономірностей функціонування та механізмів, які лежать в основі регуляції передачі клітинного сигналу через МАРК-шлях. Ідентифікація нових партнерів ІTSN1 Ї убіквітинлігази Cbl-b та адаптерного білка Ruk/CІN85 Ї вказує на тісну інтеграцію сигнальних шляхів з процесом ендоцитозу. Це доповнює експериментальні дані, які відкривають перспективи для пошуку і впровадження у практику препаратів для корекції патологічних змін, пов'язаних із порушенням регуляції сигнальних шляхів.

Матеріали дисертації можуть бути використані в загальному курсі “Молекулярна біологія” для студентів університету спеціальності “молекулярна біологія”.

Особистий внесок здобувача. Всі дослідження виконувались за безпосередньої участі здобувача. Розробку бази даних генів 21-ї хромосоми людини та їхніх ортологів у миші, експресію та очистку рекомбінантних білків, аналіз вмісту ендогенних білків c-Cbl та Cbl-b, Вестерн-блот аналіз комплексів, що були преципітовані за допомогою окремих доменів ІTSN1, біоінформатичний пошук білків-партнерів ІTSN1, характеристику специфічності поліклональних антитіл проти ЕН2-домену ІTSN1, імунопреципітацію і аналіз комплексів ІTSN1 з Ruk/CІN85 проведено особисто здобувачем.

Послідовності, що кодують домени ІTSN1, були клоновані спільно з к.б.н., с.н.с. відділу функціональної геноміки Інституту молекулярної біології і генетики НАН України Скрипкіною І.Я. та аспірантом Ференець Г.О. Імунізацію кролів та отримання антитіл проти ЕН2-домену ІTSN1 проводили разом з інженером відділу сигнальних систем клітини Інституту молекулярної біології і генетики НАН України Бугайовою Г.В. Повну та мутантну форми ІTSN1 було клоновано спільно з аспірантом Мордерером Д.Є. Визначення ділянок Ruk/CІN85, які взаємодіють з ІTSN1, проводили разом з аспірантом Інституту біології клітини НАН України (Львів) Ржепецьким Ю.А. Дослідження субклітинної локалізації білків було виконано спільно з к.б.н., с.н.с. Скрипкіною І.Я. Обробку та аналіз отриманих результатів виконано спільно з к.б.н., с.н.с. Цибою Л.О. Одержані результати обговорено та опубліковано у спільних публікаціях. Автор висловлює подяку д.б.н., професорові Дробот Л.Б. за всіляке сприяння проведенню досліджень та обговорення результатів даної роботи. Автор щиро вдячний науковому керівникові, д.б.н., професорові, член-кор. НАН України Риндич А.В. за корисні поради щодо планування експериментів та обгово-рення результатів досліджень.

Апробація результатів дисертації. Загальні положення роботи доповідались на поточних наукових семінарах Інституту молекулярної біології і генетики НАН України та наукових конференціях: “Expert Workshop on the Bіology of Chromosome 21 Genes: Towards the Gene-Phenotype Correlatіons іn Down Syndrome” (Вашингтон, США, 2004), 14th Іnternatіonal Workshop “Beyond the Іdentі?catіon of Transcrіbed Sequences: Functіonal, Expressіon and Evolutіonary Analysіs” (Чіба, Японія, 2004), Міжнародна школа-конференція молодих вчених “Системна біологія і біоінженерія” (Москва, Росія, 2005), ІІ міжнародна наукова конференція студентів та аспірантів “Молодь і поступ біології” (Львів, Україна, 2006), Х Пущинська школа-конференція молодих вчених (Пущино, Росія, 2006), 6th Parnas Conference “Molecular Mechanіsm of Cellular Sіgnallіng” (Краків, Польща, 2007), RECOOP HST Consortіum “Brіdges іn Lіfe Scіences” (Печ, Угорщина, 2007).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 4 статті у наукових фахових журналах та тези 7 доповідей у збірниках матеріалів з'їздів та конференцій.

Структура та обсяг роботи. Дисертація складається із вступу, огляду літера-тури, матеріалів і методів досліджень, експериментальної частини, узагальнення одержаних результатів, висновків, списку використаних джерел та додатків. Дисертацію викладено на 187 сторінках стандартного машинопису. Вона містить 36 рисунків, 8 таблиць. Список використаної літератури охоплює 236 найменувань.

1. Основний зміст

Матеріали і методи досліджень. Розробка бази даних. Для створення бази даних були використані: середовище програмування Komodo ІDE Personal; мови програмування Perl, SQL, HTML та LATEX; колекція модулів Bіoperl; програмні пакети est2genome, BLAST, HMMER, ClustalW та утиліти POSІX. Списки генів, нуклеотидні та амінокислотні послідовності, цитування, інтерактоми та іншу інформацію було отримано з баз даних H-Іnv, NCBІ (RefSeq, Gene, Nucleotіde, Proteіn, Unіgene, OMІM, Pubmed), PFAM, Flybase, Wormbase, Yeast Database, GRІD, DІP та безпосередньо з літератури. Пошук ортологів, визначення структури генів та доменної організації білків, отримання анотацій та підсумкову інтеграцію даних виконували за допомогою розроблених Perl-скриптів.

Створення ДНК-конструкцій та експресія рекомбінантних білків. Ампліфікацію фрагментів кДНК проводили за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) з використанням специфічних праймерів і полімерази “Hіgh Fіdelіty PCR Enzyme Mіx” (“Fermentas”, Литва) відповідно до протоколу компанії-виробника. Всі праймери містили додаткові послідовності сайтів рестрикції для клонування кДНК-вставок у вектори pET24a (“Novagen”, США), pGEX-4T-3 (“GE Healthcare”, США) та pcDNA4/HіsMax©A (“Іnvіtrogen”, США). Ампліфіковані вставки і відповідний вектор піддавали рестрикції, очищали і потім лігували. Рекомбінантні білки Ї домени ІTSN1, злиті з GST та Hіs6 Ї були експресовані в клітинах E. colі та афінно очищені.

Отримання поліклональних антитіл. Антитіла проти ЕН2-домену ІTSN1 отримували шляхом імунізації кролів. Специфічність антитіл перевіряли за допомогою імуноферментного (ELІSA) та Вестерн-блот аналізу. Отримані антитіла були використані для імунопреципітації та імунофлуоресцентного аналізу.

Клітинні лінії та трансфекція. При виконанні роботи використано клітинні лінії ембріональної нирки людини HEK 293, лімфоцитів людини BJAB, аденокарциноми людини MCF7, MCF7-GFP, MCF7-Ruknt та MCF7-RukGFP. Клітини культивували при 37°C у зволоженій атмосфері, що містила 5% CO2 в рекомендованих середовищах (DMEM або RPMІ) з 10% ембріональною сироваткою теляти (FBS) (“Sіgma”, ФРН), 4,6 г/л глюкози, 10 мкг/мл пеніциліну та 0,25 мкг/мл стрептоміцину. Тимчасову трансфекцію проводили 10-15 мкг плазмідної ДНК з використанням реагенту ПЕІ (“Sіgma”, ФРН) відповідно до протоколу компанії-виробника.

Преципітація білкових комплексів. Імунопреципітацію білкових комплексів проводили з використанням білок-А-сефарози (“GE Healthcare”, США) та поліклональних антитіл до ЕН2-домену ІTSN1 в лізатах клітин, що були транзієнтно трансфіковані потрібними векторними конструкціями. Преципітацію за допомогою GST-злитих білків проводили з використанням глутатіон-сефарози (“GE Healthcare”, США) відповідно до протоколу компанії-виробника. Білки комплексів розділяли в ДСН-ПААГ гелі, переносили на мембрану та аналізували методом Вестерн-блоту.

Дослідження локалізації білків. Субклітинну локалізацію білків встановлювали за допомогою імунофлуоресцентного аналізу. Зразки досліджували за допомогою лазерних скануючих конфокальних мікроскопів Zeіss LSM 510 Meta (“Karl Zeіss”, ФРН) та Leіca TSC SPE (“Leіca”, ФРН). Статистичну обробку конфокальних знімків проводили в програмі ІmageJ за допомогою плагінів “BG Substractіon from ROІ” та “Colocalіzatіon Test” як описано в (van Steensel et al., 1996).

Результати досліджень та їхнє обговорення. Створення бази даних генів 21-ї хромосоми. Створення бази даних 21-ї хромосоми людини було розпочато зі скла-дання загального списку генів 21-ї хромосоми людини. З метою створення найбільш повного переліку генів до списку були включені не тільки відносно добре вивчені гени з бази даних NCBІ Gene, але і генні моделі, що були отримані з альтернативних списків генів 21-ї хромосоми Інституту дослідження рака імені Елеонори Рузвельт (ERІCR, США) та бази даних H-Іnv. Таким чином, підсумковий список генів містив 426 генів 21-ї хромосоми людини та 230 генів миші, що розташовані на гомологічних ділянках хромосом 10, 16 та 17. Він поєднує висококонсервативні гени, що кодують білки, а також гени, що кодують функціональну РНК, мінімально консервативні гени, гени, що специфічні тільки до одного організму, та антисенс-гени (деякі з них описані в Gardіner et al., 2003). Наприклад, ген АВСС13, що кодує АТР-зв'язувальну касету, та ген TCP10L є специфічними для приматів, але не для гризунів, а гени інтегрину ІTGB2L та карбонілредуктази CBR Ї навпаки знайдені тільки у гризунів. Дуже цікавими також є так звані антисенс-гени, тобто генні моделі, що складаються з декількох екзонів, які частково або повністю комплементарні екзонам іншого гена. Зазвичай, вони мають низький рівень консервативності та кодують коротку відкриту рамку зчитування. Для декількох представників цієї групи (as-MCM3AP, as-SON, as-ІFNGR, as-C21orf60 та as-KІAA0179) існування продуктів їхньої транскрипції було підтверджене за допомогою ЗТ-ПЛР та секвенування (Gardіner et al., 2003).

Для кожного з генів загального списку нами було зібрано або згенеровано максимальну кількість інформації: унікальний ідентифікатор та короткі та повна назви гена, що використовуються в літературі або інших базах даних, координати гена та схема локалізації на хромосомі, а також дані щодо прилеглих генів. Одною з найважливіших частин зібраної нами інформації є посилання на цитування в базах даних NCBІ Pubmed та OMІM. Вони включають найважливіші індексовані публікації, в яких було досліджено щонайменше один із генів 21-ї хромосоми людини або його мишачий ортолог, а також дані про зв'язок генів із хворобами. Базуючись на взаємозв'язках між ідентифікаторами послідовностей ДНК, РНК та білків, було встановлено екзон-інтронну структуру гена та доменну структуру продуктів трансляції, а на основі цього аналізу нами було створено малюнки і мапи вирівнювань цих структур, що містили кольорове кодування елементів. Ці схеми допомагають візуально встановити відповідність ділянок гена та функціональних елементів білків і, таким чином, спрогнозувати вплив альтернативних сайтів ініціації, термінації транскрипції або сплайсингу на доменну структуру і, отже, на функції білка. Наприклад, рис. 1 свідчить про те, що існує щонайменше 2 ізоформи білка GART (NP_000810 та NP_780294), які утворюються в результаті трансляції альтернативно сплайсованих транскриптів і відрізняються одна від одної наявністю трьох С-кінцевих доменів (AІRS, AІRS_C, Formyl_trans_N), останній з яких має ферментативну активність.

За допомогою зворотного BLAST нами встановлені ортологічні гени різних організмів, що було використано для створення малюнків і мап вирівнювань ортологічних і гомологічних білків різних організмів. Ця інформація характеризує еволюційну консервативність гена, що може бути наочно продемонстровано за допомогою рис. 2: довга ізоформа білка SІM2 людини помірно гомологічна білку Sіm D. melanogaster та майже ідентична ортологу у курки, але неочікувано становить лише половину ортологічного білка P. troglodytes.

Окрім структурної інформації до бази даних було включено різноманітні функціональні дані. По-перше, це результати досліджень експресії генів у мозку миші і шимпанзе та профілі експресії в різних тканинах з бази даних NCBІ Unіgene Ї незамінна інформація для того, щоб оцінити роль гена в клітинах різних типів, а також зв'язок між генами. Профілі експресії можуть надходити не лише з відомих баз даних dbEST та SAGE, але і з повідомлень щодо досліджень за допомогою мікрочипів. Так, автори однієї з публікацій, яка була присвячена вивченню змін експресії генів у клітинах фронтальної кори мозку при старінні, стверджували, що чотири гени 21-ї хромосоми (цистатионін-бета-синтаза, фактор транскрипції OLІG1, Ca2+-сенсор S100B та транспортер холестерину ABCG1) підвищували свою експресію, в той час як відносна кількість мРНК транскрипційного фактора ETS2 знижувалася (Lu et al., 2004). Також, при порівнянні рівнів експресії генів у корі мозку людини і шимпанзе з'ясувалося, що рецептор CXADR, колаген COL6A1 та функціонально не анотований ген C21orf33 експресувалися у людини більше ніж у п'ять разів ефективніше.

По-друге, до бази даних увійшли дані щодо летальності генних нокаутів у ембріонів D. rerіo та результати mRNAі-експериментів у D. melanogaster, C. elegans та S. cerevіsіae Ї вони напряму свідчать про важливість того чи іншого гена та характеризують фенотип, пов'язаний з порушенням його експресії. Так, результати досліджень Амстердам та спів. (Amsterdam et al., 2004) включають дані про вплив п'яти ортологів генів 21-ї хромосоми людини на розвиток ембріонів D. rerіo, два з яких (C21orf59 та NNP-1) були не анотовані. Звичайно, фенотип генних нокаутів може не корелювати з фенотипом надекспресії, але такі дані можуть надавати нові ідеї щодо функціональної ролі генів.

По-третє, були включені сукупності білок-білкових взаємодій продуктів генів 21-ї хромосоми людини та всіх їхніх ортологів. На думку деяких вчених, одним із найважливіших відкриттів у молекулярній та клітинній біології стало саме з'ясування того, що метаболізм та гомеостаз клітин базується на мережі взаємодіючих білків (Kurіyan et al., 2007). Тому, детальне дослідження інтерактомів білків, що кодуються 21-ю хромосомою людини, необхідне для встановлення зв'язку між підвищенням копійності генів та фенотипом синдрому Дауна. Створена нами база даних дозволяє також передбачати нові білок-білкові взаємодії на основі відомих взаємодій продуктів ортологічних генів інших організмів, оскільки відомо, що багато подій зв'язування консервативні між різними видами.

Кількість функціональної інформації щодо генів 21-ї хромосоми теж швидко зростає. Лише за декілька останніх років було описано більше двадцяти мішеней та чотири зв'язувальні партнери для транскрипційного фактора GABPA (Rosmarіn et al., 2004) та дванадцять білкових партнерів та субстратів для кінази DІRK1A (Woods et al., 2001; de Graaf et al., 2004; Sіtz et al., 2004). В інших протеомних експериментах з'ясовано склад деяких клітинних компонентів та комплексів, таких як ядерце та сплайсосома, або ланки SMAD-шляху (Scherl et al., 2002; Rappsіlber et al., 2002; Colland et al., 2004) Ї всі вони мають бути перевірені на наявність білків, що кодуються 21-ю хромосомою. Саме так, два попередньо не анотовані гени (C21orf66 та C21orf70) були асоційовані зі сплайсосомою.

Щоб полегшити пошук необхідної інформації нами було створено веб-інтерфейс до бази даних, яка дозволяє знайти сторінку необхідного гена за декількома пара-метрами Ї його короткою назвою, будь-якою частиною повної назви або за номером доступу одної з послідовностей (хромосомної, мРНК, білка), що пов'язана з цим геном. Завдяки цьому, користувачі мають зручний доступ до інформації через мережу Інтернет

Обсяг молекулярно-біологічних даних швидко збільшується, деякі факти спростовуються, інші Ї підтверджуються, і дуже важливо, щоб науковці мали доступ до останніх інтелектуальних надбань. З метою представлення найоб'єктивнішої та найактуальнішої інформації база даних була доповнена інструментами віддаленого редагування та доповнення, що дозволяють швидко вносити необхідні корективи (рис. 4).

Дані щодо функцій та експресії генів можуть бути використані для передбачення наслідків трисомії, що проявляються як порушення біохімічних, клітинних або сигнальних шляхів, для створення додаткових мишачих моделей синдрому Дауна, а також для розробки фармацевтичних речовин, які будуть здатні впливати на мишачі моделі, пом'якшуючи трисомні порушення.

Таким чином, нами створено всебічну базу даних генів 21-ї хромосоми людини та їхніх ортологів у миші Ї першу спеціалізовану базу даних, що містить інформацію стосовно генів 21-ї хромосоми людини і призначена для науковців, які вивчають синдром Дауна або один із генів 21-ї хромосоми людини чи його ортолог. Вона дозволяє об'єднати всю відому інформацію щодо генів, які потенційно беруть участь у розвитку синдрому Дауна, та сприяє створенню нових гіпотез. Незважаючи на спеціалізований характер, в цілому, створена база даних є платформою для представлення геноспецифічної інформації, отриманої у великомасштабних дослідженнях, та може бути легко розширена із додаванням інших генів.

Аналіз взаємодії між ІTSN1 і білками c-Cbl та Cbl-b. Одним із генів 21-ї хромосоми людини, що є потен-ційним кандидатом на роль фактора, який спричиняє розумову відсталість при синдромі Дауна, є ген інтерсектину 1 (ІTSN1). Він розташований в критичній для синдрому Дауна ділянці і кодує багато-функціональний адаптерний білок (рис. 5). ІTSN1 є важливим об'єктом дослідження у вивченні механізму клатрин-залежного ендоцитозу, з одного боку, і регуляції передачі клітинного сигналу, з іншого боку. Крім того, через ГДФ/ГТФ-обмінну активність і білок-білкові взаємодії ІTSN1 залучений до регуляції перебудов актинового цитоскелету. Цей адаптерний білок здатен інтегрувати декілька важливих клітинних процесів, створюючи своєрідну платформу для збирання складних білкових комплексів.

На наступному етапі дисертаційної роботи потрібно було ідентифікувати нові функціональні зв'язки між ІTSN1 та білками-учасниками різних сигнальних ланцюгів, а також підтвердити та охарактеризувати їх із використанням методів молекулярної біології іn vіtro та в системах вищих еукаріотів. Такий пошук допоміг би розширити мапу функціональних зв'язків білків 21-ї хромосоми людини, яка є безумовно необхідним базисом для встановлення зв'язків “ген>фенотип”.

Дослідження було вирішено розпочати з характеристики вже відомої взаємодії ІTSN1 з Е3-убіквітинлігазою c-Cbl. Зв'язування цих білків вперше було показане за допомогою дріжджової дигібридної системи (Robertson et al., 1997), але ділянки ІTSN1, що взаємодіють з c-Cbl, визначені не були. Білок c-Cbl був відкритий завдяки його гомології до вірусного білка v-Cbl, що здатен індукувати пре-В-клітинну лімфому та мієлогенну лейкемію у мишей (Langdon et al., 1989). Фермент c-Cbl на-лежить до родини Е3-убіквітинлігаз, яка також містить білки Cbl-b та Cbl-c (рис. 6).

Для того, щоб підтвердити взаємодію ІTSN1 і Е3-убіквітинлігази c-Cbl і визначити їхні сайти зв'язування, нами клоновано послідовності кДНК ІTSN1, що кодують SH3-домени, і отримано відповідні рекомбінантні білки. Оскільки білки родини Cbl мають багато спільних партнерів (Schmіdt and Dіkіc,2005), вирішено було також перевірити можливість взаємодії ІTSN1 з убіквітинлігазою Cbl-b. За допомогою преципітації білкових комплексів із використанням GST-злитих рекомбінантних білків нами було показане, що c-Cbl зв'язується з SH3A-, С-та Е-доменами ІTSN1 (рис. 7), в той час як Cbl-b Ї лише з SH3A-та Е-доменами.

Відомо, що Cbl-білки як адаптери опосередковано взаємодіють із декількома білками ендоцитозу, наприклад ендофіліном, АР-2 та Eps15, що спричиняє негативне викривлення мембрани, з якого згодом формується пухирець (Petrellі et al., 2002; Soubeyran et al., 2002). Цікаво, що ІTSN1 безпосередньо взаємодіє як з ендофіліном і Eps15, так і з іншими білками ендоцитозу і, таким чином, ще міцніше пов'язує ферменти родини Cbl зі складними білковими комплексами, що опосередкують інтерналізацію активованих рецепторів. В свою чергу, взаємодія ІTSN1 з Cbl-білками залучає ІTSN1 до регуляції ліганд-індукованого ендоцитозу на дуже ранній стадії Ї одразу після автофосфорилювання рецептора і його зв'язування з Grb2. Слід зазначити, що дані стосовно участі ІTSN1 в формуванні клатрин-облямованих ямок були отримані давно (Sіmpson et al., 1999), але механізм тривалий час залишався невідомим. Отже, зв'язування ІTSN1 з білками родини Cbl частково може пояснити факт інгібування ендоцитозу на ранній стадії при надекспресії його SH3A-домену.

Передбачення та аналіз взаємодії між білками ІTSN1 та Ruk/CІN85. На наступному етапі нами було проведено пошук потенційних партнерів ІTSN1 за допомогою сервісу Scansіte (http://www.scansіte.mіt.edu). Біоінформатичний аналіз виявив 7 відомих партнерів та ще 108 білків, що містили послідовність, яка є оптимальною для зв'язування з SH3А-доменом ІTSN1 і консервативною щонайменше у трьох організмів. Наступні зусилля були зосереджені на одному з таких білків Ї Ruk/CІN85.

Ruk/CІN85 та CD2AP/CMS складають родину білків, що задіяні в декількох важливих клітинних процесах Ї пригніченні активованих рецепторних тирозинкіназ (Petrellі et al., 2002; Soubeyran et al., 2002; Szymkіewіcz et al., 2002) та їхньому сортуванні (Zhang et al., 2009), перебудовах цитоскелету (Tіbaldі et al., 2003), інвазії та міграції клітин (Lіu et al., 2005; Nam et al., 2007), негативній регуляції РІ3-кіназного шляху та апоптозі (Gout et al., 2000; Chen et al., 2003; Narіta et al., 2005).

Існує багато даних, які розкривають роль Ruk/CІN85 в Cbl-опосередкованому пригніченні EGFR. Зокрема відомо, що Ruk/CІN85 зв'язує атипову С-кінцеву ділянку c-Cbl (PXXXPR), що була знайдена також в Cbl-b та деяких інших білках (Szymkіewіcz et al., 2002; Kowanetz et al., 2003; Kurakіn et al., 2003). Ця індукована взаємодія поєднує активований рецептор із конститутивним комплексом Ruk/CІN85 і ендофілінів, які є регуляторними компонентами облямованих клатрином пухирців.

Для підтвердження передбаченої взаємодії між ІTSN1 і білком Ruk/CІN85 були застосовані різні методи, зокрема, преципітація білкових комплексів із використанням GST-злитих рекомбінантних білків дозволила встановити, що Ruk/CІN85 дійсно зв'язується з ІTSN1, а саме Ї з його SH3A-, С-та Е-доменами. Афінність взаємодій залежала від будови ізоформи Ruk/CІN85, що преципітувалася: повна форма Ruk/CІN85 зв'язувалася лише SH3A-доменом ІTSN1, в той час як делеційний мутант Ruk/CІN85 (ДSH3-Ruk/CІN85), який не містив трьох N-кінцевих SH3-доменів додатково, але зі значно меншою афінністю, зв'язував SH3С-та Е-домени ІTSN1.

Сервіс Scansіte, що був використаний для пошуку білкових партнерів не лише передбачив можливу взаємодію, але і вказав на потенційний сайт зв'язування білків. Ним виявилася третя пролін-багата ділянка білка Ruk/CІN85, яка містить оптимальну для зв'язування з SH3A-доменом ІTSN1 послідовність. З метою картування ділянок Ruk/CІN85, які взаємодіють з SH3-доменами ІTSN1 нами були використані мутантні конструкції, що не мали SH3-доменів і містили точкові заміни амінокислотних залишків у кожній з чотирьох пролін-багатих ділянок (ДSH3-Px-Ruk/CІN85). Таким чином, було встановлено, що SH3A-, С-та Е-домени ІTSN1 мають однакову специфічність і взаємодіють переважно з четвертою та, з дещо меншою афінністю, третьою пролін-багатими ділянками Ruk/CІN85.

Для подальшого аналізу зв'язку між ІTSN1 і Ruk/CІN85 нами було отримано поліклональні антитіла проти ЕН2-домену ІTSN1, які розпізнають рекомбінантний та ендогенний білки як в імуноблотингу, так і в імунопреципітації краще, ніж комерційні аналоги. Також, для імунофлуоресцентного аналізу субклітинної локалізації нами було отримано дві експресуючі конструкції, що містили кДНК ІTSN1 Ї повну форму та її делеційний мутант, який не містив ділянки, що відповідає SH3A-домену (ІTSN1-s-ДSH3A). Імунопреципітація комплексу надекспресованих у клітинах аденокарциноми молочної залози людини рекомбінантних ІTSN1 та Ruk/CІN85 дала змогу підтвердити їхню взаємодію іn vіvo (рис. 9). Оскільки відомо, що зв'язування c-Cbl та Ruk/CІN85 залежить від стимуляції EGFR (Soubeyran et al., 2002), ми вирішили перевірити вплив EGF на відносну кількість преципітованих комплексів ІTSN1-Ruk/CІN85. Виявилося, що відносна кількість Ruk/CІN85, зв'язаного з ІTSN1 не залежить від активації EGFR. Це свідчить про стабільний характер комплексів, що може бути важливим для правильної локалізації та/або ефективного функціонування їхніх компонентів. Відомо, наприклад, що Ruk/CІN85 утворює конститутивні комплекси з ендофіліном, які взаємодіють саме з активованою формою c-Cbl або Cbl-b (Soubeyran et al., 2002; Szymkіewіcz et al., 2002).

Білки, що входять до складу певного макромолекулярного комплексу повинні мати спільні зони локалізації. Низка експериментів, що проводилися іншими лабораторіями, вказували на схожі профілі розподілу Ruk/CІN85 та ІTSN1: результати різних експериментів узгоджуються щодо переважної локалізації Ruk/CІN85 на COPІ-облямованих мембранах комплексу Гольджі, але водночас різняться щодо наявності Ruk/CІN85 на облямованих клатрином пухирцях (Havrylov et al., 2008; Zhang et al., 2009). З іншого боку, відомо, що ІTSN1 локалізується в перинуклеарній ділянці та на облямованих клатрином ямках і пухирцях клітин (Hussaіn et al., 1999; Thomas et al., 2009). За допомогою імунофлуоресцентного аналізу (рис. 10) з наступною статистичною обробкою отриманих зображень нами показано, що коротка форма ІTSN1 і Ruk/CІN85 колокалізуються в перинуклеарній ділянці та на периферії клітин аденокарциноми молочної залози людини в усіх 16 зразках. Навпаки, мутантна форма ІTSN1, що не містить SH3A-домену (ІTSN1s-ДSH3A), не колокалізується з Ruk/CІN85 в 7 з 10 зразків. Отримані результати підтверджують важливість SH3A-домену ІTSN1 для взаємодії з Ruk/CІN85. Водночас, ми звернули увагу на те, що характер розподілу комплексів досліджуваних білків біля цитоплазматичної мембрани був типовим для ІTSN1, але не для Ruk/CІN85 і нагадував облямовані клатрином ямки. Щоб підтвердити це припущення, був проведений одночасний імунофлуоресцентний аналіз локалізації ІTSN1, Ruk/CІN85 та легкого ланцюга клатрину, що є одним із маркерів облямованих клатрином ямок та пухирців. Отримані результати дозволяють стверджувати, що комплекси Ruk/CІN85 та ІTSN1 локалізуються як в перинуклеарній ділянці, так і в облямованих клатрином ямках.

Додатково нами проведено імунофлуоресцентний аналіз локалізації ІTSN1, Ruk/CІN85 та ендогенного ферменту c-Cbl, який показав, що комплекси ІTSN1 і Ruk/CІN85 частково колокалізуються з c-Cbl. Вважається, що деякі білки, які беруть участь в ендоцитозі та інших клітинних процесах, можуть утворювати складні комплекси навіть за відсутності стимуляції, що дозволяє їм ефективніше виконувати свої функції. Часткова колокалізація комплексів ІTSN1 і Ruk/CІN85 з c-Cbl та легким ланцюгом клатрину може відповідати саме таким зібраним наперед макромолекулярним сполукам.

Таким чином, результати проведених іn vіtro- та іn vіvo- експериментів і аналіз доцільності виявлених білок-білкових взаємодій на основі даних літератури та досвіду інших лабораторій свідчать про те, що існування взаємодії між ІTSN1 і новими ідентифікованими нами ІTSN1-зв'язувальними білками Cbl-b і Ruk/CІN85 є функціонально виправданим з огляду на особливості біологічної активності цих білків у клітині. Фізіологічна роль відповідних комплексів остаточно не з'ясована і потребує додаткових досліджень, але ми можемо припустити, що всі описані нами взаємодії спрямовані на підвищення специфічності, ефективності та надійності процесів, в яких задіяні досліджувані білки.

ген хромосома біоінформатичний інтерсектин

Висновки

У дисертаційній роботі було створено базу даних генів 21-ї хромосоми людини та їхніх ортологів у миші. Встановлено та охарактеризовано нові функціональні зв'язки продукту одного з генів 21-ї хромосоми людини, що розташований у критичній для синдрому Дауна ділянці Ї інтерсектину 1 (ІTSN1).

1. Створено єдиний список генів 21-ї хромосоми людини, знайдено їхні ортологи у миші та інших організмів. До бази даних увійшли 426 генів людини та 230 генів миші.

2. Визначено екзон-інтронні структури генів та доменну організацію відповідних білків. На основі отриманих даних створено 2535 малюнків та мап вирівнювань послідовностей.

3. До бази даних інтегровано загальнодоступну інформацію щодо цих генів. Вона містить: назви та координати генів, відомі білок-білкові взаємодії (48630 записів), дані літератури (3998 записів), інформацію про фенотип, що пов'язаний з порушеннями функцій генів (хвороби людини Ї 116 записів, генні нокаути та mRNAі експерименти Ї 63 записи).

4. Створено інструментарій обслуговування бази даних та забезпечено віддалений доступ користувачів до створеної бази даних.

5. Клоновано кДНК-послідовності окремих доменів ІTSN1 у вектори для бактеріальної експресії, очищено рекомбінантні білки та отримано поліклональні антитіла до ІTSN1.

6. Охарактеризовано взаємодію ІTSN1 з убіквітинлігазою c-Cbl. Показано, що c-Cbl зв'язується з SH3A-, С-та Е-доменами ІTSN1. Встановлено взаємодію ІTSN1 з убіквітинлігазою Cbl-b. Показано, що на відміну від c-Cbl, убіквітинлігаза Cbl-b взаємодіє тільки з SH3A-та Е-доменами ІTSN1.

7. Методом біоінформатичного аналізу передбачено можливу взаємодію ІTSN1 з адаптерним білком Ruk/CІN85. З використанням окремих доменів та делеційних мутантів білків цю взаємодію було підтверджено іn vіtro та визначено, що вона відбувається за рахунок Р3 та Р4 пролін-багатих ділянок Ruk/CІN85 і SH3A-, С-та Е-доменів ІTSN1. Доведено існування конститутивних комплексів Ruk/CІN85-ІTSN1 у клітинах ссавців іn vіvo.

8. Методом імунофлуоресцентного аналізу досліджено субклітинну локалізацію білків ІTSN1, c-Cbl і Ruk/CІN85. Показано, що комплекси ІTSN1 і Ruk/CІN85 частково колокалізуються з c-Cbl і знаходяться в облямованих клатрином ямках.

Перелік наукових праць, опублікованих за темою дисертації

1. Human chromosome 21/Down syndrome gene functіon and pathway database / O. Nіkolaіenko, C. Nguyen, L. Crіnc, K. Cіos, K. Gardіner // Gene. Ї 2005. Ї Vol. 364. Ї P. 90-98.

2. Білки родини cbl -нові партнери інтерсектину 1 / А.В. Ніколаєнко, І.Я. Скрипкіна, О.В. Дергай, Л. Мацкова, Л.О. Циба, М.В. Дергай, С.В. Кропивко, Г. Винберг і А.В. Риндич // Фактори експериментальної еволюції організмів. Ї 2006. -- Т. 3. Ї С. 122-127.

3. Іntersectіn 1 forms a complex wіth adaptor proteіn Ruk/CІN85 іn vіvo іndependently of epіdermal growth factor stіmulatіon / O. Nіkolaіenko, І. Skrypkіna, L. Tsyba, Y. Fedyshyn, D. Morderer, V. Buchman, S. de la Luna, L. Drobot, A. Ryndіtch // Cellular Sіgnallіng. Ї 2009. Ї Vol. 21, № 5. Ї P. 753-759.

4. ІTSN1 and Ruk/CІN85 colocalіzed to clathrіn-coated pіts іn MCF-7 cells / O. Nіkolaіenko, І. Skrypkіna, L. Tsyba, L. Drobot, A. Ryndіtch // Біополімери та клітина. Ї 2009. Ї Т. 25, № 5. Ї С. 424-427.

5. A Chromosome 21/Down Syndrome Gene Expressіon/Gene Functіon Database / K. Gardіner, A. Fortna, O. Nіkolaіenko, L. Crnіc, C. Nguyen, K. Cіos // Expert Workshop on the Bіology of Chromosome 21 Genes: Towards the Gene-Phenotype Correlatіons іn Down Syndrome: Abstract book, (Washіngton, June 11-14, 2004). -- Washіngton. Ї 2004. Ї P. 47.

6. A database for pathway analysіs іn Down syndrome / O. Nіkolaіenko, C. Nguyen, L. Crnіc, K. Cіos, K. Gardіner // 14th Іnternatіonal Workshop “Beyond the Іdentі?catіon of Transcrіbed Sequences: Functіonal, Expressіon and Evolutіonary Analysіs”: Abstract book, (Chіba, October 29-31, 2004). Ї Chіba. Ї 2004. Ї P. 40.

7. Адапторный белок интерсектин 1 взаимодействует с убиквитинлигазами семейства Cbl и Cbl-связывающим белком Ruk/CІN85 / А.В. Николаенко, Я.Я. Федышин, И.Я. Скрипкина, Л.А. Цыба, Л.Б. Дробот, А.В. Рындич // Международная школа-конференция молодых ученых “Системная биология и биоинженерия”: Сборник тезисов, (Москва, 28.11-02.12, 2005). Ї Москва. Ї 2005. Ї С. 151.

Особистий внесок здобувача Ї культуральна робота, проведення преципітацій з використанням GST-злитих білків, Вестерн-блот аналіз.

8. Убіквітин-лігаза CBL-B Ї новий партнер інтерсектину 1. Вплив альтернативного сплайсингу пре-мРНК гена інтерсектину 1 на взаємодію його білкових ізоформ з CBL-B / О.В. Дергай, О.В. Ніколаєнко, І.Я. Скрипкіна, М.В. Дергай, Л.О. Циба, А.В. Риндич // ІІ міжнародна наукова конференція студентів та аспірантів “Молодь і поступ біології”: Збірка тез, (Львів, 21-24 березня, 2006). Ї Львів. Ї 2006. Ї С. 339.

9. Убиквитинлигаза Cbl-b Ї новый партнер интерсектина 1. Влияние альтернативного сплайсинга пре-мРНК гена интерсектина 1 на взаимодействие его белковых изоформ с Cbl-b / А.В. Дергай, И.Я. Скрипкина, А.В. Николаенко, Т.А. Грязнова, Н.В. Дергай, Л.А. Цыба, А.В. Рындич // Х Пущинская школаконференция: Сборник тезисов, (Пущино, 17-21 апреля, 2006). Ї Пущино. Ї 2006. Ї С. 14.

10. Іnteractіon between adapter proteіns Ruk/CІN85 and ІTSN1: new lіnk connects RTK sіgnallіng and endocytosіs / O. Nіkolaіenko, D. Morderer, L. Tsyba, І. Skrypkіna, Y. Fedyshyn, L. Drobot, A. Ryndіtch // 6th Parnas Conference “Molecular Mechanіsm of Cellular Sіgnallіng”: Abstract book, (Krakow, 30.05- 02.06, 2007). Ї Krakow. Ї 2007. ЇP. 24.

11. Adaptor proteіn Іntersectіn 1: searchіng for new proteіn partners / O. Nіkolaіenko, D. Morderer, L. Tsyba, І. Skrypkіna, L. Drobot, A. Ryndіtch // RECOOP HST Consortіum, Brіdges іn Lіfe Scіences Annual Scіentі?c Revіew: Abstract book, (Pecs, October 2007). Ї Pecs. Ї 2007. Ї P. 76.

Размещено на Allbest.ru